DE3830061A1 - Verfahren und anordnung fuer die lichtrastermikroskopie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lichtrastermikroskopie, das die Erkennung von Objektdetails verbessert und günstig zur bildmäßigen Untersuchung biologischer und medizinischer Objekte als auch feinstrukturierter Festkörperoberflächen angewendet werden kann, sowie eine Anordnung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Lichtrastermikroskope bestehen aus einer Lichtquelle, einer Ein­ richtung zur Fokussierung des Lichtstrahles auf das zu untersu­ chende Objekt, einen optoelektronischen Wandler zum Empfang der vom Objekt durchgelassenen oder reflektierten Strahlen und einer Einrichtung zur Rasterung einer Objektfläche durch Bewegung des Objektes oder Ablenkung des Strahles. Als Lichtquelle dient vor­ zugsweise ein CW-Laser. Wird von jedem beleuchteten Objektpunkt das gesamte ausgehende Licht von dem Abbildungssystem zur Bild­ darstellung benutzt, so handelt es sich um das einfache Licht­ rastermikroskop, dessen Auflösungsvermögen dem des Lichtmikros­ kopes entspricht (als Typ I bezeichnet). Es ist ausführlich bei Sheppard, C. J. R.; Wilson, T. J. Microscopy 114 (1978) S. 179 be­ schrieben.

Werden zusätzlich von der Probe ausgehende Strahlungen wie z. B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Raman-Strahlung oder auch Photo­ elektronen mit Hilfe eines zweiten Detektors zur Bilddarstellung benutzt, so entsteht ein kombiniertes optoelektronisches Meß­ system, das eine Identifizierung probenspezifischer Parameter hoher Empfindlichkeit erlaubt (Europ. Patentanmeldung Veröff. 00 56 426 (1981) Verfahren und Vorrichtung zur lichtindu­ zierten rastermikroskopischen Darstellung von Probenparametern in ihrer räumlichen Verteilung).

Eine Verbesserung der Auflösung räumlicher Strukturen bringt das von Sheppard, C. J. R. DE-OS 28 18 651 (1987), beschriebene konfo­ kale Lichtrastermikroskop (als Typ II bezeichnet).

Es besitzt in der Bildebene eine Lochblende, deren Durchmesser kleiner ist als der des Bildes des Fokus auf dem Objekt, so daß das gesamte aus dem Strahlbündel herausgestreute oder gebeugte Licht ausgeblendet bleibt und nur das zentrale Maximum zur Bild­ darstellung genutzt wird. Insbesondere verbessert sich die Tie­ fenschärfe.

Dichte- und Dickeninhomogenitäten des Objektes lassen sich gün­ stig mit einem Scanning-Mikroskop sichtbar machen, das nach dem Differential-Phasenkontrast-Prinzip arbeitet (Dekkers, N. H., de Lang, Optik Vol 41 (1974) S. 452). Es besitzt einen geteilten Sensor (split sensor), auf dem die Fokusfläche symmetrisch abge­ bildet wird. Die beiden Sensorhälften bilden die Differenz der auffallenden Intensität, so daß Dichte- oder Dickengradienten im Fokusbereich des Objektes sichtbar werden. Eine weitere Ver­ besserung dieser Methode bringt der Vorschlag von Sheppard, C. J. R. und Wilson, T. (EP-PS 01 68 983 A1 (1985) Scanning microscope), das Zentrum des geteilten Sensors abzudecken und nur Randzonen des abgebildeten Lichtstrahles zur Detektion zu benutzen. Das Ausblenden der starken Mittenintensität hat den Vorteil, daß bei der Differenzbildung der Randintensitäten auch Bereiche mit kleinerem Phasenkontrast sichtbar werden.

Nachteilig ist, daß die bisher vorgeschlagenen Verfahren und Ein­ richtungen der Lichtrastermikroskopie mit Detektoren arbeiten, die das Licht über mehr oder weniger großen Flächen integrieren. Das gilt auch für das konfokale Lichtrastermikroskop, wo die In­ tegration in der Ausblendung des gesamten Streulichtes zu sehen ist (Integraler Fehlbetrag).

Die Integration ist ein Faktor, der wesentlich zur Begrenzung der örtlichen Strukturerkennung beiträgt.

Relativ hoher Aufwand (optisch und mechanisch) entsteht beim konfokalen Lichtrastermikroskop durch die genaue Mitführung der Empfängerblende beim Abrastern des Objektes.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die Lichtrastermikro­ skopie ein Verfahren und eine Anordnung zu entwickeln, mit deren Hilfe mehr und genauere Informationen über Objektstrukturen und Objektparameter gewonnen werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Anordnung für die Lichtrastermikroskopie zu entwickeln, womit eine genauere Abtastung des Bildes eines Objektpunktes und damit mehr Informationen von extrem kleinen Objektstrukturen bei hoher Abtastgeschwindigkeit erreicht werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das von einem punktförmig bestrahlten Objektbereich ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitätsverteilung in der Bildebene (senkrecht zur Strahlachse) in einer oder in mehreren Richtungen kontinuierlich oder in kleinen Schritten gemessen wird. Aus der Intensitätsverteilung werden charakteristische Größen wird die Gesamtintensität, die Lage und Größe von Extremwerten und/oder die Breite von Peaks der Abtastkurve bestimmt und von einem Rechner verarbeitet. Der Meßvorgang wird bei rechnergesteuerter Flächenrasterung (x-y-Richtung) des Objektes von Punkt zu Punkt wiederholt. Die jeweils erhaltenen charakteristischen Größen der Intensitätsverteilung werden zur Bilddarstellung genutzt, sie verbessern die Erkennung von Objektdetails.

Die charakteristischen Größen und/oder ihre mathematischen Ver­ knüpfungen (Verhältnisbildungen von Größen und Lagen der Extrem­ werte, Integration über den Abtastweg) dienen der Grauwertstufung in der Bilddarstellung des Objektbereiches. Die bloße Bildung des Integrals der Intensitätsverteilung eines jeden Objektbereiches liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ I. Die bloße Messung und Verarbeitung der Höhe des Intensitätsmaximums der In­ tensitätskurve liefert Rasterbilder des Rastermikroskopes vom Typ II. Dabei spielt es keine Rolle, an welcher Stelle im Abtast­ bereich die Kurve erscheint, so daß der Meßvorgang auf eine Im­ pulshöhenanalyse reduziert werden kann. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, ohne mechanisches Nachführen der Blende ein Strahl­ scanning in dieser Richtung vorzunehmen.

Die Abrasterung des Objektes x- und y-Richtung erfolgt durch Be­ wegung des Objektes oder des Strahles oder beider in Stufen oder bei höheren Abtastgeschwindigkeiten kontinuierlich.

Zur Ermittlung bestimmter Probenparameter wird die Intensitäts­ verteilung von Streustrahlungen gemessen, deren Wellenlängen in­ folge von inelastischen Wechselwirkungen der Strahlen mit dem Objekt verändert sind, z. B. Fluoreszenz- oder Ramanstrahlung. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß weiterhin dadurch gelöst, daß zur Durchführung des Verfahrens eine rastermikroskopische Anord­ nung erstellt ist, in der sich zwischen dem abbildenden optischen System und der Blende des optoelektronischen Wandlers ein elektro­ nisch steuerbares optisches Ablenksystem befindet, eine akustoop­ tische oder elektrooptische Zelle.

Bei nur eindimensionaler Ablenkung ist das Ablenksystem vorzugs­ weise ein rotierendes Polygonprisma. Die Blende, die sich vor dem optoelektronischen Wandler in der Bildebene befindet, hat eine Öffnungsweite, die kleiner ist als der Durchmesser des Bildes des Laserfokus auf dem Objekt. Das Bild des beleuchte­ ten Objektbereiches wird über die Blende gelenkt und vom dahin­ ter befindlichen Wandler als zeitabhängige Intensität registriert.

Anstelle des Polygonprismas können schwingen­ de Ablenkelemente, wie z. B. lichtbrechende planparallele Körper oder Schwingspiegel oder auch gleichmäßig bewegte Drehspiegel angeordnet sein.

Für eine 2D-Darstellung der Intensitätsverteilung des vom be­ leuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes ist das Polygonprisma mit geringfügig in Richtung der Drehachse angeschrägten Prismen­ flächen versehen.

Der optoelektronische Wandler, die Blende und das Ablenksystem können durch eine integrierte Empfängeranordnung, durch zeilen- oder matrizenförmig angeordnete Elemente (Photodioden oder CCD- Elemente) oder auch durch eine TV-Aufnahmeeinrichtung, vorzugs­ weise mit Bildvorverstärker (Ebiscon) ersetzt sein. Die Zeile, die Matrix oder das Empfängertarget sind jeweils in der Bild­ ebene des Objektbereiches senkrecht zur Strahlachse angeordnet.

Für Messungen von Streustrahlungen, deren Wellenlängen vom Objekt durch inelastische Wechselwirkungen ver­ ändert sind, ist ein Filter im Strahlengang oberhalb des halb­ durchlässigen Spiegels angeordnet.

Für wahlweises Arbeiten im Auflicht oder im Durchlicht kann das Lichtrastermikroskop einen Strahlteiler im Strahlengang des Lasers enthalten. Die beiden Teilstrahlen sind über optische Unterbrecher- und Umlenkvorrichtungen an das Objekt geführt, ein Strahl für Durchlichtmessungen und ein Strahl für Auflichtmes­ sungen.

Für eine dreidimensionale Bilddarstellung sind das Objekt oder der Strahlfokus oder beide in Richtung der Strahlachse (Achse des Abbildungssystems = z-Achse) schrittweise verschiebbar an­ geordnet.

Zum Zwecke herkömmlicher lichtmikroskopischer Beobachtung des Objektes sind außer einer an sich bekannten Vorrichtung zur gleichmäßigen Ausleuchtung des gesamten Objektes im Strahlen­ gang des abbildenden Systems ein halbdurchlässiger Spiegel und ein Okular angeordnet.

Anhand eines Ausführungsbeispiels wird die Erfindung näher er­ läutert. Es zeigt

Fig. 1 eine mögliche Ausführungsform einer Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Lichtrastermikro­ skopie,

Fig. 2 schematisch die Intensitätsverteilung des von einem beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes.

Bei der Anordnung nach Fig. 1 ist das aus einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser 9, austretende Licht und einem opti­ schen System 8, bestehend aus einer Vorrichtung zur Strahlauf­ weitung, Fokussierung und Strahlablenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, auf die Unterseite des Objektes 7 oder mit einer weiteren Lichtquelle, vorzugs­ weise einem Laser 10 über eine Optik 11, bestehend aus einer Vorrichtung zur Strahlaufweitung, Fokussierung und Strahlab­ lenkung in der zur Drehachse des Polygonprismas 1 senkrechten Richtung, über einen halbdurchlässigen Spiegel 12 und die Op­ tik 4 auf die Oberseite des Objektes 7 fokussiert. Das Objekt 7 wird durch eine Vorrichtung zur mechanischen Verschiebung 16 durch den Rechner 14 in drei Translationsfreiheitsgraden repro­ duzierbar bewegt. Das vom beleuchteten Punkt des Objektes 7 ausgehende Licht wird sowohl bei der Transmissions- als auch der Reflektionsvariante des Beispiels durch die Optik 4 und den halbdurchlässigen Spiegel 12 durch das Polygonprisma 1 hindurch auf die Blende 2 abgebildet. Bei Bewegung (drehende) des Polygonprismas 1 wird das vom jeweiligen Objektpunkt aus­ gehende Licht an der Lochblende 2 vorbeigeführt und vom Foto­ detektor 3 erfaßt. Der A/D-Wandler 13 und der Rechner 14 er­ fassen die Intensitätsverteilung des vom jeweiligen beleuchte­ ten Objektpunkt ausgehenden Lichtes. Dabei kontrolliert ein mit dem Rechner 14 verbundenes optoelektronisches System 17 die Stellung des Polygonprismas. Es gestattet, zur Aufnahme der In­ tensitätsverteilung stets dieselben Flächenpaare des Polygon­ prismas 1 zu benutzen, um gerätebedingte Intensitätsschwankun­ gen zu vermeiden. Über die Optik 4, einen weiteren halbdurch­ lässigen Spiegel 6 und das Okular 18 kann der zu untersuchende Objektbereich visuell in herkömmlicher Durchlichtmikroskopie betrachtet werden, wenn das Objekt 7 mittels des Kondensors 20 und der Leuchte 21 über den halbdurchlässigen Spiegel 19 gleichmäßig beleuchtet wird.

Das Filter 5 dient zur Abtrennung des Fluoreszenzlichtes der Probe vom beleuchtenden Primärstrahl.

Fig. 2 stellt schematisch die Intensitätsverteilung des von einem beleuchteten Objektbereich ausgehenden Lichtes in der Bildebene in einer Richtung x dar zwecks Erklärung der Licht­ rastermikroskope der Typen I, II und III.

Zur Bilddarstellung auf einer Bildausgabeeinheit 15 werden charakteristische Merkmale der Intensitätsverteilung des vom beleuchteten Objektbereiches ausgehenden Lichtes wie z. B. Lage, Höhe und Breite der Maxima und Minima und/oder deren mathematische Verknüpfung (Typ III; Fig. 2c) oder das Inte­ gral der Intensitätsverteilung zur Aufnahme des Rasterbildes nach Typ I (Fig. 2a) oder die Höhe des Maximums zur Aufnahme von Rasterbildern des Types II (Fig. 2b) herangezogen.

Verzeichnis der verwendeten Bezugszeichen

1 Polygonprisma
2 Detektorblende (Lochblende)
3 Fotodetektor
4 Optik
5 Filter
6 halbdurchlässiger Spiegel
7 Probe (Objekt)
8, 11 optisches System (Strahlaufweitung, Fokussierung, Strahlablenkung)
9, 10 Laser
12 halbdurchlässiger Spiegel
13 Analog/Digitalwandler
14 Rechner
15 Bildausgabegerät
16 Verstelleinheit (elektromechanisch)
17 optoelektronisches System
18 Okular
19 halbdurchlässiger Spiegel
20 Kondensor
21 Leuchte

Claims (14)

1. Verfahren zur Lichtrastermikroskopie hoher Informations­ gewinnung von Objektstrukturen, bei dem das Objekt nach­ einander punktförmig vorzugsweise von einem Laser kurzer Wellenlänge beleuchtet wird und das von jedem beleuchte­ ten Objektbereich ausgehende Licht von einem optoelektro­ nischen Wandler mit vorgeschalteter Blende aufgenommen und zur Bilddarstellung genutzt wird, dadurch gekennzeich­ net, daß das von dem einzelnen beleuchteten Objektbereich ausgehende Licht hinsichtlich seiner Intensitätsverteilung in der Bildebene in einer oder mehreren Richtungen konti­ nuierlich oder in kleinen diskreten Schritten gemessen wird, aus der Intensitätsverteilung charakteristische Größen wie die Gesamtintensität, die Lage, Größe von Ex­ trema und/oder die Breite von Peaks bestimmt und von ei­ nem Rechner verarbeitet werden, daß der Meßvorgang bei rechnergesteuerter Rasterung des Objektes von Punkt zu Punkt wiederholt wird und die jeweils erhaltenen charak­ teristischen Größen der Intensitätsverteilung zur Bild­ darstellung genutzt werden.

2. Verfahren und Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die charakteristischen Größen und/oder deren mathematische Verknüpfung zur Grauwertdifferenzierung des Bildes des Objektbereiches genutzt werden und zum Vergleich mit be­ kannten Verfahren durch Bildung des Integrals der Inten­ sitätsverteilung zur Gewinnung von Rasterbildern des Ra­ stermikroskopes vom Typ I oder durch Ermittlung der Höhe des Intensitätsmaximums in der Strahlachse zur Gewinnung von Rasterbildern des Rastermikroskopes vom Typ II heran­ gezogen werden.

3. Verfahren und Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegung des Objektes oder des Strahles oder beider bei der Abrasterung des Objektes in Stufen oder bei höhe­ ren Geschwindigkeiten kontinuierlich erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Intensitätsverteilungen von Streustrahlungen gemessen werden, deren Wellenlängen infolge von inelastischen Wechselwirkungen der einfallenden Strahlung mit dem Ob­ jekt verändert sind, z. B. Fluoreszenz- oder Raman­ strahlung.

5. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem abbildenden optischen System (4) und der Blende (2) des optoelektronischen Wandlers (3) ein elektronisch steuerbares optisches Ablenksystem (1) befindet, das aus einer akustooptischen oder elektro­ optischen Zelle oder bei eindimensionaler Ablenkung vor­ zugsweise aus einem rotierenden Polygonprisma (1) besteht und daß die Blende (2), die sich in der Bildebene des ab­ tastenden Systems befindet und über die das Bild des je­ weils beleuchteten Objektbereiches gelenkt wird, eine Öffnungsweite hat, die kleiner ist als der Durchmesser des Bildes des Laserfokus auf dem Objekt.

6. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Polygonprisma (1) durch schwingende Ablenkelemente, wie z. B. lichtbrechende planparallele Körper oder Schwingspiegel ersetzt ist.

7. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Polygonprisma (1) durch einen gleichmäßig bewegten Drehspiegel ersetzt ist.

8. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polygonprisma zwecks 2D-Darstellung der Streulichtkurve eines Objektbereiches mit geringfügig in Richtung der Drehachse angeschrägten Prismenflächen versehen ist.

9. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ablenksystem, bestehend beispielsweise aus dem Polygonprisma (1), der Blende (2) und dem optoelektronischen Wandler (3), durch eine opto­ elektronische Empfängerzeile oder durch eine optoelek­ tronische Empfängermatrix ersetzt und die lichtempfind­ liche Empfängerfläche in der Bildebene des Objektberei­ ches senkrecht zur Strahlachse angeordnet ist.

10. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ablenksystem, bestehend beispielsweise aus dem Polygonprisma (1), die Blende (2) und der optoelektronische Wandler (3) durch eine TV-Auf­ nahmeeinrichtung, vorzugsweise mit Bildvorverstärker er­ setzt und die optoelektronische Wandlerfläche in der Bild­ ebene des Objektbereiches senkrecht zur Strahlachse an­ geordnet ist.

11. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Messungen von Streu­ strahlungen, deren Wellenlängen vom Objekt verändert sind, ein optisches Filter (5) oberhalb des halbdurchlässigen Spiegels (12) angeordnet ist.

12. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Strahlteiler im Strahlen­ gang des Laser angeordnet ist und die Teilstrahlen über optische Unterbrecher- und Umlenkvorrichtungen geführt sind, derart, daß das Mikroskop wahlweise im Auflicht oder im Durchlicht arbeitet.

13. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt oder der Strahlfo­ kus oder beide in Richtung der Achse des Abbildungssystems (z-Richtung) schrittweise zum Zwecke der Tiefenabtastung und rechnergesteuerten dreidimensionalen Bilddarstellung verschiebbar sind.

14. Anordnung für ein Lichtrastermikroskop nach Anspruch 5-13, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des abbildenden Systems ein halbdurchlässiger Spiegel (6) und ein Okular (18) für eine herkömmliche lichtmikroskopische Beobachtung des Objektes im Durchlicht angeordnet sind, wenn das Ob­ jekt (7) mittels der Leuchte (21), des Kondensors (20), des halbdurchlässigen Spiegels (19) für die Abbildung mittels der Optik (4) gleichmäßig beleuchtet wird.