JP2004531729A - 試料を画像化するための回転ステージ - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
発明の分野
この発明は、試料を画像化するための回転ステージと、試料の像を得る方法とに関する。この発明は、これに限定されるわけではないが、特に、光投射型断層撮影および3次元顕微鏡に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
光投射型断層撮影によってサンプルの3次元画像を生成するための光学画像化装置は、たとえば、米国特許第5,680,484号から公知である。この先行技術特許に開示される光学装置は、サンプルの一連のデジタル画像を異なる角度から撮る。これらの画像は、数学的変換を用いて3次元画像を復元するアルゴリズムへ送られる。米国特許第5,680,484号では、試料は、実質的に水平になるように2つの地点で支持される透明な管内に保持され、この管がステッピングモータおよび駆動ベルトを用いて回転されて、試料の別々の部分を画像化することが可能となる。管からの光屈折は信号品質に影響を及ぼし、管を用いることにより、画像化することのできる試料の大きさの上限が厳しく制限される。この先行技術特許に開示される装置は、この画像化技術の可能性のある用途に影響を及ぼすいくつかの制限を有し、特に、中空の円筒形の管にサンプルを入込むこと、およびサンプルの位置を調整することが難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
この発明の目的は、上述の問題のうち少なくともいくつかを克服する装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の概要
この発明の一局面に従って、複数の方向から試料を画像化するのに用いるための回転ステージが提供され、この回転ステージは試料支持手段を含み、この試料支持手段は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして画像化される試料を回転させるよう動作する回転可能部材を含み、この試料支持手段は、チャンバ内の光学画像化液に浸された試料を受取るために、固定画像化チャンバの上方に配置される。
【0005】
回転ステージは、別個の顕微鏡と、生物学的組織等の試料の3次元の画像化を可能にする、関連のハードウェアおよびソフトウェアと共に用いることができる。顕微鏡から間隔を空けて試料支持手段を配置することにより、試料ホルダへのアクセスが改善されるので、試料の位置決めを容易に調整することができる。細長い試料の場合、試料支持手段内に保持されるとき、試料の最長の軸は実質的に重力と平行である。これにより、一地点だけで試料を保持することが可能となり、さらに試料支持手段内で試料の配置を補助し、重力の作用により試料が撓むのを防ぐ。というのも、このような撓みにより試料の形状に望ましくない歪みが生じ、得られる画像の精度および解像度に影響を及ぼすおそれがあるからである。
【0006】
ステージの回転部分から固定チャンバを分けておくことにより、このチャンバの形状は回転対称形には制限されない。好ましくは、チャンバは少なくとも1つの平面を有し、この上に光が当たって試料を画像化する。欠陥またはうねりのない平坦な平面を用いること
により、確実に、光の屈折による画像の歪みを減ずる。チャンバは、透明な中空の直方体として形成され得、この直方体の2つの対向する側面が、それに沿って光が試料から放射される光軸に対して実質的に垂直となるように配置され得、これにより、広い断面積が光軸に呈示される。方形の断面を備えたこのようなチャンバを選択することにより、確実に、試料を通過する前に屈折される光の量が先行技術の円筒形の回転チャンバよりも実質的に減じられ、したがって画像品質が向上する。このチャンバの1つの壁または面は、所望の方法で光を屈折させるように形作られて、たとえば拡大効果をもたらし得る。
【0007】
回転ステージはさらに、レバー等の、回動するように装着される調整手段を含み得、そこから延在する差込みを有し、この差込みは、試料と係合して回転軸に対する試料の位置を変えるように、使用の際に、配置される。
【0008】
回転ステージはさらに、光が試料を照射した後にこの光を受取るよう位置付けられるプリズムを有し得、このプリズムは光を90°偏向するよう作用して、垂直な光軸を備えた顕微鏡がこの光を受取ることを可能にする。プリズムを用いることにより、顕微鏡に対する光路は真っ直ぐである必要がなく、このため既存の顕微鏡の変形例は、この発明に従った回転ステージとともに用いられる必要はない。
【0009】
試料支持手段の回転可能部材は、調整可能なプラットフォーム上で担持され得、水平軸に対するその位置は可変である。これにより、回転軸を光軸に対して調整することが可能となり、このため必要に応じて、光軸と回転軸との間が90°の角度に設定される。これは特に3次元の画像化に有用である。
【0010】
調整可能なプラットフォームは、好ましくは、光軸に対して回転部材を上げ下げできるように垂直に調整可能であるので、試料を下げて光の光路から出し入れすることが可能となる。
【0011】
好ましくは、回転可能部材は、回転可能部材の下方端部から試料を懸垂、懸架または垂下することができるように形成される。試料が磁化可能な金属マウントとともに適切に準備された場合、試料は、外れやすい固定ではなく磁力に依拠して、真っ直ぐに試料支持手段に取付けられる。これは有利なことである。というのも、典型的には、この試料は幾分小さくかつもろく、通常直径が1〜20mmの範囲であり、ねじ山を用いてホルダにこれら試料を固定することは複雑であるおそれがあるからである。
【0012】
この発明の別の局面に従って、試料の画像を得る方法が提供され、この方法は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして試料を回転させるステップを含み、この回転する試料は、固定光学チャンバ内で液体に浸される。
【0013】
この発明は、添付の図面に関連して、例示のために記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
詳細な説明
図1は、回転ステージ10と、回転ステージ10とは分かれている長作動距離または解剖顕微鏡12とを含む、OPTスキャナの形の光学画像化装置を示す。回転ステージ10は、支持部14、回動するよう装着されたレバー16、絞りおよび光学ディフューザ20、ならびに石英プリズム22を有する。支持部14、絞りおよび光学ディフューザ20、ならびにプリズム22は、一般的に直方体である透明チャンバ26またはキュベットを受けるためのホルダ25が固定されるのと同様に、ステージ10の基部24に固定される。キュベット26は、キュベット内に懸架される試料28を画像化するのに好適な光学特性
を有する液体を含み、適切な液体とは、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの混合物である。この装置は、明視野、暗視野および蛍光画像化のために用いることができるが、異なる角度で撮られた一連の画像から試料の3次元(3D)画像を作り出す場合、および、共焦点顕微鏡で画像化するには試料が大きすぎる場合には、特に適切である。
【0015】
光は、光軸29に沿って進み、絞りおよびディフューザ20の中心、さらに試料28を通過し、プリズム22により直角に偏向して、顕微鏡12の対物レンズ30に入る。顕微鏡が長い作動距離を有するので、プリズム22を顕微鏡の対物レンズ30の下に置くのに十分な空間を利用することができる。プリズムを用いることにより、垂直に配向された顕微鏡が試料を画像化することが可能となる。しかしながら、顕微鏡の対物レンズが光軸と平行である場合、プリズム22を省いてもよい。絞りおよびディフューザ20は、光源(図示せず)から進む光の量を制御して、試料28に達するようにし、かつ一様な照射をもたらす。
【0016】
支持部14は、その上に、軸90(図4)を中心にして回動するように装着される円形のボス、その上で上下にスライド可能な傾斜プレート33、プレート32を担持する。プレート32は、プレート32から水平に突き出る調整可能なプラットフォーム34を担持する。プラットフォーム34の角度は、傾斜アジャスタ36を用いて水平軸に対して変えることができ、プラットフォーム34の垂直位置は垂直アジャスタ40により変えることができる。ステッピングモータ42はプラットフォーム34上に装着され、モータの回転可能なモータシャフト44はこのプラットフォーム34にわたって延在する。磁石46(永久磁石または電磁石)は、シャフト44の下方端部に取付けられ、画像化されるべき試料28を担持する。試料を磁石に取付ける方法が、図5に関連して後に記載される。ステッピングモータ42は、0.9°刻みでシャフト44を回転させ、試料の最高400箇所の画像化位置を提供する。細長い試料28の一連のデジタル画像は、シャフト44をその連続回転位置に割出しし、こうして試料を連続回転位置に位置決めすることにより撮られるが、この間試料はキュベット26内に懸架され、このキュベットは固定されたままである。
【0017】
ステッピングモータ42を、その回転軸を垂直にして装着することにより、ロッド状の試料28は、その試料の制御された回転をもたらすためには、1つの地点、典型的にはその最上端部が固定されるだけでよい。試料28は磁石46により上方から支持されており、垂直アジャスタ40を用いてプラットフォームを下げることにより、液体に浸される。試料および回転軸のこの垂直な配向により、浸された試料に乾いたモータを接続するのに必要となるOリングまたは他の機械的配置を使用せずに済み、第2に、細長い試料は、重力と平行な主軸を有するので、重力によってその回転軸から逸れないことが確実となる。試料を垂直に配向させることにより試料に対する歪みの影響を回避することは、正確な3D画像を得るために、特により大きな試料にとっては、特に重要である。ほぼ直立の中空の直方体を試料28の周りの画像化チャンバ26として用いることにより、確実に、画像化液の表面積が制限され、液体の蒸発が減じられる。加えて、典型的には直径が1〜20mmのはるかに大きな試料は、このような固定されたチャンバを用いることにより、デジタル信号の品質を損なうことなく画像化され得る。
【0018】
使用の際に、デジタルカメラ52(図2)は顕微鏡12に取付けられる。このデジタルカメラ52は、光軸29に沿って伝わりかつチャンバと試料とを通って透過された光から顕微鏡によって画像化された試料のデジタル画像を生成する。一連のデジタル画像は試料を異なる角度から撮ったものであり、このデジタル情報は、数式を用いて試料の構造を3次元に復元するアルゴリズムに送られる。典型的には、これら画像は、図2に説明されるように、制御要素を用いて得られる。こうして、デジタル画像取得ソフトウェアを備えるコンピュータ50は、対象の試料から画像を受取る顕微鏡12に取付けられたデジタルカ
メラ52と双方向通信する。コンピュータ50は、顕微鏡12に取付けられるフィルタホィール56を制御して、検出される放射線の波長を変える。コンピュータ取得ソフトウェアは、デジタルカメラからの画像の取込みを制御するソフトウェア58、画像化ソフトウェア、回転ステージおよびフィルタホィールソフトウェアを制御するプログラム54、フィルタホィールを制御するソフトウェア48、ならびに画像ファイルを3D復元に変換するソフトウェア64として、図2に図示される。コンピュータは、回転ステージ10に接続される電子制御回路60とも双方向通信し、連続画像の画像取込み中に、必要に応じて、回路60を制御して試料の配向を調整する。デジタル画像が得られると、米国特許第5,680,484号に記載される分析と類似の態様で、64で処理されて、数学的処理を用いて試料の3D復元66を生成する。
【0019】
必要な場合、コンピュータは画像化プロセス全体を制御し、画像処理に取り掛かり、試料のサイズ、そのアライメント、焦点が合っているかどうか等を判断し、試料の位置を調整してから回転画像化を実行することができる。画像化プロセスをこのように完全に自動化することは、特に、多くのこのような装置を並行して実行する可能性のある大規模な遺伝子発現マッピングプロジェクトには望ましいことである。
【0020】
コンピュータに応答してステッピングモータ42を制御する回路60は、最も一般的なコンピュータシステムのために市販されている。回路60はコンピュータ50に接続しており、コンピュータ50からの信号に応答して種々の機械装置(ステッピングモータ、ソレノイド等)を制御する。
【0021】
試料の3D表示を作成するために、ソフトウェアは以下の機能を実行する。すなわち、(1)(互いに180°で撮られた各々の対の画像の間に存在する対称性によって)回転軸を決定し、(2)画像のスタックを再構成して、垂直なスタックの投影画像にし(この画像は、取込まれたすべての異なる角度から見える試料の単一の断面を呈示し)、(3)各投影画像上で数学的処理を行なって試料のその断面を再度作成し、(4)算出された断面の画像をすべて3D形式に組合わせる。透過光および蛍光放射光の両方から復元することができる。
【0022】
データ取得における一般的な装置およびその使用について記載したので、画像化装置のある構成要素を次により詳細に記載する。
【0023】
回転ステージ10の正面図が図3に示される。傾斜アジャスタ36は軸90を中心にしてプラットフォーム34の傾斜角を変える。この軸90は、シャフト44の下方端部より下にあり、かつ、ほぼ試料の高さにあるので、傾斜の調整によって試料が実質的に動くことはない。軸90は光軸29と交差し得る。(図3において両方向の矢印92により示される)傾斜調整により、ステッピングモータ42の回転軸94が光軸29に正確に垂直であることが確実となる。プラットフォーム34の傾斜を調整した後、基部24に対するプラットフォーム34の位置は、ラックアンドピニオン構成を用いて回転軸94の調整された方向にプラットフォーム34を上げ下げする垂直アジャスタ40を用いて調整される。垂直アジャスタ40を用いることにより、シャフト44の端部に取付けられる磁石上に担持される試料は、画像化のために所望の深さだけ画像化チャンバの中に下げられ、画像化が実行されると、チャンバから上げられ得る。画像化中の試料の垂直位置もまた、必要に応じてこのように変更し得る。シャフトが上げられた位置にある場合、試料を回転ステージに載せたりそこから降ろしたりすることができる。
【0024】
装置が設定されると、これを、顕微鏡の光軸がプリズムを通り画像化チャンバの中心を通過するように整列させる。しかしながら、高倍率では、試料が視野の中心から僅かにずれるので、アライメントを調整しなければならない可能性がある。上述の上下させる機構
を調整して、垂直方向へのこのずれを修正することができる。
【0025】
試料の画像化のほとんどは、回転軸を光軸に対してほぼ垂直にすることにより行なうことができるが、数学的処理を用いる試料の3D復元では、光軸と回転軸との間の角度が正確に90°でない限り、品質が極めて低くなるだろう。傾斜アジャスタ36は、角度を確実に正確に90°とするように、回転軸94を僅かに傾斜させることができる。傾斜アジャスタ36は、典型的には、ねじ機構に依拠してプラットフォーム34を一方側に圧迫する。較正サンプルを用いて傾斜の角度を調整する。この較正サンプルはいくらかの小粒子を含み、これら小粒子の軌道は、シャフトの回転中にコンピュータスクリーン上で監視され得る。回転軸が光軸に対して完全には垂直でない場合、粒子の軌道は、楕円形として現われる。シャフトが軸94を中心にして回転するときの光軸の図を示す図4(a)を参照されたい。この軸が正確に調整されると、図4(b)に示されるように、垂直な構成要素は動かずに、粒子が左右に動くのが見える。
【0026】
図5は、試料112に取付けられる金属円板110と、ステッピングモータ42の回転可能なシャフト44の下方端部に永久的に取付けられる円筒形の磁石46との間の磁力に依拠して用いられる磁気取付システムを示す。各試料は、試料の準備中に一方端に接着される小さな磁化可能な金属円板を有する。次いで、画像化が行なわれる際に円板が磁石に取付けられ、試料が磁力により円板と磁石との間で支持される。ディスク110および試料112は比較的軽いので、磁石はこれらの重量を支持するのに強く磁化される必要はない。たとえばねじ込みシステムに比べて磁石システムの1つの利点は、円板および試料のサイズが小さいので、鉗子またはピンセットで処理する必要がある点である。マウントまたは円板110は、磁石の上に鉗子でもって真っ直ぐに置かれるが、これをねじ込んで取付けるとそうはならない。別の利点は、磁石面120にわたってマウント110をスライドさせることにより、回転軸に対する試料の位置を容易に調整し得る点である。また、多くの試料は、予め円板に取付けられて準備され得、必要なときに画像化のための装置に迅速に取付けられ得る。
【0027】
サンプルの画像化のためにチャンバで用いられるある液体は、毒性があり、プラスチックに対して腐食性があり、この場合、試料は鉗子を用いると最適に処理される。さらに、磁気取付システムは、試料が磁石の下に保持されるだけでしっかりと取付けられるので、有利である。画像化の後に各試料を取除くことは同様に容易である。
【0028】
画像の解像度を最大限にするために、試料112における対象の領域122は、回転軸94を中心にして置かれる必要があり、すなわち、シャフトが回転しても動いてはならない。対象の領域または試料全体が回転画像の取込み中に中心から外れ、横方向に揺動する場合、これを視野に保持するのに必要な倍率は低くなるであろう。これは図6(a)に示される。2つの形状130および132は、その左右の最端の位置にある、回転中の試料112を示す。試料112が完全に中心に置かれると、図6(b)に示されるように、それ自体の軸でスピン回転する。これは視野にわたるより小さな幅を示し、したがって、図6(c)に示されるように、倍率を上げて、解像度がより高い画像を提供することができる。
【0029】
回転軸94に対する試料112の調整は、磁力で取付けることにより簡略化される。円板110に押し込むことにより、円板の中心が回転軸94に対してずれることがある。図5(a)では、試料112内の対象の領域122は、回転軸上の中心ではなく左方向にずらして置かれる。モータシャフトが180°回転する場合、対象の領域122は、図5(b)に示されるように、回転軸の右側に見える。磁石46は、取付けられたままで、これに沿って金属マウント110をいずれの方向にもスライドさせることを可能にするので、(図5(c)において矢印114により示されるように)レバー16により側方から押す
ことにより、図5(c)に示されるように、対象の領域122が回転軸の中心となるように試料を位置決めすることが可能となる。180°のさらなる回転により、図5(d)に示されるように、対象の領域を中心に留めたまま試料112全体が横方向に揺動することがわかる。このように、試料は、通常、コンピュータスクリーン上の回転する試料の画像を観察しつつ調整される。
【0030】
図1に示される画像化チャンバ26が、ここで、図7に関連してより詳細に記載される。画像化中に試料とともに回転しない固定された試料チャンバを有することにより、このチャンバは、米国特許第5,680,484号に記載されるシステムの場合と同様に、回転中に一定の光路を維持するために円筒形である必要はない。先行技術の管136と本発明で用いられるチャンバとの比較が図7に示され、図7(a)は(水平に懸架される)先行技術の円筒形の管136の断面図を示し、図7(b)はこの実施例で用いられるチャンバ26を示す。画像化チャンバ26は、一般的には直方体でかつ断面が正方形であるよう選択され、石英、ガラスまたは他の好適に透明な材料から作られる。各チャンバ/管は、試料の画像化を可能にする好適な光学特性を備えた液体143に浸される試料141を含む。チャンバ26の平坦な側部142、142′、144および144′により、画像の屈折歪みが減じられ、より大きな試料を画像化することが可能となる。これは、方形断面のチャンバの互いに平行な壁142および142′が光軸29に対して垂直に整列し、また、光の垂直入射が周辺の極めて小さな部分だけである円形の管136よりも、光の非屈折が生ずる画像化面積が大きいからである。こうして、サンプルから受取られる信号の量を改善し、屈折による歪みを減じて、チャンバ26に対して10mmを超える幅にわたり良質の画像を形成することができる。
【0031】
図7(c)は、図7(b)のサンプルチャンバの変形例を示す。図7(c)では、サンプルチャンバ26′は内周面が方形の断面を有するが、1つの壁140は、平凸レンズを備えるよう形作られてチャンバから出る光を屈折させる。このように形作ることにより、所望の屈折がもたらされ、図7(c)の場合、拡大効果が得られる。
【0032】
図1に示されるレバー16が、ここで、図8に関連してより詳細に記載され、図8は図1の線VIII−VIIIに沿った平面図を示す。図8(a)は、レバー16が通常の位置にあり、磁石46および金属の試料マウント110から押し出されるのを示す。試料が(示されるように)一方に過度にずれた場合、ピボット164を中心にしてレバー16を動かすことができ、これにより、差込み166が金属マウント110と係合して、試料を正確な位置へと押す(図8(b))。これは、試料の位置をコンピュータスクリーン上で監視しながら行なわれる。手動のスイッチによりステッピングモータを慎重に制御することができるので、回転中の試料の軌道を監視することができ、試料が一方の最端部にある場合モータを停止させることができる。次いで、試料が、レバー16を用いて中心に置かれ、光軸に対する試料のアライメントが完了するまでこのプロセスが続けられる。レバー16は、試料に「減速された」動きをもたらすように構成され、これにより調整を制御しやすくする。
【0033】
ピボット164はメインモータステージに取付けられる。これは支持部によってステージに固定され、これにより、差込み166が、金属マウントに接触するよう磁石のすぐ下の正確な高さにあることが確実となる。このように、差込み166は、試料を画像化するために選択される高さに関係なく、正確な高さにとどまる。
【0034】
この明細書中に記載される装置は、生物学的試料と物性物理学等の他の分野からの試料との上で、いかなる目的にも応じた、3D顕微鏡とさらに回転顕微鏡とにも好適である。
【0035】
3D顕微鏡法を行なう場合、屈折率は試料全体を通じて均一であるべきである。生物学
的組織については、これは、清浄溶剤に試料を浸すことにより容易に達成される。試料は、金属マウント上に直接接着され得るか、またはそれ自体がマウントに付着されるアガロース等の透明基材のブロックに埋め込まれ得る。次いで、清浄溶剤が、ブロックおよび試料に浸透する。BABB(ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの混合物)は溶剤として好適である。
【0036】
その屈折率を均一にすることができないか、または透明ではない試料については、依然としてこの技術は有用である。(たとえ3Dの形状全体が凸状でないとしても)断面がすべて凸状である対象物の3Dの表面の形状を、その回転シルエットから、再び正確に作り出すことができる。
【0037】
装置の生データが有用であるいくつかの適用例がある。一連の画像は回転する対象物(すなわち、試料)の動画に変換され得る。数個の静止2D画像からよりも、3D対象物の回転中に見える形状のほうがさらにより把握しやすい(多くの3D復元計画は、それらの結果をモデル回転の動画として提示する)。
【0038】
この装置は、画像化後に他の分析のためにこの試料を用いることを可能にしつつ、生物学的組織において遺伝子発現パターン(RNAおよび/またはタンパク質分布)の3Dマッピングを行なうのにも好適である。この装置を用いての試料の画像化は、比較的迅速であり、約20分で済む。対照的に、本物の組織切片を準備、埋め込み、区分け、装着、染色およびデジタル化するには何日もかかり、これにより何百ものデジタル2D部分が生成されるが、元々の3Dの形状を再び作り出すのに互いにこれらを整列させるための保証された方法はない。この組織切片は大いに伸びる傾向があるので、たとえこの切片すべてを互いに適合させて3Dの形状を作り出したとしても、最終結果は元々の試料の形状を正確には反映しないだろう。しかしながら、この装置を用いて得られる結果は、試料の実際の物理的形状に極めて類似しており、物理的な切片との唯一の違いは解像度が低いことである。この装置により生成されるデータは、純粋に3Dであるので、実際にはいかなる配向にも切除することができるか、または3Dにすることができる。
【0039】
回転ステージの変形された構成が図9に示され、図1にそれぞれ対応する部分には同様の参照番号が付される。図9の回転ステージでは、ステッピングモータ42の位置の3次元の調整が、3つの第2のステッピングモータ150、152および154を用いることにより達成される。モータ42に対する傾斜アジャスタは存在しない。代わりに、プリズムが、横断水平軸23を中心とした制御された傾斜により手動で調整され得る。モータ150および154は重要なステッピングモータである。モータ152は、手動の垂直アジャスタ40と置換えることができる。
【0040】
第2のステッピングモータ150、152および154により、x、yおよびzと明示される配向に沿って第1のステッピングモータ42の3Dの位置をサブミクロン精度で調整することが可能となる。これらのステッピングモータ150、152および154は、第1のモータ42を制御する同じコンピュータによって制御される。これは、コンピュータ50がモータ駆動回路156により4つのモータを駆動する図10に示される。この文書では、z軸は光軸29と平行であると考えられる。この軸に沿った移動により、システムの焦点が効果的に変更される。他の2つの軸に沿った移動により、試料のどの部分が光軸29の中心と一致するかが変更される。
【0041】
3つの第2のモータ150、152および154によるコンピュータ制御の並進運動は、以下の利点を有する。
【0042】
1) 試料の対象の領域(ROI)を、顕微鏡の視野内で中心に維持することが可能と
なる。これは2つの方法で達成される。
【0043】
(a) ROIは、顕微鏡の焦点深度内に維持される。
【0044】
(b) x軸に沿った、ROIの「横方向」の揺動運動を制限する。
【0045】
これらの2つの利点により、このような機構を有さないシステムに比べて解像度がはるかに高い画像化が可能となる。
【0046】
2) 図1および図8のレバーおよび差込みシステムより正確である。
【0047】
3) (レバーおよび差込みシステムとは違い)コンピュータによって完全に制御され得るので、ROIをソフトウェア内で「画面上」と容易に規定し得る。
【0048】
4) コンピュータがROIのための正確な3D座標を算出することを可能にする。
【0049】
5) 同じ試料内の異なるスキャンが3D空間において互いに関連し合うことを可能にする。
【0050】
6) コンピュータが、より高倍率でのより小さな領域の多重自動スキャンから、大きな試料の高解像度スキャンを構成することを可能にする(「タイリング」または「パッチング」として公知である)。
【0051】
視野内でROIを維持するための、コンピュータ制御によるx移動およびz移動は、以下のように算出される。
【0052】
第1に、ソフトウェアは以下の位置を算出する必要がある。
【0053】
(a) 視野に対する第1のステッピングモータ42の回転軸。
【0054】
(b) 第1のステッパの回転軸に対するROI。
【0055】
これらの2つの位置は1つの動作から算出され得る。全回転中に、ROIがカメラの視野内にとどまるのに十分な程度に倍率が低く設定される。このシステムは、x−ステッピングモータに対していくつのパルスが、コンピュータスクリーン上の画素で測定されるような所与の変位に対応するかが分かるように、予め較正される。この関係は各倍率に対して決定される。次いで、コンピュータは、(図11(a)から図11(c)に示されるように)0°、90°、180°および270°に回転される、試料の4つの画像をユーザに呈示する。図11(a)では、各々の外側の長方形がコンピュータスクリーン上の画像化ウィンドウを表し、スポットが試料の対象の領域122を表す。
【0056】
図11(b)は、低倍率のための(コンピュータスクリーン上に示されるように)光軸に沿った図を示し、図11(c)は、回転軸94に沿った平面図を示す。次いで、ユーザはコンピュータマウス(または同等物)を用いて、ROIが各画像のどこにあるかを示す。
【0057】
図12は、位置決めシステムが、xディメンジョンおよびzディメンジョンの両方向にステッピングモータ42をどれだけ動かし得るかと、したがって、中心から外れたROIをどれだけ補償し得るかとを示す。モータ42のx移動およびz移動をコンピュータによって制御して、ROI122が固定位置にとどまり、有効な回転軸を中心にして回転する
ことを確実にする。
【0058】
図11(a)、図11(b)、および図11(c)では、
χ1は、ステッピングモータユニットに変換される、0°でのROIのx−位置である。
【0059】
χ2は、ステッピングモータユニットに変換される、180°でのROIのx−位置である。
【0060】
χwは、ステッピングモータユニットに変換される、画像化ウィンドウの幅である。
【0061】
平均値χ1およびχ2により、画像化ウィンドウ(χs)に対するステッピングモータの回転軸の位置(χs)が提供される。Z1およびZ2の平均値により、この位置の第2の概算値が提供される(χs=(χ1+χ2+Z1+Z2)/4)。画像化ウィンドウ内でステッピングモータの回転軸を中心に据えるのに必要とされるx−変位(x-displacement)は、次のとおりである。
【0062】
X-displacement(χd)=χw/2−(χ1+χ2+Z1+Z2)/4
これは図13(a)および図13(b)に示される。
【0063】
図13(a)および図13(b)では、顕微鏡は図の下方向から試料を見ている。したがって、視野の端が2つの実質的に平行な線として現われ、これにより、見ることのできる範囲が示される。この視野の中心である光軸は、図13(a)において垂直な点線として示される。
【0064】
図13(b)は、0°の回転位置で試料を示す(α=0)。前述の測定値(χ1、χ2、Z1、Z2)から、第1のステッピングモータの回転軸からのROIのx距離とz距離とを容易に算出することができる。回転位置(角度α)が0である場合、χα0はx−距離である(χα0=(χ1−χ2)/2)。同様に、Zα0は、αが90°およびαが270°で得られる2つの測定値から算出することができる(Zα0=(Z1−Z2)/2)。次いで、ROIの位置をデカルト座標から極座標へ変換することができ、ここでは、αが0°である場合、Dはステッピングモータ軸からのROIの距離であり、θは光軸に対するその線(またはそれと平行な線)の角度である。
【0065】
D=(χα02+Zα02)の平方根 θ=tan-1(χα0/Zα0)
ここでは、第1のステッピングモータのいかなる回転位置(α)に対しても、第2のxzステッピングモータの移動によりROIを光軸上に位置づけることができ、全体の変位(XtおよびZt)は次のように算出される。
【0066】
χt=χd+D.sin(α+θ),および Zt=D.cos(α+θ)
1つのOPT復元からサンプリングされる領域の3−D形状は、円形の断面を有する実質的に円筒形であり、その回転対称軸は、画像化中に用いられる有効回転軸であり、その直径および長さは視野の幅および高さによって表される。我々は、デカルト座標と極座標とを交互にして試料内の位置を表すことができ、画素のサイズを試料内の実際の距離と関連づけることができるので、同じ試料から得られた他のスキャンに対する、サンプリングされた円筒形の位置と形状とを容易に算出することができる。
【0067】
2−D画像化では、高解像度の画像は、しばしば、対象物の小領域の多くの画像を高倍率で撮り、その後これらのより小さな画像を一緒につなぎ合わせることによって構成される。これは、しばしば、「タイリング」または「パッチング」として公知である。コンピ
ュータ制御のXYZステージにより、同じ方策を3−DのOPT画像化に適用することが可能となる。
【0068】
上述のように、OPTスキャンからのサンプル領域は、断面が円形である円筒形である。図14は、軸94に沿って見下ろした平面図において、試料160が、1つのスキャン162で低解像度でいかに画像化され得るか、または代替的に、試料内の各位置が少なくとも1つのサンプル領域内に含まれるように7つの高解像度スキャン170を位置決めすることによりいかに画像化され得るかを示す。個々のサンプル領域は断面が円形であるので、大きな領域を覆うための1つの効率的な配置は、スキャンを六角形に配置して、隣接するスキャンの間を僅かに一部重ね合わせることである。試料のy−軸に沿った別々の位置もまた、y−軸のステッピングモータを用いてサンプリングされ得る。
【0069】
このタイリングプロセスはコンピュータにより完全に制御および実行され得る。
【0070】
1つのスキャンでその全体が画像化されるすべての試料については、最適なサンプル領域の位置は、上述のように、ROIを識別するユーザを必要とすることなく自動的に算出され得る。単純な画像処理により、以下のように、アライメントプロセス中にテスト画像内に試料の輪郭または中心を見出すことができる。
【0071】
1) 倍率を低く設定する(コンピュータ制御の顕微鏡を用いて自動的に設定され得る)。
【0072】
2) 0°、90°、180°および270°の回転で4つの画像を撮る。
【0073】
3) 各画像のヒストグラムを算出して、背景と試料を区別するための好適なしきい値レベルを決定する。
【0074】
4) 各画像における試料の重心の位置を算出する。
【0075】
5) 上述のように、これらの位置をROI測定値として用いる。
【0076】
6) 次に続くいかなる回転中にも新たに変位をもたらす。
【0077】
7) 倍率を上げる。
【0078】
8) 4つの回転する画像を撮り、倍率が高過ぎるか(すなわち、試料の端部が視野の外側にあるか)どうかを判断する。
【0079】
9) 試料が依然として視野内にある場合、ステップ4に戻る。
【0080】
10) 試料の端部が視野の外側にある場合、倍率を以前の値に減ずる。
【0081】
11) 試料をスキャンする。
【0082】
図1または図9の回転ステージにおいて用いることのできる平行照射手段が、図15および図16に示される。
【0083】
レーザまたは他の光源172を、焦点合わせ手段(屈折レンズ174または屈折鏡)とともに用いて、すべての光線が実質的に光軸と平行である光のビーム176を生成する。図15には、回転ステージの残りの部分に関連してこの装置が示され、この例では、x方
向およびz方向へのそれぞれの、コンピュータ制御による調整のための2つのステッピングモータ150および154が備えられる。垂直方向の調整は、垂直アジャスタ40により手動で行なわれる。レンズ22は、軸23を中心にして傾斜調整することができる。
【0084】
実験の結果、光軸と非平行な試料に入射する照射光は、その結果にノイズを生じさせることが明らかである。すべての照射光線が光軸と平行である平行光源は、この問題を緩和し、その結果、画像化の品質を上げる。
【0085】
図17では、波長フィルタ178が、光源180と試料28との間の或る位置に配置される。これは、手動または自動で光路に位置決めされ得る一連の異なったフィルタからなってもよく、各々は、異なった範囲の波長の透過を可能にする。または、これは電子的に調節可能なフィルタであってもよい。
【0086】
代替的には、2つの電子的に調節可能な液晶フィルタを蛍光画像化のために用いて、照射光と検出された光との両方の波長を制限することができ、この可能性は、光検出器184の2Dアレイの前に配置される第2の電気的に制御されたフィルタ182によって示される。
【0087】
所与の化学物質は、異なる効率で別々の波長を吸収するだろう。これらの違いは、(広範囲の波長に対する吸収を説明する)スペクトルとして示すことができる。ほとんどの試料は、別々の化学物質のさまざまな空間分布を含むので、異なった試料は、異なった波長(または波長の組合せ)を用いて最適に画像化される。上述のフィルタシステムにより、所与の試料を画像化するのにどの波長を用いるかをユーザが変更することが可能となる。
【0088】
同様に、蛍光化学物質は、これらを励起する異なった波長の効率を説明する1つのスペクトルと、蛍光で放射される大量の異なった波長を説明する第2のスペクトルとを有する。2つの電子的に制御されたフィルタを用いることにより、励起と発光との可能な組合せのために、(少なくとも)2−Dパラメータ空間が発生する。このようなシステムにより、最適な組合せを調査することで異なった化学物質を識別することが可能となる。これにより、生物医学的サンプルの3−D組織構造を、特定の染色を必要とせずに画像化することが可能となる。
【0089】
この発明に従った回転ステージはプリズム22を含む必要がなく、またこの回転ステージが標準の垂直式の顕微鏡とともに用いられる必要もないことが理解される。図18は、図15の構成の変形例を示す。(図15に相当する部分が同じ参照番号を示す)図18では、チャンバ26から発する光は顕微鏡の光学素子およびデジタルカメラに入射し、顕微鏡の対物レンズ30と試料との間に短い作動距離を与える。
【0090】
この試料は、シャフト44によって担持される並進運動ステージを用いることにより位置決めされ得る。この並進運動ステージは、x方向およびz方向への手動またはコンピュータ制御による調整を有する。
【図面の簡単な説明】
【0091】
【図1】顕微鏡と組合わせたこの発明に従った、回転ステージを含む光学画像化装置を示す斜視図である。
【図2】デジタル画像を得る際にこのような画像化装置がどのように制御されるかを示す概略図である。
【図3】装置の正面斜視図である。
【図4(a)】装置の最適な作動構成を示すのに用いられる概略図である。
【図4(b)】装置の最適な作動構成を示すのに用いられる概略図である。
【図5(a)】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図5(b)】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図5(c)】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図5(d)】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図6(a)】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図6(b)】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図6(c)】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図7(a)】管を含む先行技術の試料を示す断面図である。
【図7(b)】この発明で用いられる2つの試料チャンバを示す図である。
【図7(c)】この発明で用いられる2つの試料チャンバを示す図である。
【図8(a)】試料の位置を調整するための回動するように装着されたレバーの使用を示す、図1の線VIII−VIIIに沿った部分的平面図である。
【図8(b)】試料の位置を調整するための回動するように装着されたレバーの使用を示す、図1の線VIII−VIIIに沿った部分的平面図である。
【図9】この発明に従った変形された光学画像化装置の斜視図である。
【図10】図9の装置を示す図である。
【図11(a)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図11(b)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図11(c)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図12(a)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図12(b)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図13(a)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図13(b)】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図14】図9の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図15】図1または図9の装置において用いることのできる平行照射手段を示す図である。
【図16】図1または図9の装置において用いることのできる平行照射手段を示す図である。
【図17】図1または図9の光学ステージにおける光源から波長を選択する方法を示す図である。
【図18】図16に示される装置の変形例を示す図である。
Claims (22)
- 複数の方向から試料を画像化するのに用いるための回転ステージであって、前記回転ステージは試料支持手段を含み、この試料支持手段は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして画像化される試料を回転させるよう動作する回転可能部材を含み、前記試料支持手段は、チャンバ内の光学画像化液に浸された試料を受取るために、固定画像化チャンバの上方に配置される、回転ステージ。
- 前記画像化チャンバは、光軸に対して垂直な少なくとも1つの平面を有する、請求項1に記載の回転ステージ。
- 試料によって放射される光を受取るために光軸上に位置決めされるプリズムを含み、前記プリズムは、光を90°偏向するよう作用して、垂直な光軸を備えた顕微鏡によってこの光が受取られることを可能にする、請求項1または2に記載の回転ステージ。
- 前記プリズムは、水平軸を中心とした位置に調整可能であり、この水平軸は、同様に水平である光軸と直交する、請求項3に記載の回転ステージ。
- 前記回転可能部材は、光軸に対して垂直な水平調整軸を中心として回転軸を調整するために位置が調整可能である、請求項1から4のいずれかに記載の回転ステージ。
- 前記水平調整軸は、前記回転可能部材の下方端部より下にあって、いずれの水平な調整でも試料の並進運動を最小限にすることを確実にする、請求項5に記載の回転ステージ。
- 前記回転可能部材は、回転軸と整列する方向に沿った並進運動により調整可能であり、これにより、試料を回転ステージへ載せたりまたはそこから降ろしたりすることのできる下がった動作可能位置と上がった動作不能位置との間で、前記試料支持手段を移動させることが可能となる、請求項1から6のいずれかに記載の回転ステージ。
- 前記回転可能部材は、位置調整可能なプラットフォーム上に装着されるステッピングモータの出力シャフトである、請求項1から7のいずれかに記載の回転ステージ。
- 前記回転可能部材の下方端部は、前記回転可能部材の下方端部から試料を懸垂、懸架または垂下することができるように形成される、請求項1から8のいずれかに記載の回転ステージ。
- 前記回転可能部材は、その下方端部またはその近くに、磁力により試料の取付を解放可能にするための磁気部材を有する、請求項9に記載の回転ステージ。
- 前記試料支持手段は、回転軸に対して試料を正確に位置決めするための試料位置決め手段を含む、請求項1から10のいずれかに記載の回転ステージ。
- 前記試料位置決め手段は、ステージに回動するように装着され、かつ、試料の最終的な位置決めを得るために装着された試料を押すよう動作するレバーを含む、請求項11に記載の回転ステージ。
- 前記試料位置決め手段は、回転軸に対して垂直な面における、2つの互いに垂直な方向に沿った、前記回転可能部材のコンピュータ制御による調整のための2つの電気モータを含む、請求項11に記載の回転ステージ。
- 前記試料位置決め手段は、前記回転可能部材により担持される2次元の並進運動ステージの調整のための、手動またはコンピュータ制御の調整手段を含み、前記並進運動ステージは、回転軸に対して垂直な面において2つの互いに垂直な方向への調整をもたらす、請求項11に記載の回転ステージ。
- 光のビームを生成するための平行光源を含み、すべての光線は、光軸と実質的に平行であり、使用の際に試料を照射する、請求項1から14のいずれかに記載の回転ステージ。
- 試料を照射する光の波長を制限するための波長フィルタを含む、請求項1から15のいずれかに記載の回転ステージ。
- 2つの波長フィルタ、すなわち、試料を照射する光の波長を制限するための第1のフィルタと、検出前に試料から発する光の波長を制限するための第2のフィルタとを含む、請求項1から15のいずれかに記載の回転ステージ。
- 光投射型断層撮影スキャナの一部を形成する、請求項1から17のいずれかに記載の回転ステージ。
- 試料の画像を得る方法であって、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして試料を回転させるステップを含み、回転する試料は固定光学チャンバ内の液体に浸される、方法。
- 前記回転軸は光軸に対して垂直である、請求項19に記載の方法。
- 前記試料は、回転可能部材の下方端部から懸垂、懸架または垂下される、請求項19または20に記載の方法。
- 光軸に沿って見て、回転軸上にはない一部の試料の軌道を監視するステップと、軌道の形が楕円形ではなく直線となるまで調整軸を中心にして試料を傾斜させるステップとを含む、請求項19から21のいずれかに記載の方法。
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