DE60121477T2

DE60121477T2 - Vorrichtung und verfahren zum auffangen von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60121477T2
Application number: DE60121477T
Authority: DE
Inventors: c/o Instruments T. Hitachinaka-shi SAKURAI; Hitachi T. c/o Instruments Hitachinaka-shi YOKOBAYASHI
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: US8183054B2; JP4081468B2; EP1374997B1; KR20030078897A; JP3663207B2; US20040122222A1; EP1374997A4; US20110015381A1; JP3619514B2; DE60121477D1; JP2004290211A; EP1374997A1; JP2005110687A; WO2002078847A1; KR100505380B1; JPWO2002078846A1; WO2002078846A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Auffangen von Nucleinsäuren und insbesondere ein Instrument, das Nucleinsäuren von einer Nucleinsäure enthaltenden biologischen Probe aufsammelt. Die vorliegende Erfindung betrifft speziell ein Instrument zum Aufsammeln in einer biologischen Probe enthaltener Nucleinsäurekomponenten in Form endogener oder exogener Gene von Humoralkomponenten, wobei die aufgefangenen Nucleinsäurekomponenten für die genetische Diagnose verwendet werden.
STAND DER TECHNIK
Eine Reihe in der Molekularbiologie erreichter Durchbrüche hat zu einer großen Vielzahl von Genomtechniken geführt, wodurch ermöglicht wurde, dass eine große Anzahl krankheitsinduzierender Gene separiert und identifiziert wurde. In diesem Zusammenhang wurden molekularbiologische Techniken bei der Diagnose und Untersuchung auf dem medizinischen Gebiet eingeführt, wodurch nicht nur ermöglicht wurde, dass eine Diagnose, die in früheren Jahren nicht implementiert werden konnte, erfolgreich vorgenommen werden konnte, sondern auch der Zeitaufwand (in Tagen) für eine Untersuchung erheblich verringert wurde.
Dieser schnelle Fortschritt wurde in erster Linie dank Nucleinsäure-Amplifikationstests ("nucleic-acid amplification testing" – NAT), insbesondere der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR technique: Saiki u.a., Science, 239, 487–491 (1988)) gemacht. Weil die PCR-Technik ermöglicht, dass Nucleinsäuren in einer Lösung sequenzspezifisch amplifiziert werden, kann beispielsweise die Existenz eines Virus, von dem nur eine Spurenmenge im Serum enthalten ist, indirekt bewiesen werden, indem die Nucleinsäuren, die Gene des Virus sind, amplifiziert und detektiert werden.
Die Verwendung der PCR-Technik ist jedoch bei an klinischen Einrichtungen vorgenommenen Routineuntersuchungen mit einigen Problemen verbunden. Um diese Probleme anzusprechen, sei insbesondere bemerkt, dass der Nucleinsäure-Extraktions- und Reinigungsprozess bei der Vorverarbeitung wichtig ist (Ohshima u.a., JJCLA, 22(2), 145–150 (1997)). Diese Probleme werden durch Inhibitoren induziert, die beispielsweise als Hämoglobin in Blut und eine beim Extraktionsprozess verwendete oberflächenaktive Substanz bekannt sind, welche beim Nucleinsäure-Reinigungsprozess nicht entfernt werden konnten. Der Extraktionsprozess erfordert einen für die Technik notwendigen mühsamen Arbeitsgang und einen großen Aufwand von Experten ausgeführter Arbeit. Aus diesem Grund behindert dieser Prozess die Neueinführung des genetischen Testens in Krankenhauslaborräume, und es ist sehr erwünscht, diesen Prozess zu automatisieren.
Ähnlich wird in Institutionen, in denen molekularbiologische Forschung ausgeführt wird, Plasmid-DNA gemeinhin als eine Substanz verwendet, die für die genetische Rekombination eingesetzt wird, und es ist dabei in Hinblick auf die Arbeitseinsparung auch erwünscht, die Nucleinsäureextraktions- und Reinigungsprozesse zu automatisieren.
Ein bekanntes Verfahren zum Auffangen von Nucleinsäuren aus einer biologischen Probe, die Nucleinsäuren in hoch gereinigter Form ohne Inhibitoren enthält, schließt das Verfahren ein, bei dem die Nucleinsäuren in einer solchen Weise aufgefangen werden, dass eine oberflächenaktive Substanz veranlasst wird, bei Vorhandensein von Protease auf die biologische Probe einzuwirken, wodurch die Nucleinsäuren separiert werden, mit Phenol (und Chloroform) gemischt wird, eine Wässrige-Phase-organische-Phase-Separation mehrere Male in einer Zentrifuge ausgeführt wird und die Nucleinsäuren in Form einer Ausscheidung aus der Wasserphasenprobe durch Hinzufügen von Alkohol aufgefangen werden. Es ist jedoch das Problem aufgetreten, das darin besteht, dass dieses Präparationsverfahren ein organisches Lösungsmittel, wie Phenol, eine giftige Substanz, in dem Prozess oder dem Zentrifugationsprozess benötigt oder dass die Automatisierung des Ladens von Gefäßen in die Zentrifuge bzw. des Entladens von Gefäßen aus der Zentrifuge und des Abgebens einer zentrifugierten Lösung sehr schwierig ist.
In JP 268 0462 A ist offenbart, dass Siliciumoxidteilchen, die bei Vorhandensein einer chaotropen Substanz in der Lage sind, an die Nucleinsäuren zu binden, als eine feste Phase zum Binden von Nucleinsäuren verwendet werden. Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren, bei dem Nucleinsäuren so eingesammelt werden, dass eine Nucleinsäuren enthaltende Probe in ein Reaktionsgefäß mit einer Siliciumoxidteilchensuspension und einer Guanidinthiocyanatpufferlösung als chaotrope Substanz gegeben wird und diese vermischt werden, ein Komplex, der aus den an die Siliciumoxidteilchen gebundenen Nucleinsäuren besteht, unter Verwendung einer Zentrifuge ausgefällt wird, überstehende Flüssigkeit entfernt wird, eine Reinigungsflüssigkeit zur Reinigung dem verbleibenden Komplex hinzugefügt wird, der erneut ausgefällte Komplex in einer Ethanolwasserlösung gereinigt und weiter mit Aceton gereinigt wird, Aceton aus dem Komplex entfernt wird und schließlich ein Elutionspuffer nach dem Trocknen dem Komplex hinzugefügt wird, um die Nucleinsäuren zu eluieren.
In JP-A 250681/1995 verwendet das Verfahren zum Reinigen einer DNA-Extraktionsflüssigkeit ein Patronengefäß mit einem vierfach strukturierten Filterelement, bei dem eine Glaspulverschicht zwischen zwei Glasfaserfilter und Membranfilter eingefügt ist. In JP-A 250681/1995 wird die zu reinigende Probe in solcher Weise extrahiert, dass eine präparierte DNA enthaltende Kultur vorverarbeitet und auf einen Einfangfilter pipettiert wird und dann ein Elutionsreagens zugegeben wird, um Plasmid-DNA von einer Zelle zu eluieren. Bei dem Reinigungsprozess werden die zu reinigende Probe und Natriumiodid in das Patronengefäß eingebracht, und es wird eine Vakuum-Druckabsenkung oder -Zentrifugation auf das Patronengefäß angewendet, um die Plasmid-DNA an der Glaspulverschicht zu absorbieren. Als nächstes wird eine Reinigungspufferlösung dem Patronengefäß zugegeben, eine Vakuum-Druckabsenkung oder -Zentrifugation zur Reinigung angewendet und dann ein Elutionspuffer dem Patronengefäß zugegeben und wieder eine Vakuum-Druckabsenkung oder -Zentrifugation angewendet, um die Plasmid-DNA zu eluieren.
Abgesehen davon sind in JP-A 266864/1999 ein Verfahren und ein Instrument zum Reinigen von Nucleinsäuren unter Verwendung einer Nucleinsäure-Aufnahmespitze, worin sich eine Siliciumoxid enthaltende feste Phase befindet, offenbart. Bei diesem Verfahren wird die Nucleinsäure-Aufnahmespitze abnehmbar an einer beweglichen Düse zum Ansaugen bzw. Abgeben von Flüssigkeit befestigt, eine Mischung einer Substanz zum Beschleunigen der Bindung der Nucleinsäuren an die feste Phase und einer Nucleinsäure enthaltenden Probe in die Nucleinsäure-Aufnahmespitze, die an der beweglichen Düse angebracht ist, aspiriert, um Flüssigkeit aus dem gegebenen Gefäß anzusaugen bzw. in dieses abzugeben, die Flüssigkeit von der Nucleinsäure-Aufnahmespitze abgegeben, nachdem die Nucleinsäuren an die feste Phase gebunden haben, dann eine Reinigungsflüssigkeit aspiriert und abgegeben, um das Innere der Nucleinsäure-Aufnahmespitze zu reinigen, und schließlich ein Eluent in die gereinigte Nucleinsäure-Aufnahmespitze aspiriert, um den Eluenten, der die von der festen Phase eluierten Nucleinsäuren enthält, in das gereinigte Probengefäß abzugeben.
Bei dem vorstehend erwähnten Stand der Technik kann bei dem Verfahren, das in JP-A 268 0462 offenbart ist, die Verwendung von Phenol, einer giftigen Substanz, vermieden werden, der Zentrifugationsprozess ist jedoch erforderlich, um die an die Nucleinsäuren gebundenen Siliciumoxidteilchen von der Lösung zu trennen, wobei es sich, wie im Fall eines phenolbasierten Extraktionsverfahrens, um ein Problem beim Automatisieren des Zentrifugationsprozesses handelt.
Bei dem in JP-A 250681/1995 offenbarten Verfahren ermöglicht das Einbringen des Patronengefäßes, bei dem eine Glaspulverschicht zwischen zwei Glasfaserfilter und Membranfilter eingefügt ist, das Ersetzen des Vakuumzentrifugationsprozesses durch den Vakuum-Druckabsenkungsprozess, der als ein geeignetes Automatisierungsverfahren bezeichnet werden kann, wenngleich die Strömung der Lösung auf eine Richtung beschränkt ist, wodurch die Wirksamkeit beim Kontaktieren der Plasmid-DNA oder des Elutionspuffers mit der Glaspulverschicht verringert wird, wodurch wiederum die Auffangwirksamkeit beeinträchtigt wird.
Weiterhin ist bei dem in JP-A 266864/1999 offenbarten Verfahren die Nucleinsäure-Aufnahmespitze, die intern eine feste Phase aufweist, abnehmbar an der beweglichen Düse zum Ansaugen bzw. Abgeben von Flüssigkeit angebracht, um zu erzwingen, dass die Lösung in beide Richtungen fließt, und die Kontaktwirksamkeit zwischen den Nucleinsäuren oder dem Elutionspuffer und den festen Phasen ist verbessert, wodurch die Automatisierung erleichtert wird. Es wurden Konfigurationsbeispiele der Nucleinsäure-Aufnahmespitze beschrieben, jedoch keine anderen bevorzugten Gebrauchsarten.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Instrument und ein Verfahren zum schnellen und einfachen Auffangen von Nucleinsäuren mit hoher Zuverlässigkeit aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe und insbesondere ein Instrument und ein Verfahren, die geeignet sind, um in einer biologischen Probe enthaltene Nucleinsäurekomponenten aufzufangen, bereitzustellen.
Weiterhin besteht eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Instrument und ein Verfahren bereitzustellen, die geeignet sind, um automatisch Nucleinsäuren aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe und insbesondere in der biologischen Probe enthaltene Nucleinsäuren aufzufangen.
Diese Aufgabe wird durch das Instrument und die Vorrichtung, die in Anspruch 1 definiert sind, und durch das in Anspruch 10 definierte Verfahren gelöst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleinsäure-Aufnahmespitze jedes Mal dann, wenn die zu verarbeitende Probe gewechselt wird, durch eine neue ersetzt. In jedem der Schritte 2a, 2b, 3a, 4 und 5 werden die Vorgänge des Abgebens der aspirierten Lösung in ein gegebenes Gefäß und des Aspirierens der abgegebenen Lösung in die Nucleinsäure-Aufnahmespitze wiederholt, um einen Kontakt der Lösung mit der festen Phase mit hoher Wirksamkeit zu gewährleisten. Es sei bemerkt, dass, weil Fehlfunktionen, wie erzeugte Blasen und ein erhöhter Ansaugwiderstand während des Ansaugvorgangs auftreten, wenn die Gesamtmenge der Lösung beim Abgeben in den Schritten 2a und 2b abgegeben wird, es bevorzugt ist, die Schritte so zu steuern, dass die feste Phase stets die Lösung berührt, ohne dass die Gesamtmenge der Lösung abgegeben wird.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt eine Nucleinsäure-Aufnahmespitze, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.
2 ist eine Draufsicht der Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.
3 zeigt einen schematischen Überblick der in 2 dargestellten Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung.
4 ist ein Blockdiagramm eines elektrischen Systems gemäß der in 2 dargestellten Ausführungsform.
5 zeigt einen Spender mit der in der in 2 dargestellten Ausführungsform angebrachten Nucleinsäure-Aufnahmespitze.
6 zeigt den Vorgang des Anbringens der Spitze an einer Düse gemäß der in 2 dargestellten Ausführungsform.
7 zeigt den Vorgang des Entfernens der Spitze von einer Düse gemäß der in 2 dargestellten Ausführungsform.
8 zeigt eine Graphik des Ergebnisses von Modus 1 gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
9 zeigt eine Graphik des Ergebnisses von Modus 1 gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Für eine Nucleinsäure enthaltende Probe können beliebige Proben eines lebenden Körpers, wie Blut, Serum, Sputum und Urin, biologische Proben, wie kultivierte Zellen und kultivierte Bakterien, und Nucleinsäuren enthaltende Substanzen, die in einem Gel enthalten sind, das einer Elektrophorese unterzogen wurde, oder Nucleinsäuren, wie Reaktionsprodukte eines DNA amplifizierenden Enzyms oder grob gereinigte Nucleinsäuren, verwendet werden. Es sei bemerkt, dass die hier erwähnten Nucleinsäuren Desoxyribonucleinsäuren (DNA) und Ribonucleinsäuren (RNA) mit einer Doppelstrangstruktur, einer Einzelstrangstruktur, einer Teil-Doppelstrangstruktur oder einer Teil-Einzelstrangstruktur einschließen.
Für die in der Nucleinsäure-Aufnahmespitze eingeschlossene feste Phase können beliebige Substanzen oder Produkte verwendet werden, die Siliciumoxid in der Art von Glasteilchen, Siliciumoxidteilchen, Quarzfilter und ihre zerbrochenen Körner, Siliciumoxidwolle und Diatomit oder Produkte, wie Kunststoffe, deren Oberflächen mit Siliciumoxid beschichtet sind, enthalten. Es ist notwendig, dass die feste Phase während ihrer Verwendung in der Spitze gehalten wird und so angeordnet wird, dass sich Wasserströmungsbereiche in der Spitze befinden können, wobei die Wasserströmungsbereiche vorzugsweise eine zusammenhängende Form annehmen. In Bezug auf die Form der festen Phase sei bemerkt, dass sie porös, körnig oder faserig sein kann, wobei das mittlere Intervall zwischen den festen Phasen in den Wasserströmungsbereichen im Fall einer porösen Substanz die mittlere Größe ihrer Poren bedeutet, während es im Fall einer körnigen oder faserigen Substanz das mittlere Intervall zwischen den Körnern oder den Fasern bedeutet, wobei in beiden Fällen das mittlere Intervall 25 μm nicht überschreitet. Die gewünschte feste Phase gemäß der vorliegenden Erfindung ist Siliciumoxidwolle, und es wird vorzugsweise ein aufnehmendes Material aus gesinterten Siliciumoxidteilchen auf beiden Seiten davon angeordnet, um das mittlere Intervall zwischen den als feste Phase verwendeten Siliciumoxidwollfasern zu steuern.
Es sei bemerkt, dass das mittlere Intervall zwischen den Siliciumoxidwollfasern, das hier erwähnt wird, das mittlere Intervall zwischen den als zylindrisch angenommenen Siliciumoxidwollfasern, das gebildet wird, wenn sie gleichmäßig in einem Raum angeordnet sind, angibt, wobei ihre Größe in Abhängigkeit vom Volumen, vom Querschnitt und von der Länge des Raums, in dem die Siliciumoxidwollfasern angeordnet sind, und vom Gewicht, von der relativen Dichte und vom mittleren Durchmesser der Siliciumoxidwollfasern bestimmt ist.
Falls beispielsweise der Raum, in dem sich die Siliciumoxidwollfasern befinden, eine zylindrische Form mit einem Radius von 1,5 mm aufweist und der Abschnitt, in dem sich die Fasern befinden, eine Länge h aufweist, kann das mittlere Intervall I zwischen den Siliciumoxidwollfasern unter der Annahme, dass die relative Dichte der Fasern 2,22 g/cm³ ist, der mittlere Radius der Fasern 4,5 μm ist und ihr Gesamtvolumen 5 mg ist, nach der folgenden Formel berechnet werden: I [m] = 5,04 × 10–4 h1/2 – 9,0 × 10–6.
Für das Instrument, das dazu dient die Nucleinsäure-Aufnahmespitze zu zwingen, die Lösung durch Ändern des ausgeübten Drucks zu aspirieren und abzugeben, kann ein beliebiges Instrument, einschließlich einer Handpipette oder -spritze, jedoch ohne Einschränkung auf diese, verwendet werden, vorausgesetzt, dass es eine Form aufweist, die zu einem Ende der Nucleinsäure-Aufnahmespitze passt, und so betätigt werden kann, dass eine Druckänderung ausgeübt wird, wenngleich es bevorzugt ist, dass es mit einer automatischen Vorrichtung kombiniert wird, weil die Menge der aspirierten Lösung, die Menge der abgegebenen Lösung, die Sauggeschwindigkeit, die Abgabegeschwindigkeit und andere Faktoren gesteuert werden müssen, um die Nucleinsäuren stabil aufzufangen.
Für das in Schritt 1 zu verwendende Reagens kann ein beliebiges von jenen verwendet werden, welche die Trennung der Nucleinsäuren von der Nucleinsäuren enthaltenden Probe beschleunigen können, die Verwendung von Reagenzien mit einer hohen Viskosität ist jedoch nicht wünschenswert. Zusätzlich ist es, wenn die aufgefangenen Nucleinsäuren RNA sind, bevorzugt, dass ein RNase Inhibitor hinzugefügt wird oder Guanidinthiocyanat verwendet wird, um zu verhindern, dass Ribonuclease (RNase) reagiert.
Für das in Schritt 2a zu verwendende Reagens können beliebige von jenen, die die Bindung der Nucleinsäuren an die Siliciumoxid enthaltende feste Phase beschleunigen können, und ein Reagens, das im Allgemeinen als ein chaotropisches Reagens bezeichnet wird, verwendet werden. Wenn die aufzufangenden Nucleinsäuren RNA sind, ist es aus dem gleichen Grund wie in Schritt 1 bevorzugt, dass Guanidinthiocyanat verwendet wird, und seine Endkonzentration beträgt weiter vorzugsweise 3 mol/l oder höher, und sein endgültiger pH-Wert gibt eine Azidität an.
Für das in Schritt 3a zu verwendende Reagens können beliebige von jenen verwendet werden, die die Substanz entfernen können, welche in der Lage ist, die Bindung der Nucleinsäuren an die feste Phase zu beschleunigen, die in Schritt 2 verwendet wird, während ihre Bindung an die feste Phase aufrechterhalten wird, und es ist das Verfahren bekannt, bei dem als ein Reagens Ethylalkohol oder Isopropylalkohol mit einer Konzentration von 70% oder höher verwendet wird, es wurde jedoch gezeigt, dass diese Substanzen eine nachteilige Wirkung in Fällen haben können, in denen die aufgefangenen Nucleinsäuren bei Verfahren, wie PCR, verwendet werden. Es ist daher bevorzugt, dass sie bei einer möglichst niedrigen Konzentration verwendet werden, damit sie ihre intrinsische Funktion behalten. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird aus den vorstehend erwähnten Gründen 50%iger Ethylalkohol, der 25 mmol/l Kaliumacetat enthält, verwendet.
Für das in Schritt 4 zu verwendende Reagens können beliebige von jenen verwendet werden, die den in Schritt 3 verwendeten Alkohol entfernen können, während die Bindung der Nucleinsäuren an die feste Phase so stabil wie möglich gehalten wird, es muss jedoch vermieden werden, das in Schritt 3 verwendete Reagens zum letzten Schritt zu übertragen. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden aus dem vorstehend erwähnten Grund 50 mmol/l Kaliumacetat bei einer Temperatur von 20°C oder niedriger verwendet.
Für das in Schritt 5 zu verwendende Reagens können beliebige Substanzen verwendet werden, die die Nucleinsäuren von der festen Phase lösen, und es ist das Verfahren bekannt, bei dem eine niedrige Konzentration einer Salzlösung oder deionisiertes Wasser verwendet wird. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden 10 mmol/l Bicin (pH-Wert 8,5) und 0,1 mmol/l EDTA verwendet.
[Beispiel]
Nun wird mit Bezug auf 1 das Instrument zum Auffangen der Nucleinsäuren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
1 zeigt die Konfiguration der Nucleinsäure-Aufnahmespitze. Das obere Ende der Nucleinsäure-Aufnahme spitze 31 hat einen Innendurchmesser, der es ermöglicht, dass das obere Ende hermetisch an die Spitze einer Verbindungsdüse der Vorrichtung zum Erzeugen einer Druckänderung oder eine automatische Vorrichtung angepasst wird, wobei die Nucleinsäure-Aufnahmespitze so geformt ist, dass ihr Innendurchmesser allmählich zum unteren Ende abnimmt. Die Nucleinsäure-Aufnahmespitze 31 besteht aus einem transparenten oder halbtransparenten Kunstharz. An der scharfen Seite der Spitze 31 sind scheibenförmige Blockierelemente 101a und 101b zum Verhindern, dass die feste Phase ausläuft, und zum Begrenzen des mittleren Intervalls zwischen den festen Phasen durch Einpressen der Spitze 31 von ihrem oberen Ende angeordnet, so dass die feste Phase 102 sandwichförmig dazwischen angeordnet ist, wodurch ermöglicht ist, dass die festen Phasen 102 das gegebene mittlere Intervall einhalten. Diese Blockierelemente 101a und 101b haben eine große Anzahl von Poren, durch die eine Flüssigkeit oder ein Gas leicht hindurchtreten kann, und sie haben eine Größe, durch die das Auslaufen der festen Phase 102 blockiert werden kann.
Als ein Material für die Blockierelemente 101a und 101b werden Siliciumoxidteilchen mit einer Größe von etwa 0,1 mm verwendet, die zu einer Form gesintert sind, welche an einem gegebenen Punkt in einen Innendurchmesser der Nucleinsäure-Aufnahmespitze 31 passen kann.
Für die feste Phase werden 5 mg Siliciumoxidwollfasern (Toshiba Chemical, Grade B, Durchmesser: 6–12 μm). verwendet.
Als nächstes wird mit Bezug auf die 2 bis 7 eine Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung beschrieben, die in Kombination mit der Nucleinsäure-Aufnahmespitze verwendet wird.
In den 2 und 3 hat die Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung 100 zwei Arme 16 und 33, die sich horizontal (in X-Richtung) bewegen können. An einem Arm 16 ist ein eine Abgabedüse 36 (6) tragender Düsenhalter 17 so angeordnet, dass er sich horizontal (in Y-Richtung) entlang dem Arm 16 bewegen kann. An dem anderen Arm 33 ist ein eine bewegliche Flüssigkeitsabgabedüse 39 (5) tragender Düsenhalter 34 so angeordnet, dass er sich horizontal (in Y-Richtung) entlang dem Arm 33 bewegen kann. Beide Düsenhalter 17 und 34 können sich vertikal (in Z-Richtung) in Bezug auf ihre entsprechenden Arme 16 und 33 bewegen. Weil der horizontale Bewegungsbereich des Arms 16 denjenigen des Arms 33 teilweise überlappt, sind die Arme in unterschiedlichen Höhen angeordnet.
Auf der Arbeitsebene 5 eines Hauptkörperstands sind drei Spitzengestelle 14a, 14b und 14c, an denen jeweils eine große Anzahl nicht verwendeter Abgabespitzen 15 angebracht ist, in einem gegebenen Bereich aufgestellt. Wie in 6 dargestellt ist, haben diese Spitzengestelle 14 Bohrungen, in die individuelle Abgabespitzen 15 eingefügt sind, wobei die Spitzengestelle 14 eine Kastenform mit einer solchen Höhe aufweisen, dass die Spitzen nicht in Kontakt mit der Arbeitsebene 5 oder dem Boden des Spitzengestells gelangen. Die individuellen Spitzengestelle 14a, 14b und 14c können bis zu 48 Abgabespitzen 15 tragen.
Zusätzlich ist auf der Arbeitsebene 5 ein Spitzengestell 30, an dem eine große Anzahl nicht verwendeter Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 angebracht ist, in einem gegebenen Bereich angeordnet. Das Spitzengestell 30 hat die gleiche Form wie die vorstehend beschriebenen Spitzengestelle 14. In diesem Beispiel können bis zu 48 Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 von dem Spitzengestell 30 getragen werden.
Auf der Arbeitsebene 5 sind Probengestelle 12, die mehrere Probengefäße 13 mit einer zu verarbeitenden Probe, nämlich der Nucleinsäuren enthaltenden Probe, tragen, in einem gegebenen Bereich aufgestellt. In diesem Beispiel können die individuellen Probengestelle 12 sechs Probengefäße 13 tragen. Alternativ können die individuellen Probengestelle 12 acht oder mehr Probengefäße tragen.
Zusätzlich sind auf der Arbeitsebene 5 Gefäßgestelle 23, die eine große Anzahl nicht verwendeter Verarbeitungsgefäße 24 tragen, in einem gegebenen Bereich aufgestellt. Die Gefäßgestelle 23 können bis zu 48 nicht verwendete Verarbeitungsgefäße 24 tragen. Abgesehen davon, sind auf der Arbeitsebene 5 die eine große Anzahl nicht verwendeter Reinigungsgefäße 26 tragenden Gefäßgestelle 23 in einem gegebenen Bereich aufgestellt. Diese Reinigungsgefäße werden verwendet, um die Nucleinsäuren enthaltenden gereinigten Lösungen für jede Probe aufzufangen. In diesem Beispiel können die Gefäßgestelle 25 bis zu 48 Reinigungsgefäße 26 tragen.
Auf der Arbeitsebene 5 sind eine Flüssigkeitsaufnahmeeinheit 11, die während des Primings von den Abgabedüsen 36 abgegebenes Wasser aufnimmt und als eine Ausgangsposition für die Abgabedüsen 36 wirkt, eine Reinigungseinheit 18 zum Reinigen der Abgabespitzen 15 zur Abgabe der Lösung, eine Spitzenabnahmevorrichtung 27 zum Abnehmen der an den Abgabedüsen 36 angebrachten Abgabespitzen 15 und der an beweglichen Flüssigkeitsansaug-/abgabedüsen 39 angebrachten Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31, eine Flüssigkeitsaufnahmeeinheit 28, die von den beweglichen Flüssigkeitsansaug-/abgabedüsen 39 während des Primings abgegebenes Wasser aufnimmt und als eine Ausgangsposition für die beweglichen Düsen 39 wirkt, und ein Abwasserauslass 29 zum Abgeben von den Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 abgegebenen Abwassers angeordnet.
Zusätzlich sind an den individuellen gegebenen Posi tionen auf der Arbeitsebene 5 eine in Schritt 3a verwendete dritte Reagensflasche 19, eine in Schritt 5 verwendete fünfte Reagensflasche 20, eine in Schritt 1 verwendete erste Reagensflasche 21, eine in Schritt 4 verwendete vierte Reagensflasche 102, eine in Schritt 2a und 2b verwendete zweite Reagensflasche 22 und andere aufgestellt.
Eine in 6 dargestellte Spritzenpumpe 10 und eine in 5 dargestellte Spritzenpumpe 32 sind getrennt auf dem Hauptkörperstand angeordnet, und jede von ihnen steuert individuell die Vorgänge des Aspirierens und des Abgebens von Flüssigkeit. Wie in 6 dargestellt ist, stehen die von den Düsenhaltern 17 getragenen Abgabedüsen 36 über einen flexiblen Schlauch 42 in Verbindung mit einer Flüssigkeit abgebenden Spritzenpumpe 10. Deionisiertes Wasser wird in die Abgabedüsen 36 und den Schlauch 42 gefüllt, und die Spritzenpumpe 10 wird mit einer nicht dargestellten Quelle deionisierten Wassers verbunden. Wie in 5 dargestellt ist, sind die von den Düsenhaltern 34 getragenen beweglichen Düsen 39 über einen flexiblen Schlauch 35 mit der Spritzenpumpe 32 verbunden. Deionisiertes Wasser wird in die beweglichen Düsen 39 und den Schlauch 35 gefüllt, und die Spritzenpumpe 32 wird mit einer nicht dargestellten Quelle deionisierten Wassers verbunden.
Das Anbringen der Abgabespitzen 15 an den Abgabedüsen 36 und das Anbringen der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 an den beweglichen Düsen 39 wird durch Absenken der individuellen Düsen erreicht, bis ihre Spitzen in die Düsenspitzen an ihren zugeordneten Spitzengestellen 14 und 30 passen. Zum Abnehmen der Abgabespitzen 15 von den Abgabedüsen 36 und der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 von den beweglichen Düsen 39 wird die Spitzenabnahmevorrichtung 27 verwendet. Wie in den 2 und 7 dargestellt ist, weist die Spitzenabnahmevorrichtung 27 ein Plattenelement in einer gegebenen Höhe auf, in dem ein Schlitz 55 mit einer Breite ausgebildet ist, die kleiner ist als die Außendurchmesser der Köpfe 52 der Abgabespitzen 15 und der Köpfe 54 der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 und größer ist als die Außendurchmesser der Abgabedüsen 36 und der beweglichen Düsen 39. Wenn sich die Köpfe 52 und 54 der Spitzen an niedrigeren Positionen befinden als der Schlitz 55, werden die Düsen 36 und 39 horizontal bewegt, so dass sie in den Schlitz eintreten, und die Düsenhalter 17 und 34 werden angehoben, so dass die Köpfe 52 und 54 in Kontakt mit dem Boden des Plattenelements gelangen, und weiter angehoben, so dass sie die Spitzen 15 und 31 herunter schieben. Die von den Düsen herunter geschobenen Spitzen fallen in den Spitzenabgabeauslass 50 (2) und werden in einem nicht dargestellten Auffangkasten aufgefangen.
4 zeigt die Konfiguration eines elektrischen Systems des Nucleinsäure-Aufnahmeinstruments in 2. Mit einem als Betriebssteuereinrichtung dienenden Personalcomputer (PC) 60 sind eine Tastatur 61 zum Bereitstellen eines Steuerpults, von dem Betriebsbedingungen und Probeninformationen eingegeben werden, ein Bildschirm 62, der als eine Anzeigevorrichtung zum Anzeigen eingegebener Informationen, Warninformationen und anderer Informationen dient, eine Mechaniksteuereinrichtung 65 zum Steuern individueller mechanischer Systeme der Instrumente und andere Vorrichtungen verbunden. Die Mechaniksteuereinrichtung 65 steuert einen Schrittmotor 71 zum Antreiben eines Kolbens, der bewirkt, dass die Spritzenpumpe 10 Flüssigkeit aspiriert und abgibt, einen Schrittmotor 72 zum Antreiben eines Kolbens, der bewirkt, dass die Spritzenpumpe 32 Flüssigkeit aspiriert und abgibt, einen Schrittmotor 73, der bewirkt, dass sich die Düsenhalter 17 vertikal und horizontal bewegen, einen Schrittmotor 74, der bewirkt, dass sich die Düsenhalter 34 vertikal und horizontal bewegen, einen AC-Servomotor 75 zum horizontalen Bewegen des Arms 16, einen AC-Servomotor 76 zum horizontalen Bewegen des Arms 33 und andere Vorrichtungen. Die einzelnen Teile des Instruments zur Reinigung werden entsprechend einem gegebenen Programm betrieben.
Bei Verwendung der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen mit unterschiedlichen mittleren Intervallen zwischen den zu verwendenden festen Phasen, wie in 1 dargestellt ist, wird nachstehend ein experimentelles Beispiel für das Auffangen von DNA des Hepatitis-C-Virus (HCV) in Serum unter Verwendung der in 2 dargestellten Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung beschrieben. Die zu verarbeitende Probe wurde so präpariert, dass 100 IU/ml HCV in dem HCV-negativen Serum von dem mit dem WHO International Standard gewerteten Sekundärstandard-HCV-positiven Serum erreicht werden konnten, und sie wurde dann in die in 2 dargestellten Proben gefäße 13 abgegeben. Der automatische Betrieb der in 2 dargestellten Vorrichtung ermöglichte es, dass der Arm 16 und die Düsenhalter 17 die Abgabespitzen 15 befestigten und dass 200 μl der Probe aus den Probengefäßen 13 aspiriert wurden und in die Verarbeitungsgefäße 24 abgegeben wurden. Nachdem die Probe abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die verwendeten Abgabespitzen 15, wobei die Wirkung der Spitzenabnahmevorrichtung 27 ausgenutzt wurde. Dann befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch neue Abgabespitzen 15, und es wurden 700 μl des ersten Reagens aus der ersten Reagensflasche 21 aspiriert und in die Verarbeitungsgefäße 20 abgegeben, von denen die Probe abgegeben wurde, und die Flüssigkeit wurde fünf Mal aspiriert und abgegeben, und die gesamte Flüssigkeitsmenge wurde in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben und 10 Minuten stehen gelassen. Es sei bemerkt, dass für das erste hier beschriebene Reagens eine MES-(2-Morpholino-ethansulfonsäure, Dojin Chemical Laboratories, Inc.)-Pufferlösung verwendet wurde, die 2% Triton X-100 (LKB) und 5,5 mol/l Guanidinthiocyanat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., für den biochemischen Gebrauch) enthält.
Nachdem die Flüssigkeit abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Nachdem eine gegebene Zeit verstrichen war, brachten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 neue Abgabespitzen 15 an, wurden 100 μl des zweiten Reagens von der zweiten Reagensflasche 22 aspiriert und in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben, wobei die Mischung aus der Probe und dem ersten Reagens eingefüllt wurde, und die Flüssigkeit wurde fünf Mal aspiriert und abgegeben, und es wurde dann die Gesamtmenge der Flüssigkeit in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben. Es sei bemerkt, dass für das zweite hier beschriebene Reagens ein MES-(Dojin Chemical Laboratories, Inc.)-Puffer verwendet wurde, der 1 Triton X-100 (LKB) und 5,0 mol/l Guanidinthiocyanat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., für den biochemischen Gebrauch) enthält.
Mittlerweile haben der Arm 33 und die Düsenhalter 34 die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 befestigt, und die Mischung aus der Probe, dem ersten Reagens und dem zweiten Reagens wurde durch die Spritze 32 aus dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert.
Nachdem die Mischung aspiriert worden war, wurde die aspirierte Mischung bis zu dem Flüssigkeitsniveau hinauf, bei dem die Mischung das Blockierelement 101b auf der Oberseite der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 nicht überschritt, in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben, und die Mischung wurde dann bis zu dem Flüssigkeitsniveau hinab, bei dem die Mischung das Blockierelement 101a an der Unterseite der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 nicht überschritt, aspiriert. Nachdem diese Ansaug-/Abgabevorgänge zehn Mal wiederholt worden waren, wurde die Gesamtmenge der Mischung aus dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert, und es wurde dann Luft bis zu dem Flüssigkeitsniveau aspiriert, bei dem die Mischung das Halteelement 101a nicht überschritt. Dann bewegten sich unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34 die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 zum Flüssigkeitsaufnahmegefäß 29, gaben die aspirierte Mischung bis zu dem Flüssigkeitsniveau ab, bei dem die Mischung das Halteelement 101b nicht überschritt, und es wurde auf die nächste Betätigung gewartet.
Mittlerweile haben der Arm 16 und die Düsenhalter 17 neue Abgabespitzen 15 befestigt, wurden 800 μl des zweiten Reagens von der zweiten Reagensflasche 19 aspiriert und wurde die Gesamtmenge des Reagens in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben. Nachdem das Reagens abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Mittlerweile wurden unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34 die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 bewegt, das zweite Reagens in der gleichen Weise wie die Mischung fünf Mal aspiriert und abgegeben, die Gesamtmenge der Mischung von dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert und Luft bis zu dem Flüssigkeitsniveau aspiriert, bei dem die Mischung das Halteelement 101a nicht überschritt. Dann bewegten sich, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 zum Flüssigkeitsaufnahmegefäß 29 hin, gaben das aspirierte zweite Reagens bis zu dem Flüssigkeitsniveau ab, bei dem das zweite Reagens das Halteelement 101b nicht überschritt, und es wurde auf die nächste Betätigung gewartet.
Mittlerweile befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die neuen Abgabespitzen 15, wurden 400 μl des dritten Reagens aus der dritten Reagensflasche 19 aspiriert und wurde die Gesamtmenge des dritten Reagens in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben. Nachdem das dritte Reagens abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Mittlerweile bewegten sich unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34 die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31, wurde das dritte Reagens in der gleichen Weise wie die Mischung drei Mal aspiriert und abgegeben und wurde der erste Reinigungsvorgang angewendet. Nachdem der erste Reinigungsvorgang beendet worden war, wurde die Gesamtmenge der Mischung aus dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert, und es wurde dann Luft bis zu dem Flüssigkeitsniveau aspiriert, bei dem die Mischung das Halteelement 101a nicht überschritt. Dann bewegten sich, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 zum Flüssigkeitsaufnahmegefäß 29 hin und gaben die Gesamtmenge des Reagens ab, und es wurde auf die nächste Betätigung gewartet.
Mittlerweile befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 die neuen Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 15, wurden 800 μl des dritten Reagens aus der dritten Reagensflasche 19 aspiriert und wurde die Gesamtmenge des dritten Reagens in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben.
Es sei bemerkt, dass für das hier beschriebene dritte Reagens 25 mmol/l Kaliumacetat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., spezielle Reagensklasse) enthaltendes 50%iges Ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., spezielle Reagensklasse) verwendet wurde.
Nachdem das dritte Reagens abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 die verwendeten Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Mittlerweile wurden, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 bewegt, wurde das dritte Reagens drei Mal aspiriert und abgegeben und wurde der zweite Reinigungsvorgang angewendet. Nach Abschluss des Reinigungsvorgangs wurde die Gesamtmenge der Mischung aus dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert, und es wurde dann Luft bis zu dem Flüssigkeitsniveau aspiriert, bei dem die Mischung das Halteelement 101a nicht überschritt. Dann bewegten sich, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 zum Flüssigkeitsaufnahmegefäß 29 hin, gaben die Gesamtmenge des aspirierten dritten Reagens ab und aspirierten dann 1 ml Luft zehn Mal an der gleichen Position und gaben diese ab, und es wurde schließlich auf die nächste Betätigung gewartet.
Der vorstehend beschriebene Vorgang in Bezug auf das dritte Reagens wurde noch einmal wiederholt. Es sei bemerkt, dass dieser Reinigungsvorgang bei Bedarf weiter wiederholt werden kann.
Nachdem der Vorgang mit dem dritten Reagens abgeschlossen worden war, befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die neuen Abgabespitzen 15, aspirierten 200 μl des vierten Reagens aus der vierten Reagensflasche 102 und gaben die Gesamtmenge des aspirierten vierten Reagens in das Verarbeitungsgefäß 24 ab.
Es sei bemerkt, dass für das hier erwähnte vierte Reagens 50 mmol/l Kaliumacetat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., spezielle Reagensklasse) verwendet wurden.
Nachdem das vierte Reagens abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Mittlerweile wurden, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 bewegt, und das vierte Reagens wurde drei Mal aspiriert und abgegeben, um die feste Phase zu spülen. Nach Abschluss des Spülvorgangs wurde die Gesamtmenge der Flüssigkeit aus dem Verarbeitungsgefäß 24 aspiriert, und es wurde dann Luft aspiriert, und die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 bewegten sich, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, zum Flüssigkeitsaufnahmegefäß 29, gaben die Gesamtmenge der Flüssigkeit ab, aspirierten 1 ml Luft zehn Mal an der gleichen Position und gaben diese ab, und es wurde auf die nächste Betätigung gewartet.
Nach dem Spülvorgang mit dem vierten Reagens befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die neuen Abgabespitzen 15, wurden 60 μl des fünften Reagens aus der fünften Reagensflasche 20 aspiriert und wurde die Gesamtmenge des aspirierten fünften Reagens in das Verarbeitungsgefäß 24 abgegeben.
Es sei bemerkt, dass für das hier erwähnte fünfte Reagens ein 0,1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (Nippon Gene Co., Ltd., zur Verwendung bei der gentechnischen Forschung) enthaltender 10 mmol/l Bicin-(Dojin Chemical Laboratories, Ltd.)-Puffer (pH-Wert 8,5) verwendet wurde.
Nachdem das fünfte Reagens abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27. Mittlerweile wurden, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 bewegt, das fünfte Reagens wurde zwanzig Mal aspiriert und abgegeben, und die Nucleinsäuren wurden eluiert. Nachdem die Nucleinsäuren eluiert worden waren, wurde die Gesamtmenge der Flüssigkeit von den Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 abgegeben. Nachdem die Flüssigkeit abgegeben worden war, wurden, unter der Steuerung des Arms 33 und der Düsenhalter 34, die verwendeten Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27 entfernt. Mittlerweile befestigten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 automatisch die neuen Abgabespitzen 15, aspirierten die Gesamtmenge des Eluenten aus dem Verarbeitungsgefäß 24 und dann eine kleine Luftmenge, und die Abgabespitzen 15 wurden, unter der Steuerung des Arms 16 und der Düsenhalter 17, zum Gefäß 26 der gereinigten Probe bewegt, und die Gesamtmenge des aspirierten Eluenten wurde davon in das Gefäß 26 der gereinigten Probe abgegeben. Nachdem die Probe abgegeben worden war, entfernten der Arm 16 und die Düsenhalter 17 die verwendeten Abgabespitzen 15 durch die Spitzenabnahmevorrichtung 27.
Die gleichen Schritte wie die vorstehend erwähnten wurden unter Verwendung der Nucleinsäure-Aufnahmespitzen mit verschiedenen mittleren Intervallen zwischen den Siliciumoxidwollfasern ausgeführt, welche hergestellt wurden, indem die Menge der von den Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 aspirierten festen Phase 102 konstant gehalten wurde und der Abstand zwischen dem Halteelement 101a und dem Halteelement 101b geändert wurde.
Die aufgefangenen Proben wurden unter Verwendung der Reagenzien COBAS AMPLICOR (Roche) und COBAS AMPLICOR HCV v 2,0 (Roche) beurteilt. 48,5 μl jeder aufgefangenen Probe, 41,7 μl HCV Master Mix v 2,0, 8,3 μl HCV Manganese-Reagens und 1,5 μl HCV Internal Control v 2,0 l wurden gemischt, der Vorgang wurde entsprechend dem Prozedurdokument ausgeführt, das mit einem Reagenskit angeliefert wurde, und eine HCV-Analyse wurde an den aufgefangenen Proben ausgeführt. Das Ergebnis der Analyse ist in 8 dargestellt.
Wie 8 entnommen werden kann, nimmt das Ausgangs-Absorptionsvermögen von COBAS AMPLICOR im Verhältnis zu den aufgefangenen HCV-Proben derselben Konzentration ab, wenn das mittlere Intervall zwischen den festen Phasen zunimmt. Dies bedeutet, dass, wenn das mittlere Intervall zwischen den festen Phasen anstieg, die Mengen der aufgefangenen HCV-Proben abnahmen, was nahe legt, dass in dem Fall, in dem das mittlere Intervall 21 μm beträgt oder größer ist, die Auffangwirksamkeit merklich abnehmen kann. Es sei bemerkt, dass, weil das Absorptionsvermögen von COBAS AMPLICOR als "*.***" angegeben ist, wenn es 4000 übersteigt, das Absorptionsvermögen hier unter der Annahme berechnet wurde, dass es 4000 betrug. Die mittlere Strömungsrate der Lösung wurde gemessen, wenn die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 mit dem vorstehend erwähnten mittleren Abstand 1 ml Lösung aspirierten. Das Ergebnis der Messung ist in 9 dargestellt.
Wie 9 entnommen werden kann, nimmt die mittlere Strömungsrate ab, wenn der Durchschnitt zwischen den festen Phasen abnimmt. Dies bedeutet, dass, falls das mittlere Intervall verringert wird, die Wartezeit für das Aspirieren oder Abgeben der Lösung zunimmt, was nahe legt, dass eine Verringerung des mittleren Intervalls die Verarbeitungszeit erhöhen kann, die die Vorrichtung für jede Probe benötigt, was zu einer Verringerung der Leistungsfähigkeit der Vorrichtung führt.
Wie den 8 und 9 entnommen werden kann, können die in 1 dargestellten Nucleinsäure-Aufnahmespitzen und die in 2 dargestellte Vorrichtung HCV-Gene so auffangen, dass dieses Problem praktisch vermieden wird, und das gewünschte mittlere Intervall für die Nucleinsäure-Aufnahmespitzen ist ein Abstand, der von 13 bis 21 μm reicht.
Als nächstes wird ein experimentelles Beispiel des Auffangens von Hepatitis-B-Virus-(HBV)-Genen in Serum durch die in 2 dargestellte Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung beschrieben, wobei das chaotrope Reagens durch eine andere Substanz ersetzt ist.
Es wurden Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 mit einer in 1 dargestellten Struktur und einem mittleren Intervall zwischen Siliciumoxidwollfasern von 16 μm hergestellt. Bei der gleichen Konfiguration der Vorrichtung wie derjenigen der in 2 dargestellten Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung 100 wurden die Zusammensetzungen der von der ersten Reagensflasche 21 und der zweiten Reagensflasche 22 aspirierten Reagenzien zu einem 2% Triton X-100 enthaltenden MES-(Dojin Chemical Laboratories, Ltd.)-Puffer, 6 mol/l Guanidinhydrochlorid für das erste Reagens und einem 5 mol/l Guaniginathydrochlorid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., für den biochemischen Gebrauch) enthaltenden MES-(Dojin Chemical Laboratories, Ltd.)-Puffer für das zweite Reagens geändert. Die in den Schritten 3, 4 und 5 zu verwendenden Reagenzien hatten die gleichen Zusammensetzungen wie jene, die beim Auffangen der zuvor erwähnten HCV-Gene verwendet werden.
Für zu verarbeitende Proben wurde Serum verwendet, das eine positive Reaktion mit einem Anti-HBV-Antikörper hatte. Mit den vorstehend erwähnten Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 31 in Kombination mit den in den Schritten 1, 2, 3, 4 und 5 zu verwendenden Reagenzien wurden die HBV-Gene aufgefangen, indem bewirkt wurde, dass die Vorrichtung in der gleichen Weise arbeitete wie beim Auffangen der vorstehend erwähnten HCV-Gene. Die für das Auffangen der Gene erforderliche Zeit betrug etwa 20 Minuten.
Zum Vergleichen der Zustände des Genauffangens zwischen dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und einem früheren Verfahren wurden Gene durch das Verfahren aufgefangen, das in "Protein, Nucleic Acid, Enzyme, 41 (5), 458–459 (1996)" beschrieben ist. Die für das Auffangen der Gene erforderliche Zeit betrug eineinhalb Tage.
In Bezug auf die aufgefangenen Proben wurde ein Versuch unternommen, eine spezifische 414-Base in den HBV-Genen unter Verwendung eines Reagenskits für den PCR-Gebrauch von Takara Shuzo, Co. und eines unter unserem Auftrag von Sawady Technology synthetisierten Amplifikationsprimers zu amplifizieren. In dem PCR-Verarbeitungsschritt wurden unter Verwendung des TP3000-(Takara Shuzo, Co., Ltd.)-Genamplifikationssystems eine erste thermische Denaturierung drei Minuten lang bei 94°C auf die Proben einwirken gelassen und eine zweite thermische Denaturierung 30 Sekunden lang bei 94°C einwirken gelassen, 30 Sekunden lang bei 55°C ausgeheizt und eine 30 Sekunden dauernde Stretch-Reaktion bei 72°C fünfundvierzig Mal wiederholt, und die Proben wurden schließlich 10 Minuten lang auf 72°C erwärmt. Nach Abschluss der PCR-Verarbeitung wurde eine Elektrophorese in 3%igem Agarosegel auf einige der verarbeiteten Proben angewendet, und es wurde dann mit SYBR-GreenI (FMC Bioproducts) eine Fluoreszenzbefleckung an ihnen ausgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass das gleiche Niveau des PCR-amplifizierten Bands wie beim früheren Verfahren erhalten wurde. Dies legt nahe, dass die Zielgene beim gleichen Niveau der Auffangwirksamkeit aufgefangen werden konnten, jedoch in einem kürzeren Zeitraum als beim früheren Verfahren.
Als nächstes wird ein experimentelles Ergebnis des Auffangens sowohl von HBV- als auch von HCV-Genen, die in Serum gemeinsam existieren, durch die in 2 dargestellte Nucleinsäure-Reinigungsvorrichtung beschrieben.
Nucleinsäure-Aufnahmespitzen 3 mit einer in 1 dargestellten Struktur und einem mittleren Intervall zwischen den festen Phasen von 16 μm wurden hergestellt. Die zu verarbeitenden Proben wurden so präpariert, dass die Konzentration jedes Virus in der Mischung der zwei Virustypen zwei Mal so groß war wie jene bei dem zuvor erwähnten Experiment.
Die Gene wurden mit den gleichen Zusammensetzungen der Reagenzien und beim gleichen Vorrichtungsbetrieb wie beim Auffangen von HCV-Genen, wie zuvor erwähnt wurde, aufgefangen, mit der einzigen Ausnahme, dass die Menge des Reagens aus Schritt 5 von 60 μl zu 120 μl geändert wurde.
48,5 μl aufgefangener Proben wurden beim Detektieren von HCV-Genen mit COBAS AMPLICOR verwendet, während 50 μl von ihnen beim Detektieren von HBV-Virusgenen durch Anwenden der zuvor erwähnten PCR-Verarbeitung verwendet wurden. In diesem Experiment konnte jeder Gentyp von den zwei Typen gemeinsam existierender Virusgene enthaltenden Proben mit der gleichen Wirksamkeit wie beim Auffangen dieser Gene für jeden der zwei Typen aufgefangen werden. Dies legt nicht nur nahe, dass die gemeinsam existierenden Virusgene gemeinsam aufgefangen werden können, sondern auch, dass Nucleinsäuren mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie RNA (Ribonucleinsäure) und DNA (Desoxyribonucleinsäure), gemeinsam aufgefangen werden können.

Claims

Instrument zum Auffangen von Nukleinsäuren, die intern Siliciumoxid enthaltenden feste Phasen in einem zum Kontakt mit einer Flüssigkeit fähigen Zustand aufweisen, wobei die festen Phasen von einer porösen oder körnigen oder fasrigen Substanz gebildet sind und die eine große Anzahl von Wasserströmungsbereichen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall einer porösen Substanz die mittlere Porengröße bzw. im Fall einer körnigen oder fasrigen Substanz der mittlere Abstand zwischen Körnern oder Fasern in diesen Wasserströmungsbereichen 25 μm oder weniger und mindestens 13 μm beträgt.
Instrument nach Anspruch 1, wobei die festen Phasen aus einer fasrigen Substanz bestehen.
Instrument nach Anspruch 1, wobei die festen Phasen von Siliciumoxidwolle gebildet sind.
Instrument nach Anspruch 3, wobei der mittlere Abstand zwischen den Siliciumoxidwollfasern im Bereich von 13 bis 21 μm liegt.
Instrument nach Anspruch 3, wobei der Durchmesser der Siliciumoxidwollfasern im Bereich vom 6 bis 12 μm liegt.
Instrument nach Anspruch 3, wobei jede feste Phase sandwichartig zwischen Blockierelementen angeordnet ist, die Flüssigkeit durchlassen, um den Abstand zwischen den fasrigen festen Phasen aufrechtzuerhalten.
Instrument nach Anspruch 6, wobei das Material der Blockierelemente von gesinterten Siliciumoxidteilchen gebildet ist.
Instrument nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem es sich um eine Nukleinsäure-Auffangspitze handelt.
Verfahren zum Auffangen von Nukleinsäuren unter Verwendung der Nukleinsäure-Auffangspitze nach Anspruch 8, die an einem Gerät zum Aspirieren und Abgeben von Flüssigkeit durch Ändern des anliegenden Druckes angebracht ist, wobei: ein erstes Reagens zum Trennen der Nukleinsäuren von den Proben mit den Nukleinsäure enthaltenden Proben gemischt wird, um die Trennung von Nukleinsäuren zu beschleunigen (Schritt 1), ein zweites Reagens mit einer die getrennten Nukleinsäuren enthaltenden Flüssigkeit gemischt und das erhaltene Gemisch sodann in die Nukleinsäure-Auffangspitze durch Ändern des anliegenden Drucks aspiriert, mit den festen Phasen kontaktiert und schließlich abgegeben wird (Schritt 2a), das zweite Reagens in die Nukleinsäure-Auffangspitze durch Ändern des anliegenden Drucks aspiriert, sodann mit den festen Phasen kontaktiert und schließlich zum Reinigen der festen Phasen abgegeben wird (Schritt 2b), ein drittes Reagens in die Nukleinsäure-Auffangspitze durch Ändern des anliegenden Drucks aspiriert, sodann mit den festen Phasen kontaktiert und schließlich abgegeben wird, um das in der Nukleinsäure-Auffangspitze verbliebene erste und/oder zweite Reagens zu entfernen (Schritt 3a), Luft in die Nukleinsäure-Auffangspitze geblasen wird, um die Entfernung des dritten Reagens aus der Nukleinsäure-Auffangspitze zu beschleunigen (Schritt 3b), ein viertes Reagens in die Nukleinsäure-Auffangspitze durch Ändern des anliegenden Drucks aspiriert, sodann mit den festen Phasen kontaktiert und schließlich abgegeben wird, um das verbliebene dritte Reagens auszuspülen (Schritt 4), und ein fünfte Reagens in die Nukleinsäure-Auffangspitze durch Ändern des anliegenden Drucks aspiriert, sodann mit den festen Phasen kontaktiert und schließlich abgegeben wird, um die Nukleinsäuren aus den festen Phasen zu eluieren (Schritt 5).
Verfahren zum Auffangen der Nukleinsäuren aus einem Gemisch eines Beschleunigers zum Beschleunigen der Bindung von Nukleinsäuren an Siliciumoxid enthaltende feste Phasen, unter Verwendung des Instrument nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei: das Gemisch in die aus den Siliciumoxid enthaltenden festen Phasen gebildeten Wasserströmungsbereiche zirkuliert wird und die festen Phasen mit den gebundenen Nukleinsäuren mit einem Reinigungsmittel für den Beschleuniger gereinigt werden, während die Bindung der Nukleinsäuren an die festen Phasen aufrechterhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäuren aus den festen Phasen mit den gebundenen Nukleinsäuren mittels einer Eluiersubstanz eluiert werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die mittlere Strömungsgeschwindigkeit des Gemisches von 10 bis 50 μl/s beträgt.