JP2000175683A - 核酸分離に用いるチップと構造体の形成方法 - Google Patents
核酸分離に用いるチップと構造体の形成方法Info
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Abstract
く高回収率にて分離することが可能な材料と、その材料
を安価に製造する方法を提供する。 【解決手段】そのため、粒子複合化装置にて樹脂粒子3
2aと、シリカ粒子37(樹脂粒子重量の0.2〜10wt%
分)を複合化した粒子をPTFE製の型34に入れ、熱処理
により樹脂粒子32a同志を融着させて形成した構造体
に、シリカ粒子37が単分散された珪酸エチル溶液中に
浸漬したのち取り出しさらに熱処理して構造体を形成す
る。
Description
含有する試料より核酸成分あるいはプラスミドDNAを
分離する核酸捕捉用チップとそれに内包される構造体お
よびその形成方法に関する。
核酸を分離する方法としては、まず、生体試料等を蛋白
質分解酵素の存在下で界面活性剤を作用させ核酸を遊離
させる。その後、フェノール(及びクロロホルム)と混
合し、遠心分離器による水相・有機相分離を数回行う。
その後、水相からアルコールにより沈殿物の形で核酸を
回収する方法がある。また、珪素酸化物等ある特定の一
種類の粒子を容器に詰めた構造体を用いたカラムクロマ
トグラフィーによる方法がある。近年これらの方法をよ
り簡便にするために種々の方法及び装置の検討がされて
いる。
を培養液から全自動で安価に抽出することができるDN
A抽出精製方法及び装置が記載されている。この装置の
チップは、トラップフィルターおよびメンブランフィル
ターを含む第一フィルターチューブと、ガラス繊維フィ
ルター、ガラスパウダー層およびメンブランフィルター
を含む第二フィルターチューブとを上下重ねあわせた構
造であり、真空装置(ポンプ)によって不純物の濾過、
DNAの吸着、洗浄、溶出を順次行うことにより抽出す
る構成である。
を分離する場合、装置が大掛かりとなり、且つ高速回転
させるために核酸自体が損傷してしまう問題ある。
ップでは、ある特定の一種類の粒子を容器に詰めた場
合、微粒子の性質上(特に粒径がそろっていれば)細密構
造となり、粒度分布がある場合は大きい粒子の間に小さ
い粒子が凝集して入り密になるので、液の通りが悪くな
ってしまい、試料が通過するのに非常に時間を要してし
まう。そこで時間を短縮するために真空ポンプを用いて
試料を分離すると、遠心分離同様に核酸が切断されてし
まうという問題があった。
体試料が通過し易い構造体として真空ポンプを不要とす
ることで、核酸を生体試料から切断等の欠陥なく分離で
きる構造体に適した材料と、その材料を製造する方法を
提供することにある。
め、本発明のチップは、珪素酸化物類を含み、この珪素
酸化物よりも径の大きな孔を有する構造体をその流路に
内包したものとする。また、核となる粒子表面に珪素酸
化物類の粒子を複合化し、前記複合粒子が三次元状に結
合して形成した構造体を、その流路内に内包したものと
する。
に吸着することは既に知られている。一般にシリカ(S
iO2)といっても多くの変態があり、主要なものは石
英、トリジマイト、クリストバル石の3つで、さらに高
温型と低温型がそれぞれ存在する。また、石英は塩では
ないが縮合形式から珪酸塩鉱物に分類されることもあ
る。また、普通のガラスは縮合珪酸の三次元不規則網状
構造の中にアルカリ金属やアルカリ土類金属のイオンが
入って安定化した無定形物質である。その外に珪素のア
ルコキシド化合物を用いて加水分解反応及び脱水縮合反
応からシリカを形成する方法もある。本書中において
は、これらシリカ、ガラス、珪酸塩、珪酸塩鉱物、珪酸
の縮合体で結晶性、非結晶性のもの全てをまとめて珪素
酸化物類という。
大きさで、DNAを吸着するために用いるための物のこ
とである。
を通過する時に、その内部の流路面に存在する珪素酸化
物類の部分に捕捉される。なお、本発明における構造体
は粒子が三次元状に結合して形成されているので、液体
が通過する流路が必ず貫通孔として存在している。その
ため、液通りが良く、特別な真空装置を用いて吸引しな
くても、液体試料の吸引吐出を行うことが可能である。
物類の粒子をこの珪素酸化物類よりも径の大きい樹脂粒
子表面に複合する工程と、この複合化された粒子を型に
入れ樹脂粒子の耐熱温度以上で熱処理することにより樹
脂粒子を互いに融着して構造体を成型する工程と、前記
型から取り出した構造体を珪素化合物を含有するゾルゲ
ル溶液に浸漬する工程と、前記材料を前記ゾルゲル溶液
から取り出した後、熱処理により前記ゾルゲル溶液を縮
重合させる工程を行うことにより形成できる。
粒子をこの珪素酸化物類よりも径の大きい樹脂粒子表面
に複合する工程と、この複合化された粒子と珪素化合物
を含有するゾルゲル溶液とを混合し型に入れる工程と、
熱処理により前記ゾルゲル溶液を縮重合させて混合した
材料を成形体にし前記型から取り出す工程を行うことに
より形成できる。
床検査や研究分野において核酸より遺伝子情報を得るた
め、生体試料等の核酸を含有する流体から核酸を分離す
る、前処理装置の核酸抽出に用いられる。この遺伝子検
査前処理装置においては、次に示すような手順にて核酸
の抽出を行う。なお、図1に装置の平面構成図を、図2
に核酸の分離を行う際の流路図を示す。
する吸引吐出する際に液が入る部分がチップ15、19
であり、ノズル8、9、ノズルホルダー6、7、配管
4、5を介してシリンジ2、3に接続している。このチ
ップ内に核酸を補足するための構造体(図示せず)を内
包したものが分離チップ19である。これらチップの先
端は内径側にテーパが設けられている。そのテーパ部
に、液体試料内の核酸を補足するための構造体が封入さ
れている。又各種液体試料を分注するために用いるチッ
プには何も内包していない。ここでは、構造体を封入し
た分離チップ19と区別するために、何も内包していな
いチップを分注チップ15とする。
つ、自動的に液体試料の吸引と吐出の制御を行うことが
出来る。シリンジ2、3はそれぞれ配管4、5を通し
て、ノズル8、9に、それぞれ独立に接続されている。
ノズル8、9は、ノズルホルダー6、7に固定されてい
る。ノズルホルダー6、7はそれぞれアーム10、11
にY軸方向、Z軸方向への移動が可能な状態で保持され
ている。アーム10、11は、それぞれ独立にX軸方向
への移動が可能であり、Z軸方向に差を持たせることに
より、X軸方向に一部オーバラップすることが出来、ノ
ズルホルダー6、7とアーム10、11の動作の組合せ
により、装置平面上の主要な部分への移動を制御するこ
とが出来る。
収納することが出来、同じ物を計3個設置することが出
来る。反応容器ラック16には反応容器17を48本設
置することが出来る。精製品ラック20には精製品収納
容器21が48本設置できる。また、洗浄液ボトル2
2、溶離液ボトル23、希釈液ボトル24、結合促進剤
ボトル25をそれぞれ1ボトル設置できる。チップラッ
ク18には、分離チップ19を48本設置することが出
来る。
御により、分注チップラック14上の目的とする分注チ
ップ15の上方へノズル9を移動する。その後、下方へ
ノズルホルダー7を移動し、分注チップ15の所定の位
置とノズル9を接触させ、ノズル9の先端に分注チップ
15を自動的に取り付けることが出来る。同様の制御を
ノズル8、ノズルホルダー6、アーム10で行うことに
よりノズル8の先端に分離チップ19を取り付けること
が出来る。
り、チップ抜き27の手前上方へノズル8を移動させ
る。その後、ノズルホルダー7の制御により、ノズル9
と分注チップ15の接合部がチップ抜き27よりも下部
になるように移動させる。更に、ノズル8をチップ抜き
27の方向へ移動させる。その後、ノズル9の一部をチ
ップ抜き27に接触させたまま、ノズルホルダー7を上
方に移動させる。これにより、ノズル9から分注チップ
15を自動的に取り外すことが出来る。同様の制御をノ
ズル8、ノズルホルダー6、アーム10で行うことによ
り、ノズル8から分離チップ19を取り外すことが出来
る。
出液を受けることが可能である。液受け29、30は、
ノズルのホームポジションとして機能し、受けた液体は
廃液として図示しない廃液処理の過程に送られる。洗浄
部26は、流水の吐出によりノズルホルダー7にノズル
9を介して取り付けられた分注チップ15を洗浄するこ
とが出来る。
たDNAの回収に関し、より詳細に説明する。
entas社製)を添加し、ヌクレアーゼ対策のために終濃度
で1%となるようにSDS(ドデシル硫酸ナトリュウ
ム)を添加したものを検体液13(液体試料)として、
検体ボトルに収め、その検体ボトルを図1の装置上の検
体ラック12に収納した。分注チップラック18、各試
薬ボトル22、23、24、25、反応容器17、精製
品容器21を図1の装置上の所定の位置にセットした
後、装置に次の操作を行わせる。
剤を分注チップ15を用いて混合する操作を行う。
りノズル9に分注チップ15を所定の動作により取り付
ける。その後、アーム11とノズルホルダー7及びシリ
ンジ3を制御することにより、結合促進剤ボトル25よ
り所定量の結合促進剤である塩酸グアニジンを吸引す
る。更に、50μlの空気を吸引し、制御によりノズル
9と分注チップ15を洗浄部26へ移動し、そこで分注
チップ15の外壁を流水洗浄する。洗浄後、制御により
ノズルホルダー7を検体ラック12上の所定の検体液1
3の位置へ移動し、シリンジ3の制御により所定量の検
体液13の吸引を行う。吸引後、制御によりノズルホル
ダー7を反応容器ラック16上の所定の反応容器17に
移動し、その後全量を吐出する。吐出後、更に吸引と吐
出を行うことにより検体液13と塩酸グアニジンを混合
する。混合後、制御によりノズルホルダー7をチップ抜
き27の位置へ移動し、所定量の動作によりノズル9か
ら分注チップ15を取り外す。
するための構造体に核酸(ここではDNA)を結合させ
る。
ノズル8に分離チップ19を所定の動作により取り付け
る。その後、ノズルホルダー6を反応容器ラック16上
の前記混合液の入った反応容器17に移動し、シリンジ
2の制御により、分離チップ19の内部へ混合液を吸引
する。吸引後、シリンジ2の制御により、所定の回数吸
引と吐出を繰り返し、構造体と混合液を接触させる。
後の残渣液を排出する。
を繰り返した後、分離チップ19内に反応容器17内の
混合液を吸引する。その後、アーム10、ノズルホルダ
ー6の制御により廃液口28へ移動し、分離チップ19
及びノズル8内の混合液をシリンジ2の制御により吐出
する。吐出後、分離チップ19は、アーム10、ノズル
ホルダー6の制御により液受け29へ移動する。
補足した構造体の洗浄を行う。
りノズル9に分注チップ15を所定の動作により取り付
ける。その後、アーム11とノズルホルダー7及びシリ
ンジ3の制御により分注チップ15内に洗浄ボトル22
から所定量の洗浄液を吸引する。その後、制御によりノ
ズルホルダー7を反応容器ラック16の所定の反応容器
17に移動し、洗浄液を吐出する。吐出後、アーム11
とノズルホルダー7の制御により、ノズルホルダー7を
チップ抜き27の位置へ移動し、所定の動作によりノズ
ル9から分注チップ15を取り外す。
ノズルホルダー6を制御し、分離チップ19を洗浄液の
入った反応容器ラック16上の反応容器17に移動し、
シリンジ2の制御により分離チップ19内へ洗浄液を吸
引する。吸引後、シリンジ2の制御により、分離チップ
19で所定の回数吸引と吐出を繰り返し、核酸が補足さ
れた構造体を洗浄液により洗浄する。分離チップ19
は、所定の回数吸引と吐出を繰り返した後、アーム1
0、ノズルホルダー6の制御により、廃液口28へ移動
し、分離チップ19内の洗浄液をシリンジ2の制御によ
り吐出する。吐出後、分離チップ19はアーム10、ノ
ズルホルダー6の制御により液受け29へ移動する。
返す。
体に補足された核酸の溶離を行う。
りノズル9に分注チップ15を所定の動作により取り付
ける。その後、アーム11とノズルホルダー7、及びシ
リンジ3の制御により、溶離液ボトル23から分注チッ
プ15に吸引し、制御によりノズルホルダー7を反応容
器ラック16上の所定の反応容器17に移動する。その
後、分注チップ15内の溶離液を反応容器17内へ吐出
する。吐出後、アーム11とノズルホルダー7の制御に
よりノズルホルダー7をチップ抜き27の位置へ移動
し、所定の動作によりノズル9から分注チップ15を取
り外す。
ノズルホルダー6の制御により分離チップ19を溶離液
の入った反応容器ラック16上の所定の反応容器17へ
移動する。そこで、シリンジ2の制御により分離チップ
19内へ溶離液を吸引する。吸引後、シリンジ2を制御
し、所定回数吸引と吐出を繰り返し、構造体と溶離液を
接触させる。その後、分離チップ19内に反応容器内の
溶離液を吸引した状態で、アーム10、ノズルホルダー
6を制御し、分離チップ19を所定の精製品収納容器2
1へ移動する。移動完了後、分離チップ19内の溶液を
シリンジ2の動作により精製品収納容器21内へ吐出す
る。吐出後、アーム10、ノズルホルダー6を動作させ
液受け29へ移動する。必要に応じて第5の工程も所定
回数繰り返す。
ダー6を動作させ、ノズルホルダー6をチップ抜き27
の位置へ移動させ、所定の動作をによりノズル8からチ
ップ19を取り外す。
けた核酸捕捉用構造体の形成法を説明する。図3(a)
に形成の工程を示す。
32a*2をシリカ粒子に対して樹脂粒子体積濃度10
から60Vol%になるように比重換算して秤量する。
その後所定量の珪酸エチル溶液*3を加え、粘土状にな
るまで攪拌しPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)
製の型34に入れる。図において、33はシリカ粒子と
珪酸エチル溶液の混合物を示している。
0℃にて30分熱処理し、型34内の珪酸エチルを縮重
合させる。これにより、型から取り出しても崩れない成
型品となる。
400℃以上にて3時間熱処理し、樹脂粒子32aを完
全に燃焼させる。これにより、樹脂粒子32a部分が空
孔となり、流路が形成された構造体31aとなる。図に
おいては省略しているが、樹脂粒子32aが存在してい
た空孔の部分には細かいシリカ粒子の凹凸が出来てお
り、液体試料との接触面積を大きくし、核酸を捕捉し易
いようにしている。
10μmのものである。*2は住友精化(株)製のCL
シリーズで粒径180〜1000μmのものである。*
3は珪酸エチル溶液(珪素化合物含有ゾルゲル溶液:シ
リコンアルコキシドのアルコール溶液)で珪酸エチル2
5g、水17.28g、塩酸(12N)0.3g、エタ
ノール5.42gにて調整したものである。
樹脂粒子32aは上記製品に限定されるものではない。
また、珪酸エチル濃度も変更可能である。使用する珪素
酸化物類の粒子は、0.001μm以上20μm以下と
することが望ましい。0.001μm以下の場合、調合
時に飛散し、濃度が安定しない。また、取扱上も粉塵等
が発生するという問題がある。また、20μm以上の場
合、流路を形成するための有機物との間隔が大きくな
り、構造体がもろく崩れやすくなる。
子32aの場合は、50μm以上1000μm以下とす
ることが望ましい。50μm以下の場合、通水性が悪く
液の吸引吐出時に圧がかかり、核酸が切断される可能性
がある。また、1000μm以上の場合、空孔が大きく
なり構造体が形成できず崩れてしまう。
有するゾルゲル溶液)は珪素酸化物類の粒子を結合させ
るバインダーの働きをするものである。本実施例では珪
酸エチル溶液を使用したが、バインダーとしては種々の
金属ゾルゲル液を用いても良いが、珪素化合物を含有す
るゾルゲル液を用いることで、このバインダーの部分も
核酸結合することが出来るため、核酸捕捉の効率が向上
する。
コキシドを主成分とし、これに水(加水分解用)、酸又
はアルカリ(触媒用)に、溶媒(均質溶液調整用、アル
コキシドを用いる場合は、一般にアルコールを用いる)
を混合した溶液を用いる。なお、ゾルゲル液は上記の組
成だけではなく、アルコキシドの代わりにカルボン酸塩
や無機化合物を用いることも可能である。溶媒としてエ
チレングリコール、エチレンオキシド、トリエタノール
アミン、キシレン等を用いることも可能である。又必要
に応じて、例えば亀裂が生じにくいように添加剤を追加
することも可能である。
32aの体積濃度は検体液13の通水に影響するため、
熱処理後核酸捕捉用構造体が崩れない程度に、出来るだ
けの高濃度にすることが望ましい。なお、樹脂粒子体積
濃度は用いる樹脂粒子32aの粒子径によって異なり、
構造体が大きくなるにつれてその体積濃度は小さくする
ことが好ましい。また、粒子によって比重も異なるた
め、それによっても樹脂粒子濃度は異なる。
しているため珪酸エチル溶液が固形化する温度以上で、
且つ型に使用してるPTFEの融点以下ならばいずれの
温度でも良い。時間は溶媒(本実施例においてはエタノ
ール、水)がなくなるまでを目安とする。また、熱処
理については樹脂粒子32aが燃焼して消滅するまでを
目安とする。なお、使用した樹脂粒子32aにより熱処
理温度は変える場合もあり、時間も樹脂粒子32aの種
類・量により変更可能である。
体の形成方法の他の実施例を説明する。
各工程についての説明を行う。
を、シリカ粒子に対して有機物体積濃度10〜60Vo
l%になるように比重換算して秤量する。PTFE製の
型34に繊維32bを入れ、その後、所定量のゾルゲル
液を加える。図において、33aはシリカ粒子とゾルゲ
ル液の混合物を示している。
00℃にて30分熱処理し型34内の珪酸エチルを縮重
合させる。
とも400℃にて3時間熱処理し、繊維32bを完全に
燃焼させる。これにより、繊維32b部分が空孔とな
り、シリカ粒子が付着した流路が形成された構造体31
bが形成される。
を用いる場合は、先の実施例のように樹脂粒子32aの
場合よりもバインダーとして使用している珪酸エチル溶
液の量を増やすことが望ましい。繊維32bは樹脂粒子
32aとは異なり連続しているため構造体31とするた
めには、バインダーの量を増やし、より強固な構造体3
1にする必要がある。具体的には、の工程の後、成型
体に珪酸エチル溶液を適量浸透させた後、熱処理して珪
酸エチルを縮重合させる。必要ならばこの工程を数回繰
り返す。なお、繊維32bとしては、合成繊維、天然繊
維のいずれを用いても良く、天然繊維としては木や竹な
どの植物を用いることが出来る。
分離用構造体の他の形成方法を説明する。
エタノールに対して中空樹脂粒子重量濃度約10wt%
になるように秤量し、薬さじにて攪拌する。SiO2超
微粒子エタノール分散液*5を適量加え、さらに、薬さ
じにてよく攪拌しPTFE製の型34に入れる。
20分熱処理し、型34から取り出す。これにより、中
空樹脂粒子36により流路が形成され、その流路面に珪
素酸化物であるSiO2超微粒子37が存在し、ここに
核酸が補足される。
F−80EDで平均粒径80〜90μmであり、*5は
触媒化成工業(株)製のOSCALで粒径40〜300
nmである。なお、この方法においても、中空樹脂粒子
36及びSiO2超微粒子34は上に記載の製品に限定
されるものではない。
して珪酸エチル溶液(珪素化合物を含有するゾルゲル溶
液)を用いることも出来るが、本実施例に示すように中
空樹脂粒子34の耐熱温度をわずかに越える温度で熱処
理することによって、その中空樹脂粒子34同士が溶融
付着し、スポンジ状の成型体が得られることが分かっ
た。但し、熱処理温度が低すぎると、中空樹脂粒子34
同士の溶融付着がないため、成型体とはならず粉状とな
る。一方熱処理温度が高すぎると、中空樹脂粒子34が
破裂して、しぼんで小さくなり、弾力のあるスポンジ状
には成型しない。さらに、熱処理時間が長すぎると、温
度が高すぎる状態と同様にしぼんでしまう。また、中空
でない樹脂粒子の場合は、熱処理温度が高すぎて粒子の
溶融が進むと流路が確保できなくなる。そのため、本形
成方法では材料に適した熱処理温度と時間の選定が必要
である。
法では、型34に金属を用いることも可能であるが、金
属表面とゾルゲル溶液の成分が結合する可能性がある。
結合が起こると構造体31を型から取り出す時に、崩れ
たり割れたりする。金属製の型を使用する際は、結合の
起こりにくいように表面にゾルゲル溶液と反応しない物
質を処理しておくことが望ましい。
造体の他の形成方法を説明する。
に浸漬させる。
200℃にて30分熱処理し、珪酸エチルを縮重合さ
せ、多孔質体の多孔質部分にシリコンアルコキシドの被
膜を形成する。
す。
分を流路として用いることにより流路表面積を増加さ
せ、シリコンアルコキシドで核酸を補足するようにして
いる。つまり、シリコンアルコキシドをバインダーでは
なく、核酸捕捉材として使用している。
施例の構造体を用いるか、珪酸エチルに珪素酸化物(例
えばシリカ粒子)を混合させても良い。その場合、第1
実施例とは異なり、シリカ粒子は流路に凹凸を付けて流
路表面積を増やすために用いるので、シリカ粒子でなく
とも流路に凹凸を付けられるような材料であれば何を用
いても良い。
の粒子を含むバインダーとして使用できるゾルゲル液に
浸漬させ、熱処理をすることで多孔質部分に粒子による
凹凸を付け、その後、珪酸エチルに浸漬させ熱処理し、
凹凸面に被膜を作成しても良い。
の耐熱温度以下であれば特に限定はしない。珪酸エチル
は高温で熱処理するほど結晶性のシリカとなり、核酸の
回収に望ましい状態となる。
の形成方法について説明する。
ついての説明を行う。
*6(樹脂粒子重量の0.2〜10wt%分)を秤量する。これ
ら二つの粒子を粒子複合化装置にて複合する。
所定量秤量しPTFE製の型34に入れる。
2aの耐熱温度以上にて約30分熱処理し、樹脂粒子32
a同志の融着により粒子間を結合41させた後、型から
取り出す。
37*5が単分散された珪酸エチル溶液中*3に浸漬し
た後取り出す。
ロー等で吹き飛ばして自然乾燥またあるいは40〜50℃で
乾燥させた後、100℃にて熱処理を行う。
す。
製のCLシリーズで粒径180〜1000μmのものである。*
6は(株)旭硝子製の鱗片状粒子で平均粒径4〜5μm
(厚さ約0.05μm)のものである。*5は(株)触媒化成
工業製のOSCALで粒径40〜300nmでエタノール溶液であ
る。*3は珪酸エチル溶液(珪素化合物含有ゾルゲル溶
液:シリコンアルコキシドのアルコール溶液)で珪酸エ
チル25g、水17.28g、塩酸(12N)0.3g、エタノール5.42g
にて調整したものである。
脂粒子32aに機械的に複合させ、複合粒子40を形成
する。本実施例ではシータ・コンポーザ((株)徳寿工作
所製)を使用して粒子の複合化を行った。複合化の方法
としてはその外にメカノミル(岡田精工(株)製)、メカ
ノフュージョン(ホソカワミクロン(株)製)等の方法が
あり、もちろんこれらの全て方法が使用可能であり、本
実施例に限定されるものではない。
らかいため、複合化により樹脂粒子32a表面にシリカ
粒子37が埋め込まれた状態となる。即ち、シリカ粒子
37による膜のようなものが形成されており、これによ
り樹脂自身の性質が変化している。その中の一つとし
て、見かけの耐熱温度が向上している。そのため、に
おける熱処理温度は未処理の樹脂粒子32aの耐熱温度
よりも高めに設定することが望ましい。
体の流路表面にシリカ粒子37を含有した珪酸エチル溶
液で浸漬処理による表面処理をしている。この際、先に
複合化されたシリカ粒子部に、後から処理したシリカ粒
子が珪酸エチル溶液をバインダーとして結合する。これ
により、シリカ粒子37が樹脂粒子32aに強固に結合
し、樹脂粒子32aからのシリカ粒子37の剥離脱落が
ない構造体が得られる。
返すことで、樹脂粒子32a表面をシリカ粒子37で修
飾することができ、核酸の結合へ対する樹脂粒子32a
の影響を低減することができる。但し、通水性を確保す
るために、形成している樹脂同志が作る隙間を埋めない
程度とする。
しているが、シリカ粒子(ガラスビーズ)を核にするこ
とも可能である。この場合、下地が珪素酸化物なので核
酸の回収には有効である。
形成方法を説明する。図7に形成の工程を示す。以下に
各工程についての説明を行う。
*1(樹脂粒子重量の0.2〜10wt%分)を秤量する。これ
ら二つの粒子を粒子複合化装置にて複合する。
に対し、所定量の珪酸エチル溶液を加え、よく攪拌しPT
FE製の型34に入れる。
にて30分熱処理し型内の珪酸エチルを縮重合させ粒子間
を結合させた後、型から取り出す。
Xで粒径8〜10μmのものである。
いて、シリカ粒子37及び樹脂粒子32aは上記製品に
限定されるものではない。また、珪酸エチル濃度も変更
可能である。使用する珪素酸化物類の粒子37は0.001
μm以上100μm以下とすることが望ましい。0.001μm
以下の場合、調合時に飛散し濃度が安定せず、取り扱い
上も粉塵の問題等が発生する。また、粒子の複合化は、
母粒子となる樹脂粒子32a径の10分の1以下の粒子を
子粒子として用いる方が良いとされているので100μm
以下とする。
るプラスチック樹脂を用いるが、核酸や各種使用する試
薬と反応しにくい飽和炭化水素系の樹脂、例えばポリエ
チレン、ポリプロピレン等、あるいはPTFEのような
フッ素系の樹脂が望ましい。ただし、第5実施例のよう
に樹脂表面に十分に珪素酸化物を処理することで下地の
影響を除外することも可能であり、その場合前記樹脂に
限定されない。
ける熱処理時に型を加圧状態で構造体の変位が一定とな
る状態で熱処理することにより、構造体の粒子の充填率
を向上することができる。これにより、気孔率を一定に
することができる。但し、この場合圧力が高くなるに従
い樹脂粒子32aの変形も伴う。なお、熱処理前に加圧
して一定時間保持した後、加圧を開放して熱処理を行う
ことも可能である。この場合は加圧状態で熱処理する場
合より充填率は下がるが、樹脂粒子32aの変形はな
い。なお、使用した樹脂粒子により熱処理温度は変更さ
れることもあり、時間も樹脂粒子の種類・量により変更
可能である。
温度制御できる金型中で処理を行う場合、側面の温度を
上下面より高めに設定する。これにより、側面は樹脂粒
子が融け粒子による凹凸がなくなる。構造体をチップ筐
体内に封入して使用する場合、問題となるのはチップ筐
体内壁と構造体との間にできる隙間を検体試料が流れ、
構造体が検体試料が効率よく接触できなくなることであ
る。金型の温度制御により側面のみ粒子を溶かして凹凸
を無くし平滑とすることで、チップ筐体内壁と構造体の
隙間を小さくすることが可能となる。これにより、検体
液がより構造体と接触し易い構造となり核酸の回収をよ
り効果的に行うことができる。
以外に超音波を利用する方法もある。この場合は、PT
FE製の型のピンの代わりに、超音波を発生するホーン
を挿入し、超音波接合を行う。超音波は粒子の接触して
いる部分に伝達され、接触部の温度が上昇し樹脂が溶け
て接合する。この方法は、各樹脂に適した周波数及び出
力を設定することにより、処理時間を数秒〜数十秒にす
ることができる。
の形成方法を説明する。図9に形成の工程を示す。以下
に各工程についての説明を行う。
ラス管42と、そのガラス管42より低い温度で軟化す
るガラス粒子43を用意する。(本実施例ではガラス管
42は強化ガラス、ガラス粒子43は普通ガラス(ソー
ダガラス)を用いた。) ガラス管42内にガラス粒子43を入れ、ガラス粒子
43が軟化する温度にて熱処理を行いガラス粒子同士を
互いに融着させる。(本実施例では720〜730℃で
30分) 室温まで冷却した構造体を、珪酸エチル溶液(珪素化
合物を含有するゾルゲル液)中に浸漬した後乾燥する。
なおこの時、珪酸エチル溶液がガラス粒子43によって
構成される隙間を埋めないように、窒素ガス等でブロー
して余剰分を除く。必用ならばこの工程を数回繰り返
す。
し、珪酸エチルを縮重合させ、ガラス表面にシリコンア
ルコキシドの被膜を形成する。
シリコンアルコキシドの被膜により、ガラス中に含まれ
るナトリウム等の不純物の影響をなくすことが可能とな
る。なお、工程の回数及びにおける熱処理温度は、
ガラス中の不純物の濃度により必要に応じて変更するこ
とができる。
子の軟化する温度差があるため、粒子同士は変形して融
着するが、ガラス管は変形しないため一定の形を保持す
る事が出来る。
く崩れやすいが、本実施例の構造体は管内に設置されて
いるために強度が高い。チップ内へ圧入する際は、この
管部に圧をかけて封入する事が可能で構造体が崩れる心
配がない。
粒子が単分散された珪酸エチル溶液を用いると、ガラス
中の不純物の影響を低減でき、さらに表面に小さな凹凸
が形成され、核酸の回収により有利になる。
等を用いることも可能である。その場合、外側の管は石
英ガラスの管を用いる、および熱処理温度を変更するこ
とで構造体の作成は可能である。管と中に入れる粒子と
の軟化温度に差があるものならば、構造体の作成は可能
であり、構造体を構成する材料は本実施例に限定される
ものではない。
構成されているため、オートクレーブによる滅菌も可能
である。
ずれかの構造体を用いてチップを製造する方法について
説明する。図5に本発明のチップを示す。
プ筐体(便宜上構造体を封入(内包)していないチップ
をこのように称す)19a内に封入して本発明のチップ
19を製造した。製造方法としては、チップ筐体19a
に構造体31を圧入する方法がある。また、チップ筐体
19aを構造体31に固定するために接着剤を使用する
場合は非浸透性の接着剤38を用いる。浸透性の接着剤
の場合は、構造体内部への浸透により流路の確保が困難
となるためである。あるいは、チップ筐体19a内に構
造体31を挿入した後、チップ筐体19aを変形して封
入する方法もある。その他に、通水の妨げにならないよ
うなメッシュ、フィルター等を保持材39として用いて
構造体31をチップ筐体内に封入する方法もある。
3が効率よく構造体31の内部を通過できるように、構
造体31がチップ断面一面に存在するような構成とする
ことが望ましい。なお、核酸の捕捉量を高めるため、チ
ップ19内に複数個の構造体31を入れることも可能で
ある。
るため、使用後廃棄する際にチップ筐体と構造体を分離
してチップ筐体を洗浄、消毒後再利用することも可能で
ある。
確認実験結果について説明する。
筐体19a内に圧入して製造したチップ19を用いて核
酸捕捉の確認実験を行った。実験方法は先に説明した前
処理装置1の操作手順に従って行った。その後、精製品
収納容器21内に得られた検体液13をサンプルとして
確認のためにPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行い、
電気泳動、蛍光染色を行い評価を行った。
施例で製作した種構造体31の形成条件と核酸の回収結
果を表1に示す。第2、第4実施例に関しては、略同様
の結果であるので、ここでは省略する。
%以上の回収率を得ることができた。中には、70%以
上の回収率を得られたものもある。以上のように、本発
明のチップ19を用いることで、簡単に高回収率でDN
Aを分離できることが分かった。
るために、バラの複合粒子を用いて以下のような二種類
のチップを作成し確認実験を行った。
のフィルターにて上下方向より隙間無くはさみ込み、複
合粒子が動かないように固定したチップ。
のフィルターが一定距離を保つように上下方向より挟み
込み、バラの複合粒子がフィルターの間を自由に動く事
ができるようにしたチップ。
方法で核酸の捕捉実験を行った。その結果、核酸濃度が
高い検体液からの核酸の回収では(a)(b)に大きな
差がでなかったが、核酸濃度の低い検体液からの核酸の
回収においては(a)の方が(b)よりも核酸回収率が
良好であった。
いては自由に粒子が動く(b)のチップよりも、粒子が
形成する細く狭い隙間を検体液が通過する(a)のチッ
プの方が、核酸とシリカが接触する頻度が高いため核酸
の回収率が良好となる。この結果より、本発明のような
粒子を固定化し、その隙間を液が通過する構造体が、核
酸の回収に有効であることが分かる。なお、バラの粒子
の場合は、粒子を回収するために磁力を用いたり、遠心
分離を用いる必要があり、装置を構成する上で困難な問
題となっているが、本発明は構造体になっており粒子回
収の問題はない。
チップ19を用いることで、簡単に高回収率で核酸を分
離できることを確認した。また、母粒子となる樹脂粒子
32aの粒径が小さい方、すなわち表面積が広い方が回
収率が良好であることがわかった。
必要がなく液体試料が簡単に通過可能である。また、液
体試料の流路となる部分には核酸を吸着する珪素酸化物
が凹凸をなしているため、液体試料の中から切断等の欠
陥がなく高回収率で核酸を分離することが出来、回収率
が高いため必要な試料の量も微量で済む。
る。
る。
る。
ある。
る。
ある。
ある。
に設けたチップ。
ある。
…配管、6、7…ノズルホルダー、8、9…ノズル、1
0、11…アーム、12…検体ラック、13…検体液、
14…分注ラック、15…分注チップ、16…反応容器
ラック、17…反応容器、18…チップラック、19…
チップ、20…精製品ラック、21…精製品収納容器、
22…洗浄液ボトル、23…溶離液ボトル、24…希釈
液ボトル、25…結合促進剤ボトル、26…洗浄部、2
7…チップ抜き、28…廃液口、29、30…液受け、
31…構造体、32a…樹脂粒子、32b…繊維、33
…シリカ粒子と珪酸エチル溶液の混合物、34…型、3
5…有機溶剤、36…樹脂粒子、37…SiO2微粒
子、38…非浸透性接着剤、39…保持材、40…複合
粒子、41…融着した樹脂粒子、42…ガラス管、43
…ガラス粒子。
Claims (16)
- 【請求項1】液体試料より核酸を分離する構造体を備え
たチップにおいて、 珪素酸化物類を含み、前記珪素酸化物類よりも径の大き
な孔を有する構造体をその流路に内包したチップ。 - 【請求項2】液体試料より核酸を分離する構造体を備え
たチップにおいて、 前記構造体は、核となる樹脂粒子表面に珪素酸化物類の
粒子が複合化され、前記複合粒子が三次元状に結合して
形成され、前記構造体を前記液体試料の流路に内包した
チップ。 - 【請求項3】請求項1、または2いづれかに記載のチッ
プにおいて、 前記樹脂粒子の径が50μm以上1000μm以下であ
ることを特徴とするチップ。 - 【請求項4】請求項1又は2のいづれかに記載のチップ
において、 前記構造体が多孔質体であることを特徴とするチップ。 - 【請求項5】液体試料より核酸を分離する構造体を備え
たチップにおいて、 前記構造体は、核となる粒子表面に珪素酸化物類の粒子
を複合化し、前記複合粒子が三次元状に結合しているこ
とを特徴としたチップ。 - 【請求項6】液体試料を流通させることにより、前記液
体試料中の核酸を捕捉する構造体において、 珪素酸化物類を含み、前記珪素酸化物類よりも径の大き
な孔を備えていることを特徴とする構造体。 - 【請求項7】請求項6記載の構造体において、 前記構造体が多孔質体であることを特徴とする構造体。
- 【請求項8】請求項6記載の構造体において、 前記珪素酸化物類の粒子の径が0.001μm以上10
0μm以下であることを特徴とする構造体。 - 【請求項9】液体試料より核酸を捕捉するための構造体
の形成方法において、 珪素酸化物類の粒子と、有機物と、珪素化合物を含有す
るゾルゲル溶液とを混合し型に入れる工程と、 熱処理により前記ゾルゲル溶液を縮重合させて混合した
材料を成形体にし、前記方から取り出す工程と、 前記成形体を熱処理して有機物を燃焼させる工程とを有
する構造体の形成方法。 - 【請求項10】液体試料より核酸を捕捉するための構造
体の形成方法において、 樹脂粒子と、前記樹脂粒子よりも小さな径の珪素酸化物
類の粒子と、有機溶媒とを混合する工程と、 これらを型に入れ樹脂粒子が互いに融着する温度で熱処
理した後、型から取り出す工程を有する構造体の形成方
法 - 【請求項11】液体試料より核酸を捕捉するための構造
体の形成方法において、 多孔質体からなる材料を珪素化合物を含有するゾルゲル
溶液に浸漬する工程と、 前記ゾルゲル溶液から取り出した後、熱処理により前記
ゾルゲル溶液を縮重合させる工程とを有する構造体の形
成方法。 - 【請求項12】液体試料より核酸を捕捉するための構造
体の形成方法において、 珪素酸化物類の粒子を、前記珪素酸化物類よりも大きな
径の樹脂粒子表面に複合化する工程と、 前記複合化された粒子を型にいれ樹脂粒子の耐熱温度以
上で熱処理することにより樹脂粒子を互いに融着して構
造体を形成する工程と、 前記型から取り出した構造体を珪素化合物を含有するゾ
ルゲル溶液に浸漬する工程と、前記構造体を前記ゾルゲ
ル液から取り出して、熱処理により前記ゾルゲル溶液を
縮重合させる工程を有する構造体の形成方法。 - 【請求項13】液体試料より核酸を捕捉するための構造
体の形成方法において、 珪素酸化物類の粒子を、前記珪素酸化物類よりも大きな
径の樹脂粒子表面に複合化する工程と、 前記複合化された粒子を珪素化合物を含有するゾルゲル
溶液とを混合し型に入れる工程と、 熱処理により前記ゾルゲル溶液を縮重合させて混合した
材料を成形体にし、前記型から取り出す工程を有する構
造体の形成方法。 - 【請求項14】請求項10乃至13のいずれかに記載の
構造体の形成方法において、 前記珪素酸化物類の粒子の径が0.001μm以上10
0μm以下であることを特徴とする構造体の形成方法。 - 【請求項15】請求項10乃至13のいずれかに記載の
構造体の形成方法において、 前記有機物の径が50μm以上1000μm以上である
ことを特徴とする構造体の形成方法。 - 【請求項16】請求項10乃至13のいずれかに記載の
構造体の形成方法において、 前記珪素酸化物類の粒子径が前記樹脂粒子の径の1/1
0以下であることを特徴とする構造体の形成方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11059742A JP2000175683A (ja) | 1998-03-19 | 1999-03-08 | 核酸分離に用いるチップと構造体の形成方法 |
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JP28500298 | 1998-10-07 | ||
JP10-69787 | 1998-10-07 | ||
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---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JP2011517773A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-06-16 | バイオティクス, インコーポレイテッド | サンプル調製デバイスおよび分析物の処理方法 |
US8183054B2 (en) | 2001-03-28 | 2012-05-22 | Hitachi, Ltd. | Instrument and method for collecting nucleic acids |
JP2015047285A (ja) * | 2013-08-30 | 2015-03-16 | 学校法人東京理科大学 | ガラスフィルタ及び細胞分離方法 |
-
1999
- 1999-03-08 JP JP11059742A patent/JP2000175683A/ja active Pending
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