DE2908957C2 - - Google Patents
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung
der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in
Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17b-Östradiol-Dehydrogenase
aus Plazenta in Gegenwart von NADP oder eines NADP-
Analogen sowie einer spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines
NADPH-bildenden Substrates einsetzt.
Die genaue Kenntnis der Menge von Steroidhormonen, insbesondere
der Menge Östron und Östradiol, die im Urin und im Plasma vorhanden
sind, hat für den Kliniker, insbesondere für den Gynäkologen,
eine wachsende Bedeutung bei der Feststellung einer sicheren
Diagnose und bei der Erstellung einer wirksamen Therapie,
insbesondere bei Ovarial-Insuffizienz, bei Störungen der Östrogen-
Biosynthese, bei der Überwachung problematischer Schwangerschaften
etc. Eine derartige Kenntnis macht es jedoch erforderlich,
daß man über Techniken der Östrogen-Bestimmung verfügt, die spezifisch,
genau und empfindlich, zuverlässig, reproduzierbar und
relativ wenig kostspielig sind und durchgeführt werden können,
ohne daß man von dem Techniker, der die Bestimmung durchführt,
besondere Fähigkeiten und Geschicklichkeiten fordern muß.
Im Laufe der letzten Jahre wurden mehrere Methoden zur Mikrobestimmung
von Östrogenen vorgeschlagen, die den Forderungen der
Kliniker entsprechen sollen. Die bislang am häufigsten verwendeten
Methoden der Mikrobestimmung sind:
die Mikrobestimmung durch Fluoreszenz,
die radioimmunologische Bestimmung.
die radioimmunologische Bestimmung.
Die erstere, d. h. die Bestimmung durch Fluoreszenz, bestimmt die
gesamten Phenole des Harnes, Östradiol, Östron und Östriol und umfaßt
vier Stufen: eine Stufe der Hydrolyse der konjugierten Verbindungen;
eine Stufe der Extraktion, welche eine kostspielige
und langwierige Phase der Bestimmung ist und die Handhabung
großer Mengen sehr reiner Lösungsmittel erfordert; eine Stufe
der Entwicklung des Chromophors; und eine Stufe der Ablesung.
Auf alle Fälle ist der Wert dieser Bestimmung begrenzt, da sie
keine große Spezifität hat und deshalb durch die Mediziner nur
mit der äußersten Vorsicht angewendet werden kann.
Was den zweiten Typ der bislang vorgeschlagenen Bestimmung anbelangt,
nämlich die radioimmunologische Bestimmung, obwohl sie
viel genauer als die Bestimmung durch Fluoreszenz ist und
die getrennte Bestimmung von Östradiol, Östron und Östriol im
Plasma erlaubt, hat sie jedoch den Nachteil, daß sie teuer ist und die
Verwendung von radioaktiven Isotopen erforderlich macht, wodurch
ihre Verwendung auf Laboratorien beschränkt ist, welche eine geeignete,
sehr kostspielige Einrichtung besitzen und aufgrund
einer speziellen Vereinbarung mit dem Gesundheitsministerium dazu
berechtigt sind.
Methoden zur enzymatischen Bestimmung von Östrogenen sind übrigens
in der Literatur beschrieben (M. HÄRKONEN, H. ADLERKREUZ,
E. V. GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 1974 Vol. 5, Seiten
717-725), aber infolge ihrer Schwierigkeit können sie nicht
klinisch verwendet werden. Diese Methoden beschreiben die Bestimmung
von Östradiol und Östron mit Hilfe von 17β-Östradiol-
Dehydrogenase aus der Placenta, welche mit NADP⁺ (Phospho-
Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid, Coenzym der Dehydrogenase) bzw.
NADPH verbunden ist, wobei das Östradiol von den anderen reaktiven
Steroiden, die im Plasma vorhanden sind, durch Chromatographie
über einer Aluminiumoxid-Kolonne gereinigt wird. Die enzymatische
Dismutation zwischen NADP⁺ und NADPH wird gemäß der
in der oben genannten Publikation beschriebenen Methode durchgeführt,
indem man Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) und
Glutamat-Dehydrogenase verwendet, wobei man eine Verstärkung von
10 000 erreicht; der enzymatische Kreislauf ist erforderlich, um
das während der Reaktion gebildete NADPH zu messen, weil im Plasma
der nicht-schwangeren Frau nur eine sehr geringe Konzentration
an Östradiol vorhanden ist (1 nMol/l). Das gebildete 6-Phosphogluconat
wird durch Fluorometrie unter Verwendung von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase
und NADP⁺ bestimmt. Es ist in dieser
Publikation angegeben, daß die beschriebene Methode eine Nachweisempfindlichkeit
von 25 fMol Steroid und eine Bestimmungsgenauigkeit
von 14% gestattet und daß ihre Spezifität vergleichbar
ist mit der radioimmunologischen Bestimmung. Doch weisen die
Autoren der Publikation auf die Schwierigkeit der Methode hin,
insbesondere beim enzymatischen Kreislauf, wodurch die Anwendung
ihrer Methode bei Routineanalysen im Laboratorium verhindert
wird.
Es wurde nun gefunden, daß die Schwierigkeit dieser Methode nicht
der einzige Grund ist, um ihre Verwendung für die enzymatische
Routinebestimmung im Laboratorium zu verhindern.
Wie ebenfalls aus dem Stand der Technik hervorgeht, ist es bekannt,
daß 17β-Östradiol-Dehydrogenase (das Enzym ist nach der
internationalen Klassifikation als E.C.1.1.1.62 bezeichnet) nicht
nur eine Dehydrogenase-Wirkung hat (NAD⁺ → NADH; NAD⁺ = Nikotinamid-
Adenin-Dinucleotid), sondern auch eine Transhydrogenase-
Wirkung hat: in Gegenwart von NADPH (in geringer Menge) findet
eine Übertragung und Bildung von NADH statt (wobei das Östrogen
in oxidierter oder reduzierter Form an dieser Transhydrierungsreaktion
teilnimmt).
Der Zyklus der Bildung von NADP → NADPH in Gegenwart eines Enzyms
wie Glucose-6-P-Dehydrogenase ist ebenfalls bekannt. Es genügt
daher, wenn der folgende Zyklus gebildet wird (der im Schema
1 dargestellt ist), unter solchen Konzentrationsbedingungen der Cofaktoren,
daß NADH in meßbaren Mengen entsteht, die proportional
der Konzentration an Östradiol und Östron sind:
Diese Methode der enzymatischen Bestimmung der Gesamt-Östrogene
Östron (E₁) + Östradiol (E₂) ist zwar viel einfacher als die
tatsächlich verwendeten Bestimmungsmethoden und theoretisch sehr
verlockend; leider ist sie in der Praxis jedoch nicht befriedigend,
insbesondere hinsichtlich der Genauigkeit der erhaltenen
Resultate: die Reaktionsgeschwindigkeit, die durch die Kinetik
des Auftretens von NADH bestimmt wird, ist nämlich eine Funktion
der Konzentration der Östrogene E₁ und E₂.
Nun ist die 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta mit zwei
Arten von Verunreinigungen behaftet, welche die Genauigkeit der
Bestimmung beträchtlich beeinflussen:
sie enthält Steroide, insbesondere Östradiol, in nicht vernachlässigbaren
Mengen, deren Anwensenheit die Resultate in
umso größerem Ausmaß verfälscht als es nötig ist, die 17β-
Östradiol-Dehydrogenase in relativ großen Mengen zu verwenden,
wodurch in das Milieu eine umso größere Menge an Verunreinigungen
eingebracht wird;
sie enthält als Verunreinigung auch andere nicht Östradiol-abhängige- Transhydrogenasen, deren Anwesenheit eine weitere Fehlerquelle darstellt.
sie enthält als Verunreinigung auch andere nicht Östradiol-abhängige- Transhydrogenasen, deren Anwesenheit eine weitere Fehlerquelle darstellt.
Die Verfahren gemäß dem Stand der Technik weisen die Nachteile
unzureichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, ungenügender
Spezifität und komplizierter Durchführungsweise auf.
Demgegenüber liegt vorliegender Erfindung die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁
und E₂ in biologischen Medien zu liefern, das einfach durchführbar
ist und mit großer Genauigkeit, Reproduzierbarkeit
und Spezifität funktioniert, welches den Anforderungen der
Praxis besser entspricht, als die bislang bekannten Verfahren
und insbesondere spezifisch, sehr genau, zuverlässig, wenig
kostspielig, relativ einfach durchführbar ist und im Vergleich
zu dem in der Literatur beschriebenen Verfahren zur
enzymatischen Bestimmung nicht nur die nicht Östradiol-abhängigen
Transhydrogenasen beseitigt, welche die 17β-Östradiol-
Dehydrogenase aus Placenta begleiten, welche zur Reduktion
von NAD in NADH eingesetzt wird, und auch eine totale
Eliminierung des mit der 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta
eingeschleppten Östradiols gewährleistet, so daß die enzymatische
Bestimmung unter so genauen und zuverlässigen Bedingungen
abläuft, wie sie im Stand der Technik nicht erreicht werden konnten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der
eingangs genannten Gattung dadurch gelöst,
daß man eine 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta verwendet,
die von Steroiden und verunreinigenden nicht
Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und
daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Analogen,
welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet.
Besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet,
daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-144), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17),
daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist,
daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers,
daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält, daß das dem Milieu zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.
daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-144), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17),
daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist,
daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers,
daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält, daß das dem Milieu zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.
Weitere besondere Ausführungsformen
sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestimmung in Gegenwart von NAD oder einem seiner Analogen durchgeführt wird, wie Acetyl-NAD oder Thio-NAD,
daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind,
daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10-3- bis 10-4-molar ist, diejenige des NADP 10-6- bis 10-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10-3 ist,
daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird,
daß die Proben der biologischen Media, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.
daß die Bestimmung in Gegenwart von NAD oder einem seiner Analogen durchgeführt wird, wie Acetyl-NAD oder Thio-NAD,
daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind,
daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10-3- bis 10-4-molar ist, diejenige des NADP 10-6- bis 10-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10-3 ist,
daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird,
daß die Proben der biologischen Media, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.
Beansprucht wird weiterhin eine anwendungsfertige Kombination
zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur) das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10-2-10-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10-6-10- 8 M,
Glucose-6-P: 10-2-10-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1% Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur) das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10-2-10-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10-6-10- 8 M,
Glucose-6-P: 10-2-10-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1% Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.
Besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, + 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A + 2 ×10-3 M NAD, 2×10-6 M NADP, 2×10-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht,
daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält, besteht.
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, + 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A + 2 ×10-3 M NAD, 2×10-6 M NADP, 2×10-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht,
daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält, besteht.
Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens - im Gegensatz
zu den klassischen enzymatischen Bestimmungen - verschwindet
die zu bestimmende Substanz, im vorliegenden Falle die Östrogene
E₁ und E₂, nicht; sie ist nicht der limitierende Faktor der Reaktionsgeschwindigkeit
und die Menge des gebildeten NADH ist direkt
proportional der Östrogen-Konzentration.
Es wurde gefunden, daß die absoluten und relativen Mengenverhältnisse
des in das Milieu eingeführten NAD bzw. NADP beträchtlich
zur Genauigkeit der Bestimmung beitragen, indem die Menge des
vorhandenen NADP nicht die oben angegebenen Mengenverhältnisse
überschreiten darf, da sonst die Aktivität des Enzyms 17β-Östradiol-
Dehydrogenase behindert und deshalb die Resultate verfälscht
werden.
Die Antriebskraft zu der gesamten Dosierung besteht nämlich in
den Umwandlungen von E₁ und E₂ und dann von E₂ in E₁ (wie weiter
oben im Schema 1 angegeben). Diese Umwandlungen führen in jedem
Cyclus zur Bildung einer stöchiometrischen Menge NADH.
Diese Umwandlungen verlaufen während der Inkubationszeit.
So entsteht am Ende von x Cyclen, welche einer bestimmten
Inkubationsdauer entsprechen, eine Menge NADH, die dem x-fachen
der stöchiometrischen Menge des Substrats (E₁ und/oder E₂), im
Milieu entspricht, welche Menge NADH dann gut feststellbar ist.
Außer den oben genannten Ausführungsformen betrifft die Erfindung
auch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung
hervorgehen.
In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren
näher erläutert, ohne daß die Erfindung hierauf
beschränkt werden soll.
Man versetzt 3,5 ml Plasma mit 100 µl Natriumpyrophosphat-
Puffer (0,1 M, pH 9). Der pH-Wert der Plasmaprobe beträgt
dann 8,9.
Anschließend extrahiert man zwei Mal mit 3 ml Äther und der
angereicherte Extrakt wird dann unter Stickstoff eingedampft
und auf 2 ml konzentriert, dann zwei Mal mit 1 ml Natriumcarbonat
(1 Promille) gewaschen. Dann wird der Äther zur
Trockne abgedampft und der Trockenrückstand in 1 ml 2 M-
Natronlauge aufgenommen. Die wäßrige Phase wird dann zwei
Mal mit 2 ml Benzol/Heptan (2 : 1 V/V) gewaschen, dann mit
200 µl 10 M H₃PO₄ neutralisiert und zwei Mal mit 3 ml Äther
extrahiert. Nach dem Abdampfen wird der Rückstand mit 100 µl
Äthanol und 250 µl Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,4) aufgenommen,
der 1 Promille Rinder-Serumalbumin und 20% Glycerin enthält.
Die Östrogenbestimmung wird mit 100 µl dieses Extrakts durchgeführt.
Das Reaktionsmilieu besteht aus 1 ml Tris-HCl-Puffer (0,05 M,
pH 7,4), der 5 Promille Serumalbumin, 5×10-3 M Glucose-6-P,
5×10-4 M NAD, 5×10-7 M NADP, 0,1 IE Glucose-6-P-Dehydrogenase
und 0,03 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält. Die Östrogen-
Konzentration des Extrakts beträgt 0,02 bis 2 pMol.
Die Inkubationsdauer beträgt 6 bis 16 Stunden bei 25°C.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bei 340 nm mit Hilfe eines
Spektralphotometers gemessen.
Die Adsorption (bei 340 nm) der verschiedenen Östrogen-
Konzentrationen enthaltenden Lösungen wird am Ende
der Inkubationsdauer gemessen.
Die optische Dichte bei 340 nm wird nach 6 bis 16
Stunden Reaktionsdauer bestimmt. Die beigefügte Abbildung
zeigt die Kurve I für den Standard, erhalten
mit Östradiolmengen zwischen 0,020 und 2 Picomol, das
heißt, 5 bis 500 pg nach 6 Stunden Reaktionsdauer; die
Kurve II gibt die optische Dichte wieder, die man bei
den gleichen Mengen Östradiol nach 16 Stunden Inkubation
erhält.
Die Eichkurve verläuft in einem sehr großen Bereich
linear. Sie deckt den Bereich der physiologisch auftretenden
Konzentrationen, einschließlich derjenigen
des nicht geschlechtsreifen Kindes und des Mannes, ab.
Normalerweise ist bei den Bestimmungen durch die fluorometrischen
Methoden, die derzeit im Stand der Technik durchgeführt
werden, die Empfindlichkeit begrenzt durch das
Ausmaß der Hintergrund-Fluoreszenz, welche durch den biologischen
Extrakt beigetragen wird. Nach der erfindungsgemäßen
Bestimmungsmethode ist es wegen der großen Verstärkung
nicht nötig, die Ablesungen durch Fluoreszenz
oder in einem sehr hohen Empfindlichkeitsbereich durchzuführen.
Aus diesem Grunde ist die durch den biologischen
Extrakt beigetragene Absorption vernachlässigbar, gegenüber
den Absorptionen
der Produkte der enzymatischen Reaktion.
Die Entnahme wird mit vor dem Aufstehen entnommenem Urin
durchgeführt. Man stellt 1 ml Urin auf einen pH-Wert von
6,5 bis 7 ein, indem man 50 µl (0,1 M) Citratpuffer zusetzt.
Diese Lösung wird mit einem Tropfen "β-Glucuronidase"-Pasteur
30 Minuten bei 37°C behandelt. Die Röhrchen
werden dann abgekühlt und mit 1 ml Äthanol versetzt, die
Mischung etwa 30 Minuten auf 24°C gehalten und dann bei
4000 g zentrifugiert. Der Überstand wird zur Hälfte
mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 1 Promille Rinder-Serumalbumin,
20% Glycerin verdünnt. Die Dosierung wird mit 100 µl dieses
Extraks durchgeführt.
Man verwendet die folgenden Puffer:
Puffer A:
Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 20% Glycerin, 1 Promille BSA
Puffer B:
Puffer A + 2×10-3 M NAD, 2×10-6 M NADP, 2×10-3 M
Glucose-6-Phosphat, 0,2 Einheiten pro ml Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase;
Puffer C:
Puffer A + 1600 pg Östradiol pro ml.
Puffer A:
Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 20% Glycerin, 1 Promille BSA
Puffer B:
Puffer A + 2×10-3 M NAD, 2×10-6 M NADP, 2×10-3 M
Glucose-6-Phosphat, 0,2 Einheiten pro ml Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase;
Puffer C:
Puffer A + 1600 pg Östradiol pro ml.
Für jede Probe verwendet man 3 Röhrchen, welche 100 µl der
Urinverdünnung und die folgende Mengereaktionskomponenten
enthalten:
Röhrchen 1:
Kontrolle = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B
Röhrchen 2:
Bestimmung = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B + 0,025 IE β-Östradiol-Dehydrogenase
Röhrchen 3:
Überschuß = 0,5 ml Puffer B + 0,5 ml Puffer C + 0,25 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase.
Kontrolle = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B
Röhrchen 2:
Bestimmung = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B + 0,025 IE β-Östradiol-Dehydrogenase
Röhrchen 3:
Überschuß = 0,5 ml Puffer B + 0,5 ml Puffer C + 0,25 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase.
Die Röhrchen werden 4 bis 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die optische Dichte wird bei 349 nm nach dieser Inkubationsdauer
bestimmt.
Die Konzentration der in den Proben enthaltenen Östrogene
wird im Vergleich zu dem Absorptionswert des Überschusses
mit Hilfe der folgenden Formel berechnet
C: Östrogen-Konzentration im Urin oder Plasma (µg/Liter);
800: entspricht dem Östradiol-Überschuß in dem Röhrchen;
X: Volumen des entnommenen biologischen in Mikroliter. Im vorliegenden Beispiel ist es 1000 µl im Falle des Plasmas und 25 µl im Falle von Urin.
800: entspricht dem Östradiol-Überschuß in dem Röhrchen;
X: Volumen des entnommenen biologischen in Mikroliter. Im vorliegenden Beispiel ist es 1000 µl im Falle des Plasmas und 25 µl im Falle von Urin.
Die spezifische Bestimmung von Östradiol kann durchgeführt
werden unter der Voraussetzung, daß man vorher das Östron
des Mediums mit Hydrazin reagieren läßt.
Zu diesem Zweck läßt man 0,5 ml des biologischen Mediums
(Plasma oder Urin mit Glucuronidase hydrolysiert) mit 100 µl
einer wäßrigen Hydrazinlösung (5 M, mit HCl auf pH 7 bis 8
gebracht) 30 Minuten bei 37°C reagieren. Das Östradiol
wid nach der vorher in Beispiel 1 und 2 beschriebenen
Methode bestimmt.
Aus der vorgehenden Beschreibung resultiert, daß unabhängig
von den Ausführungsarten ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung
von Östrogenen E₁ und E₂ erhalten wird, welches im
Vergleich zu den bislang bekannten Bestimmungsmethoden wesentliche
Vorteile besitzt, von denen einige schon vorher
erwähnt wurden, insbesondere:
- - das Verfahren ist sehr wenig kostspielig hinsichtlich der Reaktionskomponenten und Materialien, wobei man nur ein Photometer im nahen U.V. benötigt.
- - Man braucht keine Radioisotope.
- - Das Verfahren ist leicht automatisierbar und direkt bei im Handel erhältlichen automatischen Systemen verwendbar.
- - Von Vorteil ist ferner die große Stabilität der Reaktionskomponenten und Enzyme, die eine unerläßliche Voraussetzung einer Kommerzialisierung in großem Umfange ist.
- - Das Verfahren kann in einem sehr breiten biologischen Bereich angewandt werden.
- - Es gibt keine Neben-Reaktion.
- - Das Verfahren hat eine sehr hohe Spezifität.
- - Es werden keine Enzyme zerstört.
- - Das Verfahren ist einfach, zuverlässig, völlig reproduzierbar und sehr empfindlich.
- - Man kann das Verfahren bei einer großen Anzahl biologischer Medien anwenden.
- - Man kann das Verfahren bei biologischen Medien, wie zum Beispiel Urin, anwenden, ohne vorher die Östrogene extrahieren zu müssen oder indem man relativ einfache und schnelle Extraktions- oder Reinigungsmethoden anwendet.
Wie aus dem Obigen ersichtlich wird, ist die Erfindung nicht
auf die ausführlich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt;
sie umfaßt vielmehr alle Varianten, die dem Fachmann
aufgrund der Beschreibung einfallen, ohne vom Rahmen der
Erfindung abzuweichen.
Claims (16)
1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene
E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in
Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17β-
Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta in Gegenwart
von NADP oder eines NADP-Analogen sowie einer
spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines NADPH-
bildenden Substrates einsetzt,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine 17b-Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta
verwendet, die von Steroiden und verunreinigenden nicht
Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und
daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Anlogen,
welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der
folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase
(internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15),
Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation
1-1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale
Klassifikation 1-1-1-44), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
(G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd-
Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-
1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation
1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase
(internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)),
L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale
Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale
Klassifikation 1-2-1-17).
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat)
ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym
G6PDH ist.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet,
das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in
der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich
oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein
ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß das dem Medium zugesetzte Protein Serum-Albumin,
insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.
7. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestimmung in Gegenwart von
Acetyl-NAD
oder Thio-NAD
durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß
vorhanden sind.
9. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10-3- bis
10-4-molar ist, diejenige des NADP 10-6- bis 10-7-
molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu
NADP etwa 10+3 ist.
10. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten
und die zu bestimmenden Substanzen
enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12
Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer
Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25
bis 38°C inkubiert wird.
11. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Proben der biologischen Medien, welche die zu
bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem
Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions-
und/oder Reinigungsverfahren unterworfen
werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende
biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher
einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B.
Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den
geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den
letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem
polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke
praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers
ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins
ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie
15 bis 25% eines Polyols enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende
biologische Medium aus Urin besteht, dieses
vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines
die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms,
wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.
14. Anwendungsfertige Kombination zur Durchführung des
Verfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur), das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10-2-10-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10-6-10-8 M,
Glucose-6-P: 10-2-10-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1%,
Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur), das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10-2-10-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10-6-10-8 M,
Glucose-6-P: 10-2-10-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1%,
Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.
15. Kombination gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von
Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, 0,5 Promille
bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A mit 2
×10-3 M NAD, 2×10-6 M NADP, 2×10-3 M Glucose-
6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml
(Puffer B) besteht.
16. Kombination gemäß Anspruch 14 und 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß der innere Standard aus einem Gemisch des
obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600
Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol-
Dehydrogenase enthält, besteht.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR7806807A FR2419519A1 (fr) | 1978-03-09 | 1978-03-09 | Perfectionnements apportes aux procedes de dosage d'oestrogenes et ensemble pret a l'emploi pour la realisation desdits dosages |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2908957A1 DE2908957A1 (de) | 1979-09-27 |
DE2908957C2 true DE2908957C2 (de) | 1990-05-17 |
Family
ID=9205562
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19792908957 Granted DE2908957A1 (de) | 1978-03-09 | 1979-03-07 | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von oestrogenen sowie anwendungsfertige kombination zur durchfuehrung derselben |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2908957A1 (de) |
FR (1) | FR2419519A1 (de) |
GB (1) | GB2017906B (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL57135A (en) * | 1979-04-25 | 1982-12-31 | Abic Project Partnership | Method for the determination of a factor or factors which enhances the cortisol metabolism in lymphocytes or leucocytes |
FR2547926B1 (fr) * | 1983-06-27 | 1986-05-23 | Biomerieux Sa | Procede de dosage des oestrogenes et des androgenes par amplification et bioluminescence |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1397406A (en) * | 1971-06-22 | 1975-06-11 | Nyegaard & Co As | Enzymic reagent |
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1978
- 1978-03-09 FR FR7806807A patent/FR2419519A1/fr active Granted
-
1979
- 1979-03-07 DE DE19792908957 patent/DE2908957A1/de active Granted
- 1979-03-08 GB GB7908208A patent/GB2017906B/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2419519B1 (de) | 1981-08-14 |
FR2419519A1 (fr) | 1979-10-05 |
GB2017906A (en) | 1979-10-10 |
DE2908957A1 (de) | 1979-09-27 |
GB2017906B (en) | 1983-02-23 |
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