DE60022665T2

DE60022665T2 - Immunstimulierende nukeinsäuren

Info

Publication number: DE60022665T2
Application number: DE60022665T
Authority: DE
Inventors: M. Arthur 540 EM RB Iowa City KRIEG; Christian Max-Volmer Strabe 4 SCHETTER; Jörg VOLLMER
Original assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 1999-09-25
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2020-09-26
Also published as: EP1700603A3; EP1700603A2; NO20021453D0; UA77152C2; EE200200158A; BG106538A; OA12028A; DK1221955T3; RU2002111006A; EP1221955B9; ES2248126T3; AP2002002484A0; PL354997A1; HK1047697A1; HRP20020249A2; US20070066554A1; CN1454091A; EP1221955B1; WO2001022972A3; HUP0202639A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bakterielle DNA, aber nicht Vertebraten-DNA, weist in vitro direkte immunstimulatorische Wirkungen auf mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) auf (Krieg et al., 1995). Bakterielle DNA weist immunstimulatorische Wirkungen dahingehend auf, dass B-Zellen und natürliche Killerzellen aktiviert werden, wohingegen Vertebraten-DNA diese Eigenschaft nicht aufweist (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962 ; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147 :1759-1764 ; und Review in Krieg, 1998, In : Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein und A.M. (Hrsg.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, Seiten 431-448). Man versteht nun, dass diese immunstimulatorischen Wirkungen von bakterieller DNA das Ergebnis der Anwesenheit von unmethylierten CpG-Dinukleotiden in speziellen Basenkontexten (CpG-Motiven) sind, die bei bakterieller DNA üblich sind, aber bei Vertebraten-DNA methyliert und unterrepräsentiert sind (CpG-Supression), 1/50 bis 1/60) (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Die immunstimulatorischen Wirkungen von bakterieller DNA kann durch synthetische Oligodeoxynukleotide (ODN) nachgeahmt werden, die diese CpG-Motive enthalten. Es erscheint wahrscheinlich, dass sich die schnelle Immunaktivierung in Reaktion auf CpG-DNA als ein Bestandteil der angeborenen Immunverteidigungsmechanismen entwickelt haben kann, die Strukturmuster erkennen, die für mikrobielle Moleküle spezifisch sind.
CpG-ODN weisen in hohem Maße stimulatorische Wirkungen auf menschliche und murine Leukozyten auf, induzieren die Proliferation von fast allen (> 95%) B-Zellen und erhöhen die Immunglobulin (Ig)-Sekretion; die Zytokin-Sekretion; die lytische Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) und die IFN-γ-Sekretion; und die Aktivierung von dendritischen Zellen (DCs) und anderen Antigen-präsentierenden Zellen, um co-stimulatorische Mokelüle zu exprimieren und Zytokine zu sekretieren, insbesondere die Th1-ähnlichen Zytokine, die für die Förderung der Entwicklung von Th1-ähnlichen CpG Zellantworten wichtig sind. Die Aktivierung von B-Zellen durch CpG-DNA ist T-Zellen-unabhängig und Antigenunspezifisch. Die Aktivierung von B-Zellen durch niedrige Konzentration an CpG-DNA weist eine starke Synergie mit Signalen auf, die durch den B-Zellantigenrezeptor vermittelt werden, hinsichtlich sowohl der B-Zellproliferation als auch der Ig-Sekretion (Krieg et al., 1995). Diese starke Synergie zwischen den Signalwegen der B-Zellen, die durch den B-Zellantigenrezeptor und durch CpG-DNA ausgelöst werden, fördert Antigen-spezifische Immunantworten. Zusätzlich zu seiner direkten Wirkungen auf B-Zellen aktiviert CpG-DNA auch direkt Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen, um eine Vielzahl von Zytokinen zu sekretieren, einschließlich hoher Titer an IL-12 (Klinman et al., 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery et al., 1996). Diese Zytokine stimulieren natürliche Killerzellen (NK-Zellen), g-Interferon (IFN-γ) zu sekretieren und weisen eine erhöhte lytische Aktivität auf (Klinman et al., 1996, aaO; Cowdery et al., 1996, aaO; Yamamoto et al., 1992; Ballas et al., 1996). Insgesamt induziert CpG-DNA ein Thl-ähnliches Muster an Zytokinproduktion, das von IL-12 und IFN-γ dominiert wird bei einer geringen Sekretion von Th2-Zytokinen (Klinmann et al., 1996). Die starken direkten Wirkungen (T-Zell-unabhängig) von CpG-DNA auf T-Zellen, ebenso wie die Induktion von Zytokinen, die indirekte Wirkungen auf B-Zellen vermittels der T-Helfersignalwege haben könnten, schlägt die Verwendbarkeit von CpG-DNA in der Form von ODN als ein Vakzin-Adjuvans vor (siehe PCT-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 98/40100).
Diese immunstimulatorischen Wirkungen nativer CpG-ODN mit Phosphodiesterrückgrat sind in hohem Maße insoweit CpG-spezifisch, als dass diese Wirkungen im wesentlichen fehlen, wenn das CpG-Motiv methyliert, zu GpC gändert, oder anderweitig beseitigt oder geändert ist (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Harmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). CpG-ODN-Phospodiester können in Lipiden, Aluminium oder anderen Arten von Vehikeln mit Depot-Eigenschaften oder verbesserter Zellaufnahme formuliert werden, um die immunstimulatorischen Wirkungen zu verbessern (Yamamoto et al, 1994 Microbiol. Immunol. 38:831-836; Gramzinski et al, 1998 Mol. Med. 4:109-118).
In frühen Studien ging man davon aus, dass das immunstimulatorische CpG-Motiv der Formel Purin-Purin-CpG-Pyrimidin-Pyrimidin folgt (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17 :6230-6240 ; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Es ist jedoch nun klar, dass Mäuselymphocyten sehr gut auf Phosphodiester-CpG-Motive antworten, die nicht unter diese „Formel" fallen (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) und gleiches gilt für menschliche B-Zellen und dendritische Zellen (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Eine Reihe von früheren Forschern haben überprüft, ob der Nukleotidgehalt von ODN Wirkungen aufweisen kann, die von der Sequenz des ODN unabhängig sind. Interessanterweise hat man festgestellt, dass Antisense-ODN im allgemeinen hinsichtlich des Gehaltes von GG-, CCC-, CC-, CAC-, und CG-Sequenzen angereichert sind, während sie eine verringerte Häufigkeit an TT oder TCC-Nukleotidsequenzen verglichen mit dem aufwiesen, was man erwarten würde, wenn die Basenverwendung zufällig wäre (Smetsers et al., 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Develop. 6:63-67). Dies eröffnete die Möglichkeit, dass überrepräsentierte Sequenzen bevorzugte Zielelemente für Antisense-Oligonukleotide umfassen könnten oder umgekehrt. Ein Grund, die Verwendung von Thymidin-reichen ODN für Antisense-Experimente zu vermeiden, besteht darin, dass der Abbau von ODN durch Nukleasen, die in Zellen vorhanden sind, freies Thymidin freisetzen, das mit ³H-Thymidin kompetiert, das häufig bei Versuchen verwendet wird, um Zellproliferation zu bewerten (Matson et al., 1992 Antisense Research and Development 2:325-330).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINIDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise Pyrimidin-reiche (Py-reiche) und in einigen Ausführungsformen Thymidin (T)-reiche immunstimulatorische Nukleinsäuren, die nicht die Anwesenheit eines CpG-Motivs erfordern. Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise auch die Entdeckung, dass Nukleinsäuren, die ein TG-Dinukleotidmotiv enthalten, auch immunstimulatorisch sind. Die Erfindung basiert teilweise auf der unerwarteten Beobachtung, dass Nukleinsäuresequenzen, die keine CpG-Motive enthalten, immunstimulatorisch sind. Es wurde nach Analyse der Immunstimulationseigenschaften vieler Nukleinsäuresequenzen entdeckt, dass diese Sequenzen Py-reich sein können, d. h. T-reich, oder dass sie TG-Motive enthalten können. Es wurde auch festgestellt, dass diese Sequenzen bevorzugterweise Immunzellen von Nicht-Nagetieren aktivieren. Die Py-reichen und TG-Sequenzen sind nur minimal immunstimulatorisch bezüglich Immunzellen von Nagetieren verglichen mit Immunzellen von Nicht-Nagetieren. Es ist somit gemäß dem Verfahren der Erfindung möglich, eine Immunantwort in einem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren, indem Pyreiche und TG-immunstimulatorische Nukleinsäuren verabreicht werden. Die Py-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren der Erfindung können optional CpG-Motive enthalten. Diese Beobachtungen haben wichtige Implikationen für die klinische Entwicklung von immunstimulatorischen CpG-enthaltenden und nicht-CpG-enthaltenden Nukleinsäuren.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge umfasst, um eine Immunantwort isolierter Py-reicher oder TG-immunsimulatorischer Nukleinsäuren zu stimulieren und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In anderen Aspekten ist die Erfindung eine Stoffzusammensetzung, die eine isolierte Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure umfasst. Bei anderen Ausführungsformen kann die immunstimulatorische Nukleinsäure T-reich ist. In noch weiteren Ausführungsformen kann die immunstimulatorische Nukleinsäure T-reich sein und auch wenigstens ein TG-Motiv umfassen.
Bevorzugterweise ist die Py-reiche Nukleinsäure eine T-reiche Nukleinsäure. In einigen Ausührungsformen ist die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine Poly-T-Nukleinsäure, die 5'TTTT3' umfasst. In noch weiteren Ausführungsformen umfasst die Poly-T-Nukleinsäure 5'X₁X₂TTTTX₃X₄3', wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind. In einigen Ausführungsformen ist X₁X₂ TT und/oder X₃X₄ TT. In anderen Ausführungsformen ist X₁X₂ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA und GC; und/oder ist X₃X₄ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA, und GC.
Die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure kann nur ein einzelnes Poly-T-Motiv oder es kann eine Vielzahl von Poly T-Nukleinsäuremotive enthalten. In einigen Ausführungsformen umfasst die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7 oder wenigstens 8 T-Motive. In anderen Ausführungsformen umfasst sie wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7 oder wenigstens 8 CpG-Motive. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Vielzahl von CpG-Motiven und Poly-T-Motiven eingestreut.
In noch weiteren Ausführungsformen umfasst wenigstens eines aus der Vielzahl von Poly-T-Motiven wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7, wenigstens 8 oder wenigstens 9 aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste. In anderen Ausführungsformen beträgt die Vielzahl von Poly-T-Motiven wenigstens 3 Motive und wobei wenigstens 3 Motive jeweils wenigstens drei aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfassen oder die Vielzahl von Poly-T-Motiven beträgt wenigstens 4 Motive und wobei die wenigstens 4 Motive jeweils wenigstens 3 aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfassen.
In einigen Fällen kann die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure frei von Poly-T-Motiven sein, kann aber stattdessen eine Nukleotidzusammensetzung von mehr al 25% T aufweisen. In anderen Ausführungsformen weisen die T-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäuren Poly-T-Motive auf und umfassen auch eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25% T. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 35% T, von mehr als 40% T, von mehr als 50% T, von mehr als 60% T, von mehr als 80% T oder mehr als 90% T-Nukleotidreste. In wichtigen Ausführungsformen weist die Nukleinsäure wenigstens 50% T auf.
Die T-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren können eine jegliche Länge von mehr als 7 Nukleotiden aufweisen, können aber in einigen Ausführungsformen eine Länge von zwischen 8 und 100 Nukleotidresten aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure wenigstens 20 Nukleotide, wenigstens 24 Nukleotide, wenigstens 27 Nukleotide oder wenigstens 30 Nukleotide. In bevorzugten Ausführungsformen weist die TG-immunstimulatorische Nukleinsäure eine Länge von zwischen 10 und 25 Nukleotiden auf. Die T-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die immunstimulatorische Nukleinsäure einen T-reichen Bereich auf, der in der Mitte ihrer Länge angeordnet ist (d. h. eine in etwa gleiche Anzahl von Nukleotiden flankiert den T-reichen Bereich an seinem 5' und 3'-Ende).
Die T-reiche Nukleinsäure ist in einigen Ausführungsformen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 und 910-913. In anderen Ausführungsformen sind die T-reichen Nukleinsäuren Sequenzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 und 891.
In anderen Ausführungsformen ist die Py-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine C-reiche Nukleinsäure. Eine immunstimulatorische C-reiche Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die wenigstens einen und bevorzugterweise wenigstens 2 Poly-C-Bereiche aufweist und die 50% oder mehr C-Nukleotide enthält.
Die Py-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren können ein oder mehrere CpG-Motive enthalten. Die Motive können methyliert oder unmethyliert sein. In anderen Ausführungsformen sind die Py-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren frei von einem oder mehreren CpG-Dinukleotiden.
In anderen Ausführungsformen umfassen die Py-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukeinsäuren auch Poly-A, Poly-G, und/oder Poly-C-Motive. In noch weiteren Ausführungsformen ist die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure frei von zwei Poly-C-Sequenzen aus wenigstens drei aufeinanderfolgenden C-Nukleotidresten oder ist frei von zwei Poly-A-Sequenzen aus wenigstens drei aufeinanderfolgenden A-Nukleotidresten. In anderen Ausführungsformen umfasst die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25% C oder mehr als 25% A. In noch weiteren Ausführungsformen ist die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure frei von Poly-C-Sequenzen, Poly-D-Sequenzen oder Poly-A-Sequenzen.
Eine Poly-G-Nukleinsäure ist in einigen Ausführungsformen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 und 938. In anderen Ausführungsformen umfasst die Poly-G-Nukleinsäure eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus SEQ ID NO 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 und 937.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können die immunstimulatorischen Nukleinsäuren als solche definiert werden, die ein TG-Motiv besitzen, hierin als TG-immunstimulatorische Nukleinsäuren bezeichnet. Die TG-Nukleinsäure enthält in einer Ausführungsform wenigstens ein TG-Dinukleotid mit einer Sequenz, die wenigstens die folgende Formel enthält: 5'N₁X₁TGX₂N₂3'. In verwandten Ausführungsformen ist N₁ eine Nukleinsäuresequenz, die aus einer Anzahl von Nukleotiden besteht, die von (11-N₂) bis (21-N₂) reicht, und N₂ ist eine Nukleinsäuresequenz, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (11-N₁) bis (21-N₁) reicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X₂ Thymidin.
In weiteren Ausführungsformen weist die TG-Nukleinsäure wenigstens die folgende Formel auf: 5'X₁X₂TGX₃X₄3'. In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst die TG-Nukleinsäure die folgende Sequenz: 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3'. In einer verwandten Ausführungsform ist N₁ eine Nukleinsäuresequenz, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9-N₂) bis (19-N₂) reicht, und N₂ ist eine Nukleinsäuresequenz, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9-N₁) bis (19-N₁) reicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X₃ Thymidin. X₁X₂ sind Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sein können, bestehend aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT, und X₃X₄ sind Nukleotide, die ausgewählt sein können aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA und CA. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist X₃ ein Thymidin. In wichtigen Ausführungsformen sind X₃X₄ Nukleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus TT, TC, TA und TG. In anderen Ausführungsformen sind X₁X₂ GA oder GT und X₃X₄ TT. In noch weiteren Ausführungsformen sind X₁ oder X₂ oder beide Purine und X₃ oder X₄ oder beide Pyrimidine oder X₁X₂ sind GpA und X₃ oder X₄ oder beide sind Pyrimidine. In einer Ausführungsform ist X₂ ein T und X₃ ein Pyrimidin.
In einer Ausführungsform ist die 5'X₁X₂TGX₃X₄3'-Sequenz der TG-Nukleinsäure oder die gesamte Länge oder ein Fragment davon der TG-Nukleinsäure eine nicht-palindromische Sequenz und in anderen Ausführungsformen ist sie eine palindromische Sequenz.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die TG-Nukleinsäure auch T-reich.
Die Py-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren weisen in einigen Ausführungsformen ein Nukleotidrückgrat auf, das wenigstens eine Rückgratmodifikation enthält, wie beispielsweise eine Phosphorthioatmodifikation. Das Nukleotidrückgrat kann chimär sein oder das Nukleotidrückgrat ist bevorzugterweise vollständig modifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die immunstimulatorische Nukleinsäure ein Poly-T-Motiv auf und ein Phosphorthioatrückgrat.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung eine Zusammensetzung aus einer immunstimulatorischen Nukleinsäure in der Form einer Py-reichen oder TG-Nukleinsäure, und einem Antigen, wobei die Nukleinsäure frei von unmethylierten CpG-Motiven ist.
Eine weitere Zusammensetzung der Erfindung ist eine Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure und ein anti-mikrobielles Agens, wobei die Py-reiche oder TG-Nukleinsäure frei von unmethylierten CpG-Motiven ist. Bevorzugterweise ist das anti-mikrobielle Agens ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein antivirales Agens, ein antivirales Mittel, ein Parasitenmittel, ein antibakterielles Mittel und ein Pilzmittel.
Eine Zusammensetzung mit einer Depot-Wirkungsvorrichtung, die eine Py-reiche und/oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure enthält, wobei die Py-reiche und/oder TG-Nukleinsäure frei von unmethylierten CpG-Motiven ist, wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bereitgestellt.
Die Erfindung umfasst auch Nahrungsergänzungen aus einer Py-reichen oder TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure in einer Abgabevorrichtung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer Kapsel, einer Pille und einer sublingualen Tablette, wobei die Py-reiche oder TG-Nukleinsäure frei von nicht-methylierten CpG-Motiven ist.
Es sollte verstanden werden, dass, wenn es nützlich ist ein Py-reiches, d. h. Poly-T-, T-reiches, C-reiches oder TG-Oligonukleotid, und ein CpG-Oligonukleotids zu verabreichen, es auch wünschenswert sein kann, ein Py-reiches oder ein TG-Oligonukleotid zusammen mit einem physikalisch getrennten CpG-, Py-reichen- oder TG-Oligonukleotid zu verabreichen. Alternativ kann das CpG-, Py-reiche oder TG-Motiv auf der gleichen durchgängigen Nukleinsäure vorhanden sein wie das Py-reiche oder TG-Oligonukleotid. In noch einer weiteren Ausführungsform können alle oder eine Kombination aus Py-reichen-, TG- und CpG-Nukleinsäuren gemeinsam entweder auf getrennten Nukleinsäuren oder in dem gleichen Nukleinsäuremolekül verabreicht werden. Unter gemeinsamer Verabreichung soll verstanden werden, dass die Nukleinsäuren eng genug zeitlich zueinander verabreicht werden, um einen kombinierten Vorteil beider Oligonukleotide zu erreichen, der bevorzugterweise bei der gleichen Dosis größer ist als der durch Verabreichung eines jeden einzelnen Oligonukleotids alleine erreichte.
CpG-Oligonukleotide weisen, im allgemeinen, die Formel 5'X₁X₂CGX₃X₄3' auf, wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind und wobei wenigstens das C von CpG nicht-methyliert ist. Bevorzugterweise sind CpG-Oligonukleotide 8 bis 100 Nukleotide lang und weisen modifizierte Rückgrate auf. Besondere Strukturen sind in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen, US-Anmeldungen und darin angeführten Literaturstellen detailliert angegeben, deren Offenbarung hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind. In einer Ausführungsform ist das CpG-Oligonukleotid frei von Poly-T- und TG-Motiven und ist nicht T-reich.
In anderen Ausführungsformen weist das CpG-Oligonukleotid eine Sequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 und 909-913.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Py-reiche oder TG-Oligonukleotid frei von einem CpG-Motiv. Diese Ausführungsform der Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits, die sowohl ein CpG-Oligonukleotid (das frei von Poly-T- und TG-Motiven und nicht T-reich sein kann) als auch ein Py-reiches und/oder TG-Oligonukleotid enthalten, das physikalisch von dem CpG-Oligonukleotid getrennt ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen liegen in wirksamen Mengen vor und umfassen typischerweise pharmazeutisch akzeptable Träger, die detaillierter hierin unter Bezugnahme auf Py-reiche und TG-Oligonukleotide dargestellt sind. Die Kits umfassen wenigstens ein Gefäß, das ein Oligonukleotid enthält, das ein Py-reiches oder TG-Oligonukleotid (oder irgendeine Kombination davon) ist. Das gleiche Gefäß, oder in anderen Ausführungsformen ein zweites Gefäß, kann ein Oligonukleotid mit einem CpG-Nukleotid enthalten, das frei von Py-reichen und/oder TG-Motiven ist. Der Kit kann auch Anweisungen zur Verabreichung der Oligonukleotide an ein Lebewesen enthalten. Die Kits können ein Gefäß enthalten, das ein Lösungsmittel oder ein Verdünnungsmittel enthält.
Zusammengefasst kann, wenn es vollständig hierin angeführt wäre, ein CpG-Oligonukleotid, das physikalisch von dem Py-reichem oder TG-Oligonukleotid getrennt ist, zusammen mit den Py-reichen oder TG-Oligonukleotiden bei Verfahren, Zusammensetzungen und Produkten verwendet werden, wie sie oben beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft in anderen Aspekten immunstimulatorische Oligonukleotide, die chimäre Rückgrate aufweisen und die nicht die Anwesenheit eines CpG-Motivs erfordern. Die Erfindung basiert teilweise auf einer Entdeckung, dass Nukleinsäuresequenzen, die keine CpG-Motive enthalten, immunstimulatorisch waren und dass jene, die chimäre Rückgrate enthalten, unerwarteterweise erhöhte immunstimulierende Eigenschaften aufwiesen. Die Erfindung betrifft somit in einem Aspekt eine Zusammensetzung aus einem Oligonukleotid mit einer Formel: 5'Y₁N₁ZN₂Y₂3', wobei Y₁ und Y₂ unabhängig voneinander Nukleinsäuremoleküle sind mit zwischen 1 und 10 Nukleotiden, wobei Y₁ wenigstens eine modifizierte Internukleotidverbindung und Y₂ wenigstens eine modifizierte Internukleotidverbindung umfasst und wobei N₁ und N₂ Nukleinsäuremoleküle sind, jeweils unabhängig voneinander, mit zwischen 0 und 5 Nukleotiden, wobei aber N₁ZN₂ mindestens 6 Nukleotide insgesamt umfasst und wobei die Nukleotide von N₁ZN₂ ein Phosphodiesterrückgrat aufweisen und worin Z ein immunstimulatorisches Nukleinsäuremotiv ist, aber kein CG umfasst. In einer Ausführungsform ist Z eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TTTT, TG und einer Sequenz, wobei wenigstens 50% der Basen der Sequenz Ts sind.
In einigen Ausführungsformen weisen Y₁ und/oder Y₂ zwischen 3 und 8 Nukleotide auf. In anderen Ausführungsformen besteht Y₁ und/oder Y₂ aus wenigstens drei Gs, wenigstens vier Gs, wenigstens sieben Gs oder insgesamt aus Gs. In anderen Ausführungsformen sind Y₁ und/oder Y₂ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TCGTCG, TCGTCGT und TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). In noch weiteren Ausführungsform umfassend Y₁ und/oder Y₂ wenigstens eine, zwei, drei, vier oder fünf Poly-A, Poly-T- oder Poly-C-Sequenzen.
Die zentralen Nukleotide (N₁ZN₂) der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ weisen Phosphodiesterinternukleotidverbindungen auf und Y₁ und Y₂ weisen wenigstens eine modifizierte Internukleotidverbindung auf. Bei einigen Ausführungsformen weisen Y₁ und/oder Y₂ wenigstens zwei modifizierte Internukleotidverbindungen auf. Bei anderen Ausführungsformen weisen Y₁ und/oder Y₂ zwischen zwei und fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf. In noch weiteren Ausführungsformen weist Y₁ zwei modifizierte Internukleotidverbindungen auf und Y₂ fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf oder Y₁ weist fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf und Y₂ zwei modifizierte Internuleotidverbindungen auf. Die modifizierte Internukleotidverbindung ist in einige Ausführungsformen eine Phosphothioat-modifizierte Verbindung, eine Phosphodithioat-modifizierte Verknüpfung oder eine p-Ethoxy-modifizierte Verknüpfung.
Teile der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ können optional ein Palindrom ausbilden. In einigen Ausführungsformen bilden somit die Nukleotide N₁ZN₂ ein Palindrom. In einigen Ausführungsformen ist das Palindrom keine direkte Wiederholung. In noch weiteren Ausführungsformen bilden die Nukleotide von N₁ZN₂ kein Palindrom.
Entsprechend weiteren Ausführungsformen weist N₁ZN₂ eine Sequenz von Nukleotiden auf, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus GATTTTATCGTC (SEQ ID NO:1098), TCGATTTTTCGA (SEQ ID NO: 1099); TCATTTTTATGA (SEQ ID NO: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101); TCAATTTTTTGA (SEQ ID NO: 1102); ACGTTTTTACGT (SEQ ID NO: 1103); TCGTTTTTACGA (SEQ ID NO: 1104); TCGATTTTTACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTAACGTT (SEQ ID NO: 1106); TCGTTTTTTAACGA (SEQ ID NO: 1107); ACGTTTTTTAACGT (SEQ ID NO: 1108); GATTTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACGATTTTTCGTC (SEQ ID NO: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GATTTTTACGTC (SEQ ID NO: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGATTTTTCGTT (SEQ ID NO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119); GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID NO: 1121); TCATGTATGA (SEQ ID NO: 1122); GTGTTACGAC (SEQ ID NO: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID NO: 1124); ACGTGTACGT (SEQ ID NO: 1125); TCGTGTACGA (SEQ ID NO: 1126); TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO: 1128); TCGTGTTAACGA (SEQ ID NO: 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID NO: 1130); GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 1131); GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134); ATGATCGT (SEQ ID NO: 1135); AACGATGTCGTT (SEQ ID NO: 1136); TCACTGGTGA (SEQ ID NO: 1137); TCGTATGA (SEQ ID NO: 1138); ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1140); and ACGATGTCGT (SEQ ID NO: 1141).
Die Zusammensetzung kann optional einen pharmazeutischen Träger umfassen und/oder in einer Abgabevorrichtung formuliert sein. Bei einigen Ausführungsformen ist die Abgabevorrichtung aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus kationischen Lipiden, Zellpermeierenden Proteinen und Vorrichtungen mit Depotwirkung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung mit Depotwirkung ein biologisch abbaubares Polymer. In einer weiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung mit Depotwirkung ein Mikropartikel.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung aus einem immunstimulatorischen Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ und einem Antigen.
Eine weitere Zusammensetzung der Erfindung ist ein immunstimulatorisches Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ und ein anti-mikrobielles therapeutisches Agens. Bevorzugterweise ist das anti-mikrobielle therapeutische Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem antiviralen Mittel, einem Parasitenmittel, einem antibakteriellen Mittel und einem Pilzmittel.
Eine Zusammensetzung einer Vorrichtung mit Depotwirkung, die ein immunstimulatorisches Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ umfasst, wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bereitgestellt.
Die Erfindung umfasst auch Nahrungsergänzungsmittel mit einem immunstimulatorschen Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ in einer Abgabevorrichtung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer Kapsel, einer sublingualen Tablette und einer Pille.
In einem weiteren Aspekt umfasst die oben beschriebene Zusammensetzung auch eine immunstimulatorische Nukleinsäure mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid, einem TG-Dinukleotide oder einer Py-reichen Sequenz, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure ein nicht-methyliertes CG-Dinukleotid, ein TG-Dinukleotid oder eine Py-reiche Sequenz aufweist mit einer anderen Sequenz als das Oligonukleotid, das 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3' umfasst.
In einige Ausführungsformen weist die immunstimulatorische Nukleinsäure mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid, einem TG-Dinukleotid oder einer Py-reichen Sequenz ein vollständiges Phosphodiesterrückgrat auf und in einer weiteren Ausführungsform weist die immunstimulatorische Nukleinsäure mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid, einem TG-Dinukleotid oder einer Py-reichen Sequenz ein modifiziertes Rückgrat auf, das optional Nukleotidverbindungen aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Phosphothioat, Phosphodithioat und p-Ethoxy.
In einer Ausführungsform weist die immunstimulatorische Nukleinsäure mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid eine Formel auf umfassend 5' X₁X₂CGX₃X₄ 3', wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind. In anderen Ausführungsformen umfasst die immunstimulatorische Nukleinsäuresequenz wenigstens die folgende Formel: 5' TCNTX₁X₂CGX₃X₄ 3', wobei N eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus von etwa 0 bis 25 Nukleotiden zusammengesetzt ist, wobei wenigstens ein Nukleotid eine modifizierte Internukleotidverbindung aufweist, und wobei die Nukleinsäure weniger als oder gleich 100 Nukleotide aufweist. Entsprechend einigen Ausführungsformen sind X₁X₂ Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus GT, GG, GA und AA und X₃X₄ sind Nukleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus TT, CT oder GT. In einer bevorzugten Ausführungsform sind X₁X₂ GA und X₃X₄ sind TT.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die immunstimulatorische Nukleinsäuresequenz mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid wenigstens eine der folgenden Sequenzen: ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No.15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT (SEQ ID No. 32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID No. 31); ATCGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID No. 18); TCCATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 28); GGGGGG (SEQ ID No. 12); TCCATGACGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No. 41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID No. 37); TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID No. 36); TCCATGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 3); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID No 39); TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No. 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No.10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID No. 72); TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 73); TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No. 74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 76); TCCTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID No. 52); TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No 121); TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID No. 120); TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No. 81); TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID No. 82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 47); TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 46); TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 49); GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No. 48); TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No. 51); and TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 85). In einer weiteren Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure mit einer Py-reichen oder TG-Sequenz eine Nukleinsäuresequenz, wie sie oben beschrieben ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits, die sowohl ein Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ als auch ein CpG-Oligonukleotid (das optional frei von Poly-T- und TG-Motiven ist und nicht Py-reich ist), ein Py-reiches und/oder TG-Oligonukleotid umfasst, das physikalisch von dem Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ getrennt ist. Die pharmazeutischen Präparate liegen in wirksamen Mengen vor und umfassen typischerweise pharmazeutisch akzeptable Träger, wie sie alle detailliert hierin angegeben sind. Die Kits umfassen wenigstens ein Gefäß, das ein Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ enthält. Das gleiche Gefäß, oder in anderen Ausführungsformen ein zweites Gefäß, kann ein Oligonukleotid mit einem CpG-Motiv enthalten, das optional frei von Py-reichen und/oder TG-Motiven und/oder einem Py-reichen oder TG-Oligonukleotid (oder einer Kombination daraus) sein kann. Der Kit enthält auch Anweisungen zur Verabreichung der Oligonukleotide an ein Lebewesen. Der Kit kann ein Gefäß umfassen, das ein Lösungsmittel oder ein Verdünnungsmittel enthält.
Zusammengefasst kann, wenn er vollständig hierin angegeben wäre, ein Oligonukleotid mit der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂, das physikalisch von dem CpG-, Py-reichen oder TG-Oligonukleotid getrennt ist, zusammen mit den CpG-, Py-reichen, TG-Oligonukleotiden in den Verfahren, Zusammensetzungen und Produkten, wie sie hierin beschrieben sind, verwendet werden. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens zwei Oligonukleotide der Erfindung umfasst, wobei die wenigstens zwei Oligonukleotide voneinander unterschiedliche Sequenzen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen.
Eine Vakzinformulierung wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bereitgestellt. Das Vakzin umfasst irgendeine der Zusammensetzungen der Erfindung in Kombination mit einem Antigen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer Py-reichen oder einer TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren. Bevorzugterweise wird die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure oral, lokal, in einer Vorrichtung mit Depotwirkung, mucosal auf eine Mucosaoberfläche, systemisch, parenteral oder intramuskulär verabreicht. Wenn die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure an eine Mucosaoberfläche verabreicht wird, kann sie in einer Menge verabreicht werden, die für die Induktion einer Mucosaimmunantwort oder einer systemischen Immunantwort wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Mucosaoberfläche ausgebildet aus der Gruppe bestehend aus einer oralen, nasalen, rektalen, vaginalen und okularen Oberfläche.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Exposition des Lebewesens gegenüber einem Antigen, wobei die Immunantwort eine Antigen-spezifische Immunantwort ist. Das Antigen kann durch einen Nukleinsäurevektor codiert werden, der einem Lebewesen verabreicht werden kann. In einige Ausführungsformen ist das Antigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Tumorantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Parasitenantigen und einem Peptidantigen.
Py-reiche und TG-immunstimulatorische Nukleinsäuren sind in der Lage, ein breites Spektrum an Immunantwort hervorzurufen. Beispielsweise können diese immunstimulatorischen Nukleinsäuren verwendet werden, um eine Th2- in eine Th1-Immunantwort umzusteuern. Py-reiche und TG-Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um eine Immunzelle zu aktivieren, wie beispielsweise einen Leukozyten, eine dentritische Zelle und eine NK-Zelle. Die Aktivierung kann in vivo, in vitro, oder ex vivo durchgeführt werden, beispielsweise durch Isolieren einer Immunzelle von dem Lebewesen, Kontaktieren der Immunzelle mit einer wirksamen Menge der Py-reichen oder TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure, um die Immunzelle zu aktivieren, und erneutes Verabreichen der aktivierten Immunzelle an das Lebewesen. In einigen Ausführungsformen exprimiert die dentritische Zelle ein Krebsantigen. Die dentritische Zelle kann gegenüber dem Krebsantigen ex vivo exponiert werden.
Die von Py-reichen oder TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren gelieferte Immunantwort kann auch zur Induktion von Cytokinproduktion führen, z. B. Produktion von IL-6, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α und IFN-γ.
In einer noch weiteren Ausführungsform sind die Py-reichen und TG-Nukleinsäuren für die Behandlung von Krebs nützlich. Die Py-reichen und TG-Nukleinsäuren sind gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung auch nützlich bei der Verhinderung von Krebs (z. B. Verringern eines Risikos, Krebs zu entwickeln) bei einem Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es einen Krebs entwickelt. Der Krebs kann aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus Gallengangkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Choriocarcinom, Darmkrebs, Endometriumkrebs, Magenkrebs, intraepitheliale Neoplasmen, Lymphomen, Leberkrebs, Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger und nicht-kleinzelliger Leberkrebs), Melanom, Neuroblastome, Oralkrebs, Eierstockkrebs, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Rektalkrebs, Sarcoma, Schilddrüsenkrebs und Nierenkrebs, ebenso wie anderen Carcinomen und Sarkomen. Bei einigen wichtigen Ausführungsformen ist der Krebs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Knochenkrebs, Hirn- und ZNS-Krebs, Bindegewebskrebs, Speiseröhrenkrebs, Augenkrebs, Hodgkins-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Mundhöhlenkrebs, Hautkrebs und Hodenkrebs.
Py-reiche und TG-Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um das Ansprechverhalten einer Krebszelle auf eine Krebstherapie (z. B. eine Anti-Krebstherapie) zu erhöhen, optional wenn die Py-reiche oder TG-immunstimulatorische Nukleinsäure zusammen mit einer Anti-Krebstherapie verabreicht wird. Die Anti-Krebstherapie kann eine Chemotherapie, ein Vakzin (z. B. ein in vitro geprimtes dendritisches Zellvakzin oder ein Krebsantigenvakzin) oder eine Antikörper-basierte Therapie sein. Diese letzte Therapie kann auch das Verabreichen eines Antikörpers umfassen, der für ein Zelloberflächenantigen, beispielsweise eine Krebszelle, spezifisch ist, wobei die Immunantwort zu einer Antigen-abhängigen Zellcytotoxizität (ADCC) führt. In einer Ausführungsform kann der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt sein bestehend aus Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab und ImmuRAIT-CEA.
Entsprechend einigen Aspekten der Erfindung wird somit einem Lebewesen mit Krebs oder für das das Risiko besteht, dass es Krebs entwickelt, eine immunstimulatorische Nukleinsäure und eine Anti-Krebstherapie verabreicht. In einigen Ausführungsformen ist die Anti-Krebstherapie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem chemotherapeutischen Agens, einem immuntherapeutischen Agens und einem Krebsvakzin. Das chemotherapeutische Agens kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Vincristin, Adriamycin, Cisplatin, zuckerfreie Chlorethylnitrosoharnstoffe, 5-Fluoruracil, Mitomycin C, Bleomycin, Doxorubicin, Dacarbazin, Taxol, Fragylin, Meglamin GLA, Valrubicin, Carmustain und Poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, RAS-Famesyl-Transferaseinhibitor, Famesyl-Transferaseinhibitor, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantron/Mitroxantron, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD 183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicin, Metastron/Strontiumderivat, Temodal/Temozolomid, Evacet/liposomales Doxorubicin, Yewtaxan/Placlitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabin, Furtulon/Doxifluridin, Cyclopax/orales Paclitaxel, orales Taxoid, SPU-077/Cisplatin, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS-Oncogeninhibitor, BMS-182751/orales Platin, UFT (Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisol, Eniluracil/776C85/SFU-Verstärker, Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribin, Paxex/Paclitaxel, Doxil/liposomales Doxorubicin, Caelyx/liposomales Doxorubicin, Fludara/Fludarabin, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimid, LU 103793/Dolastain, Caetyx/liposomales Doxorubicin, Gemzar/Gemcitabin, ZD 0473/Anormed, YM 116, Iodgasbläschen, CDK4- und CDK2-Inhibitoren, PARP-Inhibitoren, D4809/Dexifosamid, Ifes/Mesnex/Ifosamid, Vumon/Teniposid, Paraplatin/Carboplatin, Plantinol/Cisplatin, Vepesid/Etoposid, ZD 9331, Taxoter/Docetaxel, Prodrug von Guaninarabinosid, Taxan-Analog, Nitrosoharnstoffe, alkylierende Agenzien wie beispielsweise Melphelan und Cyclophosphamid, Aminoglutethimid, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cytarabin-HCl, Dactinomycin, Daunorubicin HCl, Estramustinphosphatnatrium, Etoposid (VP16-213), Floxuridin, Fluoruracil (5-FU), Flutamid, Hydroxharnstoff (Hydroxycarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolid-Acetat (LHRH-Freisetzungsfaktor-Analogon), Lomustin (CCNU), Mechlorethamin-HCl (Stickstoffsenfgas), Mercaptopurin, Mesna, Mitotan (o.p'-DDD), Mitoxantron-HC1, Octreotid, Plicamycin, Procarbazin-HCl, Streptozocin, Tamoxifen-Citrat, Thioguanin, Thiotepa, Vinblastinsulfat, Amsacrin (mAMSA), Azacitidin, Erthropoietin, Hexamethylmelamin (HMM), Interleukin 2, Mitoguazon (Methyl-GAG; Methylglyoxal-bis-Guanylhydrazon; MGBG), Pentostatin (2'-Deoxycoformycin), Semustin (Methyl-CCNU), Teniposid (VM-26) und Vindesin-Sulfat, ist aber nicht darauf beschränkt.
Das immuntherapeutische Agens kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMab-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab und ImmuRAIT-CEA, ist aber nicht darauf beschränkt.
Das Krebsvakzin kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus EGF, anti-idiotypischen Krebsvakzinen, Gp75-Antigen, GMK-Melanomvakzin, MGV-Gangliosid-Konjugatvakzin, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL-Theratop, BLP25 (MUC-1), liposomalem idiotypischem Vakzin, Melacin, Peptidantigen-Vakzine, Toxin-/Antigenvakzine, MVA-basiertes Vakzin, PACIS, BCG-Vakzin, TA-HPV, TA-CIN, DISC-Virus und ImmuCyst/TheraCys, ist aber nicht darauf beschränkt.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Verfahren, die die Verhinderung oder die Behandlung von Krebs betreffen, kann dem Lebewesen weiter Interferon-α verabreicht werden.
In anderen Aspekten betrifft die Erfindung Verfahren zur Verhinderung einer Krankheit in einem Lebewesen. Das Verfahren umfasst eine regelmäßige Verabreichung einer Py-reichen oder TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Lebewesen, um das Ansprechverhalten des Immunsystems zu fördern und die Erkrankung in dem Lebewesen zu verhindern. Beispiele für Erkrankungen oder Zustände, die unter Verwendung der prophylaktischen Verfahren der Erfindung verhindert werden sollen, umfassen mikrobielle Infektionen (beispielsweise sexuell übertragene Erkrankungen) und anaphylaktischen Schock bedingt durch Lebensmittelallergien.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren einer angeborenen Immunantwort durch Verabreichen einer Py-reichen oder einer TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Lebewesen in einer Menge, die wirksam ist zum Aktivieren einer angeborenen Immunantwort.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer viralen oder retroviralen Infektion bereitgestellt. Das Verfahren umfasst, an ein Lebewesen, das eine virale oder retrovirale Infektion aufweist oder für das das Risiko besteht, eine solche zu entwickeln, eine wirksame Menge einer der Zusammensetzungen der Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung der viralen oder retroviralen Infektion zu verabreichen. In einigen Ausführungsformen wird das Virus durch ein Hepatitisvirus, HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Herpesvirus oder Papillomavirus verursacht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer bakteriellen Infektion bereitgestellt. Das Verfahren umfasst, einem Lebewesen, das eine bakterielle Infektion aufweist oder für das das Risiko besteht, eine solche zu entwickeln, eine wirksame Menge einer der Zusammensetzungen der Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung der bakteriellen Infektion zu verabreichen. In einer Ausführungsform wird die bakterielle Infektion durch ein intrazelluläres Bakterium bedingt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Parasiteninfektion, indem einem Lebewesen, das eine Parasiteninfektion aufweist oder für das das Risiko einer solchen besteht, eine wirksame Menge von einer der Zusammensetzungen der Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung der Parasiteninfektion verabreicht wird. In einer Ausführungsform beruht die Parasiteninfektion auf einem intrazelluläre Parasiten. In einer weiteren Ausführungsform beruht die Parasiteninfektion auf einem Parasiten, der verschieden ist von Helminthen-Parasiten.
In einigen Ausführungsformen ist das Lebewesen ein Mensch und in anderen Ausführungsformen ist das Lebewesen ein nichtmenschlicher Vertebrat, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem Hund, einer Katze, einem Pferd, einer Kuh, einem Schwein, einer Ziege, einem Fisch, einem Affen, einem Huhn und einem Schaf.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln oder zum Verhindern von Asthma, indem einem Lebewesen, das Asthma hat oder für das die Gefahr besteht, Asthma zu entwickeln, einer Menge von einer der Zusammensetzungen der Erfindung, die zur Behandlung oder Verhinderung von Asthma wirksam ist, verabreicht wird. In einer Ausführungsform ist das Asthma allergisches Asthma.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung oder Verhinderung einer Allergie. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge einer der Zusammensetzungen der Erfindung an ein Lebewesen, das unter einer Allergie leidet oder für das das Risiko besteht, an einer solchen zu erkranken, zur Behandlung oder Verhinderung der Allergie.
Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Immundeffizienz wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge einer der Zusammensetzungen der Erfindung an ein Lebewesen, das an einer Immundeffizienz leidet oder ein Risiko hat, diese zu entwickeln, zur Behandlung oder Verhinderung der Immundeffizienz.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Induzierung einer TH1-Immunantwort durch Verabreichen einer der Zusammensetzungen der Erfindung in einer wirksamen Menge an ein Lebewesen, um eine TH1-Immunantwort zu produzieren.
In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren der Erfindung die Verabreichung eines Oligonukleotids der Formel 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3' und einer immunstimulatorischen Nukleinsäure mit einem nicht-methylierten CG-Dinukleotid, einem TG-Dinukleotid oder einer T-reichen Sequenz. In einer Ausführungsform wird das Oligonukleotid, das 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3' umfasst, getrennt von der immunstimulatorischen Nukleinsäure verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden das Oligonukleotid, das 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3' umfasst, und die immunstimulatorische Nukleinsäure in einem abwechselnden wöchentlichen Schema verabreicht und in anderen Ausführungsformen werden das Oligonukleotid, das 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3' umfasst, und die immunstimulatorische Nukleinsäure in einem abwechselnden zweiwöchentlichen Schema verabreicht.
Die Erfindung liefert in einem weiteren Aspekt eine Zusammensetzung, die eine immunstimulatorische Nukleinsäure und eine Anti-Krebstherapie umfasst, formuliert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und in einer wirksamen Menge, um einen Krebs zu behandeln oder das Risiko zu verringern, Krebs zu entwickeln. In wichtigen Ausführungsformen ist die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, einer TG-Nukleinsäure und einer C-reichen Nukleinsäure.
Die Erfindung stellt weiter einen Kit bereit, der ein erstes Gefäß, das eine immunstimulatorische Nukleinsäure, und wenigstens ein weiteres Gefäß (z. B. ein zweites Gefäß) umfasst, das eine Anti-Krebstherapie enthält, und Anwendungsanweisungen enthält. In einer Ausführungsform umfasst der Kit weiter Interferon-α, das in einem noch weiteren Gefäß (z. B. einem dritten Gefäß) getrennt aufbewahrt sein kann. In einer wichtigen Ausführungsform umfasst der Kit eine Vorrichtung mit Depotwirkung, die eine immunstimulatorische Nukleinsäure enthält, und wenigstens ein Gefäß, das eine Anti-Krebstherapie und Anweisungen zur zeitlichen Verabreichung der Anti-Krebstherapie aufnimmt. Die immunstimulatorische Nukleinsäure kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus einer Py-reichen Nukleinsäure, einer TG-Nukleinsäure und einer CpG-Nukleinsäure besteht, wobei die CpG-Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist, die SEQ. ID. NO. 246 umfasst.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren bereit zur Verhinderung oder Behandlung von Asthma oder Allergie, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immunstimulatorischen Nukleinsäure und eines Asthma-/Allergie-Medikamentes in einer wirksamen Dosis umfasst, um Asthma oder Allergie zu behandeln oder zu verhindern. In wichtigen Ausführungsformen ist die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, einer TG-Nukleinsäure und einer C-reichen Nukleinsäure.
In einer Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure eine T-reiche Nukleinsäure. In einer verwandten Ausführungsform weist die T-reiche Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz auf, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908, und 910-913. In anderen Ausführungsformen werden die T-reichen Nukleinsäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 und 891.
In einer noch weiteren verwandten Ausführungsform ist die T-reiche Nukleinsäure nicht eine TG-Nukleinsäure. In einer noch weiteren Ausführungsform ist die T-reiche Nukleinsäure nicht eine CpG-Nukleinsäure.
In einer Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure eine TG-Nukleinsäure. In einer weiteren verwandten Ausführungsform ist die TG-Nukleinsäure keine T-reiche Nukleinsäure. In einer weiteren verwandten Ausführungsform ist die TG-Nukleinsäure nicht eine CpG-Nukleinsäure.
In einer Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure eine CpG-Nukleinsäure, wobei die CpG-Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist, die SEQ ID NO: 246 umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Asthma-/Allergiemedikament ein Medikament, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem PDE-4-Inhibitor, Bronchodilator/beta-2-Agonisten, K+-Kanalöffner, VLA-4-Antagonisten, Neurokin-Antagonisten, TXA2-Syntheseinhibitor, Xanthanin, Arachidonsäure-Antagonisten, 5-Lipoxygenase-Inhibitor, Thromboxin-A2-Rezeptor-Antagonisten, Thromboxan-A2-Antagonisten, Inhibitor des 5-Lipox-Aktivierungsproteins und Protease-Inhibitor, ist aber nicht darauf beschränkt. In einigen wichtigen Ausführungsformen ist das Asthma-/Allergiemedikament ein Bronchodilator/Beta-2-Agonist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Salmeterol, Salbutamol, Terbutalin, D2522/Formoterol, Fenoterol und Orciprenalin.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Asthma-/Allergiemedikament ein Medikament, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Anti-Histaminen und Prostaglandin-Induktoren. In einer Ausführungsform ist das Anti-Histamin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Loratidin, Cetirizin, Buclizin, Ceterizin-Analoga, Fexofenadin, Terfenadin, Desloratadin, Norastemizol, Epinastin, Ebastin, Ebastin, Astemizol, Levocabastin, Azelastin, Tranilast, Terfenadin, Mizolastin, Betatastin, CS 560 und HSR 609. In weiteren Ausführungsformen ist der Prostaglandin-Induktor 5-5751.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist das Asthma-/Allergiemedikament ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Steroiden und Immunmodulatoren. Die Immunmodulatoren können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus anti-inflammatorischen Agenzien, Leukotrien-Antagonisten, IL4-Muteinen, löslichen IL-4-Rezeptoren, immunsuppressiven Agenzien, anti-IL-4-Antikörpern, IL-4-Antagonisten, anti-IL-5-Antikörpern, löslichen IL-13-Rezeptor-Fc-Fusionsproteinen, anti-IL-9-Antikörpern, CCR3-Antagonisten, CCRS-Antagonisten, VLA-4-Inhibitoren und IgE-herunterregulierende Agenzien, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform ist das IgE-herunterregulierende Agens ein anti-IgE.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Steroid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Beclomethason, Fluticason, Tramcinolon, Budesonid und Budenosid. In einer noch weiteren Ausführungsform ist das immunsuppressive Agens ein Tolerierungspeptidvakzin.
In einer Ausführungsform wird die immunstimulatorische Nukleinsäure gleichzeitig mit dem Asthma-/Allergiemedikament verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform ist der Patient ein immunkompromittierter Patient.
Die immunstimulatorische Nukleinsäuren, die an einen Patienten bei den hierin offenbarten Verfahren verabreicht werden sollen und die die Prävention und Behandlung von Asthma/Allergie betreffen, sind wie für andere Verfahrensaspekte der Erfindung beschrieben.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung einen Kit, der ein erstes Gefäß umfasst, das eine immunstimulatorische Nukleinsäure enthält, und wenigstens ein weiteres Gefäß (z. B. ein zweites Gefäß), das ein Asthma-/Allergiemedikament enthält, und Verwendungsanweisungen. Die in dem Kit nützliche immunstimulatorische Nukleinsäure ist eine solche, wie sie hierin beschrieben ist. In einer wichtigen Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, einer TG-Nukleinsäure und einer C-reichen Nukleinsäure. In einer weiteren wichtigen Ausführungsform umfasst der Kit ein Depotvehikel, das eine immunstimulatorische Nukleinsäure enthält, und wenigstens ein Gefäß, das ein Asthma-/Allergiemedikament enthält, und Anweisungen für das Timing der Verabreichung des Asthma-/Allergiemedikamentes.
Das Asthma-/Allergiemedikament kann aus der Gruppe der Asthma-/Allergiemedikamente ausgewählt werden, die in den vorstehenden Verfahren beschrieben sind, die die Prävention oder Behandlung von Asthma/Allergie betreffen.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die eine immunstimulatorische Nukleinsäure und ein Asthma-/Allergiemedikament umfasst, die in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einer wirksamen Menge formuliert ist, um eine Immunantwort zu verhindern oder zu behandeln, die mit der Exposition gegenüber einem Asthma- oder Allergiemediator verbunden ist. Die immunstimulatorische Nukleinsäure kann ausgewählt sein aus der Gruppe von immunstimulatorischen Nukleinsäuren, wie sie für die vorhergehenden Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben sind. In wichtigen Ausführungsformen ist die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, einer TG-Nukleinsäure und einer C-reichen Nukleinsäure. Das Asthma-/Allergiemedikament kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Asthmamedikamenten und Allergiemedikamenten, wie sie in den vorstehenden Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben sind.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus SEQ ID NO: 95 – 136, SEQ ID NO: 138 – 152, SEQ ID NO: 154 – 222, SEQ ID NO: 224 – 245, SEQ ID NO: 247 – 261, SEQ ID NO: 263 – 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303 – 4109, SEQ ID NO: 414 – 420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426 – 947, SEQ ID NO: 959 – 1022, SEQ ID NO: 1024 – 1093, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Bevorzugterweise ist die immunstimulatorische Nukleinsäure in der Zusammensetzung in einer wirksamen Menge vorhanden. In einer Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure in einer wirksamen Menge vorhanden, um eine Immunantwort zu induzieren. In einer anderen Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure in einer wirksamen Menge vorhanden, um eine Krebserkrankung zu verhindern oder zu behandeln. In einer noch weiteren Ausführungsform ist die immunstimulatorische Nukleinsäure in einer wirksamen Menge vorhanden, um Asthma/Allergie zu verhindern oder zu behandeln. Die Erfindung umfasst auch Kits, die irgendeine der vorhergehenden immunstimulatorischen Nukleinsäurezusammensetzungen und Gebrauchsanweisungen umfassen.
In einem noch weiteren Aspekt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung einer immunstimulatorischen Nukleinsäure, die im Wesentlichen aus 5' M₁TCGTCGTTM₂ 3' besteht, wobei wenigstens eines der Cs unmethyliert ist, wobei M₁ eine Nukleinsäure ist mit wenigstens einem Nukleotid, wobei M₂ eine Nukleinsäure mit zwischen 0 und 50 Nukleotiden ist und wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure weniger als 100 Nukleotide aufweist.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung einer immunstimulatorischen Nukleinsäure umfassend 5' TCGTCGTT 3', wobei wenigstens eines der Cs unmethyliert ist, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure weniger als 100 Nukleotide und ein Phosphodiesterrückgrat aufweist, und eine Depotvorrichtung. Bei einigen Ausführungsformen ist die Depotvorrichtung ein Mikropartikel. In anderen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ein Antigen.
Eine jede der Beschränkungen der Erfindung kann verschiedene Ausführungsformen der Erfindung umfassen. Es wird daher erwartet, dass eine jede der Beschränkungen der Erfindung, die irgendein Element oder Kombinationen von Elementen enthält, in einem jeden Aspekt der Erfindung enthalten sein kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist ein Histogramm der Expression von CD86 (Y-Achse) durch CD19+-Zellen nach Exposition dieser Zellen gegenüber Oligonukleotiden, die auf der X-Achse gezeigt sind, bei einer Konzentration von 0,15 μg/ml.
1B ist ein Histogramm der Expression von CD86 (Y-Achse) durch CD19+-Zellen nach Exposition dieser Zellen gegenüber den auf der X-Achse gezeigten Oligonukleotiden bei einer Konzentration von 0,30 μg/ml.
2 ist ein Diagramm, das die Fähigkeiten von ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 und ODN 2202 zeigt, B-Zellproliferation bei Konzentrationen zu stimulieren, die von 0,2 μg/ml bis 20 μg/ml reichen.
3 ist ein Diagramm, das die Fähigkeiten von ODN 2188, ODN 2189, ODN 2190 und ODN 2182 vergleicht, B-Zellproliferation bei Konzentrationen zu stimulieren, die von 0,2 μg/ml bis 20 μg/ml reichen.
4 ist ein Säulendiagramm, das durch Nicht-CpG-ODN-induzierte dosisabhängige B-Zellaktivierung darstellt. PBMC eines Blutspenders wurden mit den angegebenen Konzentrationen an ODNs 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) und 5162 (SEQ ID NO: 1094) inkubiert und mit mAb für CD19 (B-Zellmarker) und CD86 (B-Zellaktivierungsmarker, B7-2) gefärbt. Die Expression wurde durch Flusszytometrie gemessen.
5 ist ein Säulendiagramm, das die Stimulierung von B-Zellen durch einen verschiedenen Satz unterschiedlicher Nicht-CpG ODNs zeigt. PBMC von einem repräsentativen Spender wurden mit 0,4 μg/ml, 1,0 μg/ml oder 10,0 μg/ml der folgenden ODNs stimuliert: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO: 913), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5162 (SEQ ID NO: 1094), 5163 (SEQ ID NO: 1095), 5168 (SEQ ID NO: 1096) und 5169 (SEQ ID NO: 1097) und die Expression des Aktivierungsmarkers CD86 (B7-2) auf CD19-positiven B-Zellen durch Flusszytometrie gemessen.
6 ist ein Säulendiagramm, das die B-Zellaktivierung durch Nicht-CpG-ODNs 1982 und 2041 zeigt. PBMC wurden mit den angegebenen Konzentrationen von ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO: 225) und 2041 (SEQ ID NO: 282) inkubiert und die B-Zellaktivierung (Expression des Aktivierungsmarkers CD86) durch Flusszytometrie gemessen.
7 ist ein Säulendiagramm, das NK-Zellen darstellt, die durch Nicht-CpG-ODNs aktiviert sind. PBMC wurden mit 6 μg/ml der folgenden ODNs inkubiert: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911) und 5126 (SEQ ID NO: 1058) und mit mAb für CD3 (T-Zellmarker), CD56 (NK-Zellmarker) und CD69 (früher Aktivierungsmarker) gefärbt. Die Expression von CD69 auf CD56-positiven NK-Zellen wurde durch Flusszytometrie gemessen.
8 ist ein Säulendiagramm, das zeigt, dass NK-vermittelte Zytotoxizität durch Nicht-CpG-ODN erhöht wird. NK-vermittelte Lyse von K-562-Zielzellen wurde gemessen nach Inkubation von PBMC mit 6 μg/ml der ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2194 (SEQ ID NO: 911) und 5126 (SEQ ID NO: 1058) über Nacht.
9 ist ein Säulendiagramm, das zeigt, dass NKT-Zellen durch Nicht-CpG ODN aktiviert werden können. PBMC eines repräsentativen Spenders wurden mit 6 μg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911) und 5126 (SEQ ID NO: 1058) für 24 Stunden inkubiert und die Aktivierung von NKT-Zellen wurde durch Flusszytometrie nach Färben der Zellen mit mAb für CD3 (T-Zell-Marker), CD56 (NK-Zellmarker) und CD69 (früher Aktivierungsmarker) gemessen.
10 ist ein Säulendiagramm, das die Stimulierung von Monozyten durch verschiedene CpG und nicht-CpG-ODN zeigt. PBNC wurden mit 6 μg/ml 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2178 (SEQ ID NO: 428), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5126 (SEQ ID NO: 1058) und 5163 (SEQ ID NO: 1095) inkubiert und auf CD14 (Monozyten-Marker) und CD80 (B7-1, Aktivierungsmarker) gefärbt. Die Expression wurde vermittels Flusszytometrie gemessen.
11 ist ein Säulendiagramm, das die Freisetzung von TNFα nach Kultur menschlicher Zellen mit Nicht-CpG ODN zeigt. PBMC wurden für 24 Stunden mit oder ohne 6 μg/ml der angegebenen ODNs oder 1 μg/ml LPS als Positivkontrolle kultiviert und TNFα durch ELISA gemessen.
12 ist ein Säulendiagramm, das die Freisetzung von IL-6 nach Kultur mit Nicht-CpG ODNs darstellt und zeigt das gleiche Muster wie für TNFα. PBMC wurden mit den angegebenen ODNs (1,0 μg/ml) kultiviert und IL-6 wurde in den Überständen durch ELISA gemessen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft in einem Aspekt die Erkenntnis, dass Pyrimidin (Py)-reiche und bevorzugterweise Thymidin (T)-reiche Nukleinsäuren ebenso wie Nukleinsäuren, die TG-Dinukleotidmotive enthalten, wirksam sind bei der Vermittlung von immunstimulatorischen Wirkungen. Es war im Stand der Technik bekannt, dass CpG-enthaltende Nukleinsäuren therapeutisch und prophylaktische Zusammensetzungen sind, die das Immunsystem stimulieren, um Krebserkrankungen, Infektionserkrankungen, Allergie, Asthma und andere Störungen zu behandeln und dabei helfen, vor opportunistischen Infektionen nach Krebschemotherapie zu schützen. Die starke, gleichwohl ausgeglichene zelluläre und humorale Immunantworten, die von der CpG-Stimulierung resultieren, spiegeln das eigene natürliche Verteidigungssystem des Körpers gegen eindringende Pathogene und Krebszellen wider. CpG-Sequenzen werden, während sie in der menschlichen DNA vergleichsweise selten sind, üblicherweise in der DNA von infektiösen Organismen wie beispielsweise Bakterien gefunden. Das menschliche Immunsystem hat sich offensichtlich dahingehend entwickelt, dass es CpG-Sequenzen als ein frühes Warnsignal für Infektionen erkennt und eine sofortige und leistungsfähige Immunantwort gegen eindringende Pathogene initiiert, ohne nachteilige Reaktionen zu verursachen, die oft im Zusammenhang mit anderen immunstimulatorischen Agenzien auftreten. Somit können CpG-enthaltende Nukleinsäuren, die auf diesem angeborenen Immunverteidigungsmechanismus beruhen, für die Immuntherapie einen einzigartigen und natürlichen Weg nutzen. Die Wirkungen von CpG-Nukleinsäuren auf die Immunmodulation wurden von dem Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung entdeckt und sind extensiv in den ebenfalls anhängigen Patentanmeldungen beschrieben, wie beispielsweise den US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/386,063, eingereicht am 07. Februar 1995 (und der verwandten PCT US95/01570); 08/738,652, eingereicht am 30. Oktober 1996; 08/960,774, eingereicht am 30. Oktober 1997 (und der verwandten PCT/US97/19791, WO 98/18810); 09/191,170, eingereicht am 13. November 1998; 09/030,701, eingereicht am 25. Februar 1998 (und der verwandten PCT/US98/03678; 09/082,649, eingereicht am 20. Mai 1998 (und der verwandten PCT/US98/10408); 09/325,193, eingereicht am 03. Juni 1999 (und der verwandten PCT/US98/04703); 09/286,098, eingereicht am 02. April 1999 (und der verwandten PCT/US99/07335); 09/306,281, eingereicht am 06. Mai 1999 (und der verwandten PCT/US99/09863). Die gesamten Inhalte von einem jeden dieser Patente und einer jeden dieser Patentanmeldungen werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die Beobachtungen der vorliegenden Erfindung sind auf alle der oben beschriebenen Anwendungen von CpG-enthaltenden Nukleinsäuren ebenso wie irgendwelche andere bekannte Verwendung von CpG-Nukleinsäuren anwendbar. Die Erfindung umfasst, in einem Aspekt, die Entdeckung, dass Py-reiche und bevorzugterweise T-reiche und TG-Nukleinsäuren ähnliche immunstimulatorische Eigenschaften wie CpG-Oligonukleotide aufweisen, unabhängig davon, ob ein CpG-Motiv vorhanden ist. Die vorliegende Erfindung ist somit für ein jegliches Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems unter Verwendung von Py-reichen oder TG-Nukleinsäuren nützlich. Es wurde gemäß der Erfindung auch überraschenderweise entdeckt, dass chimäre Oligonukleotide, denen ein CpG-Motiv fehlt, immunstimulatorisch sind und viele der gleichen prophylaktischen und therapeutischen Aktivitäten aufweisen wie ein CpG-Oligonukleotid.
Eine Py-reiche Nukleinsäure ist eine T-reiche oder C-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure. In einigen Ausführungsformen sind T-reiche Nukleinsäuren bevorzugt. Eine T-reiche Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die wenigstens eine Poly-T-Sequenz enthält und/oder die eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % T-Nukleotidresten aufweist. Eine Nukleinsäure mit einer Poly-T-Sequenz enthält wenigstens vier Ts in einer Reihe, wie beispielsweise 5'TTTT3'. Bevorzugterweise umfasst die T-reiche Nukleinsäure mehr als eine Poly-T-Sequenz. In bevorzugten Ausführungsformen kann die T-reiche Nukleinsäure 2, 3, 4 etc. Poly-T-Sequenzen aufweisen, wie beispielsweise Oligonukleotid #2006 (SEQ ID NO: 246). Eines der am stärksten immunstimulatorischen T-reichen Oligonukleotide, die gemäß der Erfindung entdeckt worden sind, ist eine Nukleinsäure, die vollständig aus T-Nukleotidresten besteht, beispielsweise Oligonukleotid #2183 (SEQ ID NO: 433). Andere T-reiche Nukleinsäuren gemäß der Erfindung weisen eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % T-Nukleotidresten auf, enthalten aber nicht notwendigerweise eine Poly-T-Sequenz. Bei diesen T-reichen Nukleinsäuren können die T-Nukleotidreste voneinander durch andere Arten von Nukleotidresten getrennt sein, d. h. G, C und A. Bei einigen Ausführungsformen weisen die T-reichen Nukleinsäuren eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % und 99 % T-Nukleotidresten auf und eine jegliche ganzzahlige Prozentzahl dazwischen. Bevorzugterweise weisen die T-reichen Nukleinsäuren wenigstens eine Poly-T-Sequenz auf und eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % T-Nukleotidresten.
Man hat gemäß der Erfindung entdeckt, dass der T-Gehalt eines ODN eine dramatische Wirkung auf die immunstimulatorische Wirkung des ODN aufweist und dass T-reiche ODN eine Vielzahl von menschlichen Immunzelltypen bei Abwesenheit irgendeines CpG-Motivs aktivieren können. Ein Oligonukleotid mit einer 3'-Poly-T-Region und 2 5'CGs, z. B. ODN 2181 (SEQ ID NO: 431) ist hoch immunstimulatorisch. Ein Oligonukleotid mit ähnlicher Länge, ODN 2116 (SEQ ID NO: 357), das zwei CG-Dinukleotide am 5'-Ende und eine Poly-C-Region am 3'-Ende enthält, war unter Verwendung von experimentellen Standardbedingungen ebenfalls immunstimulatorisch, aber weniger als das T-reiche Oligonukleotid. Obwohl C und T fast identische Strukturen aufweisen, unterscheiden sich somit ihre Wirkungen auf die Immuneigenschaften eines ODN. Sie sind beide in der Lage, eine Immunantwort zu induzieren, aber in unterschiedlichem Umfang. Somit sind sowohl T-reiche als auch C-reiche Oligonukleotide gemäß der Erfindung nützlich, T-reiche Oligonukleotide sind aber bevorzugt. Weiterhin sind, wenn der T-Gehalt der ODN durch Einbau anderer Basen wie beispielsweise G, A oder C verringert ist, die immunstimulatorischen Wirkungen verringert (ODN #2188 (SEQ ID NO: 905), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908) und 2193 (SEQ ID NO: 910)).
Eine C-reiche Nukleinsäure ist ein Nukleinsäuremolekül, das wenigstens eine oder bevorzugterweise wenigstens zwei Poly-C-Regionen aufweist, oder das aus wenigstens 50 % C-Nukleotiden besteht. Eine Poly-C-Region weist wenigstens vier C-Reste in einer Reihe auf. Somit ist eine Poly-C-Region von der Formel 5'CCCC3' umfasst. In einigen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass die Poly-C-Region die Formel 5' CCCCCC 3' aufweist. Andere C-reiche Nukleinsäuren gemäß der Erfindung weisen eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 50 % C-Nukleotidresten auf, umfassen aber nicht notwendigerweise eine Poly-C-Sequenz. Bei diesen C-reichen Nukleinsäuren können die C-Nukleotidreste voneinander durch andere Arten von Nukleotidresten, d. h. G, T und A, getrennt sein. In einigen Ausführungsformen weisen die C-reichen Nukleinsäuren eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 60 %, 70 %, 80 %, 90 % und 99 % C-Nukleotidreste auf und eine jede ganzzahlige %-Zahl dazwischen auf. Bevorzugterweise weisen die C-reichen Nukleinsäuren wenigstens eine Poly-C-Sequenz auf und eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 50 % C-Nukleotidresten und sind in einigen Ausführungsformen auch T-reich.
Wie in den Beispielen gezeigt, hat man gefunden, dass einige ODN immunstimulatorisch sind, von denen man früher geglaubt hat, dass sie nicht immunstimulatorisch sind, einschließlich zweier ODNs mit den SEQ ID NO: 225 und SEQ ID NO: 282, die zuvor als nicht stimulatorisch beschrieben und überwiegend als Kontroll-ODNs verwendet worden sind (Takahashi, T et al 2000, J. Immunol. 164:4458). Unsere Experimente zeigten, dass diese ODNs B-Zellen stimulieren können, gleichwohl bei höheren Konzentrationen verglichen mit CpG ODNs (6). Ein langes Poly-T-ODN (30mer) induzierte wenigstens in einigen Experimenten eine starke Aktivierung von B-Zellen, die vergleichbar den stärksten CpG-ODN-Aktivatoren von B-Zellen ist. Diese Experimente enthüllten auch die überraschende Feststellung, dass sogar Poly-C-ODNs zu einer Stimulierung von B-Zellen führen können.
Die Immunstimulation durch diese ODNs war jedoch nicht auf menschliche B-Zellen beschränkt. Verschiedene experimentelle Tests zeigten deutlich, dass zusätzlich Monozyten, NK-Zellen und sogar NKT-Zellen durch derartige nicht-CpG-ODNs aktiviert werden können (7 – 10). Im Gegensatz zu Poly-T- und Poly-C-Sequenzen wurde keine Immunstimulierung durch Poly-A-Sequenzen (wenigstens für Monozyten, B- und NK-Zellen) erreicht. Interessanterweise wurde gefunden, dass die Einführung eines CpG-Motivs in die SEQ ID NO: 225 die immunstimulatorische Aktivität erhöhte, wohingegen die Verlängerung mit einem Poly-T-Bereich die Immunstimulierung nicht erhöhte. Dies legt nahe, dass CpG- und T-reiche ODN durch unterschiedliche Mechanismen oder Wege funktionieren können. Es ist auch möglich, dass das Einführen eines Poly-T-Motivs an eine andere Position von SEQ ID NO: 225 zu einer Änderung der immunstimulatorischen Eigenschaften führen kann.
Eine „TG-Nukleinsäure" oder eine „TG-immunstimulatorische Nukleinsäure", wie hierin verwendet, ist eine Nukleinsäure, die wenigstens ein TpG-Dinukleotid (Thymidin-Guanin-Dinukleotid-Sequenz, d. h. „TG-DNA" oder DNA, die ein 5'-Thymidin gefolgt von einem 3'-Guanosin enthält und durch eine Phosphatbindung verknüpft ist) enthält und einen Bestandteil des Immunsystems aktiviert.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine TG-Nukleinsäure bereit, die durch wenigstens die folgende Formel dargestellt ist:
5'N₁X₁TGX₂N₂3'
wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind und N irgendein Nukleotid ist und N₁ und N₂ Nukleinsäuresequenzen sind, die aus irgendeiner Anzahl von N zusammengesetzt sind, unter der Voraussetzung, dass sich die Gesamtsumme von N₁ und N₂ im Bereich von 11 bis 21 bewegt. Beispielsweise kann, wenn N₁ 5 ist, dann N₂ 6 sein (was zu einer Gesamtlänge für das Oligonukleotid von 15 Nukleotiden führt). Das TG kann sich irgendwo innerhalb des Oligonukleotidbereiches befinden, einschließlich dem 5'-Ende, dem Zentrum und dem 3'-Ende. Somit kann N₁ Null bis einschließlich 21 sein, vorausgesetzt, dass N₂ entsprechend ausgewählt ist, um eine Summe aus N₁ und N₂ zu ergeben, die 11 bis einschließlich 21 ist. In ähnlicher Weise kann N₂ von Null bis einschließlich 21 sein, unter der Voraussetzung, dass die Gesamtsumme von N₁ und N₂ 11 bis einschließlich 21, ergibt. In einigen Ausführungsformen ist X₁ Adenin, Guanin oder Thymidin und X₂ ist Cytosin, Adenin oder Thymidin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X₂ Thymidin. In anderen Ausführungsformen ist X₁ Cytosin und/oder X₂ Guanin. In anderen Ausführungsformen, wie sie hierin diskutiert sind, kann die Nukleinsäure andere Motive umfassen, vorausgesetzt, dass sie lang genug ist, um dies zu bewerkstelligen.
In anderen Ausführungsformen wird die TG-Nukleinsäure durch wenigstens die folgende Formel dargestellt:
5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3'
wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind. In einigen Ausführungsformen sind X₁X₂ Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, TpA und TpT; und X₃X₄ sind Nukleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA und CpA; N ist irgendein Nukleotid und N₁ und N₂ sind Nukleinsäuresequenzen, die aus irgendeiner Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt sind, vorausgesetzt, dass die Gesamtsumme von N₁ und N₂ sich im Bereich von 9 bis 19 bewegt. In einigen Ausführungsformen sind X₁X₂ GpA oder GpT und X₃X₄ TpT. In anderen Ausführungsformen ist X₁ oder X₂ oder beide Purine und X₃ oder X₄ oder beide sind Pyrimidine oder X₁X₂ sind GpA und X₃ oder X₄ oder beide sind Pyrimidine. In einer bevorzugten Ausführungsform sind X₃X₄ Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus TpT, TpC und TpA.
Die immunstimulatorische Nukleinsäure kann irgendeine Größe (d. h. Länge) aufweisen, vorausgesetzt, dass sie wenigstens vier Nukleotide umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen weisen die immunstimulatorischen Nukleinsäuren eine Länge im Bereich zwischen 6 und 100 auf. In noch anderen Ausführungsformen bewegt sich die Länge im Bereich von zwischen 8 und 35 Nukleotiden. Bevorzugterweise reicht die Größe der TG-Oligonukleotide von 15 bis 25 Nukleotiden.
Die Größe (d. h. Anzahl von Nukleotidresten über die Länge der Nukleinsäure) der immunstimulatorischen Nukleinsäure kann auch zu der stimulatorischen Aktivität der Nukleinsäure beitragen. Man hat überraschenderweise entdeckt, dass selbst für hoch immunstimulierende immunstimulatorische Nukleinsäuren die Länge der Nukleinsäure das Ausmaß der Immunstimulierung, die erreicht werden kann, beeinflusst. Man hat gezeigt, dass eine Erhöhung der Länge einer T-reichen Nukleinsäure bis zu 24 Nukleotiden eine erhöhte Immunstimulierung bedingt. Die Experimente, die in den Beispielen dargestellt sind, zeigen, dass wenn die Länge der T-reichen Nukleinsäure von 18 auf 27 Nukleotide erhöht ist, die Fähigkeit der Nukleinsäure eine Immunantwort zu stimulieren, signifikant erhöht ist (vergleiche ODN #2194, 2183, 2195 und 2196, die sich hinsichtlich der Größe von 27 auf 18 Nukleotide verringern). Die Erhöhung der Länge der Nukleinsäure auf bis zu 30 Nukleotide weist einen dramatischen Einfluss auf die biologischen Eigenschaften der Nukleinsäure auf, die Erhöhung der Länge über 30 Nukleotide hinaus scheint jedoch die immunstimulatorische Wirkung nicht weiter zu beeinflussen (vergleiche z. B. ODN 2179 mit 2006).
Man hat gezeigt, dass TG-Nukleinsäuren, die hinsichtlich ihrer Länge von 15 bis 25 Nukleotiden reichen, eine erhöhte Immunstimulierung aufweisen können. In einem Aspekt liefert somit die Erfindung ein Oligonukleotid, das eine Länge von 15 – 27 Nukleotide aufweist (d. h. ein Oligonukleotid, das 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder 27 Nukleotide lang ist), das eine T-reiche Nukleinsäure oder eine TG-Nukleinsäure sein kann, oder sowohl eine T-reiche als auch eine TG-Nukleinsäure sein kann. In einer Ausführungsform ist das Oligonukleotid keine T-reiche Nukleinsäure und auch keine TG-Nukleinsäure. In anderen Ausführungsformen weist das Oligonukleotid kein CG-Motiv auf. Die Erfindung stellt in ähnlicher Weise Oligonukleotide bereit, die eine Länge von 15 – 27 Nukleotiden aufweisen, Oligonukleotide, die eine Länge von 18 – 25 Nukleotiden aufweisen, Oligonukleotide, die eine Länge von 20 – 23 Nukleotiden aufweisen und Oligonukleotide, die eine Länge von 23 – 25 Nukleotiden aufweisen. Eine jegliche der vorstehenden Ausführungsformen betreffend Oligonukleotide mit einer Länge von 15 – 27 betreffen auch die Oligonukleotide mit diesen unterschiedlichen Längen. Die Erfindung umfasst weiter die Verwendung von einem jeglichen dieser vorstehenden Oligonukleotide in den hierin beschriebenen Verfahren.
Obwohl ein maximales Ausmaß an Immunstimulierung mit einigen T-reichen Nukleinsäuren, wenn die Nukleinsäure eine Länge von 24 – 30 Nukleotidresten aufweist, ebenso wie mit einigen TG-Nukleinsäuren, die eine Länge von 15 – 25 Nukleotiden aufweisen, erreicht wird, können auch kürzere oder längere immunstimulatorische Nukleinsäuren gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Um die Aufnahme in Zellen zu erleichtern, weisen immunstimulatorische Nukleinsäuren bevorzugterweise eine Minimallänge von 6 Nukleotidresten auf. Nukleinsäuren mit irgendeiner Größe von mehr als 6 Nukleotiden (selbst viele kb lang) sind in der Lage, eine Immunantwort gemäß der Erfindung zu induzieren, wenn ausreichend immunstimulatorische Motive vorhanden sind, da größere Nukleinsäuren innerhalb von Zellen abgebaut werden. Bevorzugterweise bewegen sich die immunstimulatorischen Nukleinsäuren im Bereich zwischen 8 und 100 und in einigen Ausführungsformen weisen T-reiche enthaltende immunstimulatorische Nukleinsäuren eine Länge zwischen 24 und 40 Nukleotiden und TG-enthaltende immunstimulatorische Nukleinsäuren zwischen 15 und 25 Nukleotiden auf.
In einer Ausführungsform wird die T-reiche Nukleinsäure durch wenigstens die folgende Formel dargestellt:
5'X₁X₂TTTTX₃X₄3'
wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind. In einer Ausführungsform ist X₁X₂ TT und/oder X₃X₄ TT. In einer weiteren Ausführungsform sind X₁X₂ irgendeine der folgenden Nukleotide TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC; und X₃X₄ sind irgendwelche der folgenden Nukleotide TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC.
In einigen Ausführungsformen ist bevorzugt, dass die immunstimulatorischen Nukleinsäuren kein Poly-C (CCCC) oder Poly-A (AAAA) enthalten. In anderen Ausführungsformen ist bevorzugt, dass die immunstimulatorische Nukleinsäure ein Poly-C, Poly-A, Poly-G (GGGG) oder multiple GGs enthält. Vor allem Poly-G oder multiple GG-Motive weisen dramatische Wirkungen auf bestimmte immunstimulatorische Nukleinsäuren auf. Die Wirkung dieser Nicht-T-Sequenzen hängt teilweise vom Status des Nukleinsäurerückgrats ab. Beispielsweise wird, wenn die Nukleinsäure ein Phosphodiester-Rückgrat oder ein chimäres Rückgrat aufweist, das Einschließen dieser Sequenzen in die Nukleinsäure nur eine minimale Wirkung, wenn überhaupt, auf die biologische Aktivität der Nukleinsäure aufweisen. Wenn das Rückgrat vollständig Phosphothioat (oder andere Phosphatmodifikationen) oder im Wesentlichen Phosphothioat ist, dann kann die Aufnahme dieser Sequenzen einen stärkeren Einfluss auf die biologische Aktivität oder die Kinetiken der biologischen Aktivität aufweisen, was eine Verringerung der Potenz der T-reichen und TG-immunstimulatorischen Nukleinsäuren bedingt.
Obwohl man gezeigt hat, dass C-reiche Nukleinsäuren immunstimulatorische Eigenschaften aufweisen, kann das Einfügen von Poly-C-Sequenzen in eine T-reiche Nukleinsäure in einer Art und Weise, die den relativen Anteil an T-Nukleotiden in der Nukleinsäure verringern würde, einen negativen Einfluss auf die Nukleinsäure aufweisen. Obwohl Anwender nicht durch einen vorgeschlagenen Mechanismus gebunden sind, glaubt man, dass das Immunsystem einen Mechanismus entwickelt hat, um zwischen Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Nukleotideigenschaften zu unterscheiden, was möglicherweise aus unterschiedlichen Sätzen von Bindungsproteinen resultiert, die unterschiedliche Sequenzen oder spezifische Bindungsproteine erkennen, die alle immunstimulatorischen Sequenzen erkennen, aber mit unterschiedlichen Affinitäten. Im Allgemeinen sind Nukleinsäuren, die unmethylierte CpG-Motive enthalten, am stärksten immunstimulatorisch, gefolgt von T-reichen Nukleinsäuren, TG-Nukleinsäuren und C-reichen Nukleinsäuren. Diese Verallgemeinerung weist jedoch viele Ausnahmen auf. Beispielsweise ist eine starke T-reiche Nukleinsäure wie SEQ ID NO: 886 in einigen Tests stärker immunstimulatorisch als einige CpG-enthaltende Nukleinsäuren (z. B. eine Phosphothioat-CpG-Nukleinsäure, die ein einzelnes CpG-Motiv enthält).
Man hat auch entdeckt, dass das Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes an eine immunstimulatorische Nukleinsäure die Aktivität der Nukleinsäure erhöhen kann. Man hat entdeckt, dass wenn eine hoch immunstimulatorische CpG-Nukleinsäure (SEQ ID NO: 246) durch das Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes (AAAAAA) oder eines Poly-T-Schwanzes (TTTTTT) modifiziert wurde, die sich ergebenden Oligonukleotide eine erhöhte immunstimulatorische Aktivität aufwiesen. Die Fähigkeit des Poly-A-Schwanzes und des Poly-T-Schwanzes, die immunstimulatorischen Eigenschaften des Oligonukleotids zu erhöhen, waren sehr ähnlich. SEQ ID NO: 246 ist ein T-reiches Oligonukleotid. Es ist wahrscheinlich, dass wenn ein Poly-A- und Poly-T-Schwanz zu einer Nukleinsäure hinzugefügt werden, die nicht T-reich ist, dies einen größeren Einfluss auf die immunstimulatorische Fähigkeit der Nukleinsäure haben würde. Da der Poly-T-Schwanz zu einer Nukleinsäure hinzugegeben wurde, die bereits in hohem Maße T-reich war, wurden die immunstimulatorischen Eigenschaften der Poly-T-Hinzufigung etwas verdünnt, gleichwohl nicht vollständig. Diese Feststellung hat wichtige Implikationen für die Verwendung von Poly-A-Regionen. In einigen Ausführungsformen umfassen somit die immunstimulatorischen Nukleinsäuren eine Poly-A-Region und in anderen Ausführungsformen nicht.
Einige der immunstimulatorischen Nukleinsäuren der Erfindung umfassen ein oder mehrere CG-Motive. Die Anwesenheit von CG-Motiven in den immunstimulatorischen Nukleinsäuren hat auch einen Einfluss auf die biologische Aktivität der Nukleinsäuren. Wenn die Gesamtlänge einer immunstimulatorischen Nukleinsäure 20 Nukleotidreste oder weniger ist, dann sind CpG-Motive bei der Bestimmung der Immunwirkung der Nukleinsäure wichtig und die Methylierung dieser Motive verringert die Potenz der immunstimulatorischen Wirkungen der Nukleinsäure. Wenn die Länge der immunstimulatorischen Nukleinsäure auf 24 erhöht wird, dann werden die immunstimulatorischen Wirkungen der Nukleinsäure weniger abhängig von den CpG-Motiven und werden nicht länger durch Methylierung der CpG- Motive oder durch ihre Inversion in GC-Dinukleotide beseitigt, unter der Voraussetzung, dass andere immunstimulatorische Eigenschaften, wie sie hierin beschrieben sind, vorhanden sind.
Beispielsweise ist ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) eine hoch immunstimulatorische 7-reiche Nukleinsäure mit einer Länge von 24 Nukleotidresten mit vier CpG-Dinukleotiden. ODN 2117 (SEQ ID NO: 358) jedoch, bei dem die CpG-Motive methyliert sind, ist ebenfalls hoch immunstimulatorisch. ODN 2137 (SEQ ID NO: 886), bei dem die CpG-Motive von ODN 2006 zu GpC umgedreht sind und welches entsprechend sechs TG-Dinukleotide enthält, ist ebenfalls immunstimulatorisch. Die immunstimulatorischen Wirkungen von Nukleinsäuren wie beispielsweise ODN 2117 und 2137 werden durch ihren T- und TG-Gehalt gesteuert. Eine jede dieser drei Nukleinsäuren ist T-reich und ODN 2137 ist zusätzlich TG-reich. Wenn ihr T-Gehalt durch Einfügen von anderen Basen wie beispielsweise A (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) oder ihr TG-Gehalt durch Substitution von TG durch AG verringert wird, dann sind ihre immunstimulatorischen Wirkungen etwas verringert. In einem weiteren Beispiel weist eine Nukleinsäure mit einer Länge von 24 Nukleotiden, bei der alle Positionen randomisiert sind, nur eine bescheidene immunstimulatorische Wirkung auf (ODN 2182 (SEQ ID NO: 432)). In ähnlicher Weise weist eine Nukleinsäure mit einer Länge von 24 Nukleotiden mit anderen Nukleotidzusammensetzungen unterschiedliche immunstimulatorische Effekte auf, abhängig von ihrem T-Gehalt (ODN 2188 (SEQ ID NO: 905), 2189 (SEQ ID NO: 906), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908), 2193 (SEQ ID NO: 910), 2183 (SEQ ID NO: 433), und 2178 (SEQ ID NO: 428)). ODN 2190, das TGT-Motive enthält, ist immunstimulatorischer als ODN 2202, welches TGG-Motive besitzt. In einigen Ausführungsformen sind somit TGT-Motive bevorzugt. In noch weiteren Ausführungsformen ist die Anzahl von TGT-Motiven wichtig insoweit, als dass eine Erhöhung der Anzahl von TG-Motiven zu einer Erhöhung der Immunstimulation führt. Einige bevorzugte TG-Nukleinsäuren enthalten wenigstens drei TG-Motive.
Beispiele für CpG-Nukleinsäuren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die in der Tabelle A aufgelistet sind, wie beispielsweise SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 7900792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904, und 909-913.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfassen die immunstimulatorischen Nukleinsäuren CpG-Dinukleotide und in anderen Ausführungsformen sind die immunstimulatorischen Nukleinsäuren frei von CpG-Dinukleotiden. Die CpG-Dinukleotide können methyliert oder unmethyliert sein. Eine Nukleinsäure, die wenigstens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, ist ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmethylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotid-Sequenz enthält (d. h. „CpG-DNA" oder DNA, die ein unmethyliertes 5'-Cytosin enthält, gefolgt von 3'-Guanosin und durch eine Phosphatbindung verknüpft ist) und das Immunsystem aktiviert. Eine Nukleinsäure, die wenigstens ein methyliertes CpG-Dinukleotid enthält, ist eine Nukleinsäure, die eine methylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotid-Sequenz enthält (d. h. ein methyliertes 5'-Cytosin, gefolgt von einem 3'-Guanosin und durch eine Phosphatbindung verknüpft).
Beispiele für T-reiche Nukleinsäuren, die frei von CpG-Nukleinsäuren sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die in Tabelle A angegeben sind, wie beispielsweise SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 und 910-913. Beispiele für T-reiche Nukleinsäuren, die CpG-Nukleinsäuren enthalten, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die in Tabelle A angegeben sind, wie beispielsweise SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 und 891.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren können doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Moleküle in vivo stabiler, wohingegen einzelsträngige Moleküle eine erhöhte Immunaktivität aufweisen. In einigen Aspekten der Erfindung ist es somit bevorzugt, dass die Nukleinsäure einzelsträngig ist und in anderen Aspekten ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäure doppelsträngig ist.
Der Begriff T-reiche Nukleinsäure und TG-Nukleinsäure, wie hierin verwendet, bezeichnet eine immunstimulatorische T-reiche Nukleinsäure bzw. eine immunstimulatorische TG-Nukleinsäure, sofern nicht anders angegeben. Die T-reichen Nukleinsäuresequenzen der Erfindung sind jene, die oben breit beschrieben sind, ebenso wie die Nukleinsäuren, die in Tabelle A gezeigt sind, die wenigstens ein Poly-T-Motiv und/oder eine Zusammensetzung von mehr als 25 % T- oder bevorzugterweise 35 % Nukleotidresten aufweisen. Die C-reichen Nukleinsäuren sind jene mit wenigstens einer und bevorzugterweise wenigstens zwei Poly-C-Regionen. Die TG-Nukleinsäuren der Erfindung sind jene, die oben umfänglich beschrieben sind, ebenso wie die in Tabelle A gezeigten spezifischen Nukleinsäuren, die wenigstens ein TG-Motiv aufweisen.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können, müssen aber nicht, auch ein Poly-G-Motiv enthalten. Poly-G-enthaltende Nukleinsäuren sind ebenfalls immunstimulatorisch. Eine Vielzahl von Literaturstellen, einschließlich Pisetsky und Reich, 1993 Mol. Biol. Reports, 18:217-221; Krieger und Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63:601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90:3745-3749; Wyatt et al., 1994, PNAS, 91:1356-1360; Rando und Hogan, 1998, In Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Herausg. Krieg und Stein, S. 335-352; und Kimura et al., 1994, J. Biochem. 116, 991-994 beschreiben auch die immunstimulatorischen Eigenschaften von Poly-G-Nukleinsäuren.
Poly-G-Nukleinsäuren sind bevorzugterweise Nukleinsäuren mit den folgenden Formeln:
5' X₁X₂GGGX₃X₄ 3'
wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind. In bevorzugten Ausführungsformen ist wenigstens X₃ oder X₄ ein G. In anderen Ausführungsformen sind X₃ und X₄ ein G. In noch weiteren Ausführungsformen ist die bevorzugte Formel 5' GGGNGGG 3' oder 5' GGGNGGGNGGG 3', wobei N zwischen 0 und 20 Nukleotide darstellt. In anderen Ausführungsformen ist die Poly-G-Nukleinsäure frei von unmethylierten CG-Dinukleotiden, wie beispielsweise die Nukleinsäuren, die unten als SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 und 938 aufgelistet sind. In anderen Ausführungsformen umfasst die Poly-G-Nukleinsäure wenigstens ein unmethyliertes CG-Dinukleotid, wie beispielsweise die unten als SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 und 937 aufgelisteten Nukleinsäuren.
Die Begriffe „Nukleinsäure" und „Oligonukleotid" werden austauschbar verwendet, um mehrere Nukleotide (d. h. Moleküle umfassend einen Zucker (z. B. Ribose oder Desoxyribose), der an eine Phosphatgruppe gebunden ist und mit einer austauschbaren organischen Base, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z. B. Cytosin (C), Thymidin (T) oder Uracil (U) ist) oder ein substituiertes Purin (z. B. Adenin (A) oder Guanin (G) ist) zu bezeichnen. Wie hierin verwendet bezeichnen die Begriffe sowohl Oligoribonukleotide als auch Oligodesoxyribonukleotide. Die Begriffe sollen auch Polynukleoside (d. h. ein Polynukleotid ohne das Phosphat) und irgendwelche anderen organische Basen enthaltende Polymere umfassen. Nukleinsäuremoleküle können aus bestehenden Nukleinsäurequellen (z. B. genomische oder cDNA) erhalten werden, sind aber bevorzugterweise synthetisch (d. h. hergestellt durch Nukleinsäuresynthese).
Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid umfassen auch Nukleinsäuren oder Oligonukleotide mit Substitutionen oder Modifikationen, wie beispielsweise an den Basen und/oder Zuckern. Beispielsweise umfassen sie Nukleinsäuren mit Rückgratzuckern, die kovalent an niedermolekulare organische Gruppen gebunden sind, die verschieden sind von einer Hydroxylgruppe an der 3'-Position und einer Phosphatgruppe an der 5'-Position. Die solchermaßen modifizierten Nukleinsäuren können eine 2'-O-alkylierte Ribosegruppe enthalten. Zusätzlich können modifizierte Nukleinsäuren Zucker wie beispielsweise Arabinose anstelle von Ribose enthalten. Die Nukleinsäuren können somit hinsichtlich der Rückgratzusammensetzung heterogen sein, wodurch sie eine jegliche mögliche Kombination aus Polymereinheiten enthalten, die aneinandergeknüpft sind, wie beispielsweise Peptid-Nukleinsäuren (die ein Aminosäurerückgrat mit Nukleinsäurebasen aufweisen). In einigen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren hinsichtlich der Rückgratzusammensetzung homogen. Nukleinsäuren umfassen auch substituierte Purine und Pyrimidine wie beispielsweise C-5-Propin-modifizierte Basen (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Purine und Pyrimidine umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymidin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6- Diaminopurin, Hypoxanthin und andere natürlich und nicht natürlich auftretende Nukleobasen, substituierte und unsubstituierte aromatische Reste. Andere derartige Modifikationen sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können die Nukleinsäuren der Erfindung de novo synthetisiert werden unter Verwendung einer von einer Vielzahl von in der Technik gut bekannten Verfahrensweisen. Beispielsweise das b-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Verfahren (Beaucage, S.L., und Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); und Nukleosid-H-Phosphonat-Verfahren (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986,; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Diese Chemien können von einer Vielzahl von automatisierten Nukleinsäuresynthesegeräten durchgeführt werden, die auf dem Markt verfügbar sind. Diese Nukleinsäuren werden als synthetische Nukleinsäuren bezeichnet. Alternativ können T-reiche und/oder TG-Dinukleotide im großen Maßstab in Plasmiden hergestellt werden (siehe Sambrook, T., et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) und in kleinere Stücke oder als Ganzes verabreicht werden. Nukleinsäuren können aus bestehenden Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden (z. B. genomisch oder cDNA) unter Verwendung bekannter Techniken, wie beispielsweise jene, die Restriktionsenzyme, Exonukleasen oder Endonukleasen verwenden. Nukleinsäuren, die auf diese Weise hergestellt sind, werden als isolierte Nukleinsäure bezeichnet. Eine isolierte Nukleinsäure bezeichnet im Allgemeinen eine Nukleinsäure, die von Bestandteilen getrennt ist, die normalerweise damit in der Natur verbunden sind. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäure eine solche sein, die von einer Zelle, von einem Zellkern, von Mitochondrien oder von Chromatin getrennt ist. Die Begriffe Py-reiche Nukleinsäuren und TG-Nukleinsäuren umfassen sowohl synthetische als auch isolierte Py-reiche Nukleinsäuren und TG-Nukleinsäuren.
Für die in vivo-Verwendung können die Py-reichen und TG-Nukleinsäuren optional vergleichsweise resistent gegenüber Abbau sein (z. B. stabilisiert sein). Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül" soll ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das vergleichsweise resistent ist gegenüber in vivo-Abbau (z. B. durch eine Exo- oder Endonuklease). Die Stabilisierung kann eine Funktion der Länge oder der Sekundärstruktur sein. Nukleinsäuren, die hunderte von kbs lang sind, sind vergleichsweise resistent gegenüber in vivo-Abbau. Bei kürzeren Nukleinsäuren kann die Sekundärstruktur ihre Wirkung stabilisieren und erhöhen.
Beispielsweise kann dann die Nukleinsäure stabilisiert werden und deshalb eine größere Aktivität aufweisen, wenn das 3'-Ende einer Nukleinsäure eine Selbstkomplementarität zu einer stromaufwärts gelegenen Region aufweist, so dass sie sich zurückfalten und eine Art von Stammschleifenstruktur ausbilden kann.
Alternativ kann eine Nukleinsäurestabilisierung vermittels Phosphatrückgratmodifikationen erreicht werden. Bevorzugte stabilisierte Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung weisen ein modifiziertes Rückgrat auf. Es ist gezeigt worden, dass eine Modifikation des Nukleinsäurerückgrates den Py-reichen und TG-Nukleinsäuren eine erhöhte Aktivität verleiht, wenn sie in vivo verabreicht werden. Diese stabilisierten Strukturen sind bevorzugt, da die Py-reichen und TG-Moleküle der Erfindung wenigstens ein teilweise modifiziertes Rückgrat aufweisen. Py-reiche und TG-Konstrukte mit Phosphothioat-Verbindungen liefern eine maximale Aktivität und schützen die Nukleinsäure vor Abbau durch intrazelluläre Exo- und Endonukleasen. Andere modifizierte Nukleinsäuren umfassen Phosphodiester-modifizierte Nukleinsäuren, Kombinationen aus Phosphodiester- und Phosphothioat-Nukleinsäure, Methylphosphonat, Methylphosphothioat, Phosphodithioat, p-Ethoxy und Kombinationen davon. Eine jede dieser Kombinationen und ihre besonderen Wirkungen auf Immunzellen wird bezüglich der CpG-Nukleinsäuren in den veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen PCT/US95/01570 (WO 96/02555) und PCT/US97/19791 (WO 98/18810), die die Priorität der U.S.-Anmeldungen 08/386,063 und 08/960,774, eingereicht am 7. Februar 1995 bzw. 30. Oktober 1997, beanspruchen, detaillierter diskutiert, deren gesamter Offenbarungsgehalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Man nimmt an, dass diese modifizierten Nukleinsäuren eine höhere stimulatorische Aktivität zeigen können infolge der erhöhten Nukleaseresistenz, erhöhter zellulärer Aufnahme, erhöhter Proteinbindung und/oder geänderter intrazellulärer Lokalisation.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können optional chimäre Oligonukleotide sein. Die chimären Oligonukleotide sind Oligonukleotide mit einer Formel 5' Y₁N₁ZN₂Y₂ 3'. Y₁ und Y₂ sind Nukleinsäuremoleküle mit zwischen 1 und 10 Nukleotiden. Y₁ und Y₂ enthalten jeweils wenigstens eine modifizierte Internukleotidverbindung. Da wenigstens 2 Nukleotide der chimären Oligonukleotide Rückgratmodifikationen umfassen, sind diese Nukleinsäuren ein Beispiel für eine Art von „stabilisierten immunstimulatorischen Nukleinsäuren".
Bezüglich der chimären Oligonukleotide werden Y₁ und Y₂ unabhängig voneinander betrachtet. Dies bedeutet, dass jeweils Y₁ und Y₂ voneinander verschiedene Sequenzen und verschiedene Rückgratverbindungen in dem gleichen Molekül aufweisen oder nicht aufweisen können. Die Sequenzen variieren, in einigen Fällen haben aber Y₁ und Y₂ eine Poly-G-Sequenz. Eine Poly-G-Sequenz bezeichnet wenigstens 3 Gs in einer Reihe. In anderen Ausführungsformen bezeichnet die Poly-G-Sequenz wenigstens 4, 5, 6, 7 oder 8 Gs in einer Reihe. In anderen Ausführungsformen können Y₁ und Y₂ TCGTCG, TCGTCGT oder TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145) sein. Y₁ und Y₂ können auch eine Poly-C-, Poly-T- oder Poly-A-Sequenz aufweisen. In einigen Ausführungsformen weisen Y₁ und/oder Y₂ zwischen 3 und 8 Nukleotiden auf.
N₁ und N₂ sind Nukleinsäuremoleküle mit zwischen 0 und 5 Nukleotiden, so lange wie N₁ZN₂ insgesamt wenigstens 6 Nukleotide aufweist. Die Nukleotide von N₁ZN₂ weisen ein Phosphodiesterrückgrat auf und umfassen keine Nukleinsäuren mit einem modifizierten Rückgrat.
Z ist ein immunstimulatorisches Nukleinsäuremotiv, umfasst aber kein CG. Beispielsweise kann Z eine Nukleinsäure, eine T-reiche Sequenz, z. B. umfassend ein TTTT-Motiv, oder eine Sequenz sein, wobei wenigstens 50 % der Basen der Sequenz Ts sind, oder Z kann eine TG-Sequenz sein.
Die mittleren Nukleotide (N₁ZN₂) der Formel Y₁N₁ZN₂Y₂ weisen Phosphodiester-Internukleotid-Verbindungen auf und Y₁ und Y₂ haben wenigstens eine, können aber mehr als eine oder können sogar nur modifizierte Internukleotidverbindungen aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen weisen Y₁ und/oder Y₂ wenigstens zwei oder zwischen zwei und fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf oder Y₁ weist zwei modifizierte Internukleotidverbindungen auf und Y₂ weist fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf, oder Y₁ weist fünf modifizierte Internukleotidverbindungen auf und Y₂ weist zwei modifizierte Internukleotidverbindungen auf. Die modifizierte Internukleotidverbindung ist in einigen Ausführungsformen eine Phosphothioat-modifizierte Verbindung, eine Phosphodithioat-modifizierte Verbindung oder eine p-Ethoxy-modifizierte Verbindung.
Modifizierte Rückgrate wie beispielsweise Phosphothioate können synthetisiert werden unter Verwendung von automatisierten Techniken, die entweder Phosphoramidat oder H- Phosphonat-Chemien verwenden. Aryl- und Alkyl-Phosphonate können hergestellt werden wie, beispielsweise, beschrieben in US-Patent 4,469,863; und Alkylphosphotriester (bei denen der geladene Sauerstoffteil alkyliert ist, wie in US-Patent 5,023,243 und dem europäischen Patent 092,574 beschrieben) können hergestellt werden durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien. Verfahren zum Herstellen anderer DNA-Rückgratmodifikationen und -substitutionen sind beschrieben worden (Uhlmann, E. und Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990).
Andere stabilisierte Nukleinsäuren umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga wie beispielsweise Alkyl- und Aryl-Phosphate (bei denen der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Arylgruppe ersetzt ist), Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei denen der geladene Sauerstoffteil alkyliert ist. Man hat auch gezeigt, dass Nukleinsäuren, die Diol, wie beispielsweise Tetraethylenglycol oder Hexaethylenglycol, an einem oder beiden Enden enthalten, im wesentlichen resistent sind gegenüber Nukleaseabbau.
Im dem Fall, wo die Py-reiche oder TG-Nukleinsäure zusammen mit einem Antigen verabreicht wird, das durch einen Nukleinsäurevektor codiert wird, ist es bevorzugt, dass das Rückgrat der Py-reichen oder TG-Nukleinsäure eine chimäre Kombination aus Phosphodiester und Phosphothioat (oder anderen Phosphatmodifikation) ist. Die Zelle kann ein Problem haben, einen Plasmidvektor in Anwesenheit einer vollständigen Phosphothioat-Nukleinsäure aufzunehmen. Wenn somit sowohl ein Vektor als auch eine Nukleinsäure einem Patient verabreicht werden, ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäure ein chimäres Rückgrat oder ein Phosphothioatrückgrat aufweist, aber dass das Plasmid mit einem Vehikel verbunden ist, das es direkt in die Zelle abgibt, wodurch die Notwendigkeit für eine zelluläre Aufnahme vermieden wird. Derartige Vehikel sind in der Technik bekannt und umfassen, beispielsweise, Liposomen und Genkanonen.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuren ebenso wie verschiedene Kontrollnukleinsäuren sind in Tabelle A unten angegeben.
Tabelle A
Während CpG-Effekte in Mäusen gut charakterisiert sind, ist die Information hinsichtlich des menschlichen Systems beschränkt. CpG-Phosphothioat-Oligonukleotide mit starker stimulatorischer Aktivität im Maussystem zeigen eine niedrigere Aktivität bei Immunzellen vom Menschen und anderen Nicht-Nagetierlebewesen. In den Beispielen ist die Entwicklung eines potenten menschlichen CpG-Motivs und die Charakterisierung seiner Wirkungen und Wirkmechanismen auf menschliche primäre B-Zellen beschrieben. DNA, die dieses CpG-Motiv enthält, stimulierte primäre menschliche B-Zellen stark zu proliferieren, IL-6 zu produzieren und erhöhte Titer an CD86, CD40, CD54 und MHC II zu exprimieren. Es erhöhte DNA-Bindungsaktivität der Transkriptionsfaktoren NF_κB und AP-1, ebenso wie die Phosphorylierung der Stress-aktivierten Proteinkinasen JNK und p38 und den Transkriptionsfaktor ATF-2. Die von CpG-DNA aktivierten Übertragungswege von B-Zellen waren verschieden von jenen, die von dem B-Zellrezeptor aktiviert werden, der ERK und eine andere Isoform von JNK aktivierte, aber nicht p38 und ATF-2 aktivierte. Im Allgemeinen sind die Daten betreffend CpG-DNA-initiierter Signaltransduktion konsistent mit den in Mäusen beobachteten (Hacker H., et al. 1998. Embo J 17:6230, Yi A. K., und Krieg A. M. 1998. J Immunol 161:4493).
Das bevorzugte Motiv von Nicht-Nagetierlebewesen ist 5' TCGTCGTT 3'. Basenaustausche innerhalb des potentesten 8mer-CpG-Motivs (5' TCGTCGTT 3') verringerten die Aktivität der Oligonukleotide. Die Thymidine an der 5'- und der 3'-Position dieses Motivs waren wichtiger als das Thymidin an der mittleren Position. Ein Adenin oder Guanosin an der mittleren Position ergab eine Verringerung der Aktivität.
Nebenbei gesagt zeigten unsere Studien, dass ein menschliches CpG-Motiv innerhalb eines Phosphodiester-Oligonukleotids (2080) ausreichend ist, um die maximale Wirkung zu ergeben und dass zusätzliche CpG-Motive (2059) die Aktivität nicht weiter erhöhten. Das Oligonukleotid mit dem 8mer-Motiv 5' TCG TCG TT 3' (2080), das zwei CpG-Dinukleotide enthielt, zeigte die höchste Aktivität bei diesen Studien. Das Ersetzen der Basen, die die beiden CpG-Dinukleotide flankierten (5'-Position, mittlere Position, 3'-Position) verringerte die Aktivität dieser Sequenz. Beide CpG-Dinukleotide innerhalb des 8mer-CpG-Motivs waren für die optimale Aktivität erforderlich (2108, 2106). Cytidin-Methylierung der CpG-Dinukleotide (2095) beseitigte die Aktivität von 2080, während die Methylierung eines nicht im Zusammenhang stehenden Cytidins (2094) dies nicht bewirkte. Das Hinzufügen von zwei CpG-Motiven in die Sequenz von 2080, was zu 2059 führte, erhöhte die Aktivität der Phosphodiesteroligonukleotide nicht weiter. Die Sequenz von 2080 mit einem Phosphothioatrückgrat (2116) zeigte eine geringere Aktivität, was nahelegt, dass zusätzliche CpG-Motive für ein potentes Phosphothioatoligonukleotid bevorzugt sind.
Man hat gemäß der Erfindung entdeckt, dass die immunstimulatorischen Nukleinsäuren in vitro dramatische immunstimulatorische Wirkungen auf menschliche Zellen wie beispielsweise NK-Zellen, B-Zellen und DCs aufweisen. Es ist gezeigt worden, dass die hierin verwendeten in vitro-Tests die in vivo-Wirksamkeit als ein Vakzinadjuvans bei Nicht-Nagetierwirbeltieren vorhersagen (Beispiel 12), was nahelegt, dass immunstimulatorische Nukleinsäuren wirksame therapeutische Agenzien für die Vakzinierung von Menschen, für die Krebsimmuntherapie, für die Asthmaimmuntherapie, für die allgemeine Erhöhung der Immunfunktion, für die Erhöhung der hämatopoetischen Erholung nach Bestrahlung oder Chemotherapie und für andere immunmodulatorische Anwendungen sind.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren sind somit in einigen Aspekten der Erfindung als prophylaktische Vakzine für die Behandlung eines Lebewesens nützlich, für das ein Risiko besteht, eine Infektion mit einem infektiösen Organismus oder eine Krebserkrankung zu entwickeln, bei dem ein spezifisches Krebsantigen identifiziert worden ist, oder eine Allergie oder Asthma, wo das Allergen oder eine Prädisposition für Asthma bekannt ist, zu entwickeln. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren können auch ohne das Antigen oder Allergen für einen kurzfristigeren Schutz gegen Infektion, Allergie oder Krebserkrankung gegeben werden, und in diesem Falle werden wiederholte Dosen einen langfristigeren Schutz erlauben. Ein Lebewesen, für das ein Risiko besteht, ist, wie hierin verwendet, ein Lebewesen, für das ein Risiko besteht, einem Pathogen, das eine Infektion verursacht, oder einem Krebs oder einem Allergen ausgesetzt zu sein, oder für das ein Risiko besteht, Krebs zu entwickeln. Beispielsweise kann ein Lebewesen, für das ein Risiko besteht, ein Lebewesen sein, das beabsichtigt, in ein Gebiet zu reisen, wo eine spezielle Art von infektiösem Agens gefunden wird, oder es kann ein Lebewesen sein, das durch seine Lebensweise oder durch medizinische Eingriffe Körperflüssigkeiten ausgesetzt ist, die infektiöse Organismen enthalten können, oder direkt dem Organismus ausgesetzt ist, oder sogar irgendein Lebewesen, das in einem Gebiet lebt, wo ein infektiöser Organismus oder ein Allergen identifiziert worden ist. Lebewesen, für die das Risiko besteht, dass sie eine Infektion entwickeln, umfassen auch allgemeine Populationen, für die eine Gesundheitsbehörde die Impfung mit einem speziellen Antigen eines infektiösen Organismus empfiehlt. Wenn das Antigen ein Allergen ist und das Lebewesen allergische Reaktionen gegen das spezielle Antigen entwickelt und das Lebewesen dem Antigen ausgesetzt ist, beispielsweise während der Pollensaison, dann besteht für das Lebewesen das Risiko, dem Antigen ausgesetzt zu werden. Ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, eine Allergie bis hin zu Asthma zu entwickeln, umfasst jene Lebewesen, von denen bekannt ist, dass sie eine Allergie oder Asthma haben, die aber die aktive Krankheit während der immunstimulatorischen Nukleinsäurebehandlung nicht aufweisen, ebenso wie Lebewesen, von denen man glaubt, dass sie ein Risiko haben, diese Erkrankungen infolge genetischer oder Umweltfaktoren zu entwickeln.
Ein Lebewesen, für das ein Risiko besteht, eine Krebserkrankung zu entwickeln, ist ein solches, für das eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass es eine Krebserkrankung entwickelt. Diese Lebewesen umfassen, beispielsweise, Lebewesen mit einer genetischen Anomalie, von deren Anwesenheit gezeigt worden ist, dass sie mit einer höheren Wahrscheinlichkeit korreliert, dass eine Krebserkrankung entwickelt wird, und Lebewesen, die Krebs-erzeugenden Agenzien ausgesetzt sind, wie beispielsweise Tabak, Asbest oder anderen chemischen Toxinen, oder ein Lebewesen, das zuvor gegen Krebs behandelt worden ist und sich in offenkundiger Remission befindet. Wenn ein Lebewesen, für das ein Risiko besteht, dass es eine Krebserkrankung entwickelt, mit einem Antigen, das spezifisch ist für die Krebserkrankung, für die das Lebewesen ein Risiko trägt, diese zu entwickeln, und einer immunstimulatorischen Nukleinsäure behandelt wird, kann das Lebewesen in der Lage sein, Krebszellen abzutöten, während sie sich entwickeln. Wenn ein Tumor anfängt, sich in einem Lebewesen zu bilden, wird das Lebewesen eine spezifische Immunantwort gegen das Tumorantigen entwickeln.
Zusätzlich zur Verwendung der immunstimulatorischen Nukleinsäuren für die prophylaktische Behandlung umfasst die Erfindung auch die Verwendung der immunstimulatorischen Nukleinsäuren für die Behandlung eines Lebewesens, das eine Infektion, eine Allergie, Asthma oder eine Krebserkrankung hat.
Ein Lebewesen mit einer Infektion ist ein Lebewesen, das einem infektiösen Pathogen ausgesetzt worden ist und akute oder chronische nachweisbare Titer des Pathogens im Körper aufweist. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren können mit einem Antigen verwendet werden, um eine Antigen-spezifische systemische oder mukosale Immunantwort aufzubauen, die in der Lage ist, das Ausmaß des infektiösen Pathogens zu verringern oder dieses auszurotten. Eine infektiöse Erkrankung, wie hierin verwendet, ist eine Erkrankung, die aus der Anwesenheit eines fremden Mikroorganismus im Körper resultiert. Es ist besonders wichtig, wirksame Impfstrategien und Behandlungen zu entwickeln, um die Schleimhautoberflächen des Körpers zu schützen, die die primäre Eintrittsstelle des Pathogens sind.
Ein Lebewesen mit einer Allergie ist ein Lebewesen, das eine allergische Reaktion in Reaktion auf ein Allergen zeigt oder ein Risiko aufweist, diese zu entwickeln. Eine Allergie bezeichnet eine erworbene Überempfindlichkeit gegenüber einer Substanz (Allergen). Allergische Bedingungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Ekzeme, Rhinitis allergica oder Schnupfen, Heuschnupfen, Konjunktivitis, Bronchialasthma, Nesselfieber (Quaddeln) und Lebensmittelallergien und andere atopische Zustände.
Derzeit werden allergische Erkrankungen im Allgemeinen durch die Injektion von kleinen Dosen Antigens behandelt, gefolgt von nachfolgenden erhöhten Dosierungen des Antigens. Man glaubt, dass dieses Verfahren eine Toleranz gegenüber dem Allergen induziert, um weitere allergische Reaktionen zu verhindern. Diese Verfahren können jedoch mehrere Jahre benötigen, um wirksam zu werden und sind mit dem Risiko von Nebenwirkungen wie beispielsweise anaphylaktischem Schock verbunden. Die Verfahren der Erfindung vermeiden diese Probleme.
Allergien werden im Allgemeinen durch IgE-Antikörper-Erzeugung gegen harmlose Allergene verursacht. Die Zytokine, die durch systemische oder mukosale Verabreichung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren induziert werden, gehören überwiegend zu der als Th1 bezeichneten Klasse (Beispiele sind IL-12 und IFN-γ) und diese induzieren sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten. Die mit Th1-Antwort verbundenen Arten von Antikörpern schützen im Allgemeinen mehr, da sie hohe Neutralisierungs- und Opsonierungsfähigkeiten aufweisen. Der andere Haupttyp von Immunantwort, der mit der Produktion von IL-4-, IL-5- und IL-10-Zytokinen verbunden ist, wird als Th2-Immunantwort bezeichnet. Th2-Antworten umfassen überwiegend Antikörper und diese weisen eine geringere Schutzwirkung gegenüber Infektion auf und einige Th2-Isotypen (z. B. IgE) sind mit Allergie verbunden. Allgemein scheint es so, dass allergische Erkrankungen durch Immunantworten vom Th2-Typ vermittelt werden, während Th1-Antworten den besten Schutz gegen Infektion liefern, obwohl exzessive Th1-Antworten mit Autoimmunerkrankung verbunden sind. Auf der Grundlage der Fähigkeit der immunstimulatorischen Nukleinsäuren, die Immunantwort in einem Lebewesen von einer Th2- (die mit der Produktion von IgE-Antikörpern und Allergie verbunden ist) zu einer Th1-Antwort (die gegen allergische Reaktionen schützt) zu verschieben, kann einem Lebewesen eine wirksame Dosis einer immunstimulatorischen Nukleinsäure zum Induzieren einer Immunantwort verabreicht werden, um eine Allergie zu behandeln oder zu verhindern.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren haben somit einen erheblichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von allergischen und nicht-allergischen Zuständen, wie beispielsweise Asthma. Th2-Zytokine, insbesondere IL-4 und IL-5 sind in den Atemwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Zytokine fördern wichtige Aspekte der asthmatischen Entzündungsreaktion, einschließlich IgE-Isotopen-Umschaltung, eosinophile Chemotaxis und Aktivierung und Wachstum von Mastzellen. Th1-Zytokine, insbesondere IFN-γ und IL-12, können die Bildung von Th2-Klonen und die Produktion von Th2-Zytokinen unterdrücken. Asthma bezeichnet eine Störung des respiratorischen Systems, die durch Entzündung, Verengen der Atemwege und erhöhte Reaktivität der Atemwege gegenüber inhalierten Agenzien gekennzeichnet ist. Asthma ist häufig, obgleich nicht ausschließlich, mit atopischen oder allergischen Symptomen verbunden.
Ein Lebewesen, das einen Krebs aufweist, ist ein Lebewesen, das nachweisbare Krebszellen aufweist. Der Krebs kann ein maligner oder nicht-maligner Krebs sein. Krebserkrankungen oder Tumoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Gallengangkrebs; Gehirnkrebs; Brustkrebs; Gebärmutterhalskrebs; Choriokarzinom; Kolonkrebs; Endometriumskrebs; Speiseröhrenkrebs; Magenkrebs; intraepitheliale Neoplasmen; Lymphome; Leberkrebs; Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger und nicht-kleinzelliger); Melanom; Neuroblastome; Mundkrebs; Eierstockkrebs; Bauchspeicheldrüsenkrebs; Prostatakrebs; Mastdarmkrebs; Sarkome; Hautkrebs; Hodenkrebs; Schilddrüsenkrebs; und Nierenkrebs, ebenso wie andere Karzinome und Sarkome. In einer Ausführungsform ist der Krebs Haarzell-Leukämie, chronische myelogene Leukämie, kutane T-Zell-Leukämie, multiples Myelom, follikuläres Myelom, malignes Melanom, Plattenepithelkarzinom, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, Blasenzellkarzinom oder Kolonkarzinom.
Ein Lebewesen gemäß der Erfindung ist ein Nicht-Nagetierlebewesen. Ein Nicht-Nagetierlebewesen soll einen Menschen oder ein Wirbeltier bezeichnen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Hühnchen, einen Primaten, beispielsweise Affen, und Fische (Aquakulturarten), z. B. Lachs, schließt aber spezifisch Nagetiere wie Ratten und Mäuse aus.
Die Erfindung kann somit auch verwendet werden, um Krebs und Tumoren bei nicht-menschlichen Lebewesen zu behandeln. Krebs ist eine der Haupttodesursachen bei Haustieren (d. h. Katzen und Hunden). Krebs betrifft üblicherweise ältere Tiere, die, im Falle von Haustieren, in die Familie aufgenommen worden sind. 45 % der Hunde, die älter als 10 Jahre sind, werden wahrscheinlich dieser Erkrankung erliegen. Die üblichsten Behandlungsoptionen umfassen chirurgischen Eingriff, Chemotherapie und Bestrahlungstherapie. Andere Behandlungsmodalitäten, die mit einem gewissen Erfolg verwendet worden sind, sind Lasertherapie, Cryotherapie, Hyperthermie und Immuntherapie. Die Wahl der Behandlung hängt von der Art des Krebses und dem Umfang der Dissemination ab. Wenn das maligne Wachstum nicht auf einen diskreten Körperbereich beschränkt ist, ist es schwierig, nur malignes Gewebe zu entfernen, ohne auch normale Zellen zu beeinträchtigen.
Maligne Erkrankungen, die üblicherweise bei Hunden und Katzen diagnostiziert werden, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Lymphosarkom, Osteosarkom, Mammatumore, Mastozytom, Gehirntumor, Melanom, Adenokankroid, karzinoider Lungentumor, Bronchiallymphknotentumor, bronchioläres Adenokarzinom, Fibrom, Myxochondrom, Lungensarkom, Neurosarkom, Osteom, Papillom, Retinoblastom, Ewing-Sarkom, Wilms-Tumor, Burkitt'sches Lymphosarkom, Mikrogliom, Neuroblastom, Osteoklastom, orale Neoplasie, Fibrosarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom. Andere Neoplasien bei Hunden umfassen genitales Plattenepithelkarzinom, übertragbarer veneraler Tumor, Hodentumor, Seminom, Sertoli-Zell-Tumor, Hämangioperizytom, Histiozytom, Chlorom (granulozytisches Sarkom), Hornhautpapillom, Hornhautplattenepithelkarzinom, Hämangiosarkom, Pleuramesotheliom, Basalzellentumor, Thymom, Magentumor, Nebennierenkarzinom, orale Papillomatose, Hämangioendotheliom und Zystadenom. Zusätzliche Malignitäten, die bei Katzen diagnostiziert werden, umfassen Follikellymphom, intestinales Lymphosarkom, Fibrosarkom und Lungenplattenepithelkarzinom. Es ist bekannt, dass das Frettchen, ein zunehmend beliebtes Haustier, Insulinom, Lymphom, Sarkom, Neurom, Pankreasinselzellentumor, gastrisches MALT-Lymphom und Magenadenokarzinom entwickelt.
Neoplasien, die landwirtschaftlichen Viehbestand beeinträchtigen können, umfassen Leukämie, Hämangioperizytom und Rinderaugenneoplasie (beim Rind); Präputiumfibrosarkom, ulzeratives Plattenepithelkarzinom, Präputiumkarzinom, Bindegewebeneoplasie und Mastozytom (bei Pferden); Leberzellkarzinom (beim Schwein); Lymphom und Lungenadenomatose (bei Schafen); Lungensarkom, Lymphom, Rous-Sarkom, Retikulendotheliose, Fibrosarkom, Nephroblastom, B-Zell-Lymphom und lymphoide Leukose (bei Vogelarten); Retinoblastom, Leberneoplasie, Lymphosarkom (lymphoblastisches Lymphom), plasmazellenartige Leukämie und Schwimmblasenkarzinom (bei Fischen), käsige Lumphadenitis (CLA): chronische, infektiöse, ansteckende Erkrankung von Schafen und Ziegen, verursacht durch das Bakterium Corynebacterium pseudotuberculosis, und ansteckender Lungentumor von Schafen, verursacht durch jaagsiekte.
Das Lebewesen wird gegenüber dem Antigen exponiert. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff exponiert entweder den aktiven Schritt des Kontaktierens des Lebewesens mit einem Antigen oder die passive Exposition des Lebewesens gegenüber dem Antigen in vivo. Verfahren für die aktive Exposition eines Lebewesens gegenüber einem Antigen sind in der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen wird ein Antigen direkt dem Lebewesen verabreicht durch Mittel wie beispielsweise intravenöse, intramuskuläre, orale, transdermale, mukosale, intranasale, intratracheale oder subkutane Verabreichung. Das Antigen kann systemisch oder lokal verabreicht werden. Verfahren zum Verabreichen des Antigens und der immunstimulatorischen Nukleinsäure sind detaillierter unten beschrieben. Ein Lebewesen wird gegenüber einem Antigen passiv exponiert, wenn ein Antigen für die Exposition gegenüber den Immunzellen im Körper verfügbar wird. Ein Lebewesen kann passiv gegenüber einem Antigen exponiert werden, beispielsweise durch Eintritt eines fremden Pathogens in den Körper oder durch die Entwicklung einer Tumorzelle, die ein fremdes Antigen auf ihrer Oberfläche exprimiert.
Die Verfahren, bei denen ein Lebewesen gegenüber einem Antigen passiv exponiert wird, können insbesondere vom Zeitpunkt der Verabreichung der immunstimulatorischen Nukleinsäure abhängen. Beispielsweise kann, bei einem Lebewesen, für das ein Risiko besteht, eine Krebserkrankung oder eine infektiöse Krankheit oder eine allergische oder asthmatische Reaktion zu entwickeln, dem Lebewesen die immunstimulatorische Nukleinsäure regelmäßig verabreicht werden, wenn das Risiko am größten ist, d. h. während der allergischen Saison oder nach Exposition gegenüber einem Krebs-erzeugenden Agens. Zusätzlich kann die immunstimulatorische Nukleinsäure Reisenden verabreicht werden, bevor sie in fremde Länder reisen, wo für sie ein Risiko besteht, infektiösen Agenzien exponiert zu sein. In ähnlicher Weise kann die immunstimulatorische Nukleinsäure Soldaten oder Zivilisten, für die ein Risiko besteht, dass sie gegenüber biologischen Kampfstoffen exponiert sind, verabreicht werden, um eine systemische oder mukosale Immunantwort gegen das Antigen zu induzieren, und wenn das Lebewesen diesem gegenüber exponiert wird.
Ein Antigen, wie hierin verwendet, ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Antigene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Zellen, Zellextrakte, Proteine, Polypeptide, Peptide, Polysaccharide, Polysaccharidkonjugate, Peptid- und Nicht-Peptid-Mimetika von Polysacchariden und anderen Molekülen, kleine Moleküle, Lipide, Glycolipide, Kohlenhydrate, Viren und Virusextrakte und multizelluläre Organismen wie beispielsweise Parasiten und Allergene. Der Begriff Antigen umfasst breit eine jegliche Art von Molekül, das von einem Wirtsimmunsystem als fremd erkannt wird. Antigene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Krebsantigene, mikrobielle Antigene und Allergene.
Ein Krebsantigen, wie hierin verwendet, ist eine Verbindung, wie beispielsweise ein Peptid oder Protein, das mit einem Tumor oder einer Krebszelloberfläche verbunden ist, und das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen, wenn es auf der Oberfläche einer Antigenpräsentierenden Zelle im Zusammenhang mit einem MHC-Molekül exprimiert wird. Krebsantigene können aus Krebszellen hergestellt werden, entweder durch Herstellen von rohen Extrakten von Krebszellen, beispielsweise wie beschrieben in Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, durch teilweises Reinigen der Antigene, durch rekombinante Technologie oder durch de novo-Synthese bekannter Antigene. Krebsantigene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Antigene, die rekombinant exprimiert werden, ein immunogener Teil davon oder ein ganzer Tumor oder Krebs. Derartige Antigene können isoliert oder rekombinant hergestellt werden oder durch irgendwelche andere Mittel, die in der Technik bekannt sind.
Ein mikrobielles Antigen, wie hierin verwendet, ist ein Antigen eines Mikroorganismus und umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, Viren, Bakterien, Parasiten und Pilze. Derartige Antigene umfassen den intakten Mikroorganismus ebenso wie natürliche Isolate und Fragmente oder Derivate davon und auch synthetische Verbindungen, die identisch oder ähnlich zu Antigen von natürlichen Mikroorganismen sind und eine Immunantwort induzieren, die für den Mikroorganismus spezifisch ist. Eine Verbindung ist einem natürlichen Antigen eines Mikroorganismus ähnlich, wenn es eine Immunantwort (humoral und/oder zellulär) gegenüber einem natürlichen Antigen eines Mikroorganismus induziert. Derartige Antigene werden routinemäßig in der Technik verwendet und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Beispiele für Viren, die man beim Menschen gefunden hat, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Retroviridae (z. B. menschliches Immundefizienzvirus, wie beispielsweise HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III bezeichnet; und andere Isolate, wie beispielsweise HIV-LP; Picornaviridae (z. B. Poliovirus, Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviridae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis erzeugen); Togaviridae (z. B. Pferdeenzephalitis-Virus, Rubella-Virus); Flaviridae (z. B. Dengue-Virus, Enzephalitis-Virus, Gelbfieberviren); Coronoviridae (z. B. Coronavirus); Rhabdoviradae (z. B. vesikuläres Stomatitis-Virus, Tollwutvirus); Coronaviridae (z. B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z. B. vesikuläres Stomatitis-Virus, Tollwutviren); Filoviridae (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z. B. Parainfluenza-Viren, Mumps-Viren, Masern-Viren, Respiratory-syncytial-Virus); Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Viren); Bungaviridae (z. B. Hantaan-Viren, Bunga-Viren, Phleboviren und Nairo- Viren); Arena viridae (hämorrhagische Fieberviren); Reoviridae (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvovirida (Parvoviren); Papovaviridae (Papilloma-Viren, Polyoma-Viren); Adenoviridae (die meisten Adenoviren); Herpesviridae (Herpes-simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizellen-Zoster-Virus, Zytomegalovirus (CMV), Herpes-Virus; Poxviridae (Variola-Viren, Vaccinia-Viren, Pocken-Viren); und Iridoviridae (z. B. Afrikanisches Schweinefieber-Virus); und unklassifizierte Viren (z. B. ätiologische Agenzien von spongiformen Enzephalopathien, dem Agens für Delta-Hepatitis (von dem man annimmt, dass es ein defekter Satellit von Hepatitis B-Virus ist), das Agens von non-A-, non-B-Hepatitis (Klasse 1 = innerlich übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen (d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
Sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Bakterien dienen als Antigene bei Vertebraten-Tieren. Derartige Gram-positive Bakterien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Pasteurella-Spezies, Staphylococci-Spezies und Streptococcus-Spezies. Gramnegative Bakterien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Escherichia coli, Pseudomonas-Spezies und Salmonella-Spezies. Spezifische Beispiele für infektiöse Bakterien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Gruppe B-Streptococcus), Streptococcus (Viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe Formen), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia und Actinomyces israelli.
Beispiele für Pilze umfassen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen Plasmodium spp., wie beispielsweise Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale und Plasmodium vivax und Toxoplasma gondii. Durch Blut übertragene und/oder Gewebeparasiten umfassen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense und Trypanosoma rhodesiense (Afrikanische Schlafkrankheit), Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) und Toxoplasma gondii.
Andere medizinisch relevante Mikroorganismen sind in der Literatur intensiv beschrieben worden, siehe z. B. C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, deren gesamte Inhalte hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Obwohl viele der beschriebenen mikrobiellen Antigene menschliche Erkrankungen betreffen, ist die Erfindung auch nützlich für die Behandlung von anderen nicht-menschlichen Vertebraten. Nicht-menschliche Vertebraten sind auch in der Lage, Infektionen zu entwickeln, die mit den immunstimulatorischen Nukleinsäuren, wie sie hierin offenbart sind, verhindert oder behandelt werden können. Beispielsweise sind zusätzlich zur Behandlung von menschlichen Infektionserkrankungen die Verfahren der Erfindung auch nützlich für die Behandlung von Infektionen von Tieren.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff Behandlung, behandelt oder Behandeln, wenn er zusammen mit einer Infektionserkrankung verwendet wird, die prophylaktische Behandlung, die die Widerstandsfähigkeit eines Lebewesens (z. B. eines Lebewesens, für das die Gefahr einer Infektion besteht) gegenüber Infektionen mit einem Pathogen erhöht oder, mit anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit verringert, dass das Lebewesen mit dem Pathogen infiziert wird, ebenso wie eine Behandlung nachdem das Lebewesen (ein Lebewesen, das infiziert worden ist) infiziert worden ist, um die Infektion zu bekämpfen, z. B. die Infektion zu verringern oder zu beseitigen, oder zu verhindern, dass sie schlimmer wird.
Viele Vakzine für die Behandlung von nicht-menschlichen Vertebraten sind in Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3. Ausgabe, North American Compendiums, Inc., 1995 beschrieben. Wie oben beschrieben umfassen Antigene infektiöse Mikroben, wie beispielsweise Viren, Parasiten, Bakterien und Pilze und Fragmente davon, die aus natürlichen Quellen abgeleitet sind, oder synthetisch abgeleitet sind. Infektiöse Viren von sowohl menschlichen als auch nicht-menschlichen Vertebraten umfassen Retroviren, RNA-Viren und DNA-Viren. Diese Gruppe von Retroviren umfasst sowohl einfache Retroviren als auch komplexe Retroviren. Die einfachen Retroviren umfassen die Untergruppen von Retroviren vom B-Typ, Retroviren vom C-Typ und Retroviren vom D-Typ. Ein Beispiel für einen Retrovirus vom B-Typ ist der Mausbrusttumorvirus (MMTV). Die Retroviren vom C-Typ umfassen die Untergruppen Gruppe A des C-Typs (einschließlich Rous-Sarkoma-Virus (RSV), Vogelleukämievirus (ALV) und Vogelmyeloblastosevirus (AMV)) und Gruppe B des C-Typs (einschließlich Katzenleukämievirus (FeLV), Gibbonleukämievirus (GALV), Milznekrosevirus (SNV), Reticuloendotheliosevirus (RV) und Affensarkomavirus (SSV)). Retroviren vom D-Typ umfassen Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV) und Affenretrovirus Typ 1 (SRV-1). Die komplexen Retroviren umfassen die Untergruppen der Lentiviren, T-Zell-Leukämieviren und die Schaumviren. Lentiviren umfassen HIV-1, umfassen aber HIV-2, SIV, Visna-Virus, Katzenimmundefizienzvirus (FIV) und infektiöses Pferdeanämievirus (EIAV). Die T-Zell-Leukämieviren umfassen HTLV-I, HTLV-II, Affen-T-Zell-Leukämievirus (STLV) und Rinderleukämievirus (BLV). Die Schaumviren umfassen menschlichen Schaumvirus (HFV), Affenschaumvirus (SFV) und Rinderschaumvirus (BFV).
Beispiele für andere RNA-Viren, die Antigene in Vertebraten-Tieren sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mitglieder der Familie Reoviridae, einschließlich des Genus Orthoreovirus (mehrere Serotypen von sowohl Säugetier- als auch Vogel-Retroviren), des Genus Orbivirus (Blauzungen-Virus, Eugenangee-Virus, Kemerovo-Virus, Afrikanischer Pferdeerkrankungsvirus und Colorado-Zeckenfieber-Virus), des Genus Rotavirus (menschlicher Rotavirus, Nebraska-Kälberdiarrhö-Virus, Affen-Rotavirus, Rinder- oder Schaf-Rotavirus, Vogel-Rotavirus); die Familie Picornaviridae, einschließlich des Genus Enterovirus (Poliovirus, Coxsackie-Virus A und B, enterische cytopathische menschliche Waisen- (ECHO)-Viren, Hepatitis A-Virus, Affen-Enteroviren, Murine Enzephalomyelitis (ME)-Viren, Poliovirus muris, Rinder-Enteroviren, Schweine-Enteroviren, der Genus Cardiovirus (Enzephalomyocarditis-Virus (EMC), Mengovirus), den Genus Rhinovirus (menschliche Rhinoviren, einschließlich wenigstens 113 Subtypen; andere Rhinoviren), den Genus Apthovirus (Maul- und Klauenseuche (FMDV); die Familie Calciviridae, einschließlich Schweinevesikularexanthem-Virus, San Miguel-Seelöwen-Virus, Katzenpicornavirus und Norwalk-Virus; die Familie Togaviridae, einschließlich des Genus Alphavirus (Östlicher Pferdeenzephalitis-Virus, Semliki-Forst-Virus, Sindbis-Virus, Chikungunya-Virus, O'Nyong-Nyong-Virus, Ross-Fluss-Virus, Venezuelanischer Pferdeenzephalitis-Virus, Westlicher Pferdeenzephalitis-Virus), des Genus Flavirius (durch Moskitos übertragenes Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, Japanischer Enzephalitisvirus, St. Louis-Enzephalitisvirus, Murray Valley-Enzephalitisvirus, Westlicher Nil-Virus, Kunjin-Virus, Zentraleuropäischer durch Zecken übertragener Virus, Fernöstlicher durch Zecken übertragener Virus, Kyasanur-Forst-Virus, Louping III-Virus, Powassan-Virus, hämorrhagischer Omsk-Fiebervirus), des Genus Rubivirus (Rubella virus), des Genus Pestivirus (Schleimhauterkrankungsvirus, Schweinecholeravirus, Grenzerkrankungsvirus); die Familie Bunyaviridae, einschließlich des Genus Bunyvirus (Bunyamwera- und verwandte Viren, Gruppe der Kalifornischen Enzephalitisviren), des Genus Phlebovirus (Sizilianischer Sandfliegenfiebervirus, Rift Valley-Fiebervirus), des Genus Nairovirus (Crimean-Congohämorrhagischer Fiebervirus, Nairobi-Schafkrankheitsvirus) und des Genus Uukuvirus (Uukuniemi- und verwandte Viren); die Familie Orthomyxoviridae, einschließlich des Genus Influenzavirus (Influenzavirus Typ A, viele menschliche Untertypen); Schweineinfluenzavirus und Vogel- und Pferdeinfluenzaviren; Influenza Typ B (viele menschliche Subtypen) und Influenza Typ C (möglicher separater Genus); die Familie Paramyxoviridae, einschließlich des Genus Paramyxovirus (Parainfluenza-Virus Type 1, Sendai-Virus, Hämadsorptions-Virus, Parainfluenza-Viren der Typen 2 bis 5, Newcastle-Disease-Virus, Mumpsvirus), des Genus Morbillivirus (Masernvirus, subakuter sklerotisierender Panenzephalitisvirus, Staupevirus, Rinderpest-Virus), des Genus Pneumovirus (Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Respiratory-Syncytial-Virus des Rindes und Pneumonia-Virus); die Familie Rhabdoviridae, einschließlich des Genus Vesiculovirus (VSV), Chandipura-Virus, Flanders-Hart-Park-Virus), des Genus Lyssavirus (Tollwutvirus), Fisch-Rhabdoviren und zwei mutmaßliche Rhabdoviren (Marburg-Virus und Ebola-Virus); die Familie Arenaviridae, einschließlich Lymphozytenchoriomeningitisvirus (LCM), Tacaribe-Virus-Komplex und Lassa-Virus; die Familie Coronoaviridae, einschließlich infektiöser Bronchitisvirus (IBV), Hepatitis-Virus, menschlicher enterisches Coronavirus und infektiöse Katzenperitonitis (Katzen-Coronavirus).
Beispielhafte DNA-Viren, die Antigene bei Vertebraten-Tieren sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die Familie Poxviridae, einschließlich des Genus Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, Affenpocken-Vaccinia, Kuhpocken, Büffelpocken, Kaninchenpocken, Ectromelia), des Genus Leporipoxvirus (Myxom, Fibrom), des Genus Avipoxvirus (Geflügelpocken, andere Vogelpockenviren), des Genus Capripoxvirus (Schafpocken, Ziegenpocken), der Genus Suipoxvirus (Schweinepocken), der Genus Parapoxvirus (kontagiöses postuläres Dermatitisvirus, Pseudokuhpocken, papuläres Stomatitisvirus des Rindes); die Familie Iridoviridae (Afrikanisches Schweinefiebervirus, Froschviren 2 und 3, Lymphocystis-Virus von Fischen); die Familie Herpesviridae, einschließlich der Alpha-Herpesviren (Herpes Simplex Typen 1 und 2, Varizella-Zoster, Pferdeabortionsvirus, Pferdeherpesvirus 2 und 3, Pseudotollwutvirus, infektiöses Keratokonjunctivitisvirus des Rindes, infektiöser Rhinotracheitisvirus vom Rind, Katzenrhinotracheitisvirus, infektiöser Laryngotracheitisvirus), die Beta-Herpesviren (menschliches Zytomegalovirus und Zytomegaloviruses vom Schwein und von Affen); die Gamma-Herpesviren (Epstein-Barr-Virus (EBV), Marek-Virus, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, Meerschweinchen-Herpesvirus, Lucke-Tumorvirus); die Familie Adenoviridae, einschließlich des Genus Mastadenovirus (menschliche Untergruppen A, B, C, D, E und nicht gruppierte; Affenadenoviren (wenigstens 23 Serotypen), infektiöse Hundehepatitis und Adenoviren von Rind, Schweinen, Schafen, Fröschen und vielen anderen Spezies, des Genus Aviadenovirus (Vogel-Adenoviren); und nicht-kultivierbare Adenoviren; die Familie Papoviridae, einschließlich des Genus Papillomavirus (menschliche Papillomaviren, Rinderpapillomaviren, Shope-Kaninchenpapillomavirus und verschiedene pathogene Papillomaviren anderer Spezies), des Genus Polyomavirus (Polyomavirus, vakuolisierendes Affen-Agens (SV-40), vakuolisierendes Kaninchen-Agens (RKV), K-Virus, BK-Virus, JC-Virus und andere Affenpolyomaviren wie beispielsweise lymphotrophes Papillomavirus); die Familie Parvoviridae, einschließlich des Genus Adeno-assoziierte Viren, des Genus Parvovirus (Katzenpanleukopänievirus, Rinderparvovirus, Hundeparvovirus, Viruserkrankung des Aleutennerz etc). Schließlich können DNA-Viren Viren umfassen, die nicht in die obigen Familien passen, wie beispielsweise die Viren der Kuru- und Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung und chronisch infektiöse neuropathische Agenzien (CHINA-Virus).
Eine jede der vorstehenden Listen ist veranschaulichender Natur und soll nicht beschränkend sein.
Zusätzlich zur Verwendung der immunstimulatorischen Nukleinsäuren, um eine Antigenspezifische Immunantwort im Menschen zu erzeugen, sind die Verfahren der bevorzugten Ausführungsformen besonders gut geeignet für die Behandlung von Vögeln wie beispielsweise Hennen, Hühnchen, Truthähnen, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen. Vögel sind die primären Zielorganismen für viele Arten von Infektionen.
Schlüpfende Vögel sind kurz nach der Geburt pathogenen Mikroorganismen ausgesetzt. Obwohl diese Vögel anfänglich vor Pathogenen durch von der Mutter stammende Antikörper geschützt sind, ist dieser Schutz nur vorübergehend und das unreife Immunsystem des Vogels muss beginnen, den Vogel vor den Pathogenen zu schützen. Es ist oft wünschenswert, eine Infektion bei jungen Vögeln zu verhindern, wenn sie am empfindlichsten sind. Es ist auch wünschenswert, ältere Vögel vor Infektion zu schützen, insbesondere wenn die Vögel in geschlossenen Quartieren untergebracht sind, was zu einer schnellen Verbreitung der Erkrankung führt. Es ist somit wünschenswert, die immunstimulatorische Nukleinsäure und das Nicht-Nukleinsäureadjuvans der Erfindung Vögeln zu verabreichen, um eine Antigenspezifische Immunantwort zu verstärken, wenn das Antigen vorhanden ist.
Ein Beispiel einer üblichen Infektion bei Hühnchen ist das infektiöse Anämievirus von Hühnchen (CIAV). CIAV wurde zuerst 1979 in Japan im Rahmen einer Untersuchung einer Vakzinierungspause gegen Marek'sche Krankheit isoliert (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385). Seit dieser Zeit ist CIAV bei kommerziellen Geflügeln in allen wesentlichen Geflügel-produzierenden Ländern nachgewiesen worden (van Bulow et al., 1991, S. 690-699) in Diseases of Poultry, 9. Ausgabe, Iowa State University Press).
CIAV-Infektion führt zu einer klinischen Erkrankung, die durch Anämie, Hämorrhagie und Immunsuppression bei jungen empfindlichen Hühnchen gekennzeichnet ist. Eine Atrophie des Thymus sowie des Knochenmarks und konsistente Läsionen von CIAV-infizierten Hühnchen sind ebenfalls für die CIAV-Infektion charakteristisch. Lymphozytenverarmung im Thymus und gelegentlich in der Bursa fabricii führt zu Immunsuppression und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber sekundären viralen, bakteriellen oder Pilzinfektionen, die dann den Verlauf der Krankheit verkomplizieren. Die Immunsuppression kann eine verschlimmerte Erkrankung nach Infektion mit einem oder mehreren Viren bedingen aus umfassend den Marek-Virus (MDV), den Virus der infektiösen Bursaerkrankung, den Reticuloendotheliose-Virus, den Adenovirus oder den Reovirus. Es ist berichtet worden, dass die Pathogenese von MDV durch CIAV verstärkt wird (DeBoer et al., 1989, S. 28, in Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.). Weiter ist berichtet worden, dass CIAV die Zeichen einer infektiösen Bursaerkrankung verschlimmert (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). Hühnchen entwickeln infolge CAA eine Altersresistenz gegenüber experimentell induzierter Erkrankung. Diese ist im Wesentlichen im Alter von 2 Wochen vollständig, aber ältere Vögel sind noch für eine Infektion empfindlich Yuasa, N. et al., 1979 a.a.O.; Yuasa, N. et al., Arian Diseases 24, 202-209, 1980). Wenn jedoch Hühnchen mit sowohl CAA als auch einem immunsuppressiven Agens (IBDV, MDV etc.) infiziert werden, ist die Altersresistenz gegenüber der Erkrankung verzögert (Yuasa, N. et al., 1979 und 1980 a.a.O.; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). Merkmale von CIAV, die die Krankheitsübertragung potenzieren können, umfassen eine hohe Resistenz gegenüber Inaktivierung durch die Umwelt und einige übliche Desinfektionsmittel. Die wirtschaftliche Bedeutung einer CIAV-Infektion auf die Geflügelindustrie wird ersichtlich aus der Tatsache, dass 10 bis 30 % der infizierten Vögel bei Ausbruch der Erkrankung sterben.
Die Impfung von Vögeln kann wie bei anderen Vertebraten in einem jeglichen Alter erfolgen. Normalerweise werden Vakzinierungen bis zu einem Alter von 12 Wochen für einen Lebendorganismus und zwischen 14 und 18 Wochen für einen inaktivierten Mikroorganismus oder eine andere Art von Vakzin durchgeführt. Für in ovo-Vakzinierung kann die Vakzinierung im letzten Viertel der Embryonalentwicklung durchgeführt werden. Das Vakzin kann subkutan, durch Spray, oral, intraokular, intratracheal, nasal oder durch andere Schleimhautabgabeverfahren, wie sie hierin beschrieben sind, abgegeben werden. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren der Erfindung können somit Vögeln und anderen nicht-menschlichen Vertebraten verabreicht werden unter Verwendung von Routinevakzinierungsschemata und das Antigen kann verabreicht werden nach einer angemessenen Zeitspanne, wie hierin beschrieben.
Rinder und Viehbestand sind auch für Infektionen empfindlich. Erkrankungen, die diese Tiere betreffen, können erhebliche wirtschaftliche Verluste mit sich bringen, insbesondere bei Rindern. Die Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um vor einer Infektion eines Viehbestandes wie beispielsweise Kühen, Pferden, Schweinen, Schafen und Ziegen zu schützen.
Kühe kann durch Rinderviren infiziert werden. Virales Rinderdiarrhövirus (BVDV) ist ein kleiner behüllter positiv-strängiger RNA-Virus und wird, zusammen mit dem Schweinecholeravirus (HOCV) und dem Schafgrenzerkrankungsvirus (BDV) in die Gattung Pestivirus klassifiziert. Obwohl Pestiviren zuvor in der Familie der Togaviridae klassifiziert worden sind, haben einige Studien ihre Umklassifizierung innerhalb der Familie der Flaviviridae zusammen mit den Flavivirus- und Hepatitis C-Virus (HCV)-Gruppen nahegelegt (Francki, et al., 1991).
BVDV, der ein wichtiges Pathogen für Rinder ist, kann auf der Grundlage von Zellkulturanalysen in zytopathogene (CP) und nicht-zytopathogene (NCP)-Biotypen unterschieden werden. Der NCP-Biotyp ist weiter verbreitet, obwohl beide Biotypen bei Rindern gefunden werden können. Wenn eine trächtige Kuh mit einem NCP-Stamm infiziert wird, kann die Kuh ein persistent infiziertes und spezifisch immuntolerantes Kalb gebären, das den Virus während seiner gesamten Lebenszeit verbreiten wird. Die persistent infizierten Rinder können einer Schleimhauterkrankung erliegen und beide Biotypen können dann aus dem Tier isoliert werden. Klinische Manifestationen können Verwerfen, Teratogenese und Atemprobleme, Schleimhauterkrankung und milde Diarrhö umfassen. Zusätzlich ist eine schwere Thrombozytopenie, verbunden mit Herdenepidemien, beschrieben worden, die zum Tod der Tiere führen kann, und Stämme, die mit dieser Erkrankung verbunden sind, scheinen virulenter als die klassischen BVDVs zu sein.
Pferdeherpesviren (EHV) umfassen eine Gruppe von Antigen-distinkten biologischen Agenzien, die eine Vielzahl von Infektionen bei Pferden verursachen, die von subklinischen bis hin zu tödlichen Erkrankungen reichen. Diese umfassen Pferdeherpesvirus-1 (EHV-1), ein ubiquitäres Pathogen bei Pferden. EHV-1 ist mit Epidemien von Verwerfen, Erkrankungen der Atemwege und Störungen des zentralen Nervensystems verbunden. Eine primäre Infektion der oberen Atemwege von jungen Pferden führt zu einer fiebrigen Erkrankung, die 8 bis 10 Tage dauert. Immunologisch erfahrene Stuten können über die Atemwege erneut infiziert werden, ohne dass die Erkrankung apparent wird, so dass ein Verwerfen möglicherweise ohne Warnung erfolgt. Das neurologische Syndrom ist mit Atemwegserkrankung oder Verwerfen verbunden und kann Tiere eines jeden Geschlechts in einem jeden Alter betreffen, das zu einem Mangel an Koordination, Schwäche und posteriorer Paralyse führt (Telford, E. A. R. et al., Virology 189, 304-316, 1992). Andere EHVs umfassen EHV-2 oder Pferdezytomegalovirus, EHV-3, Pferdekoitusexanthemvirus und EHV-4, früher als EHV-1-Subtyp 2 klassifiziert.
Schafe und Ziegen können durch eine Vielzahl von gefährlichen Mikroorganismen infiziert werden, einschließlich Visna-Maedi.
Primaten wie beispielsweise kleinere Affen, Menschenaffen und Makaken können durch Affenimmundefizienzvirus infiziert werden. Man hat berichtet, dass inaktivierter Zellvirus und zellfreie Ganzaffenimmundefizienzvakzine Makaken einen Schutz verleihen (Stott et al. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246:1293-1297; und Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6:1239-1246). Man hat berichtet, dass ein rekombinantes HIV gp120-Vakzin Schimpansen einen Schutz verleiht (Berman et al. (1990) Nature 345:622-625).
Katzen, sowohl Hauskatzen als auch Wildkatzen, sind gegenüber einer Infektion mit einer Vielzahl von Mikroorganismen empfindlich. Beispielsweise ist die infektiöse Katzenperitonitis eine Erkrankung, die bei sowohl Haus- als auch Wildkatzen wie beispielsweise Löwen, Leoparden, Geparden und Jaguaren auftritt. Wenn es wünschenswert ist, eine Infektion mit dieser und anderen Arten von pathogenen Organismen bei Katzen zu verhindern, können die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um Katzen zu impfen, um sie gegenüber einer Infektion zu schützen.
Hauskatzen können mit verschiedenen Retroviren infiziert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Katzenleukämievirus (FeLV), Katzensarkomavirus (FeSV), Concornavirus vom endogenen Typ (RD-114) und Synzytium bildendes Katzenvirus (FeSFV). Von diesen ist FeLV das signifikanteste Pathogen, was unterschiedliche Symptome erzeugt, einschließlich lymphoretikularer und myeloider Neoplasmen, Anämien, immunvermittelte Störungen und ein Immundefizienzsyndrom, das ähnlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom beim Menschen (AIDS) ist. Kürzlich ist eine spezielle replikationsdefekte FeLV-Mutante, bezeichnet als FeLV-AIDS, mit immunsuppressiven Eigenschaften assoziiert worden.
Die Entdeckung eines T-lymphotropen Katzenlentivirus (auch als Katzenimmundefizienz bezeichnet) ist zuerst von Pedersen et al. (1987) Science 235:790-793 berichtet worden. Merkmale von FIV sind berichtet worden in Yamamoto et al. (1988) Leukemia, Dezember-Ergänzung 2:2045-2155; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; und Ackley et al. (1990) J. Virol. 64:5652-5655. Das Klonieren und die Sequenzanalyse von FIV ist von Olmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2448-2452 und 86:4355-4360 berichtet worden.
Infektiöse Katzenperitonitis (FIP) ist eine sporadische Erkrankung, die in unvorhersehbarer Weise bei domestizierten und wilden Feliden auftritt. Während FIP in erster Linie eine Erkrankung von Hauskatzen ist, ist sie bei Löwen, Berglöwen, Leoparden, Geparden und dem Jaguar diagnostiziert worden. Kleinere Wildkatzen, die von FIP betroffen worden sind, umfassen den Luchs und Caracal, die Sandkatze und die Pallaskatze. Bei domestizierten Katzen tritt die Erkrankung überwiegend bei jungen Tieren auf, obwohl Katzen eines jeglichen Alters empfindlich sind. Ein hauptsächliches Auftreten erfolgt im Alter von 6 bis 12 Monaten. Eine Abnahme der Inzidenz wird im Alter von 5 bis 13 Jahren beobachtet, gefolgt von einer erhöhten Inzidenz bei Katzen im Alter von 14 bis 15 Jahren.
Virale, bakterielle und parasitische Erkrankungen bei Fischen, Schalentieren oder anderen aquatischen Lebensformen stellen ein erhebliches Problem für die Aquakulturindustrie dar. Infolge der hohen Dichte der Tiere in den Schlüpftanks oder eingefassten Meeresfarmbereichen können Infektionserkrankungen einen Großteil des Bestandes auslöschen in, beispielsweise, in einer Anlage für Fische, Schalentiere oder andere aquatische Lebensformen. Das Verhindern einer Erkrankung ist ein erwünschteres Heilmittel für diese Bedrohungen des Fisches als eine Intervention, wenn die Erkrankung einmal voranschreitet. Das Impfen von Fischen ist das einzige Präventivverfahren, das einen langfristigen Schutz durch Immunität verleihen kann. Nukleinsäure-basierte Vakzinierungen sind in US-Patent 5,780,448 beschrieben, das an Davis erteilt worden ist.
Das Immunsystem der Fische weist viele Merkmale auf, die dem Säugetierimmunsystem ähnlich sind, wie beispielsweise das Vorhandensein von B-Zellen, T-Zellen, Lymphokinen, Komplement und Immunglobulinen. Fische weisen Lymphozyten-Subklassen auf mit Rollen, die ähnlich zu jenen von B- und T-Zellen von Säugetieren zu sein scheinen. Impfstoffe können durch Immersion oder oral verabreicht werden.
Aquakulturarten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Flossenfische, Schalentiere und andere aquatische Tiere. Fische umfassen alle Vertebraten-Fische, die Knochen- oder Knorpelfische sein können, wie beispielsweise Salmonide, Karpfen, Wels, Gelbschwanz, Seebrasse und Seebarsch. Salmonide sind eine Familie von Flossenfischen, die Forelle (einschließlich Regenbogenforelle), Lachs und Arktische Rotforelle umfassen. Beispiele für Schalentiere umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Muscheln, Hummer, Garnelen, Krabben und Austern. Andere kultivierte aquatische Tiere umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Aale, Tintenfisch und Kraken.
Polypeptide von viralen Aquakulturpathogenen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Glycoprotein (G) oder Nukleoprotein (N) des Virus von viraler hämorrhagischer Septikhämie (VHSV); G- oder N-Proteine des infektiösen hämatopoietischem Nekrosevirus (IHNV); VP1- VP2-, VP3- oder N-Strukturproteine des infektiösen Pankreasnekrosevirus (IPNV); G-Protein der Karpfenfrühlingsvirämie (SVC); und ein Membran-assoziiertes Protein, Tegumin oder Kapsidprotein oder Glycoprotein von Kanalwelsvirus (CCV).
Typische Parasiten, die Pferde infizieren, sind Gasterophilus spp.; Eimeria leuckarti, Giardia spp.; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (RBCs), Theileria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; Sarcocystis spp.
Typische Parasiten, die Schweine infizieren, umfassen Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii und Sarcocystis spp. und Trichinella spiralis.
Die Hauptparasiten von Milch- und Fleischrindern umfassen Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC), Babesia bigemina (RBC), Trypanosoma spp. (Plasma), Theileria spp. (RBC); Theileria parva (Lymphozyten); Tritrichomonas foetus; und Sarcocystis spp.
Die Hauptparasiten von Raubtieren umfassen Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (Eulen), Haemoproteus spp., Trypanosoma spp.; Histomonas; Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria; Toxoplasma.
Typische Parasiten, die Schafe und Ziegen infizieren, umfassen Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp.; Toxoplasma gondii; Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (Plasma), Theileria spp. (RBC); und Sarcocystis spp.
Typische Parasiteninfektionen bei Geflügel umfassen Kokzidiose, die von Eimeria acervulina, E. necatrix, E. tenella, Isospora spp. und Eimeria truncata verursacht wird; Histomoniasis, die von Histomonas meleagridis und Histomonas gallinarum verursacht wird; Trichomoniasis, die von Trichomonas gallinae verursacht wird; und Hexamitiase, die von Hexamita meleagridis verursacht wird. Geflügel kann auch von Emeria maxima, Emeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium, Eimeria brunetti, Emeria adenoeides, Leucocytozoon spp., Plasmodium spp., Hemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii und Sarcocystis infiziert werden.
Die Verfahren der Erfindung können auch für die Behandlung und/oder Prävention von parasitischen Infektionen bei Hunden, Katzen, Vögeln, Fischen und Frettchen verwendet werden. Typische Parasiten von Vögeln umfassen Trichomonas gallinae; Eimeria spp., Isospora spp., Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Haemoproteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leucocytozoon/Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Typische Parasiten, die Hunde infizieren, umfassen Trichinella spiralis; Isopora spp., Sarcocystis spp., Cryptosporidium spp., Hammondia spp., Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.
Typische Parasiten, die Katzenarten infizieren, umfassen Isospora spp., Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., Hammondia hammondi, Besnoitia spp., Giardia spp.; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis, Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (Erythrozyten, RE-Zellen).
Typische Parasiten, die Fische infizieren, umfassen Hexamita spp., Eimeria spp.; Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp.; Plistophora spp., Myxosoma Henneguya; Costia spp., Ichthyophithirius spp., und Oodinium spp.
Typische Parasiten von Wildtieren umfassen Giardia spp. (Karnivoren, Herbivoren), Isospora spp. (Karnivoren), Eimeria spp. (Karnivoren, Herbivoren); Theileria spp. (Herbivoren), Babesia spp. (Karnivoren, Herbivoren), Trypanosoma spp. (Karnivoren, Herbivoren); Schistosoma spp. (Herbivoren); Fasciola hepatica (Herbivoren), Fascioloides magna (Herbivoren), Fasciola gigantica (Herbivoren), Trichinella spiralis (Karnivoren, Herbivoren).
Parasitische Infektionen in Zoos können auch ernsthafte Probleme darstellen. Typische Parasiten der Bovidae-Familie (Blesbok, Antilope, Banteng, Elenantilope, Gaur, Impala, Klippspringer, Kudu, Gazelle) umfassen Eimeria spp. Typische Parasiten der Pinnipedae-Familie (Robbe, Seelöwe) umfassen Eimeria phocae. Typische Parasiten in der Familie der Camelidae (Kamele, Lamas) umfassen Eimeria spp. Typische Parasiten der Familie der Giraffidae (Giraffen) umfassen Eimeria spp. Typische Parasiten der Familie der Elephantidae (Afrikanischer und Asiatischer) umfassen Fasciola spp. Typische Parasiten der niederen Primaten (Schimpansen, Orang-Utans, Gorillas, Paviane, Makaken, kleinere langschwänzige Affen) umfassen Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii; Plasmodim spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (Plasma), Leishmania spp. (Makrophagen).
Polypeptide von bakteriellen Pathogenen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, ein Eisen-reguliertes Außenmembranprotein (IROMP), ein Außenmembranprotein (OMP) und ein A-Protein von Aeromonis salmonicida, das Furunkulose verursacht, p57-Protein von Renibacterium salmoninarum, das bakterielle Nierenerkrankung verursacht (BKD), Hauptoberflächen-assoziiertes Antigen (msa), ein Oberflächen-exprimiertes Cytotoxin (mpr), ein Oberflächen-exprimiertes Hämolysin (ish) und ein Flagellenantigen von Yersiniose; ein extrazelluläres Protein (ECP), ein Eisen-reguliertes Außenmembranprotein (IROMP) und ein Strukturprotein von Pasteurellose; ein OMP und ein Flagellenprotein von Vibrosis anguillarum und V. ordalii; ein Flagellenprotein, ein OMP-Protein, aroA und purA von Edwardsiellosis ictaluri und E. tarda; und Oberflächenantigen von Ichthyophthirius; und ein Struktur- und Regulationsprotein von Cytophaga columnari; und ein Struktur- und Regulationsprotein von Rickettsia.
Polypeptide eines parasitischen Pathogens umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Oberflächenantigene von Ichthyophthirius.
Ein Allergen bezeichnet eine Substanz (Antigen), das eine allergische oder asthmatische Reaktion in einem empfänglichen Lebewesen induzieren kann. Die Liste von Allergenen ist enorm und kann Pollen, Insektengifte, Tierhautschuppe, Pilzsporen und Wirkstoffe (z. B. Penicillin) umfassen. Beispiele für natürliche, Tier- und Pflanzenallergene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Proteine, die für die folgenden Genera spezifisch sind: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (z. B. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (z. B. Lolium perenne oder Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (z. B. Plantago lanceolata); Parietaria (z. B. Parietaria officinalis oder Parietaria judaica); Blattella (z. B. Blattella germanica); Apis (z. B. Apis multiflorum); Cupressus (z. B. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica und Cupressus macrocarpa); Juniperus (z. B. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis und Juniperus ashei); Thuya (z. B. Thuya orientalis); Chamaecyparis (z. B. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (z. B. Periplaneta americana); Agropyron (z. B. Agropyron repens); Secale (z. B. Secale cereale); Triticum (z. B. Triticum aestivum); Dactylis (z. B. Dactylis glomerata); Festuca (z. B. Festuca elatior); Poa (z. B. Poa pratensis oder Poa compressa); Avena (z. B. Avena sativa); Holcus (z. B. Holcus lanatus); Anthoxanthum (z. B. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (z. B. Arrhenatherum elatius); Agrostis (z. B. Agrostis alba); Phleum (z. B. Phleum pratense); Phalaris (z. B. Phalaris arundinacea); Paspalum (z. B. Paspalum notatum); Sorghum (z. B. Sorghum halepensis); und Bromus (z. B. Bromus inermis).
Das Antigen kann ein Antigen sein, das von einem Nukleinsäurevektor codiert wird, muss aber nicht in einem Nukleinsäurevektor codiert werden. Im ersteren Falle wird der Nukleinsäurevektor dem Lebewesen verabreicht und das Antigen wird in vivo exprimiert. Im letzteren Fall kann das Antigen direkt dem Lebewesen verabreicht werden. Ein Antigen, das nicht in einem Nukleinsäurevektor codiert wird, bezeichnet, wie hierin verwendet, irgendeine Art von Antigen, das keine Nukleinsäure ist. Beispielsweise ist bei einigen Aspekten der Erfindung das nicht in einem Nukleinsäurevektor codierte Antigen ein Polypeptid. Geringfügige Modifikationen der primären Aminosäuresequenzen von Polypeptidantigenen können auch zu einem Polypeptid führen, das eine verglichen mit dem unmodifizierten Gegenstück-Polypeptid im Wesentlichen äquivalente Antigenaktivität aufweist. Derartige Modifikationen können vorsätzlich, wie beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese, oder spontan sein. Alle durch diese Modifikationen hergestellten Polypeptide sind hierin umfasst, solange noch Antigenität besteht. Das Polypeptid kann z. B. ein virales Polypeptid sein.
Der Begriff im Wesentlichen gereinigt, wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit dem es natürlicherweise verbunden ist. Ein Fachmann kann virale oder bakterielle Polypeptide reinigen unter Verwendung von Standardtechniken für die Proteinreinigung. Das im Wesentlichen reine Polypeptid wird oft eine einzelne Hauptbande in einem nicht-reduzierenden Polyacrylamidgel ergeben. Im Falle von teilweise glycosylierten Polypeptiden oder jenen, die mehrere Startcodons haben, können jedoch mehrere Banden in einem nicht-reduzierenden Polyacrylamidgel auftreten, diese werden aber ein spezifisches Muster für dasjenige Polypeptid ausbilden. Die Reinheit des viralen oder bakteriellen Polypeptids kann auch bestimmt werden durch aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse. Andere Arten von Antigenen, die nicht von einem Nukleinsäurevektor codiert werden, wie beispielsweise Polysaccharide, kleine Moleküle, Mimetika etc. sind oben beschrieben und sind in der Erfindung umfasst.
Die Erfindung verwendet auch Polynukleotide, die die antigenen Polypeptide codieren. Es wird ins Auge gefasst, dass das Antigen dem Lebewesen in einem Nukleinsäuremolekül verabreicht wird, das für das Antigen codiert, so dass das Antigen in vivo exprimiert werden muss. Derartige Antigene, die dem Lebewesen in einem Nukleinsäurevektor verabreicht werden, werden als Antigene bezeichnet, die von einem Nukleinsäurevektor codiert werden. Die das Antigen codierende Nukleinsäure ist funktionsfähig mit einer Genexpressionssequenz verbunden, die die Expression der Antigennukleinsäure innerhalb einer eukaryotischen Zelle steuert. Die Genexpressionssequenz ist irgendeine regulatorische Nukleotidsequenz, wie beispielsweise eine Promotorsequenz oder Promotor-Enhancer-Kombination, was die effiziente Transkription und Translation der Antigen-Nukleinsäure erleichtert, an die sie operativ gebunden ist. Die Genexpressionssequenz kann, beispielsweise, ein Säugetier- oder viraler Promotor sein, wie beispielsweise ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor. Konstitutive Säugetierpromotoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Promotoren für die folgenden Gene: Hypoxanthinphosphoribosyl-Transferase (HPTR), Adenosindesaminase, Pyruvatkinase, b-Actin-Promotor und andere konstitutive Promotoren. Beispielhafte virale Promotoren, die in eukaryotischen Zellen konstitutiv funktionieren, umfassen, beispielsweise, Promotoren vom Zytomegalievirus (CMV), Affenvirus (z. B. SV40), Papillomavirus, Adenovirus, menschliches Immundefizienzvirus (HIV), Rous-Sarkoma-Virus, Zytomegalievirus, die langen terminalen Wiederholungen (LTR) von Moloney-Leukämie-Virus und anderen Retroviren und den Thymidinkinasepromotor von Herpes simplex-Virus. Andere konstitutive Promotoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Promotoren, die als Genexpressionssequenzen der Erfindung geeignet sind, umfassen auch induzierbare Promotoren. Induzierbare Promotoren werden in der Gegenwart eines induzierenden Agens exprimiert. Beispielsweise wird der Metallthionein-Promotor induziert, die Transkription und Translation in Gegenwart bestimmter Metallionen zu fördern. Andere induzierbare Promotoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Im Allgemeinen soll die Genexpressionssequenz, wie erforderlich, 5'-nicht-transkribierende und 5'-nicht-translatierende Sequenzen umfassen, die bei der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind, wie beispielsweise eine TATA-Box, Kappen-Sequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen. Insbesondere werden derartige 5'-nicht-Transkriptionssequenzen eine Promotorregion umfassen, die eine Promotorsequenz für die Transkriptionssteuerung der funktionsfähig verbundenen Antigennukleinsäure umfasst. Die Genexpressionssequenzen umfassen optional Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen, wie erwünscht.
Die Antigen-Nukleinsäure ist operativ mit der Genexpressionssequenz verbunden. Wie hierin verwendet sollen die Antigennukleinsäuresequenz und die Genexpressionssequenz operativ verbunden sein, wenn sie kovalent in einer solchen Art und Weise miteinander verbunden sind, um die Expression oder Transkription und/oder Translation der Antigen-codierenden Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der Genexpressionssequenz zu stellen. Zwei DNA-Sequenzen sollen funktionsfähig verbunden sein, wenn die Induktion eines Promotors in der 5'-Genexpressionssequenz zur Transkription der Antigensequenz führt und wenn die Art der Verbindung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Leserahmenverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der Promotorregion stört, die Transkription der Antigensequenz zu steuern oder (3) die Fähigkeit des korrespondierenden RNA-Transkripts stört, in ein Protein translatiert zu werden. Eine Genexpressionssequenz würde daher funktionsfähig mit einer Antigen-Nukleinsäuresequenz verbunden sein, wenn die Genexpressionssequenz in der Lage wäre, die Transkription dieser Antigennukleinsäuresequenz zu beeinflussen, so dass das sich ergebende Transkript in das erwünschte Protein oder Polypeptid translatiert wird.
Die Antigennukleinsäure der Erfindung kann dem Immunsystem alleine oder zusammen mit einem Vektor verabreicht werden. In der breitesten Bedeutung des Wortes ist ein Vektor irgendein Vehikel, das in der Lage ist, den Transfer der Antigennukleinsäure zu den Zellen des Immunsystems zu erleichtern, so dass das Antigen exprimiert und auf der Oberfläche der Immunzelle präsentiert werden kann. Der Vektor transportiert im Allgemeinen die Nukleinsäure mit einem verringerten Abbau verglichen mit dem Umfang des Abbaus zu den Immunzellen, der sich bei Abwesenheit des Vektors einstellen würde. Der Vektor umfasst optional die oben beschriebene Genexpressionssequenz, um die Expression der Antigen-Nukleinsäure in Immunzellen zu erhöhen. Im Allgemeinen umfassen die für die Erfindung nützlichen Vektoren, sind aber nicht darauf beschränkt, Plasmide, Phagemide, Viren, andere Vehikel, die von Viren- oder Bakterienquellen abgeleitet sind und die durch die Einführung oder den Einbau der Antigen-Nukleinsäuresequenz manipuliert worden sind. Virale Vektoren sind eine bevorzugte Art von Vektor und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Nukleinsäuresequenzen von den folgenden Viren: Retrovirus, wie beispielsweise muriner Moloney-Leukämievirus, muriner Sarkomavirus nach Harvey, muriner Brusttumorvirus und Rous-Sarkoma-Virus; Adenovirus, adeno-assoziierter Virus; Viren vom SV40-Typ; Polyoma-Viren; Epstein-Barr-Viren; Papillomaviren; Herpesvirus; Vakziniavirus; Poliovirus; und RNA-Virus wie beispielsweise ein Retrovirus. Man kann leicht andere, nicht namentlich erwähnte Vektoren verwenden, die aber in der Technik bekannt sind.
Bevorzugte virale Vektoren basieren auf nicht-zytopathischen eukaryotischen Viren, bei denen nicht-essentielle Gene durch das interessierende Gen ersetzt worden sind. Nicht-zytopathische Viren umfassen Retroviren, deren Lebenszyklus reverse Transkription genomischer viraler RNA in DNA mit nachfolgender proviraler Integration in die zelluläre DNA des Wirtes umfasst. Retroviren sind für gentherapeutische Versuche am Menschen zugelassen worden. Am nützlichsten sind jene Retroviren, die Replikations-defizient sind (d. h. in der Lage sind, die Synthese des erwünschten Proteins zu steuern, aber nicht in der Lage sind, ein infektiöses Partikel herzustellen). Derartige genetisch geänderte retrovirale Expressionsvektoren sind allgemein nützlich für die hoch effiziente Transduktion von Genen in vivo. Standardprotokolle für die Produktion von Replikations-defizienten Retroviren (einschließlich der Schritte des Einbauens von exogenem genetischen Material in ein Plasmid, Transfektion einer Verpackungszelle, die mit dem Plasmid ausgestattet ist, Produktion von rekombinanten Retroviren durch die Verpackungszelllinie, Gewinnen der viralen Partikel aus Gewebekulturmedien und Infektion der Zielzellen mit viralen Partikeln) werden beschrieben von Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual W.H. Freeman C.O., New York (1990) und Murry, E.J. Methods in Molecular Biology, Band 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).
Ein bevorzugter Virus für bestimmte Anwendungen ist der adeno-assoziierte Virus, ein doppelsträngiger DNA-Virus. Der adeno-assoziierte Virus kann so konstruiert werden, dass er Replikations-defizient und in der Lage ist, einen breiten Bereich von Zelltypen und -arten zu infizieren. Er weist weitere Vorteile auf, wie beispielsweise Stabilität gegenüber Hitze und Lipidlösungsmittel; hohe Transduktionsfrequenzen in Zellen unterschiedlicher Abstammung, einschließlich hämopoetischer Zellen; und das Fehlen einer Superinfektionsinhibierung, was somit eine Reihe von Transduktionen erlaubt. Es wurde berichtet, dass der adeno-assoziierte Virus in menschliche zelluläre DNA in einer ortsspezifischen Art und Weise integrieren kann, wodurch die Möglichkeit einer Insertionsmutagenese und Variabilität von eingeführten Genexpressionsmerkmalen retroviraler Infektion minimiert wird. Zusätzlich hat man adenoassoziierte Virusinfektionen in Gewebekultur für mehr als 100 Passagen bei Abwesenheit von Selektionsdruck verfolgt, was impliziert, dass die genomische Integration des adenoassoziierten Virus ein vergleichsweise stabiles Ereignis ist. Der adeno-assoziierte Virus kann auch extrachromosomal funktionieren.
Andere Vektoren umfassen Plasmidvektoren. Plasmidvektoren sind intensiv in der Technik beschrieben worden und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. In den letzten wenigen Jahren hat man festgestellt, dass Plasmidvektoren für die Abgabe von Genen in Zellen in vivo besonders vorteilhaft sind infolge ihrer Unfähigkeit, innerhalb eines Wirtes zu replizieren und in das Genom eines Wirts zu integrieren. Diese Plasmide, die jedoch einen Promotor aufweisen, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, können ein Peptid von einem Gen exprimieren, das operativ innerhalb des Plasmids codiert ist. Einige üblicherweise verwendete Plasmide umfassen pBR322, pUC 18, pUC19, pRC/CMV, SV40 und pBlueScript. Andere Plasmide sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Zusätzlich können Plasmide unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligationsansätzen spezifisch konstruiert werden, um spezifische DNA-Fragmente zu entfernen und hinzuzufügen.
Man hat kürzlich entdeckt, dass gentragende Plasmide in das Immunsystem eingeführt werden können unter Verwendung von Bakterien. Modifizierte Formen von Bakterien wie beispielsweise Salmonella können mit dem Plasmid transfiziert und als Abgabevehikel verwendet werden. Die bakteriellen Abgabevehikel können einem Wirtslebewesen oral oder durch andere Verabreichungsmittel verabreicht werden. Die Bakterien geben das Plasmid an Immunzellen, beispielsweise B-Zellen, dendritische Zellen, ab, wahrscheinlich durch Hindurchtreten durch die Darmbarriere. Ein hohes Ausmaß an Immunschutz ist unter Verwendung dieser Verfahrensweise erreicht worden. Derartige Verfahren zur Abgabe sind für die Aspekte der Erfindung nützlich, die eine systemische Abgabe von Antigen, immunstimulatorischer Nukleinsäure und/oder anderen therapeutischen Agens verwenden.
Die immunstimulatorische Nukleinsäuren sind somit als Vakzinadjuvans nützlich. Man hatte zuvor etabliert, dass CpG-Oligonukleotide ausgezeichnete Vakzinadjuvanzien sind. Man hat auch gezeigt, dass, obwohl CpG-ODN ausgezeichnete Vakzinadjuvanzien bei Mäusen sind, diese nicht die bevorzugten Adjuvanzien bei Nicht-Nagetierlebewesen sind. Um die besten immunstimulatorischen Nukleinsäuren für die Verwendung als ein Vakzinadjuvans beim Menschen und anderen Nicht-Nagetierlebewesen zu identifizieren, wurde ein in vivo Screening für verschiedene Nukleinsäuren zu diesem Zweck durchgeführt. Mehrere in vitro Assays wurden in Mäusen für ihren prädiktiven Wert hinsichtlich Adjuvansaktivität in vivo in Mäusen evaluiert. Während des Verlaufs dieser Studie wurde ein in vitro-Test identifiziert, der für eine in vivo-Wirksamkeit prädiktiv ist. Man hatte ziemlich überraschend entdeckt, dass sowohl B-Zell- als auch NK-Zellaktivierung besonders gut mit der Fähigkeit einer immunstimulatorischen Nukleinsäure korrelierte, eine in vivo-Immunantwort gegen ein Antigen zu verstärken.
Der gute prädiktive Wert der B-Zellaktivierung für in vivo-Vakzinadjuvansaktivität ist am wahrscheinlichsten mit der zentralen Rolle von B-Zellen bei der Etablierung einer spezifischen Immunantwort verbunden. Polyklonale Proliferation von B-Zellen (induziert durch immunstimulatorische Nukleinsäuren) erhöht die Wahrscheinlichkeit eines Antigenspezifischen Passens von B-Zellen/T-Helferzellen. Darüber hinaus aktiviert eine erhöhte Expression des co-stimulatorischen Moleküls CD86 auf polyklonal expandierten B-Zellen Antigen-spezifische T-Helferzellen. B-Zellen erhöhten auch ihre CD40-Expression in Reaktion auf immunstimulatorische Nukleinsäuren, wodurch die Fähigkeit von CD40L exprimierenden T-Helferzellen verbessert wurde, B-Zellen zu stimulieren. Eine erhöhte ICAM-1-Synthese von B-Zellen erleichterte den Zell-Zell-Kontakt. Der Aktivierungsstatus von polyklonalen B-Zellen spielt somit eine kritische Rolle während der Initiierung einer spezifischen Antikörperantwort.
Der Beitrag von NK-Zellaktivität für die Etablierung spezifischer Antikörper war jedoch überraschend. NK-Zellen sind Teil des angeborenen Immunsystems und sind als solches an der ersten Verteidigungslinie gegen Pathogene beteiligt. Am wahrscheinlichsten ist das von NK-Zellen produzierte Zytokinmuster nach Aktivierung eng mit der Initiierung einer spezifischen Immunantwort verbunden. In einem Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zum Identifizieren eines Adjuvans, indem NK-Zellaktivierung nachgewiesen wird.
Der NK-Zellaktivierungstest kann wie in den Beispielen unten beschrieben ausgeführt werden oder unter Verwendung anderer bekannter NK-Zellaktivitätstests. Es ist jedoch bevorzugt, dass eine gemischte Zellpopulation wie beispielsweise PBMC verwendet wird, da es wahrscheinlich ist, dass die NK-Zellaktivierung eine indirekte Wirkung ist. Der Test ist bevorzugterweise nützlich für die Identifizierung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren, die bei Menschen und anderen Nicht-Nagetierlebewesen als Adjuvanzien nützlich sind.
Die Zytokininduktion wurde auch als ein wichtiger Vorhersagefaktor von in vivo-Adjuvansaktivität identifiziert. Da es eine 2-fache logarithmisch höhere Endotoxinempfindlichkeit von primären Monozyten des Menschen gegenüber denen der Maus gibt, ist jedoch eine gewisse Vorsicht erforderlich, um eine Endotoxinkontamination immunstimulatorischer Nukleinsäuren zu vermeiden, die für das Testen in dem menschlichen System verwendet werden (Hartmann G., und Krieg A. M. 1999. Gene Therapy 6:893). Da TNF-α, IL-6 und IL-12 durch menschliche Monozyten in Reaktion auf geringe Mengen an Endotoxin hergestellt werden, ist ihr Wert für in vitro-Screeningtests mit hohem Durchsatz von beschränktem Wert. Andererseits zeigen menschliche B-Zellen und NK-Zellen nur eine geringe Aktivierung durch Endotoxin und sind somit beim Testen auf immunstimulatorische Aktivität weit nützlicher.
Die Stimulierung einer zellulären Funktion in entweder NK- oder B-Zellen (d. h. lytische Aktivität, Proliferation) erfordert eine stärkere immunstimulatorische Nukleinsäure als die Induktion von Aktivierungsmarkern auf ihrer Oberfläche (CD69, CD86). Für beide Zelltypen zeigt die Verwendung von Zelloberflächenaktivierungsmarkern einen verglichen mit den funktionellen Tests höheren nicht-spezifischen Hintergrund, der dem Phosphothioathintergrund zugeordnet werden konnte,. Diese hohe Empfindlichkeit von Oberflächenmarkern erfordert die Verwendung von niedrigen Konzentrationen an immunstimulatorischen Nukleinsäuren für eine optimale Diskriminierung zwischen immunstimulatorischer Nukleinsäure ähnlicher Aktivität. Die Verwendung von Oberflächenmarkern erlaubt somit den Vergleich von immunstimulatorischen Nukleinsäuren mit schwacher Aktivität, wohingegen funktionale Tests für den Vergleich von immunstimulatorischen Nukleinsäuren mit hoher Aktivität bevorzugt sind. Es ist festzuhalten, dass sich die optimalen Konzentrationen an immunstimulatorischer Nukleinsäure zum Stimulieren von B-Zellen und NK-Zellen unterscheiden. Während 0,6 μg/ml ODN bereits maximal ist, um B-Zellen zu stimulieren, kann eine optimale NK-Zellaktivierung 6 μg/ml ODN erfordern. Sowohl B-Zellaktivierung als auch funktionale Aktivität von NK-Zellen wurden innerhalb frisch isolierter PBMC gemessen. Man hatte zuvor festgestellt, dass hoch gereinigte menschliche primäre B-Zellen durch CpG-DNA aktiviert werden. Die Existenz einer direkten Wirkung von CpG-DNA auf NK-Zellen ist weniger klar und ein Sekundärmechanismus, der durch einen weiteren Zelltyp innerhalb PBMC vermittelt wird, könnte zu einer CpG-induzierten funktionalen Aktivität von NK-Zellen beitragen.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können einem Lebewesen mit einem antimikrobiellen Agens verabreicht werden. Ein antimikrobielles Agens, wie hierin verwendet, bezeichnet eine natürlicherweise vorkommende oder synthetische Verbindung, die in der Lage ist, infektiöse Mikroorganismen abzutöten oder zu inhibieren. Die Art des antimikrobiellen Agens, das gemäß der Erfindung nützlich ist, wird von der Art des Mikroorganismus abhängen, mit dem das Lebewesen infiziert ist, oder ein Risiko besteht, infiziert zu werden. Antimikrobielle Agenzien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, antibakterielle Agenzien, antivirale Agenzien, Pilzmittel und Parasitenmittel. Formulierungen wie beispielsweise „anti-infektiöses Agens", „antibakterielles Agens", „antivirales Agens", „antifungales Mittel", „Parasitenagens" und „Parasitizide" haben für die Fachleute auf dem Gebiet eine gut etablierte Bedeutung und werden in medizinischen Standardtexten definiert. Kurz gesagt töten antibakterielle Agenzien Bakterien oder inhibieren diese und umfassen Antibiotika ebenso wie andere synthetische oder natürliche Verbindungen mit ähnlichen Funktionen. Antibiotika sind niedermolekulare Moleküle, die von Zellen, wie beispielsweise Mikroorganismen, als Sekundärmetabolite produziert werden. Im Allgemeinen stören Antibiotika eine oder mehrere bakterielle Funktionen oder Strukturen, die für Mikroorganismen spezifisch sind, und in Wirtszellen nicht vorhanden sind. Antivirale Agenzien können aus natürlichen Quellen isoliert oder synthetisiert werden und sind nützlich beim Abtöten oder Inhibieren von Viren. Pilzmittel werden verwendet, um oberflächliche Pilzinfektionen ebenso wie opportunistische und primäre syntemische Pilzinfektionen zu behandeln. Parasitenmittel töten oder inhibieren Parasiten.
Beispiele für Parasitenmittel, auch als Parasitizide bezeichnet, die für die Verabreichung an den Menschen nützlich sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Albendazol, Amphotericin B, Benznidazol, Bithionol, Chloroquin-HCl, Chloroquin-Phosphat, Clindamycin, Dehydroemetin, Diethylcarbamazin, Diloxanidfuroat, Eflornithin, Furazolidaon, Glukokortikoide, Halofantrin, Iodoquinol, Ivermectin, Mebendazol, Mefloquin, Megluminantimoniat, Melarsoprol, Metrifonat, Metronidazol, Niclosamid, Nifurtimox, Oxamniquin, Paromomycin, Pentamidinisethionat, Piperazin, Praziquantel, Primaquinphosphat, Proguanil, Pyrantelpamoat, Pyrimethanmin-Sulfonamide, Pyrimethanmin-Sulfadoxin, Quinacrin-HCl, Chininsulfat, Chinidingluconat, Spiramycin, Stibogluconat-Natrium (Natrium-Antimongluconat), Suramin, Tetracyclin, Doxycyclin, Thiabendazol, Tinidazol, Trimethroprim-Sulfamethoxazol und Tryparsamid, von denen einige alleine oder in Kombination mit anderen verwendet werden.
Parasitizide, die bei nicht-menschlichen Lebewesen verwendet werden, umfassen Piperazin, Diethylcarbamazin, Thiabendazol, Fenbendazol, Albendazol, Oxfendazol, Oxibendazol, Febantel, Levamisol, Pyranteltartrat, Pyrantelpamoat, Dichlorvos, Ivermectin, Doramectic, Milbemycinoxim, Iprinomectin, Moxidectin, N-Butylchlorid, Toluol, Hygromycin B-Thiacetarsemid-Natrium, Melarsomin, Praziquantel, Epsiprantel, Benzimidazole wie beispielsweise Fenbendazol, Albendazol, Oxfendazol, Clorsulon, Albendazol, Amprolium; Decoquinat, Lasalocid, Monensinsulfadimethoxin; Sulfamethazin, Sulfachinoxalin, Metronidazol.
Parasitizide, die bei Pferden verwendet werden, umfassen Mebendazol, Oxfendazol, Febantel, Pyrantel, Dichlorvos, Trichlorfon, Ivermectin, Piperazin; für S. westeri: Ivermectin, Benzimiddazole wie beispielsweise Thiabendazol, Cambendazol, Oxybendazol und Fenbendazol. Nützliche Parasitizide für Hunde umfassen Milbemycinoxin, Ivermectin, Pyrantelpamoat und die Kombination aus Ivermectin und Pyrantel. Die Behandlung von Parasiten bei Schweinen kann die Verwendung von Levamisol, Piperazin, Pyrantel, Thiabendazol, Dichlorvos und Fenbendazol umfassen. Bei Schafen und Ziegen umfassen Anthelmintika Levamisol oder Ivermectin. Caparsolat hat eine gewisse Wirksamkeit bei der Behandlung von D. immitis (Herzwurm) bei Katzen gezeigt.
Antibakterielle Agenzien töten oder inhibieren das Wachstum oder die Funktion von Bakterien. Eine große Klasse von antibakteriellen Agenzien stellen Antibiotika dar. Antibiotika, die für das Abtöten oder Inhibieren einer großen Breite von Bakterien wirksam sind, werden als Breitbandantibiotika bezeichnet. Andere Arten von Antibiotika sind überwiegend wirksam gegen die Bakterien der Klasse der Gram-positiven oder Gramnegativen. Diese Arten von Antibiotika werden als Antibiotika mit einem engen Wirkspektrum bezeichnet. Andere Antibiotika, die gegen einzelne Organismen oder Erkrankungen wirksam sind und nicht gegen andere Arten von Bakterien, werden als Antibiotika mit beschränktem Spektrum bezeichnet. Antibakterielle Agenzien werden manchmal auf der Grundlage ihres primären Wirkmechanismus klassifiziert. Im Allgemeinen sind antibakterielle Agenzien Zellwandsyntheseinhibitoren, Zellmembraninhibitoren, Proteinsyntheseinhibitoren, Nukleinsäuresynthese- oder funktionale Inhibitoren und kompetitive Inhibitoren.
Antibakterielle Agenzien, die für die Erfindung nützlich sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, natürliche Penizilline, semi-synthetische Penizilline, Clavulansäure, Cephalosporine, Bacitracin, Ampizillin, Carbenicillin, Oxacillin, Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin, Methicillin, Dicloxacillin, Nafcillin, Zephalothin, Cephapyrin, Cephalexin, Cefamandol, Cefaclor, Cefazolin, Cefuroxin, Cefoxitin, Cefotaxim, Cefsulodin, Cefetamet, Cefixim, Ceftriaxon, Cefoperazon, Ceftazidin, Moxalactam, Carbapenems, Imipenems, Monobactems, Euztreonam, Vancomycin, Polymyxin, Amphotericin B, Nystatin, Imidazol, Clotrimazol, Miconazol, Ketoconazol, Itraconazol, Fluconazol, Rifampins, Ethambutol, Tetracycline, Chloramphenicol, Macrolide, Aminoglycoside, Streptomycin, Kanamycin, Tobramycin, Amikacin, Gentamicin, Tetracyclin, Minocyclin, Doxycyclin, Chlortetracyclin, Erythromycin, Roxithromycin, Clarithromycin, Oleandomycin, Azithromycin, Chloramphenicol, Chinolone, Co-Trimoxazol, Norfloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin, Nalidixinsäure, Temafloxacin, Sulfonamide, Gantrisin und Trimethoprim; Acedapson; Acetosulfonnatrium; Alamecin; Alexidin; Amdinocillin; Amdinocillinpivoxil; Amicyclin; Amifloxacin; Amifloxacinmesylat; Amikacin; Amikacinsulfat; Aminosalizylsäure; Aminosalizylnatrium; Amoxicillin; Amphomycin; Ampicillin; Ampicillinnatrium; Apalcillinnatrium; Apramycin; Aspartocin; Astromicinsulfat; Avilamycin; Avoparcin; Azithromycin; Azlocillin; Azlocillinnatrium; Bacampicillinhydrochlorid; Bacitracin; Bacitracinmethylendisalizylat; Bacitracinzink; Bambermycine; Benzoylpascalcium; Berythromycin; Betamicinsulfat; Biapenem; Biniramycin; Biphenaminehydrochlorid; Bispyrithionmagsulfex; Butikacin; Butirosinsulfat; Capreomycinsulfat; Carbadox; Carbenicillindinatrium; Carbenicillinindanylnatrium; Carbenicillinphenylnatrium; Carbenicillinkalium; Carumonamnatrium; Cefaclor; Cefadroxil; Cefamandol; Cefamandolnafat; Cefamandolnatrium; Cefaparol; Cefatrizin; Cefazaflurnatrium; Cefazolin; Cefazolinnatrium; Cefbuperazon; Cefdinir; Cefepim; Cefepimhydrochlorid; Cefetecol; Cefixim; Cefmenoximhydrochlorid; Cefmetazol; Cefmetazolnatrium; Cefonicidmononatrium; Cefonicidnatrium; Cefoperazonnatrium; Ceforanid; Cefotaximnatrium; Cefotetan; Cefotetandinatrium; Cefotiamhydrochlorid; Cefoxitin; Cefoxitinnatrium; Cefpimizol; Cefpimizolnatrium; Cefpiramid; Cefpiramidnatrium; Cefpiromsulfat; Cefpodoximproxetil; Cefprozil; Cefroxadin; Cefsulodinnatrium; Ceftazidim; Ceftibuten; Ceftizoximnatrium; Ceftriaxonnatrium; Cefuroxim; Cefuroximaxetil; Cefuroximpivoxetil; Cefuroximnatrium; Cephacetrilnatrium; Cephalexin; Cephalexinhydrochlorid; Cephaloglycin; Cephaloridin; Cephalothinnatrium; Cephapirinnatrium; Cephradin; Cetocyclinhydrochlorid; Cetophenicol; Chloramphenicol; Chloramphenicolpalmitat; Chloramphenicolpantothenatkomplex; Chloramphenicolnatriumsuccinat; Chlorhexidinphosphanilat; Chloroxylenol; Chlortetracyclinbisulfat; Chlortetracyclinhydrochlorid; Cinoxacin; Ciprofloxacin; Ciprofloxacinhydrochlorid; Cirolemycin; Clarithromycin; Clinafloxacinhydrochlorid; Clindamycin; Clindamycinhydrochlorid; Clindamycinpalmitathydrochlorid; Clindamycinphosphat; Clofazimin; Cloxacillinbenzathin; Cloxacillinnatrium; Cloxyquin; Colistimethatnatrium; Colistinsulfat; Coumermycin; Coumermycinnatrium; Cyclacillin; Cycloserin; Dalfopristin; Dapson; Daptomycin; Demeclocyclin; Demeclocyclinhydrochlorid; Demecyclin; Denofungin; Diaveridin; Dicloxacillin; Dicloxacillinnatrium; Dihydrostreptomycinsulfat; Dipyrithion; Dirithromycin; Doxycyclin; Doxycyclincalcium; Doxycyclinfosfatex; Doxycyclinhyclat; Droxacinnatrium; Enoxacin; Epicillin; Epitetracyclinhydrochlorid; Erythromycin; Erythromycinacistrat; Erythromycinestolat; Erythromycinethylsuccinat; Erythromycingluceptat; Erythromycinlactobionat; Erythromycinpropionat; Erythromycinstearat; Ethambutolhydrochlorid; Ethionamid; Fleroxacin; Floxacillin; Fludalanin; Flumequin; Fosfomycin; Fosfomycintromethamin; Fumoxicillin; Furazoliumchlorid; Furazoliumtartrat; Fusidatnatrium; Fusidsäure; Gentamicinsulfat; Gloximonam; Gramicidin; Haloprogin; Hetacillin; Hetacillinkalium; Hexedin; Ibafloxacin; Imipenem; Isoconazol; Isepamicin; Isoniazid; Josamycin; Kanamycinsulfat; Kitasamycin; Levofuraltadon; Levopropylcillinkalium; Lexithromycin; Lincomycin; Lincomycinhydrochlorid; Lomefloxacin; Lomefloxacinhydrochlorid; Lomefloxacinmesylat; Loracarbef; Mafenid; Meclocyclin; Meclocyclinsulfosalicylat; Megalomicinkaliumphosphat; Mequidox; Meropenem; Methacyclin; Methacyclinhydrochlorid; Methenamin; Methenaminhippurat; Methenaminmandelat; Methicillinnatrium; Metioprim; Metronidazolhydrochlorid; Metronidazolephosphat; Mezlocillin; Mezlocillinnatrium; Minocyclin; Minocyclinhydrochlorid; Mirincamycinhydrochlorid; Monensin; Monensinnatrium; Nafcillinnatrium; Nalidixatnatrium; Nalidixsäure; Natamycin; Nebramycin; Neomycinpalmitat; Neomycinsulfat; Neomycinundecylenat; Netilmicinsulfat; Neutramycin; Nifuraden; Nifuraldezon; Nifuratel; Nifuratron; Nifurdazil; Nifurimid; Nifurpirinol; Nifurquinazol; Nifurthiazol; Nitrocyclin; Nitrofurantoin; Nitromid; Norfloxacin; Novobiocinnatrium; Ofloxacin; Ormetoprim; Oxacillinnatrium; Oximonam; Oximonamnatrium; Oxolinsäure; Oxytetracyclin; Oxytetracyclincalcium; Oxytetracyclinhydrochlorid; Paldimycin; Parachlorophenol; Paulomycin; Pefloxacin; Pefloxacinmesylat; Penamecillin; Penicillin-G-Benzathin; Penicillin-G-Kalium; Penicillin-G-Procain; Penicillin-G-Natrium; Penicillin V; Penicillin-V-Benzathin; Penicillin-V-Hydrabamin; Penicillin-V-Kalium; Pentizidonnatrium; Phenylaminosalicylat; Piperacillinnatrium; Pirbenicillinnatrium; Piridicillinnatrium; Pirlimycinhydrochlorid; Pivampicillinhydrochlorid; Pivampicillinpamoat; Pivampicillinprobenat; Polymyxin-B-Sulfat; Porfiromycin; Propikacin; Pyrazinamid; Pyrithionzink; Chindecaminacetat; Chinupristin; Racephenicol; Ramoplanin; Ranimycin; Relomycin; Repromicin; Rifabutin; Rifametan; Rifamexil; Rifamid; Rifampin; Rifapentin; Rifaximin; Rolitetracyclin; Rolitetracyclinnitrat; Rosaramicin; Rosaramicinbutyrat; Rosaramicinpropionat; Rosaramicinnatriumphosphat; Rosaramicinstearat; Rosoxacin; Roxarson; Roxithromycin; Sancyclin; Sanfetrinemnatrium; Sarmoxicillin; Sarpicillin; Scopafungin; Sisomicin; Sisomicinsulfat; Sparfloxacin; Spectinomycinhydrochlorid; Spiramycin; Stallimycinhydrochlorid; Steffimycin; Streptomycinsulfat; Streptonicozid; Sulfabenz; Sulfabenzamid; Sulfacetamid; Sulfacetamidnatrium; Sulfacytin; Sulfadiazin; Sulfadiazinnatrium; Sulfadoxin; Sulfalen; Sulfamerazin; Sulfameter; Sulfamethazin; Sulfamethizol; Sulfamethoxazol; Sulfamonomethoxin; Sulfamoxol; Sulfanilatzink; Sulfanitran; Sulfasalazin; Sulfasomizol; Sulfathiazol; Sulfazamet; Sulfisoxazol; Sulfisoxazolacetyl; Sulfisoxazoldiolamin; Sulfomyxin; Sulopenem; Sultamicillin; Suncillinnatrium; Talampicillinhydrochlorid; Teicoplanin; Temafloxacinhydrochlorid; Temocillin; Tetracyclin; Tetracyclinhydrochlorid; Tetracyclinphosphatkomplex; Tetroxoprim; Thiamphenicol; Thiphencillinkalium; Ticarcillincresylnatrium; Ticarcillindinatrium; Ticarcillinmononatrium; Ticlaton; Tiodoniumchlorid; Tobramycin; Tobramycinsulfat; Tosufloxacin; Trimethoprim; Trimethoprimsulfat; Trisulfapyrimidine; Troleandomycin; Trospectomycinsulfat; Tyrothricin; Vancomycin; Vancomycinhydrochlorid; Virginiamycin und Zorbamycin.
Antivirale Agenzien sind Verbindungen, die die Infektion von Zellen durch Viren oder Replikation des Virus innerhalb der Zelle verhindern. Es gibt viel weniger antivirale Wirkstoffe als antibakterielle Wirkstoffe, da der Prozess der viralen Replikation so nahe zur DNA-Replikation innerhalb der Wirtszelle verwandt ist, dass nicht-spezifische antivirale Agenzien für den Wirt toxisch wären. Es gibt verschiedene Stadien innerhalb des Prozesses der viralen Infektion, die durch antivirale Agenzien blockiert oder inhibiert werden können. Diese Phasen umfassen Anbindung des Virus an die Wirtszelle (Immunglobulin oder bindende Peptide), Enthüllen des Virus (z. B. Amantadin), Synthese oder Translation viraler mnRNA (z. B. Interferon), Replikation viraler RNA oder DNA (z. B. Nukleotidanaloga), Reifung neuer Virusproteine (z. B. Proteaseinhibitoren) und Knospen und Freisetzen des Virus.
Nukleotidanaloga sind synthetische Verbindungen, die zu Nukleotiden ähnlich sind, die aber eine unvollständige oder anormale Desoxyribose- oder Ribosegruppe aufweisen. Wenn die Nukleotidanaloga einmal in der Zelle sind, werden sie phosphoryliert, wodurch sie Triphosphate ausbilden, die mit normalen Nukleotiden um den Einbau in die virale DNA oder RNA kompetieren. Wenn einmal die Triphosphatform des Nukleotidanaloga in die wachsende Nukleinsäurekette eingebaut ist, verursacht sie eine irreversible Assoziierung mit der viralen Polymerase und somit eine Kettentermination. Nukleotidanaloga umfasen, sind aber nicht darauf beschränkt, Acyclovir (verwendet für die Behandlung von Herpes-simplex-Virus und Varizella-Zoster-Virus), Gancyclovir (nützlich für die Behandlung von Zytomegalovirus), Idoxuridin, Ribavirin (nützlich für die Behandlung des Respiratory-syncytial-Virus), Didesoxyinosin, Didesoxycytidin und Zidovudin (Azidothymidin).
Die Interferone sind Zytokine, die von Virus-infizierten Zellen ebenso wie von Immunzellen sekretiert werden. Die Interferone funktionieren, indem sie an spezifische Rezeptoren an Zellen benachbart den infizierten Zellen binden, wodurch eine Veränderung in der Zelle erfolgt, die sie vor der Infektion durch den Virus schützen. α- und β-Interferon induzieren auch die Expression von MHC-Molekülen der Klasse I und Klasse II auf der Oberfläche von infizierten Zellen, was zu einer erhöhten Antigenpräsentation für die Immunzellenerkennung des Wirtes fuhrt. α- und β-Interferone sind als rekombinante Formen erhältlich und sind für die Behandlung chronischer Hepatitis B- und C-Infektion verwendet worden. Bei den Dosierungen, die für die antivirale Therapie wirksam sind, weisen Interferone schwerwiegende Nebenwirkungen wie beispielsweise Fieber, Unwohlsein und Gewichtsverlust auf.
Die Immunglobulintherapie wird für die Prävention viraler Infektionen verwendet. Die Immunglobulintherapie für virale Infektionen ist verschieden von der für bakterielle Infektionen, da anstatt dass sie Antigen-spezifisch ist, die Immunglobulintherapie durch Binden an extrazelluläre Virionen funktioniert und verhindert, dass sie an die Zelle, die für die virale Infektion empfindlich sind, binden und in diese eindringen. Die Therapie ist für die Prävention viraler Infektion für die Zeitspanne nützlich, die der Antikörper in dem Wirt vorhanden ist. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Immunglobulintherapie, normale Immunglobulintherapie und Hyper-Immunglobulintherapie. Normale Immunglobulintherapie verwendet ein Antikörperprodukt, das aus dem Serum von normalen Blutspendern präpariert und vereinigt wird. Dieses vereinigte Produkt enthält geringe Titer an Antikörpern gegen einen großen Bereich von menschlichen Viren, wie beispielsweise Hepatitis A, Parvovirus, Enterovirus (insbesondere bei Neugeborenen). Hyper-Immunglobulintherapie verwendet Antikörper, die aus dem Serum von Personen hergestellt werden, die hohe Titer an Antikörper für einen speziellen Virus aufweisen. Diese Antikörper werden dann gegen einen spezifischen Virus verwendet. Beispiele für Hyper-Immunglobuline umfassen Zoster-Immunglobulin (nützlich für die Verhinderung von Varizella bei immun-kompromittierten Kindern und Neugeborenen), menschliches Tollwutimmunglobulin (nützlich für die Post-Expositionsprophylaxe eines Lebewesens, das von einem Tier mit Tollwut gebissen wurde), Hepatitis B-Immunglobulin (nützlich für die Prävention von Hepatitis B-Virus, insbesondere in einem Lebewesen, das dem Virus ausgesetzt war) und RSV-Immunglobulin (nützlich für die Behandlung von Respiratory-syncytial-Virusinfektionen).
Eine weitere Art von Immunglobulintherapie ist die aktive Immunisierung. Diese umfasst die Verabreichung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten gegen virale Oberflächenproteine. Zwei Arten von Vakzinen, die für die aktive Immunisierung von Hepatitis B verfügbar sind, umfassen aus Serum gewonnene Hepatitis B-Antikörper und rekombinante Hepatitis B-Antikörper. Beide werden aus HBsAg hergestellt. Die Antikörper werden Lebewesen in drei Dosen verabreicht, für die ein hohes Risiko einer Infektion mit Hepatitis B-Virus besteht, wie beispielsweise medizinischem Personal, Sexualpartner von chronischen Trägern und Kleinkindern.
Somit umfassen antivirale Agenzien, die für die Erfindung nützlich sind, sind aber nicht darauf beschränkt, Immunglobuline, Amantadin, Interferon, Nukleosidanaloga und Proteaseinhibitoren. Spezifische Beispiele für antivirale Agenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Acemannan; Acyclovir; Acyclovirnatrium; Adefovir; Alovudin; Alvirceptsudotox; Amantadinhydrochlorid; Aranotin; Arildon; Atevirdinmesylat; Avridin; Cidofovir; Cipamfyllin; Cytarabinhydrochlorid; Delavirdinmesylat; Desciclovir; Didanosin; Disoxaril; Edoxudin; Enviraden; Enviroxim; Famciclovir; Famotinhydrochlorid; Fiacitabin; Fialuridin; Fosarilat; Foscarnetnatrium; Fosfonetnatrium; Ganciclovir; Ganciclovirnatrium; Idoxuridin; Kethoxal; Lamivudin; Lobucavir; Memotinhydrochlorid; Methisazon; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin; Rimantadinhydrochlorid; Saquinavirmesylat; Somantadinhydrochlorid; Sorivudin; Statolon; Stavudin; Tiloronhydrochlorid; Trifluridin; Valacyclovirhydrochlorid; Vidarabin; Vidarabinphosphat; Vidarabinnatriumphosphat; Viroxim; Zalcitabin; Zidovudin; und Zinviroxim.
Pilzmittel sind für die Behandlung und Prävention von infektiösen Pilzen nützlich. Pilzmittel werden manchmal durch ihren Wirkmechanismus klassifiziert. Einige Pilzmittel funktionieren als Zellwandinhibitoren, indem Glukosesynthase inhibiert wird. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Basiungin/ECB. Andere Pilzmittel funktionieren, indem sie die Integrität der Membran destabilisieren. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Imidazole wie beispielsweise Clotrimazol, Sertaconzol, Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol, Miconazol und Voriconacol ebenso wie FK 463, Amphotericin B, BAY 38-9502, MK 991, Pradimicin, UK 292, Butenafin und Terbinafin. Andere Pilzmittel funktionieren, indem sie Chitin abbauen (z. B. Chitinase), oder durch Immunsuppression (501 Creme). Einige Beispiele für kommerziell erhältliche Agenzien sind in Tabelle B gezeigt.
Tabelle B
Die Antipilzmittel, die in der Erfindung nützlich sind, umfassen somit, sind aber nicht beschränkt auf Imidazole, FK 463, Amphotericin B, BAY 38-9502, MK 991, Pradimicin, UK 292, Butenafine, Chitinase, 501 Creme, Acrisorcin; Ambruticin; Amorolfin, Amphotericin B; Azaconazol; Azaserin; Basifungin; Bifonazol; Biphenaminhydrochlorid; Bispyrithionmagsulfex; Butoconazolnitrat; Calciumundecylenat; Candicidin; Carbol-Fuchsin; Chlordantoin; Ciclopirox; Ciclopiroxolamin; Cilofungin; Cisconazol; Clotrimazol; Cuprimyxin; Denofungin; Dipyrithion; Doconazol; Econazol; Econazolnitrat; Enilconazol; Ethonamnitrat; Fenticonazolnitrat; Filipin; Fluconazol; Flucytosin; Fungimycin; Griseofulvin; Hamycin; Isoconazol; Itraconazol; Kalafungin; Ketoconazol; Lomofungin; Lydimycin; Mepartricin; Miconazol; Miconazolnitrat; Monensin; Monensinnatrium; Naftifinhydrochlorid; Neomycinundecylenat; Nifuratel; Nifurmeron; Nitralaminhydrochlorid; Nystatin; Oktansäure; Orconazolnitrat; Oxiconazolnitrat; Oxifunginhydrochlorid; Parconazolhydrochlorid; Partricin; Kaliumiodid; Proclonol; Pyrithionezink; Pyrrolnitrin; Rutamycin; Sanguinariumchloride; Saperconazol; Scopafungin; Seleniumsulfid; Sinefungin; Sulconazolnitrat; Terbinafin; Terconazol; Thiram; Ticlaton; Tioconazol; Tolciclat; Tolindat; Tolnaftat; Triacetin; Triafungin; Undecylensäure; Viridofulvin; Zinkundecylenat; und Zinoconazolydrochlorid.
Immunstimulatorische Nukleinsäuren können mit anderen therapeutischen Agenzien wie beispielsweise Adjuvanzien kombiniert werden, um Immunantworten zu verstärken. Die immunstimulatorische Nukleinsäure und das andere therapeutische Agens können gleichzeitig oder sequenziell verabreicht werden. Wenn die anderen therapeutischen Agenzien gleichzeitig verabreicht werden, können sie in der gleichen oder in verschiedenen Formulierungen verabreicht werden, werden aber zum gleichen Zeitpunkt verabreicht. Die anderen therapeutischen Agenzien werden sequenziell bezüglich zueinander und zur immunstimulatorischen Nukleinsäure verabreicht, wenn die Verabreichung der anderen therapeutischen Agenzien und der immunstimulatorischen Nukleinsäure zeitlich getrennt ist. Die zeitliche Trennung zwischen Verabreichung dieser Verbindungen kann eine Frage von Minuten oder sie kann länger sein. Andere therapeutische Agenzien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Adjuvanzien, Zytokine, Antikörper, Antigene etc.
Die immunstimulatorische Nukleinsäuren sind als Adjuvanzien zum Induzieren einer systemischen Immunantwort nützlich. Somit kann eine jede einem Lebewesen verabreicht werden, das gegenüber einem Antigen exponiert ist, um eine verstärkte Immunantwort gegenüber dem Antigen zu produzieren.
Zusätzlich zu den immunstimulatorischen Nukleinsäuren können die Zusammensetzungen der Erfindung auch mit Nicht-Nukleinsäure-Adjuvanzien verabreicht werden. Ein Nicht-Nukleinsäure-Adjuvans ist irgendein Molekül oder eine Verbindung ausgenommen die immunstimulatorischen Nukleinsäuren, wie sie hierin beschrieben sind, das/die die humorale und/oder zelluläre Immunantwort stimulieren kann. Nicht-Nukleinsäure-Adjuvanzien umfassen, beispielsweise, Adjuvanzien, die eine Depotwirkung erzeugen, immunstimulierende Adjuvanzien und Adjuvanzien, die eine Depotwirkung erzeugen und das Immunsystem stimulieren.
Ein Adjuvans, das eine Depotwirkung erzeugt, wie hierin verwendet, ist ein Adjuvans, das bedingt, dass das Antigen langsam in den Körper freigegeben wird, wodurch die Exposition von Immunzellen gegenüber dem Antigen verlängert wird. Diese Klasse von Adjuvanzien umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, Aluminium (z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat); oder Emulsions-basierte Formulierungen, einschließlich Mineralöl, Nicht-Mineralöl, Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-in-Öl-Emulsion, Öl-in-Wasser-Emulsionen wie beispielsweise die Seppic ISA-Serie von Montanidadjuvanzien (z. B. Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, Frankreich); MF-59 (eine Squalen-in-Wasser-Emulsion, stabilisiert mit Span 85 und Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; und PROVAX (eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die ein stabilisierendes Detergens und ein Mizellenausbildendes Agens enthält; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).
Ein immunstimulierendes Adjuvans ist ein Adjuvans, das eine Aktivierung einer Zelle des Immunsystems bedingt. Es kann, beispielsweise, eine Immunzelle veranlassen, Zytokine zu produzieren und zu sekretieren. Diese Klasse von Adjuvanzien umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, Saponine, die aus der Borke des Q. saponaria Baums isoliert sind, wie beispielsweise QS21 (ein Glycolipid, das in dem 21. Peak bei HPLC-Fraktionierung eluiert; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA); poly[di(Carboxylatophenoxy)phosphazen (PCPP-Polymer; Virus Research Institute, USA); Derivate von Lipopolysacchariden wie beispielsweise Monophosphoryllipid A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), Muramyldipeptid (MDP; Ribi) und Threonyl-Muramyl-Dipeptid (t-MDP; Ribi); OM-174 (ein zu Lipid A verwandtes Glucosamin-Disaccharid; OM Pharma SA, Meyrin, Schweiz); und Leishmania-Elongationsfaktor (ein gereinigtes Leishmania-Protein; Corixa Corporation, Seattle, WA).
Adjuvanzien, die eine Depotwirkung erzeugen und das Immunsystem stimulieren, sind jene Verbindungen, die beide der oben erwähnten Funktionen aufweisen. Diese Klasse von Adjuvanzien umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, ISCOMS (Immunstimulierende Komplexe, die gemischte Saponine und Lipide enthalten und virusgroße Partikel mit Poren ausbilden, die ein Antigen halten können; CSL, Melbourne, Australien); SB-AS2 (SmithKline Beecham Adjuvans-System #2, das eine Öl-in-Wasser-Emulsion ist, die MPL und QS21 enthält: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Belgien); SB-AS4 (SmithKline Beecham Adjuvans-System #4, das Aluminium und MPL enthält; SBB, Belgien); nicht-ionische Blockcopolymere, die Mizellen ausbilden wie beispielsweise CRL 1005 (diese enthalten eine lineare Kette aus hydrophoben Polyoxpropylen flankiert von Ketten aus Polyoxyethylen; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); und Syntex Adjuvans-Formulierung (SAF, eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die Tween 80 und ein nicht-ionisches Blockcopolymer enthält; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren sind auch nützlich als Schleimhautadjuvanzien. Man hat kürzlich entdeckt, dass sowohl systemische als auch Schleimhautimmunität durch Abgabe von CpG-Nukleinsäuren an die Schleimhaut induziert wird. Die systemische Immunität, die in Antwort auf CpG-Nukleinsäuren induziert wurde, enthielt sowohl humorale als auch zellvermittelte Antworten auf spezifische Antigene, die nicht in der Lage waren, eine systemische Immunität zu induzieren, wenn sie alleine an die Schleimhaut verabreicht wurden. Weiterhin induzierten sowohl CpG-Nukleinsäuren als auch Choleratoxin (CT, ein Schleimhautadjuvans, das eine Th2-ähnliche Antwort induziert) CTL. Dies war überraschend, da bei der systemischen Immunisierung die Anwesenheit von Th2-ähnlichen Antikörpern normalerweise mit einem Fehlen von CTL verbunden ist (Schirmbeck et al., 1995). Auf der Grundlage der hierin angegebenen Ergebnisse erwartet man, dass die immunstimulatorischen Nukleinsäuren in ähnlicher Weise funktionieren.
Zusätzlich induzieren die immunstimulatorischen Nukleinsäuren eine Schleimhautantwort an sowohl lokalen (z. B. Lunge) als auch entfernten (z. B. unterer Verdauungstrakt) Schleimhautstellen. Erhebliche Titer an IgA-Antikörpern werden an entfernten Schleimhautstellen durch die immunstimulatorische Nukleinsäuren induziert. CT wird allgemein als ein hoch wirksames Schleimhautadjuvans erachtet. Wie früher berichtet (Snider 1995) induziert CT überwiegend Antikörper vom IgG1-Isotyp, die eine Antwort vom Th2-Typ anzeigen. Im Gegensatz dazu sind die immunstimulatorischen Nukleinsäuren eher Th1 mit überwiegend IgG2a-Antikörpern, insbesondere nach einem Auffrischen oder wenn die zwei Adjuvanzien kombiniert werden. Antikörper vom Th1-Typ haben im Allgemeinen bessere Neutralisierungseigenschaften und eine Th2-Antwort in der Lunge ist weiterhin im hohen Maße unerwünscht, da sie mit Asthma verbunden ist (Kay, 1996, Hogg, 1997). Somit weist die Verwendung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren als Schleimhautadjuvans Vorteile auf, die andere Schleimhautadjuvanzien nicht erreichen können. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren der Erfindung sind auch als Schleimhautadjuvanzien für die Induktion sowohl einer systemischen als auch einer Schleimhautimmunantwort nützlich.
Schleimhautadjuvanzien, die als Nicht-Nukleinsäure-Schleimhautadjuvanzien bezeichnet werden, können auch mit den immunstimulatorischen Nukleinsäuren verabreicht werden. Ein Nicht-Nukleinsäure-Schleimhautadjuvans, wie hierin verwendet, ist ein Adjuvans, das verschieden ist von einer immunstimulatorischen Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Schleimhautimmunantwort in einem Lebewesen zu induzieren, wenn es an eine Schleimhautoberfläche zusammen mit einem Antigen verabreicht wird. Schleimhautadjuvanzien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, bakterielle Toxine, z. B. Choleratoxin (CT), wobei CT-Derivative umfassen, aber nicht beschränkt sind auf die CT-B-Untereinheit (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val zu Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val zu Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Tyr zu Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Val zu Asp, Ser zu Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg zu His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (His zu Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser zu Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu zu Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser zu Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS 106 (Pro zu Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); und CTK63 (Ser zu Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), Zonula occludens-Toxin, Zot, hitzelabiles Enterotoxin von Escherichia coli, labiles Toxin (LT), LT-Derivative umfassend, aber nicht darauf beschränkt, LT B-Untereinheit (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg zu Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser zu Phe) (Komase et al., 1998); LT112K (Glu zu Lys) (Komase et al., 1998); LT118E (Gly zu Glu) (Komase et al., 1998); LT 146E (Arg zu Glu) (Komase et al., 1998); LT 192G (Arg zu Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser zu Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); and LTR72 (Ala zu Arg) (Giuliani et al., 1998), Pertussistoxin, PT. (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag und Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995) umfassend PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); Toxin-Derivative (siehe unten) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag und Clements, 1999); Lipid A-Derivative (z. B. Monophosphoryllipid A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; Muramyldipeptid (MDP)-Derivative (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); Proteine der bakteriellen äußeren Membran (z. B. Protein A der äußeren Oberfläche (OspA)-Lipoprotein von Borrelia burgdorferi, Außenmembranprotein von Neisseria meningitidis) (Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); Öl-in-Wasser-Emulsionen (z. B. MF59) (Barchfield et al., 1999, Verschoor et al., 1999, O'Hagan, 1998); Aluminumsalze (Isaka et al., 1998, 1999); und Saponine (z. B. QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMS, MF-59 (eine Squalen-in-Wasser-Emulsion, die mit Span 85 und Tween 80 stabilisiert ist; Chiron Corporation, Emeryville, CA); die Seppic ISA-Reihe von Montanidadjuvanzien (z. B. Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, Frankreich); PROVAX (eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die ein stabilisierendes Detergens und ein Mizellenausbildendes Agens enthält; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvans-Formulierung (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO); poly[di(Carboxylatophenoxy)phosphazen (PCPP-Polymer; Virus Research Institute, USA) und Elongationsfaktor von Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).
Immunantworten können auch induziert oder verstärkt werden durch die Co-Verabreichung oder die co-lineare Expression von Zytokinen (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al.,1997; Kim et al.,1997) oder B-7 co-stimulatorischen Molekülen (Iwasaki et al.,1997; Tsuji et al.,1997) mit den immunstimulatorischen Nukleinsäuren. Die Zytokine können direkt mit immunstimulatorischen Nukleinsäuren verabreicht werden oder können in der Form eines Nukleinsäurevektors verabreicht werden, der das Zytokin codiert, so dass das Zytokin in vivo exprimiert werden kann. In einer Ausführungsform wird das Zytokin in der Form eines Plasmidexpressionsvektors verabreicht. Die Bezeichnung Zytokin bezeichnet einen generischen Namen für eine mannigfaltige Gruppe löslicher Proteine und Peptide, die als humorale Regulatoren bei nano- bis picomolaren Konzentrationen wirken und die, entweder unter normalen oder pathologischen Bedingungen, die funktionalen Aktivitäten einzelner Zellen und Gewebe modulieren. Diese Proteine vermitteln direkt Wechselwirkungen zwischen Zellen und regulieren Prozesse, die in der extrazellulären Umgebung erfolgen. Beispiele für Zytokine umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozytenkoloniestimulierender Faktor (G-CSF), Interferon-γ (γ-IFN), IFN-α, Tumornekrosefaktor (TNF), TGF-β, den FLT-3-Liganden und den CD40-Liganden.
Zytokine spielen eine Rolle beim Steuern der T-Zellantwort. Helfer (CD4+)-T-Zellen orchestrieren die Immunantwort von Säugetieren durch die Produktion von löslichen Faktoren, die auf andere Immunsystemzellen wirken, einschließlich andere T-Zellen. Die meisten reifen CD4+-T-Helferzellen exprimieren eines von zwei Zytokinprofilen: Th1 oder Th2. Die Th1-Untergruppe fördert eine Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ, Zellvermittelte Immunität und Immunglobulinklassen-Umschalten auf IgG_2a. Die Th2-Untergruppe induziert humorale Immunität, indem B-Zellen aktiviert werden, Antikörperproduktion gefördert wird und ein Klassenumschalten auf IgG₁ und IgE induziert wird. Bei einigen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass das Zytokin ein Th1-Zytokin ist.
Die Nukleinsäuren sind auch nützlich zum Umsteuern von einer Th2-Immunantwort auf eine Th1-Immunantwort. Das Umsteuern einer Immunantwort von einer Th2- zu einer Th1-Immunantwort kann erzielt werden, indem die Titer an Zytokinen gemessen werden, die in Reaktion auf die Nukleinsäure hergestellt werden (z. B. indem monozytische Zellen und andere Zellen induziert werden, um Th1-Zytokine zu produzieren, einschließlich IL-12, IFN-γ und GM-CSF). Das Umsteuern oder erneute Ausbalancieren der Immunantwort von einer Th2- zu einer Th1-Antwort ist besonders nützlich bei der Behandlung oder Prävention von Asthma. Beispielsweise kann eine wirksame Menge zur Behandlung von Asthma diejenige Menge sein, die nützlich ist für das Umsteuern einer Immunantwort vom Th2-Typ, die mit Asthma verbunden ist, zu einer Antwort vom Th1-Typ. Th2-Zytokine, insbesondere IL-4 und IL-5, sind in den Atemwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Zytokine fördern wichtige Aspekte der asthmatischen Entzündungsreaktion, einschließlich Umschalten auf IgE-Isotyp, eosinophile Chemotaxis und Aktivierung und Mastzellenwachstum. Th1-Zytokine, insbesondere IFN-γ und IL-12, können die Bildung von Th2-Klonen und Produktion von Th2-Zytokinen unterdrücken. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren der Erfindung bedingen eine Erhöhung der Th1-Zytokine, was dabei hilft, das Immunsystem erneut auszubalancieren, was die nachteiligen Wirkungen verhindert oder verringert, die mit einer überwiegenden Th2-Immunantwort verbunden sind.
Die Nukleinsäuren sind auch nützlich bei der Verbesserung des Überlebens, der Differenzierung, der Aktivierung und der Reifung von dendritischen Zellen. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren haben die einzigartige Fähigkeit, das Überleben der Zellen, die Differenzierung, Aktivierung und Reifung von dendritischen Zellen zu fördern. Dendritische Vorläuferzellen, die aus Blut durch immunmagnetisches Zellsortieren isoliert sind, entwickeln morphologische und funktionale Eigenschaften von dendritischen Zellen während einer zweitägigen Inkubation mit GM-CSF. Ohne GM-CSF werden diese Zellen apoptotisch. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren sind GM-CSF insoweit überlegen, als dass sie das Überleben und die Differenzierung von dendritischen Zellen (MHC II-Expression, Zellgröße, Granularität) fördern. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren induzieren auch die Reifung von dendritischen Zellen. Da dendritische Zellen die Verbindung zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem darstellen, indem sie Antigene präsentieren und indem sie Mustererkennungsrezeptoren exprimieren, die mikrobielle Moleküle wie LPS in ihrer lokalen Umgebung nachweisen, unterstützt die Fähigkeit, dendritische Zellen mit immunstimulatorischen Nukleinsäuren zu aktivieren, die Verwendung dieser immunstimulatorischen Nukleinsäure-basierten Strategien für in vivo- und ex vivo-Immuntherapie gegen Erkrankungen wie beispielsweise Krebs und allergische oder infektiöse Erkrankungen. Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren sind auch nützlich für die Aktivierung und Induzierung der Reifung von dendritischen Zellen.
Immunstimulatorische Nukleinsäuren erhöhen auch die lytische Aktivität von natürlichen Killerzellen und die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC). ADCC kann durchgeführt werden unter Verwendung einer immunstimulatorischen Nukleinsäure in Verbindung mit einem Antikörper, der für ein zelluläres Target, wie beispielsweise eine Krebszelle, spezifisch ist. Wenn die immunstimulatorische Nukleinsäure einem Lebewesen zusammen mit dem Antikörper verabreicht wird, wird das Immunsystem des Lebewesens dahingehend induziert, die Tumorzelle zu töten. Die Antikörper, die bei dem ADCC-Verfahren nützlich sind, umfassen Antikörper, die mit einer Zelle im Körper wechselwirken. Viele derartige Antikörper, die für zelluläre Targets spezifisch sind, sind in der Technik beschrieben worden und viele sind kommerziell erhältlich. Beispiele dieser Antikörper sind unten in der Liste von Krebsimmuntherapien angeführt.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren können auch zusammen mit einer Antikrebstherapie verabreicht werden. Antikrebstherapien umfassen Krebsmedikamente, Bestrahlung und chirurgische Eingriffe. Wie hierin verwendet bezeichnet ein „Krebsmedikament" ein Agens, das einem Lebewesen verabreicht wird zu Zwecken der Behandlung eines Krebses. Wie hierin verwendet umfasst „Behandeln eines Krebses" die Prävention der Entwicklung eines Krebses, Verringern der Symptome von Krebs und/oder Inhibieren des Wachstums eines etablierten Krebses. In anderen Aspekten wird das Krebsmedikament einem Lebewesen verabreicht, für das das Risiko besteht, dass es eine Krebserkrankung entwickelt, zu Zwecken der Verringerung des Risikos, eine Krebserkrankung zu entwickeln. Verschiedene Arten von Medikamenten für die Behandlung von Krebs werden hierin beschrieben. Für die Zwecke dieser Beschreibung werden die Krebsmedikamente als chemotherapeutische Agenzien, immuntherapeutische Agenzien, Krebsvakzine, Hormontherapie und Modifikatoren der biologischen Antwort definiert.
Wie hierin verwendet bezeichnet ein „Krebsmedikament" ein Agens, das einem Lebewesen für die Zwecke der Behandlung einer Krebserkrankung verabreicht wird. Wie hierin verwendet umfasst „Behandeln von Krebs" die Prävention der Entwicklung eines Krebses, Verringern der Symptome von Krebs und/oder Inhibieren des Wachstums eines etablierten Krebses. In anderen Aspekten wird das Krebsmedikament einem Lebewesen, das ein Risiko hat, einen Krebs zu entwickeln, für die Zwecke der Verringerung des Risikos verabreicht, den Krebs zu entwickeln. Verschiedene Arten von Medikamenten für die Behandlung von Krebs sind hierin beschrieben. Für die Zwecke dieser Beschreibung werden die Krebsmedikamente als chemotherapeutische Agenzien, immuntherapeutische Agenzien, Krebsvakzine, Hormontherapie und Modifikatoren der biologischen Antwort klassifiziert. Zusätzlich sollen die Verfahren der Erfindung die Verwendung von mehr als einem Krebsmedikament zusammen mit den immunstimulatorischen Nukleinsäuren umfassen. Beispielhaft können, wo angemessen, die immunstimulatorischen Nukleinsäuren mit sowohl einem chemotherapeutischen Agens als auch einem immuntherapeutischen Agens verabreicht werden. Alternativ kann das Krebsmedikament ein immuntherapeutisches Agens und ein Krebsvakzin umfassen, oder ein chemotherapeutisches Agens und ein Krebsvakzin, oder ein chemotherapeutisches Agens, ein immuntherapeutisches Agens und ein Krebsvakzin, die alle einem Lebewesen zu Zwecken der Behandlung eines Lebewesens verabreicht werden, das Krebs aufweist oder für das das Risiko besteht, dass es Krebs entwickelt.
Krebsmedikamente funktionieren auf verschiedenen Wegen. Einige Krebsmedikamente funktionieren dadurch, dass physiologische Mechanismen angepeilt werden, die für Tumorzellen spezifisch sind. Beispiele umfassen das Anpeilen spezifischer Gene und ihrer Genprodukte (d. h. in erster Linie Proteine), die bei Krebserkrankungen mutiert sind. Derartige Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Onkogene (z. B. Ras, Her2, bcl-2), Tumorsuppressorgene (z. B. EGF, p53, Rb) und Zellzyklus-Zielmoleküle (z. B. CDK4, p21, Telomerase). Krebsmedikamente können alternativ Signaltransduktionswege und molekulare Mechanismen anpeilen, die bei Krebszellen verändert sind. Das Anpeilen von Krebszellen vermittels der auf der Zelloberfläche exprimierten Epitope wird erreicht durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern. Die letzte Art von Krebsmedikament wird im Allgemeinen als Immuntherapie bezeichnet.
Andere Krebsmedikamente peilen Zellen an, die verschieden sind von Krebszellen. Beispielsweise prägen einige Medikamente das Immunsystem, um Tumorzellen anzugreifen (d. h. Krebsvakzine). Noch andere Medikamente, die als Angiogeneseinhibitoren bezeichnet werden, funktionieren, indem sie die Blutversorgung von soliden Tumoren angreifen. Da die Krebsarten, die am malignesten sind, in der Lage sind, zu metastasieren (d. h. sie existiert an der primären Tumorstelle und befallen ein distales Gewebe, wodurch ein Sekundärtumor ausgebildet wird), sind Medikamente, die dieses Metastasieren verhindern, auch bei der Behandlung von Krebs nützlich. Angiogene Mediatoren umfassen basischen FGF, VEGF, Angiopoetine, Angiostatin, Endostatin, TNFα, TNP-470, Thrombospondin-1, Plättchenfaktor 4, CAI und bestimmte Mitglieder der Integrinproteinfamilie. Eine Kategorie dieser Art von Medikamenten ist ein Metallproteinaseinhibitor, der die Enzyme inhibiert, die bei Krebszellen verwendet werden, um aus der primären Tumorstelle auszutreten und in andere Gewebe auszutreten.
Einige Krebszellen sind antigen und können somit durch das Immunsystem angepeilt werden. In einem anderen Aspekt ist die kombinierte Verabreichung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren und Krebsmedikamenten, besonders jenen, die als Krebsimmuntherapien klassifiziert sind, für die Stimulierung einer spezifischen Immunantwort gegen ein Krebsantigen nützlich. Ein „Krebsantigen", wie hierin verwendet, ist eine Verbindung wie beispielsweise ein Peptid, das mit einem Tumor oder einer Krebszelloberfläche verbunden ist und das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen, wenn es auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle im Kontext mit einem MHC-Molekül präsentiert ist.
Krebsantigene, wie jene, die in Krebsvakzinen vorhanden sind, oder jene, die verwendet werden, um Krebsimmuntherapien herzustellen, können aus rohen Krebszellextrakten hergestellt werden, wie beispielsweise beschrieben in Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, oder durch teilweises Reinigen der Antigene unter Verwendung von rekombinanter Technologie oder durch de novo-Synthese bekannter Antigene. Krebsantigene können in der Form von immunogenen Teilen eines speziellen Antigens verwendet werden oder in einigen Fällen kann eine ganze Zelle oder eine Tumormasse als das Antigen verwendet werden. Derartige Antigene können isoliert oder rekombinant oder durch irgendwelche andere Mittel hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind.
Die Theorie der Immunüberwachung besagt, dass eine Hauptfunktion des Immunsystems darin besteht, neoplastische Zellen zu detektieren und zu eliminieren, bevor sich ein Tumor ausbildet. Ein Grundprinzip dieser Theorie besagt, dass Krebszellen antigenisch verschieden sind von normalen Zellen und somit eine Immunantwort hervorrufen, die ähnlich zu derjenigen ist, die eine Abstoßung von immunologisch inkompatiblen allogenen Transplantaten verwendet. Studien haben bestätigt, dass sich Tumorzellen, entweder qualitativ oder quantitativ, hinsichtlich ihrer Expression von Antigenen unterscheiden. Beispielsweise sind „Tumor-spezifische Antigene" Antigene, die spezifisch mit Tumorzellen aber nicht mit normalen Zellen assoziiert sind. Beispiele für Tumor-spezifische Antigene sind virale Antigene in Tumoren, die von DNA- oder RNA-Viren induziert sind. „Tumorassoziierte" Antigene sind sowohl in Tumorzellen als auch in normalen Zellen, aber in einem unterschiedlichen Ausmaß oder in einer unterschiedlichen Form in Tumorzellen vorhanden. Beispiele für derartige Antigene sind onkofetale Antigene (z. B. karzinoembryonales Antigen), Differenzierungsantigene (z. B. T- und Tn-Antigene) und Onkogenprodukte (z. B. HER/neu).
Verschiedene Arten von Zellen, die Tumorziele in vitro und in vivo töten können, sind identifiziert worden: natürliche Killerzellen (NK-Zellen), zytolytische T-Lymphozyten (CTLs), Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAKs) und aktivierte Makrophagen. NK-Zellen können Tumorzellen abtöten, ohne dass sie vorher für spezifische Antigene sensibilisiert worden sind und die Aktivität erfordert nicht die Anwesenheit von Klasse I-Antigenen, die von dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Zielzellen codiert werden. Man glaubt, dass NK-Zellen an der Kontrolle von entstehenden Tumoren und bei der Kontrolle von metastatischem Wachstum teilhaben. Im Gegensatz zu NK-Zellen können CTLs Tumorzellen nur abtöten, nachdem sie für Tumorantigene sensibilisiert worden sind und wenn das Zielantigen auf den Tumorzellen exprimiert ist, die auch MHC Klasse I exprimieren. Man glaubt, dass CTLs Effektorzellen bei der Abstoßung von transplantierten Tumoren und von Tumoren sind, die durch DNA-Viren verursacht werden. LAK-Zellen sind eine Untergruppe von Null-Lymphozyten, die von NK- und CTL-Populationen verschieden sind. Aktivierte Makrophagen können Tumorzellen in einer Art und Weise töten, die weder Antigen-abhängig noch MHC-restringiert ist, wenn sie einmal aktiviert sind. Man glaubt, dass aktivierte Makrophagen die Wachstumsgeschwindigkeit der Tumoren, die sie infiltrieren, verringern. In vitro-Tests haben andere Immunmechanismen wie beispielsweise Antikörper-abhängige, zellvermittelte zytotoxische Reaktionen und Lyse durch Antikörper plus Komplement identifiziert. Man glaubt jedoch, dass diese Immuneffektormechanismen in vivo weniger wichtig sind als die Funktion von NK, CTLs, LAK und Makrophagen in vivo (für eine Übersicht siehe Piessens, W.F., und David, J., "Tumor Immunology", In: Scientific American Medicine, Band 2, Scientific American Books, N.Y., S. 1-13, 1996.
Das Ziel der Immuntherapie besteht darin, die Immunantwort eines Patienten gegenüber einem etablierten Tumor zu erhöhen. Ein Verfahren der Immuntherapie umfasst die Verwendung von Adjuvanzien. Adjuvanssubstanzen, die von Mikroorganismen abgeleitet sind, wie beispielsweise Bazillus Calmette-Guerin, erhöhen die Immunantwort und erhöhen die Resistenz gegenüber Tumoren bei Tieren.
Immuntherapeutische Agenzien sind Medikamente, die von Antikörpern oder Antikörperfragmenten abgeleitet sind, die spezifisch ein Krebsantigen binden oder dieses erkennen. Wie hierin verwendet ist ein Krebsantigen breit definiert als ein Antigen, das von einer Krebszelle exprimiert ist. Bevorzugterweise ist das Antigen auf der Zelloberfläche der Krebszelle exprimiert. Bevorzugtererweise ist das Antigen sogar ein solches, das von normalen Zellen nicht oder wenigstens nicht im gleichen Umfang wie von Krebszellen exprimiert wird. Antikörper-basierte Immuntherapien können funktionieren, indem sie an die Zelloberfläche einer Krebszelle binden und dadurch das endogene Immunsystem stimulieren, die Krebszelle anzugreifen. Eine andere Art und Weise, wie die Antikörper-basierte Therapie funktioniert, ist ein Abgabesystem für das spezifische Targetieren toxischer Substanzen an Krebszellen. Antikörper sind üblicherweise an Toxine wie beispielsweise Ricin (z. B. von Rizinusbohnen), Calicheamicin und Maytansinoiden, an radioaktive Isotope wie beispielsweise Iod-131 und Yttrium-90, an chemotherapeutische Agenzien (wie hierin beschrieben) oder an Mittel konjugiert, die die biologische Antwort modifizieren. Auf diese Weise können die toxischen Substanzen in der Region des Krebses konzentriert und die nichtspezifische Toxizität für normale Zellen kann minimiert werden. Zusätzlich zur Verwendung von Antikörpern, die für Krebsantigene spezifisch sind, sind auch Antikörper, die an Vaskulatur binden, wie beispielsweise jene, die an Endothelzellen binden, bei der Erfindung nützlich. Dies deshalb, weil solide Tumoren im Allgemeinen von neu gebildeten Blutgefäßen abhängig sind, um zu überleben und somit die meisten Tumoren in der Lage sind, das Wachstum neuer Blutgefäße zu rekrutieren und zu stimulieren. Infolge dessen ist eine Strategie von vielen Krebsmedikamenten, die Blutgefäße, die einen Tumor versorgen und/oder das Bindegewebe (oder Stroma), das derartige Blutgefäße stützt, anzugreifen.
Die Verwendung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren zusammen mit immuntherapeutischen Agenzien wie beispielsweise monoklonalen Antikörpern ist in der Lage, ein Langzeitüberleben durch eine Anzahl von Mechanismen zu verlängern, einschließlich signifikanter Verstärkung von ADCC (wie oben diskutiert), Aktivierung natürlicher Killer (NK)-Zellen und Erhöhung der IFNα-Titer. Die Nukleinsäuren, wenn sie zusammen mit monoklonalen Antikörpern verwendet werden, dienen dazu, die Dosis des Antikörpers zu verringern, die erforderlich ist, um ein biologisches Ergebnis zu erzielen.
Beispiele für Krebsimmuntherapien, die derzeit verwendet werden oder die in der Entwicklung sind, sind in Tabelle C aufgelistet.
Tabelle C
Noch andere Typen von chemotherapeutischen Agenzien, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Aminoglutethimid, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cytarabin-HCl, Dactinomycin, Daunorubicin-HCl, Estramustinphosphatnatrium, Etoposid (VP16-213), Floxuridin, Fluorouracil (5-FU), Flutamid, Hydroxyharnstoff (Hydroxycarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolidacetat (LHRH-Freisetzungsfaktoranalogon), Lomustin (CCNU), Mechlorethamin-HCl (Stickstoffsenfgas), Mercaptopurin, Mesna, Mitotan (o.p'-DDD), Mitoxantron-HCl, Octreotid, Plicamycin, Procarbazin-HCl, Streptozocin, Tamoxifencitrat, Thioguanin, Thiotepa, Vinblastinsulfat, Amsacrin (m-AMSA), Azacitidin, Erthropoietin, Hexamethylmelamin (HMM), Interleukin-2, Mitoguazon (Methyl-GAG; Methylglyoxal-bis-Guanylhydrazon; MGBG), Pentostatin (2'Deoxycoformycin), Semustin (Methyl-CCNU), Teniposid (VM-26) und Vindesinsulfat.
Krebsvakzine sind Medikamente, die eine endogene Immunantwort gegen Krebszellen stimulieren sollen. Derzeit hergestellte Vakzine aktivieren in überwiegender Weise das humorale Immunsystem (d. h. die Antikörper-abhängige Immunantwort). Andere Vakzine, die sich derzeit in der Entwicklung befinden, konzentrieren sich auf die Aktivierung des Zellvermittelten Immunsystems, einschließlich zytotoxischer T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Tumorzellen zu töten. Krebsvakzine verstärken im Allgemeinen die Präsentation von Krebsantigenen gegenüber Antigen-präsentierenden Zellen (z. B. Makrophagen und dendritische Zellen) und/oder gegenüber anderen Immunzellen wie beispielsweise T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen.
Obwohl Krebsvakzine eine von verschiedenen Formen annehmen können, wie hierin unten diskutiert, besteht ihr Zweck darin, Krebsantigene und/oder Krebs-assoziierte Antigene an Antigen-präsentierende Zellen (APC) abzugeben, um das endogene Verarbeiten derartiger Antigene durch APC zu erleichtern und somit die letztendliche Präsentation von Antigen auf der Zelloberfläche im Kontext von MHC-Molekülen der Klasse I. Eine Form von Krebsvakzin ist ein Ganzellvakzin, das ein Präparat von Krebszellen ist, die aus einem Lebewesen entfernt, ex vivo behandelt und dann als ganze Zellen in das Lebewesen wieder eingeführt worden sind. Lysate von Tumorzellen können ebenfalls als Krebsvakzine verwendet werden, um eine Immunantwort hervorzurufen. Eine weitere Form von Krebsvakzin ist ein Peptidvakzin, das Krebs-spezifische oder Krebs-assoziierte kleine Proteine verwendet, um T-Zellen zu aktivieren. Krebs-assoziierte Proteine sind Proteine, die nicht exklusiv von Krebszellen exprimiert werden (d. h. andere normale Zellen können diese Antigene noch exprimieren). Die Expression von Krebs-assoziierten Antigenen ist im Allgemeinen bei Krebserkrankungen eines speziellen Typs konsistent hochreguliert. Eine noch weitere Form von Krebsvakzin ist ein dendritisches Zellvakzin, das ganze dendritische Zellen umfasst, die einem Krebsantigen oder einem Krebs-assoziierten Antigen in vitro ausgesetzt worden sind. Lysate oder Membranfraktionen von dendritischen Zellen können auch als Krebsvakzine verwendet werden. Dendritische Zellvakzine sind in der Lage, Antigen-präsentierende Zellen direkt zu aktivieren. Andere Krebsvakzine umfassen Gangliosidvakzine, Hitzeschockproteinvakzine, virale und bakterielle Vakzine und Nukleinsäurevakzine.
Die Verwendung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren zusammen mit Krebsvakzinen liefert eine verbesserte Antigen-spezifische humorale und Zell-vermittelte Immunantwort zusätzlich zur Aktivierung von NK-Zellen und endogenen dendritischen Zellen und ein Erhöhen von IFNα-Titern. Diese Erhöhung erlaubt, dass ein Vakzin mit einer verringerten Antigen-Dosis verwendet wird, um die gleiche vorteilhafte Wirkung zu erzielen. In einigen Fällen können Krebsvakzine zusammen mit Adjuvanzien verwendet werden, wie jenen, die oben beschrieben sind.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Krebsantigen" und „Tumorantigen" austauschbar verwendet, um Antigene zu bezeichnen, die unterschiedlich von Krebszellen exprimiert werden und dadurch verwendet werden können, um Krebszellen anzugreifen. Krebsantigene sind Antigene, die potentiell offenkundig Tumor-spezifische Immunantworten stimulieren können. Einige dieser Antigene werden von normalen Zellen codiert, obwohl nicht notwendigerweise exprimiert. Diese Antigene können als jene charakterisiert werden, die in normalen Zellen normalerweise still sind (d. h. nicht exprimiert werden), jene, die nur zu bestimmten Stadien der Differenzierung exprimiert werden und jene, die vorübergehend exprimiert werden, wie beispielsweise embryonale und fetale Antigene. Andere Krebsantigene werden von mutierten zellulären Genen codiert, wie beispielsweise Onkogenen (z. B. aktiviertes ras-Onkogen), Suppressorgenen (z. B. mutiertes p53), Fusionsproteinen, die sich aus internen Deletionen oder chromosomalen Translokationen ergeben. Noch andere Krebsantigene können von viralen Genen wie beispielsweise jenen codiert werden, die auf RNA- und DNA-Tumorviren getragen werden.
Andere Vakzine liegen in der Form von dendritischen Zellen vor, die man gegenüber Krebsantigenen in vitro exponiert hat, die Antigene prozessiert haben und in der Lage sind, die Krebsantigene auf ihrer Zelloberfläche im Kontext von MHC-Molekülen für eine wirksame Antigenpräsentation gegenüber anderen Immunsystemzellen zu exprimieren.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren werden in einem Aspekt der Erfindung zusammen mit Krebsvakzinen verwendet, die auf dendritischen Zellen basieren. Eine dendritische Zelle ist eine professionelle Antigen-präsentierende Zelle. Dendritische Zellen bilden die Verknüpfung zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem, indem Antigene präsentiert werden und durch ihre Expression von Mustererkennungsrezeptoren, die mikrobielle Moleküle wie beispielsweise LPS in ihrer lokalen Umgebung nachweisen. Dendritische Zellen internalisieren, verarbeiten und präsentieren lösliche spezifische Antigene, gegenüber denen sie exponiert sind, in effizienter Art und Weise. Der Prozess der Internalisierung und Präsentierung von Antigen bedingt eine schnelle Hochregulierung der Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und costimulatorischer Moleküle, die Produktion von Zytokinen und die Migration zu lymphatischen Organen, wo man glaubt, dass sie bei der Aktivierung von T-Zellen beteiligt sind.
Die Tabelle D listet eine Vielzahl von Krebsvakzinen auf, die entweder derzeit verwendet werden oder in der Entwicklung sind.
Tabelle D
Wie hierin verwendet umfassen chemotherapeutische Agenzien alle Formen von Krebsmedikamenten, die nicht in die Kategorie von immuntherapeutischen Agenzien oder Krebsvakzinen fallen. Chemotherapeutische Agenzien, wie hierin verwendet, umfassen sowohl chemische als auch biologische Agenzien. Diese Agenzien funktionieren so, dass sie eine zelluläre Aktivität inhibieren, von der die Krebszelle für ein weiteres Überleben abhängig ist. Kategorien von chemotherapeutischen Agenzien umfassen alkylierende/Alkaloid-Agenzien, Antimetabolite, Hormone oder Hormonanaloga und sonstige anti-neoplastische Wirkstoffe. Die meisten, wenn nicht alle dieser Agenzien sind direkt toxisch für Krebszellen und erfordern keine Immunstimulierung. Die Kombination aus Chemotherapie und der Verabreichung einer immunstimulatorischen Nukleinsäure erhöht die maximal tolerierbare Dosis an Chemotherapie.
Chemotherapeutische Agenzien, die derzeit in der Entwicklung sind oder in einem klinischen Umfeld verwendet werden, sind in Tabelle E gezeigt.
Tabelle E
In einer Ausführungsform verwenden die Verfahren der Erfindung immunstimulatorische Nukleinsäuren als Ersatz für die IFNα-Therapie bei der Behandlung von Krebs. Derzeit verlangen einige Behandlungsprotokolle die Verwendung von IFNα. Da IFNα nach der Verabreichung von immunstimulatorischen Nukleinsäuren hergestellt wird, können diese Nukleinsäuren verwendet werden, um IFNα endogen zu erzeugen.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Induzieren von antigener nicht-spezifischer angeborener Immunaktivierung und einem breiten Resistenzspektrum gegenüber Infektionen unter Verwendung der immunstimulatorischen Nukleinsäuren. Die antigene nicht-spezifische angeborene Immunaktivierung, wie hierin verwendet, bezeichnet die Aktivierung von Immunzellen, die von T-Zellen verschieden sind, und kann beispielsweise die Aktivierung von NK-Zellen, T-Zellen oder andere Immunzellen umfassen, die in einer Antigenabhängigen Art und Weise antworten oder eine Kombination dieser Zellen. Es wird ein breites Resistenzspektrum gegenüber Infektionen induziert, da die Zellen in aktiver Form vorliegen und geprägt sind, um auf irgendeine eindringende Verbindung oder Mikroorganismus zu antworten. Die Zellen brauchen nicht gegen ein spezielles Antigen spezifisch geprägt zu werden. Dies ist besonders nützlich bei einem biologischen Krieg und den anderen, oben beschriebenen Umständen wie beispielsweise bei Reisenden.
Der Stimulationsindex einer speziellen immunstimulatorischen Nukleinsäure kann in verschiedenen Immunzelltests getestet werden. Bevorzugterweise beträgt der Stimulationsindex der immunstimulatorischen Nukleinsäure hinsichtlich B-Zell-Proliferation wenigstens etwa 5, bevorzugterweise mindestens etwa 10, bevorzugtererweise wenigstens etwa 15 und am bevorzugtesten wenigstens etwa 20, wie durch Einbau von ³H-Uridin in eine murine B-Zellkultur bestimmt, die mit 20 μM Nukleinsäure für 20 Stunden bei 37°C kontaktiert und mit 1 μCi ³H-Uridin gepulst, und geerntet und 4 Stunden später gezählt wurde wie detaillierter in den veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen PCT/LTS95/01570 (WO 96/02555) und PCT/LTS97/19791 (WO 98/18810), die die Priorität der US Anmeldungen 08/386,063 und 08/960,774, eingereicht am 07. Februar 1995 bzw. 30. Oktober 1997 beansprucht, beschrieben. Bei der in vivo Anwendung ist beispielsweise wichtig, dass die immunstimulatorischen Nukleinsäuren in der Lage sind, wirksam eine Immunantwort, wie beispielsweise Antikörperproduktion, zu induzieren.
Immunstimulatorische Nukleinsäuren sind wirksam bei nicht-Nagetiervertebraten. Unterschiedliche immunstimulatorische Nukleinsäuren können eine optimale Immunstimulierung erzeugen, abhängig von der Art des Lebewesens und der Sequenz der immunstimulatorischen Nukleinsäure. Man hat gefunden, dass viele Vetrebraten gemäß der Erfindung auf die gleiche Klasse von immunstimulatorischen Nukleinsäuren ansprechen, die manchmal als menschenspezifische immunstimulatorische Nukleinsäuren bezeichnet werden. Nagetiere antworten jedoch auf andere Nukleinsäuren. Wie hierin gezeigt braucht eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine optimale Stimulierung beim Menschen verursacht, nicht generell eine optimale Stimulierung in einer Maus hervorzurufen und umgekehrt. Eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine optimale Stimulierung bei Menschen bedingt, erzeugt jedoch oft eine optimale Stimulierung in anderen Tieren wie beispielsweise Kühen, Pferden, Schafen etc. Der Fachmann kann unter Verwendung der hierin gegebenen Lehre die für eine spezielle, interessierende Spezies nützliche optimale Nukleinsäuresequenz identifizieren unter Verwendung von Routinetests, die hierin beschrieben sind und/oder in der Technik bekannt sind.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren können direkt dem Lebewesen verabreicht oder zusammen mit einem Nukleinsäureabgabekomplex abgegeben werden. Ein Nukleinsäureabgabekomplex soll ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das mit einem Targetierungsmittel (z. B. einem Molekül, das zu einer höher-affinen Bindung an eine Zielzelle führt (z. B. B-Zell-Oberflächen und/oder erhöhte zelluläre Aufnahme durch Zielzellen) verbunden ist (beispielsweise ionisch oder kovalent daran gebunden, oder darin eingeschlossen). Beispiele für Nukleinsäureabgabekomplexe umfassen Nukleinsäuren, die mit einem Sterol verbunden sind (z. B. Cholesterol), ein am Lipid (z. B. kationisches Lipid, Virosom oder Liposom) oder ein Zielzellen-spezifisches Bindungsagens (z. B. ein Ligand, der von einem Zielzellen-spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte Komplexe können in vivo ausreichend stabil sein, um ein signifikantes Entkoppeln vor der Internalisierung durch die Zielzelle zu verhindern. Der Komplex kann jedoch unter bestimmten Bedingungen innerhalb der Zelle spaltbar sein, so dass die Nukleinsäure in einer funktionalen Form freigesetzt wird.
Abgabevehikel oder Abgabevorrichtungen zum Abgeben von Antigen und Nukleinsäuren an Oberflächen sind beschrieben worden. Die immunstimulatorische Nukleinsäure und/oder das Antigen und/oder andere Therapeutika können alleine (z. B. in Saline oder Puffer) oder unter Verwendung von irgendwelchen Abgabevehikeln, die in der Technik bekannt sind, verabreicht werden. Beispielsweise sind die folgenden Abgabevehikel beschrieben worden: Cochleate (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsome (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1999); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Liposome (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995b); lebende bakterielle Vektoren (e. g., Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigalla, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); lebende virale Vektoren (e.g., Vaccinia, adenovirus, Herpes simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); Mikrosphären (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); nukleäre Nukleinssäurevakzine (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); Polymere (z. B. Carboxymethylcellulose, Chitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); Polymerringe (Wyatt et al., 1998); Proteosome (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); Natriumflorid (Hashi et al., 1998); transgene Pflanzen (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); Virosome (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); virusähnliche Partikel (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Andere Abgabevehikels sind in der Technik bekannt und zusätzliche Beispiele werden bei der Diskussion von Vektoren angeführt.
Der Begriff wirksame Menge einer immunstimulatorischen Nukleinsäure bezeichnet die Menge, die erforderlich oder ausreichend ist, um eine erwünschte biologische Wirkung zu realisieren. Beispielsweise ist eine wirksame Menge einer immunstimulatorischen Nukleinsäure zum Induzieren von Schleimhautimmunität die Menge, die erforderlich ist, um die Entwicklung von IgA in Reaktion auf ein Antigen nach Exposition gegenüber dem Antigen zu bedingen, wohingegen die Menge, die erforderlich ist zum Induzieren von systemischer Immunität jene Menge ist, die erforderlich ist, um die Entwicklung von IgG in Reaktion auf ein Antigen nach Exposition gegenüber dem Antigen hervorzurufen. Kombiniert mit den hierin gegebenen Lehren kann durch Auswahl unter den geeigneten aktiven Verbindungen und Abwägen von Faktoren wie beispielsweise Wirksamkeit, relative Bioverfügbarkeit, Körpergewicht des Patienten, schwere nachteilige Nebenwirkungen und bevorzugter Verabreichungsmodus ein wirksames prophylaktisches oder therapeutisches Behandlungsschema geplant werden, das keine substantielle Toxizität verursacht und dennoch vollständig wirksam ist, um das spezielle Lebewesen zu behandeln. Die wirksame Menge für irgendeine spezielle Anwendung kann variieren abhängig von solchen Faktoren wie die Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand, die spezielle, verabreichte immunstimulatorische Nukleinsäure, das Antigen, die Größe des Lebewesens oder die Schwere der Erkrankung oder des Zustandes. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann die wirksame Menge einer speziellen immunstimulatorischen Nukleinsäure und/oder Antigen und/oder andere therapeutische Agens empirisch bestimmen, ohne dass es eines unangemessenen Experimentierens bedürfte.
Patientendosen der Verbindungen, wie sie hierin beschrieben sind, für die Schleimhaut- oder lokale Abgabe reichen typischerweise von 0,1 μg bis 10 mg pro Verabreichung, die, abhängig von der Anwendung, täglich, wöchentlich oder monatlich oder an irgendeinen Zeitraum dazwischen gegeben werden könnte. Typischererweise reichen die Schleimhaut- oder lokalen Dosen von etwa 10 μg bis 5 mg pro Verabreichung und am typischsten von etwa 100 μg bis 1 mg, mit zwei bis vier Verabreichungen, die Tage oder Wochen voneinander getrennt sind. Typischererweise reichen immunstimulierende Dosen von 1 μg bis 10 mg pro Verabreichung und am typischsten von 10 μg bis 1 mg mit täglicher oder wöchentlicher Verabreichung. Patientendosen der hierin beschriebenen Verbindungen für die parenterale Abgabe für die Zwecke der Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort, wobei die Verbindungen mit einem Antigen aber nicht einem weiteren therapeutischen Agens verabreicht werden, sind typischerweise 5- bis 10.000-fach höher als die wirksame Schleimhautdosis für Vakzinadjuvans oder immunstimulierende Anwendungen und typischererweise 10- bis 1.000-fach höher, am typischsten 20- bis 100-fach höher. Dosen der hierein beschriebenen Verbindungen für die parenterale Abgabe für die Zwecke der Induktion einer angeborenen Immunantwort oder für die Erhöhung von ADCC oder für das Induzieren einer Antigenspezifischen Immunantwort, wenn die immunstimulatorischen Nukleinsäuren zusammen mit anderen therapeutischen Agenzien oder in spezialisierten Abgabevehikeln verabreicht werden, reichen typischerweise von etwa 0,1 μg bis 10 mg pro Verabreichung, die, abhängig von der Anwendung, täglich, wöchentlich oder monatlich gegeben werden könnte, oder in irgendeiner Zeitspanne dazwischen. Typischererweise reichen parenterale Dosen für diese Zwecke von etwa 10 μg bis 5 mg pro Verabreichung und am typischten von etwa 10 μg bis 1 mg, wobei zwei bis vier Verabreichungen Tage oder Wochen voneinander getrennt sind. Bei einigen Ausführungsformen können jedoch die parenteralen Dosen für diese Zwecke in einem Bereich 5- bis 10.000-fach höher als die oben beschriebene typische Dosierung verwendet werden.
Für eine der hierin beschriebenen Verbindungen kann die therapeutisch wirksame Menge anfänglich aus Tiermodellen bestimmt werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis kann auch bestimmt werden aus Daten von Menschen für CpG-Oligonukleotide, die am Menschen getestet worden sind (klinische Versuche am Menschen sind initiiert worden), und für Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie ähnliche pharmakologische Aktivitäten aufweisen, wie andere Schleimhautadjuvanzien, z. B. LT und andere Antigene für Vakzinierungszwecke, für die Schleimhaut- oder lokale Verabreichung. Höhere Dosen sind für parenterale Verabreichung erforderlich. Die angewandte Dosis kann angepasst werden auf der Grundlage der relativen Bioverfügbarkeit und Potenz der verabreichten Verbindung. Das Anpassen der Dosis, um eine maximale Wirksamkeit zu erreichen, auf der Grundlage der oben beschriebenen Verfahren und anderer, den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren ist im Rahmen der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns.
Die Formulierungen der Erfindungen werden in pharmazeutisch akzeptablen Lösungen verabreicht, die routinemäßig pharmazeutisch akzeptable Konzentrationen an Salz, Pufferagenzien, Konservierungsmitteln, kompatiblen Trägern, Adjuvanzien und optional anderen therapeutischen Agenzien enthalten können.
Für die Verwendung in der Therapie kann eine wirksame Menge der immunstimulatorischen Nukleinsäure einem Lebewesen durch irgendeine Art und Weise verabreicht werden, die die Nukleinsäure an die erwünschte Oberfläche verabreicht, z. B. über Schleimhaut oder systemisch. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch Mittel erfolgen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Bevorzugte Verabreichungsrouten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, oral, parenteral, intramuskulär, intranasal, intratracheal, Inhalation, okular, vaginal und rektal.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen (d. h. immunstimulatorische Nukleinsäuren, Antigene und andere therapeutische Agenzien) leicht formuliert werden durch Kombinieren der aktiven Verbindungen) mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die in der Technik gut bekannt sind. Derartige Träger erlauben, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirups, Schlämme, Suspensionen und dergleichen, für die orale Aufnahme durch ein zu behandelndes Lebewesen formuliert werden können. Pharmazeutische Präparate für die orale Verwendung können als solide Bindemittel erhalten werden, optionales Zermahlen einer sich ergebenden Mischung und Verarbeiten der Mischung aus Granula, nach, sofern erwünscht, Zugabe von geeigneten Hilfsstoffen, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Bindemittel sind, insbesondere, Füllmittel wie beispielsweise Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulosepräparate wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidone (PVP). Sofern erwünscht können Sprengmittel hinzugegeben werden wie beispielsweise quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie beispielsweise Natriumalginat. Optional können die oralen Formulierungen auch in Saline oder Puffern zum Neutralisieren innerer Säurebedingungen formuliert werden oder ohne irgendwelche Träger verabreicht werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummi arabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen hinzugegeben werden, um verschiedene Kombinationen von aktiven Verbindungsdosierungen zu identifizieren oder zu charakterisieren.
Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, umfassen Schiebepass-Kapseln, die aus Gelatine hergestellt sind, ebenso wie weiche, abgedichtete Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie beispielsweise Glycerol oder Sorbitol, hergestellt sind. Die Schiebepass-Kapseln können die aktiven Bestandteile gemischt mit Füllmaterial wie beispielsweise Lactose, Binder wie beispielsweise Stärke, und/oder Schmiermittel wie beispielsweise Talk oder Magnesiumstearat und, optional, Stabilisatoren, enthalten. In Weichkapseln können die aktiven Verbindungen gelöst oder in geeigneten Flüssigkeiten suspendiert sein, wie beispielsweise fette Öle, flüssiges Paraffin oder flüssige Polyethylenglycole. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugegeben werden. Mikrosphären, die für die orale Verabreichung formuliert sind, können ebenfalls verwendet werden. Solche Mikrosphären sind in der Technik gut definiert worden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine derartige Verabreichung geeignet sind.
Für die bukale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, die in herkömmlicher Art und Weise formuliert sind.
Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung herkömmlich in einer Aerosolspraydarstellung abgegeben werden aus mit Druck beaufschlagten Packungen oder einem Zerstäuber unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluormethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas. Im Falle eines mit Druck beaufschlagten Aerosols kann die Dosierungseinheit bestimmt werden, indem ein Ventil bereitgestellt wird, um eine abgemessene Menge abzugeben. Kapseln und Kartuschen aus, z. B., Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die eine Pulvermischung der Verbindung enthalten und eine geeignete Pulverbasis wie beispielsweise Lactose oder Stärke.
Die Verbindungen können, wenn es wünschenswert ist, diese systemisch zu verabreichen, formuliert werden für die parenterale Verabreichung durch Injektion, z. B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion. Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosenform bereitgestellt sein, z. B. in Ampullen oder in Mehrfachdosenbehältern mit einem hinzugefügten Konservierungsstoff. Die Zusammensetzungen können Formen einnehmen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Öl oder wässrige Vehikel, und können Formulierungsagenzien wie beispielsweise Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
Pharmazeutisch Formulierungen für die parenterale Verabreichung umfassen wässrige Lösungen für die aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Zusätzlich können Suspensionen aus den aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fette Öle wie beispielsweise Sesamöle oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol oder Dextran. Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Agenzien enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
Alternativ können die aktiven Verbindungen in Pulverform vorliegen für die Konstitution vor der Verwendung mit einem geeigneten Vehikel mit z. B. sterilem Pyrogen-freien Wasser.
Die Verbindungen können auch in Rektal- oder Vaginalzusammensetzungen formuliert werden wie beispielsweise als Suppositorien oder Retentionsklistiere, die, z. B. herkömmliche Suppositorienbasen wie beispielsweise Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparat formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialen (z. B. als eine Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauscherharzen, oder als schwerlösliche Derivate formuliert sein, beispielsweise als ein schwer löslicher Salz.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Feststoff- oder Gelphasenträger oder Bindemittel enthalten. Beispiele für derartige Träger oder Bindemittel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Kalziumcarbonat, Kalziumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Zellulosederivate, Gelatine und Polymere wie beispielsweise Polyethylenglycole.
Geeignete flüssige oder feste pharmazeutische Präparationsformen sind, beispielsweise, wässrige oder Salinelösungen für die Inhalation, mikroenkapsuliert, encochleiert, auf mikroskopische Goldpartikel beschichtet, in Liposomen enthalten, zerstäubt, Aerosole, Pellets für die Implantation in die Haut oder auf einen scharfen Gegenstand getrocknet, der in die Haut eingekratzt werden soll. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen auch Granula, Pulver, Tabletten, beschichtete Tabletten, (Mikro)Kapseln, Suppositorien, Sirups, Emulsionen, Suspensionen, Cremes, Tropfen oder Präparate mit einer verlängerten Freisetzung von aktiven Verbindungen, bei deren Herstellung Mittel und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie beispielsweise Sprengmittel, Bindemittel, Beschichtungsmittel, Quellungsmittel, Schmiermittel, Geschmackstoffe, Süßstoffe oder Lösungsvermittler üblicherweise wie oben beschrieben verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich für die Verwendung bei einer Vielzahl von Wirkstoffabgabesystemen. Für eine kurze Übersicht von Verfahren für die Wirkstoffabgabe siehe Langer, Science 249:1527-1533, 1990, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuren und optional andere Therapeutika und/oder Antigene können per se (nackt) oder in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verabreicht werden. Wenn in Medikamenten verwendet, sollten die Salze pharmazeutisch akzeptabel sein, aber nicht-pharmazeutisch akzeptable Salze können bequem verwendet werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze daraus herzustellen. Derartige Salze umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, jene, die aus den folgenden Säuren hergestellt werden: Salzsäuren, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalen-2-sulfonsäure und Benzensulfonsäure. Derartige Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalisalze wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Kalziumsalze der Carboxylsäuregruppe hergestellt werden.
Geeignete Pufferagenzien umfassen: Essigsäure und ein Salz (1-2% W/V); Zitronensäure und ein Salz (1-3% W/V); Borsäure und ein Salz (0,5-205% W/V); und Phosphorsäure und ein Salz (0,8-2% W/V). Geeignete Konservierungsmittel umfassen Benzalkoniumchlorid (0,003-0,03% W/V); Chlorbutanol (0,3-0,9% W/V); Parabene (0,01-0,25% W/V) und Thimerosal (0,004-0,02% W/V).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine wirksame Menge einer immunstimulatorischen Nukleinsäure und optional Antigene und/oder andere therapeutische Agenzien, die optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten sind. Der Begriff pharmazeutisch akzeptabler Träger bedeutet einen oder mehrere kompatible Feststoffe oder Flüssigfüllstoffe, Verdünnungsmittel oder Verkapselungssubstanzen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder an einen anderen Vertrebraten geeignet sind. Der Begriff Träger bezeichnet einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlich oder synthetisch, mit dem der aktive Bestandteil kombiniert ist, um die Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind auch in der Lage, mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung vermischt zu werden in einer Art und Weise, so dass keine Wechselwirkung besteht, die die erwünschte pharmazeutische Wirksamkeit beeinträchtigen würde.
Die für die Erfindung nützlichen immunstimulatorischen Nukleinsäuren können in Mischungen mit zusätzlichem zusätzlichen Adjuvans/Adjuvanzien, anderen Therapeutika oder Antigenen) abgegeben werden. Eine Mischung kann aus mehreren Adjuvanzien zusätzlich zu der immunstimulatorischen Nukleinsäure oder mehreren Antigenen oder anderen Therapeutika bestehen.
Eine Vielzahl von Verabreichungsrouten sind verfügbar. Die spezielle, ausgewählte Art und Weise wird, natürlich, von den speziellen Adjuvanzien oder dem speziellen ausgewählten Antigen abhängen, dem speziell zu behandelnden Zustand und der für eine therapeutisch Wirksamkeit erforderlichen Dosierung. Die Verfahren dieser Erfindung können, allgemein gesprochen, ausgeführt werden unter Verwendung irgendeiner Verabreichungsart, die medizinisch akzeptabel ist, was bedeutet eine jegliche Art eine wirksame Immunantwort ergibt, ohne klinisch inakzeptable nachteilige Wirkungen zu verursachen. Bevorzugte Verabreichungswege sind oben diskutiert.
Die Zusammensetzungen können bequem in einer Einheitsdosierungsform vorliegen und hergestellt werden durch irgendeines der auf dem Gebiet der Pharmazeutik bekannten Verfahren. Alle Verfahren umfassen den Schritt, die Verbindungen mit einem Träger in Kontakt zu bringen, der ein oder mehrere zusätzliche Bestandteile ausbildet. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die Verbindungen gleichförmig und eng mit einem flüssigen Träger, einem fein verteilten festen Träger oder beiden in Kontakt gebracht werden und dann, sofern erforderlich, das Produkt geformt wird. Flüssige Dosiseinheiten sind Glasröhrchen oder Ampullen. Feste Dosiseinheiten sind Tabletten, Kapseln und Suppositorien. Für die Behandlung eines Patienten können, abhängig von der Aktivität der Verbindung, der Art der Verabreichung, dem Ziel der Immunisierung (d. h. prophylaktisch oder therapeutisch), der Art und der Schwere der Erkrankung, Alter und Körpergewicht des Patienten, verschiedene Dosen erforderlich sein. Die Verabreichung einer gegebenen Dosis kann sowohl durch eine einzelne Verabreichung in der Form einer einzelnen Dosiseinheit oder ansonsten durch mehrere kleinere Dosiseinheiten durchgeführt werden. Eine mehrfache Verabreichung von Dosen zu spezifischen Intervallen von Wochen oder Monaten voneinander ist für das Auffrischen der Antigen-spezifischen Antworten üblich.
Andere Abgabesysteme können Systeme zur zeitlichen Freisetzung, verzögerten Freisetzung oder fortgesetzten Freisetzung umfassen. Derartige Systeme können die wiederholte Verabreichungen der Verbindung vermeiden, was für den Patienten und den Arzt angenehmer ist. Viele Arten von Freisetzungsabgabesystemen sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Sie umfassen polymerbasierte Systeme wie beispielsweise Poly(Lactid-Glycolid), Copolyoxalate, Polycaprolactone, Polyesteramide, Polyorthoester, Polyhydroxybuttersäure und Polyanhydride. Mikrokapseln der vorerwähnten Polymere, die Wirkstoffe enthalten, sind, beispielsweise, in US-Patent 5,075,109 beschrieben. Abgabesysteme umfassen auch nicht-Polymersysteme, welche sind: Lipide, einschließlich Sterolen wie beispielsweise Cholesterol, Cholesterolester und Fettsäuren, oder neutrale Fette wie beispielsweise Mono-, Di- und Tri-Glyceride; Hydrogelabgabesysteme; sylastische Systeme; Peptid-basierte Systeme, Wachsbeschichtungen, komprimierte Tabletten unter Verwendung herkömmlicher Binder und Bindemittel; teilweise verschmolzene Implantate; und dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf: (a) Erosionssysteme, bei denen ein Agens der Erfindung in einer Form innerhalb einer Matrix enthalten ist, wie beispielsweise jener, in den US-Patenten 4,452,775, 4,675,189 und 5,736,152 beschrieben ist und (b) Diffusionssysteme, bei denen ein aktiver Bestandteil mit einer gesteuerten Geschwindigkeit aus einem Polymer permeiert, wie beispielsweise in den US-Patenten 3,854,480, 5,133,974 und 5,407,686 beschrieben. Zusätzlich können Pumpenbasierte Hardwareabgabesysteme verwendet werden, von denen einige für die Implantation angepasst sind.
Die vorliegende Erfindung wir weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keinster Weise als weiter beschränkend verstanden werden sollten. Die gesamten Inhalte aller Referenzen (einschließlich Literaturreferenzen), erteilten Patenten, offengelegten Patentanmeldungen und co-anhängigen Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert werden, werden hierin ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen.
BEISPIELE
Materialien und Methoden:
Oligodeoxynukleotide:
Native Phosphodiester- und Phosphothioat-modifizierte ODN wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) und Hybridon Specialty Products (Milford, MA) gekauft. Die ODN wurden auf Endotoxin getestet unter Verwendung des LAL-Tests (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; untere Nachweisgrenze 0,1 EU/ml). Für in vitro Tests wurden ODN in TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA) verdünnt und bei – 20°C gelagert. Für in vivo Verwendung wurden die ODN in Phosphat-gepufferter Saline (0,1 M PBS, pH 7,3) verdünnt und bei 4°C gelagert. Aller Verdünnungen wurden durchgeführt unter Verwendung von pyrogenfreien Reagenzien.
Isolierung von menschlichen PBMC und Zellkultur:
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus peripherem Blut von gesunden Freiwilligen durch Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), wie beschrieben isoliert (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Die Zellen wurden in RPMI 1640-Kulturmedium suspendiert, das mit 10% (V/V) hitzeinaktiviertem (56°C, 1 Stunde) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle von Gibco BRL), Grand Island, NY) suplementiert war (vollständiges Medium). Zellen (Endkonzentration 1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in vollständigem Medium in einem befeuchteten 5% CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. ODN und LPS (aus Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder anti-IgM wurden als Reize verwendet. Für die Messung von lytischer Aktivität von menschlichen NK wurden PBMC bei 5 × 10⁶/Napf in Platten mit 24 Näpfen inkubiert. Die Kulturen wurden nach 24 Stunden geerntet und die Zellen als Effektoren in einem standardmäßigen vierstündigem ⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen K562-Zielzellen wie früher beschrieben (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845) verwendet. Für die B-Zellproliferation wurde ein 1 μ Ci ³H-Thymidin 18 Stunden vor der Ernte hinzugegeben und die Menge an ³H-Thymidineinbau bestimmt durch Scintillationszählen am Tag 5. Standardabweichungen der Dreifachnäpfe waren < 5%.
Flusscytometrie an menschlichen PBMC:
Oberflächenantigene an Primaten-PBMC wurden wie früher beschrieben gefärbt (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920-928). Monoklonale Antikörper gegen CD3 (UCHT1), CD14 (MSEc), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) und CD 86 (2331 [FUN-1]) wurden von Pharmingen, San Diego, CA gekauft. IgG₁,κ (MOPC-21) und IgG_2b,κ (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10) wurden verwendet, um auf nicht-spezifisches Färben zu kontrollieren. NK-Zellen wurden durch CD56 Expression auf CD3-, CD14- und CD19-negativen Zellen identifiziert, wohingegen B-Zellen durch Expression von CD 19 identifiziert wurden. Flusszytometriedaten wurden von 10.000 Zellen pro Probe an einem FACSscan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) aufgenommen. Die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des FSC/SSC-Gates, das für die Analyse verwendet wurde, wurde durch Propidium-Iodidfärbung (2 μg/ml) untersucht und es wurde bestimmt, dass sie größer als 98% war. Die Daten wurden unter Verwendung des Computerprogramms FlowJo (Version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA) analysiert.
Ergebnisse:
Beispiel 1: CpG-abhängige Stimulierung von menschlichen B-Zellen hängt von der Methylierung und der ODN-Länge ab.
Menschliche PBMC wurden von normalen Spendern erhalten und für 5 Tage bei 2 × 10⁵/Napf mit den angegebenen Konzentrationen der angegebenen ODN-Sequenzen inkubiert. Wie in Tabelle F gezeigt proliferieren menschliche PBMCs oberhalb des Hintergrundes, wenn sie mit einer Vielzahl von verschiedenen CpG-ODN kultiviert werden, zeigen aber auch eine gewisse Proliferation selbst mit ODN, die kein CpG-Motiv enthalten. Die Bedeutung von unmethylierten CpG-Motiven bei der Bereitstellung einer optimalen Immunstimulierung mit diesen ODN wird gezeigt durch die Tatsache, dass ODN 1840 (SEQ ID NO. 83) 56.603 ³H-Thymidineinbauzähler induziert, wohingegen das gleiche T-reiche ODN mit den methylierten CpG-Motiven (non-CpG), 1979 (SEQ ID NO. 222), eine niedrigere aber gegenüber dem Hintergrund noch erhöhte Aktivität (nur 18.618 Zähler) bei der gleichen Konzentration von 0,6 μg/ml induzierte. Die verringerte Proliferation bei höheren ODN-Konzentrationen kann ein Artefakt der Zellen sein, die unter diesen experimentellen Bedingungen erschöpft sind, oder könnte eine gewisse Toxizität höherer ODN-Konzentrationen widerspiegeln. Interessanterweise sind kürzere ODN, die CpG-Motive enthalten, wie beispielsweise die 13-14mere 2015 und 2016 weniger stimulatorisch trotz der Tatsache, dass ihre molare Konzentration tatsächlich höher wäre, da die ODNs auf der Grundlage von Massen anstatt von Molarität hinzugegeben wurden. Dies zeigt, dass die ODN-Länge auch eine wichtige Determinante bei den Immuneffekten der ODN sein kann. Ein nicht-CpG-ODN, aber leicht T- reiches ODN (etwa 30% T), 1982 (SEQ ID NO. 225), verursachte nur eine geringe Menge an Hintergrundzellproliferation.
Tabelle F
Die Zahlen stellen cpm von ³H-Thymidineinbau für Kulturen menschlicher PBMCs dar, die oben beschrieben aufgestellt wurden.
Beispiel 2: Konzentrationsabhängige Aktivierung der Aktivität menschlicher NK-Zellen mit Thymidin-reichen ODN.
Menschliche PBMCs wurden für 24 Stunden mit einem Satz unterschiedlicher CpG- oder nicht- CpG ODN bei zwei verschiedenen Konzentrationen kultiviert und dann auf Ihre Fähigkeit hin getestet, NK-Zielzellen abzutöten, wie früher beschrieben (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Das Abtöten wird als lytische Einheiten oder L.U. gemessen. Der bei diesem Versuch verwendete menschliche Spender wies ein Hintergrundniveau von 3,69 L.U. auf, was sich auf 180,36 L.U. erhöhte unter Verwendung der Positivkontrolle IL-2. Ein CpG-Oligo, 2006 (SEQ ID NO. 246) induzierte hohe Titer an lytischer NK-Funktion bei einer niedrigen Konzentration von 0,6 und einen niedrigen Titer bei einer Konzentration von 6,0. Überraschenderweise behielt ein T-reiches ODN, bei dem das CpG-Motiv von 2006 methyliert war (ODN bei 2117 (SEQ. ID. NO. 358)) oder zu GpCs invertiert war (ODN 2137 SEQ ID NO: 886)) eine starke immunstimulatorische Funktion bei den höheren ODN-Konzentrationen bei, wie in Tabelle G gezeigt. Diese konzentrationsabhängigen immunstimulatorischen Wirkungen sind nicht eine allgemeine Eigenschaft des Phosphothioat-Rückgrates, da die unten beschriebenen Experimente zeigten, dass ein Poly-A-ODN nicht über den Hintergrund stimulierend ist. Eine Stimulierung wird beobachtet mit einem-Basen langen ODN, bei dem alle Basenpositionen randomisiert sind, so dass A, C, G und T mit einer Frequenz von 25 % an einer jeden Basenposition auftreten wird (ODN 2182 (SEQ ID NO. 432)). Die stimulatorische Wirkung eines derartigen 24-Basen-ODN wird stark erhöht, wenn es ausschließlich Poly-T ist, wobei in diesem Fall die Stimulierung auch bei der niedrigsten Konzentration von 0,6 μg/ml gesehen wird (ODN 2183 (SEQ ID NO. 433)). Tatsächlich ist die stimulierende Wirkung von ODN SEQ ID NO.: 433 bei dieser niedrigen Konzentration höher als jene von irgendeinem anderen ODN, das bei dieser niedrigen Konzentration getestet wurde, abgesehen von dem optimalen menschlichen immunstimulierenden ODN mit der SEQ ID NO.: 246. Tatsächlich stimulierte die höhere Konzentration von ODN SEQ ID NO.: 433 mehr NK-Aktivität als irgendein anderes Phosphothioat-ODN mit Ausnahme des starken CpG-ODN 2142 (SEQ ID NO.: 890), das geringfügig höher war. Wenn der G-Gehalt von ODN SEQ ID NO. 246 relativ zum T-Gehalt durch Hinzugeben von mehr Gs somit zu einer Abnahme des Anteils von T-Nukleotiden führte, ist die immunstimulatorische Wirkung des ODN verringert (siehe ODN 2132 (SEQ ID NO.: 373)). Der T-Gehalt eines ODN ist somit eine wichtige Determinante für seine immunstimulatorische Wirkung. Obwohl eine Poly-C-ODN von den nicht-C-ODN am stimulierendsten ist, sind auch andere Basen bei der Bestimmung der immunstimulatorischen Wirkung eines nicht-CpG-ODN wichtig. ODN 2131 (SEQ ID NO.: 372), bei dem geringfügig mehr als die Hälfte der Basen T sind, und bei dem keine Gs enthalten sind, ist immunstimulatorisch bei einer Konzentration von 6 μg/ml, weist aber eine geringere Aktivität auf als andere C-reiche ODN. Wenn die 6 As in ODN 2131 (SEQ ID NO.: 372) durch 6 Gs ersetzt sind, kann die immunstimulatorische Wirkung des ODN erhöht werden (siehe ODN 2130 (SEQ ID NO.: 371)).
Tabelle G
Beispiel 3: Induktion von B-Zellproliferation durch T-reiche nicht-CpG-ODN
Um die Fähigkeit von T-reichen ODN zu bewerten, B-Zellproliferation zu aktivieren, wurden PBMCs mit zytoplasmatischem Farbstoff CSFE gefärbt, fünf Tage mit dem angegebenen ODN bei entweder 0,15 oder 0,3 μg/ml inkubiert und dann durch Flusszytometrie analysiert. B-Zellen wurden identifiziert durch Einstellen auf Zellen, die für den Linienmarker CD 19 positiv sind. CpG ODN 2006 war ein starker Induktor für die B-Zellproliferation und diese Wirkung wurde verringert, wenn die CpG-Motive methyliert oder zu GpC invertiert waren, wie in 1 bei einer ODN-Konzentration von 0,3 μg/ml gezeigt. Die Basenzusammensetzung des ODN scheint bei der Bestimmung der immunstimulatorischen Wirkung wichtig zu sein. Die Verringerung des T-Gehaltes eines ODN verringert wesentlich die immunstimulatorische Wirkung, wie durch ODN 2177 (SEQ ID NO. 427) exemplifiziert, bei dem 6 der in ODN 2137 (SEQ ID NO. 886) vorhandenem T zu As geändert wurden, was zu einer stark verringerten immunstimulatorischen Wirkung führte. Die Bedeutung von Ts bei der immunstimulatorischen Wirkung eines ODN wird auch durch den Vergleich von ODN 2116 (SEQ ID NO. 357) und 2181 (SEQ ID NO. 431) gezeigt, die sich hinsichtlich des 3'-Endes des ODN unterscheiden. ODN 2181, bei dem das 3'-Ende Poly-T ist, stimuliert mehr als ODN 2116, bei dem das 3'-Ende Poly-C ist, trotz der Tatsache, dass beide ODN ein TCGTCG am 5'-Ende aufweisen.
Beispiel 4: Durch TG-Oligonukleotide induzierte B-Zellproliferation
Die stimulierenden Wirkungen von TG-Motiven sind in 2 gezeigt. ODN 2137 weist die identische Basenzusammensetzung auf wie ODN 2006, die CG-Motive sind jedoch alle zu GCs invertiert worden, was zu einer CG-freien Nukleinsäure führt. ODN enthält jedoch 6 TG-Dinukleotide. In ODN 2177 sind alle TG-Dinukleotide von ODN 2137 zu AG verändert worden. Obwohl ODN 2177 nur 6 Adenine enthält, ist es tatsächlich nicht-stimulierend bei einer Konzentration von 0,2 μg/ml. Zum Vergleich, ein ODN mit einer Länge von 24 Basen, bei denen eine jede Position randomisiert ist, so dass sie eine der vier Basen ist (ODN 2182), induziert bei einer Konzentration von 0,2 μg/ml > 12 % der B-Zellen zu proliferieren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die stimulierenden Wirkungen von ODN 2137 nicht einfach jene eines Phosphothioatrückgrates sind, sondern mit der Anwesenheit von TG-Dinukleotiden im Zusammenhang stehen.
Um die Wirkung einer sich ändernden Anzahl von TG-Dinukleotidmotiven zu bestimmen, wurden ODN 2200 und ODN 2202 verglichen, wie in 2 gezeigt. Beide ODN enthalten 18 Ts und 6 Gs, in ODN 2200 sind aber alle Gs konsekutiv, so dass dort nur ein TG-Dinukleotid vorhanden ist, wohingegen in ODN 2202 alle Gs als GG-Dinukleotide in dem ODN aufgetrennt sind, so dass dort drei TGs vorhanden sind. ODN 2202 stimuliert signifikant stärker als ODN 2200, was in Übereinstimmung ist mit dem Modell, dass wenigstens drei TG-Motive in einem ODN für eine optimale stimulierende Wirkung erforderlich sind. Es ist wahrscheinlich, dass sogar höhere Ausmaße an Stimulierung erreicht werden könnten, wenn die TG-Motive wie hierin gelehrt, optimiert worden wären.
Beispiel 5: Wirkungen von TTG gegenüber TTG-Motiven
3 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, die durchgeführt wurden, um den TG-Gehalt hinsichtlich der relativen Ausmaße von Ts gegenüber Gs zu studieren, da er mit der stimulierenden Wirkung eines ODN in Zusammenhang steht. Die Figur zeigt, dass ein ODN, bei dem alle Basenpaare so randomisiert sind, dass sie entweder T oder G sind (ODN 2188 (SEQ ID NO. 905)), nicht-stimulierend ist bei einer Konzentration von 0,2 μg/ml, ähnlich einem ODN, bei dem alle Basen so randomisiert sind, dass sie entweder A oder G sind (ODN 2189 (SEQ ID NO. 906)). Bei der höheren Konzentration von 2 μg/m1 ist jedoch das randomisierte T/G ODN 2188 signifikant mehr stimulierend. Das letztere Ausmaß an Stimulierung ist noch niedriger als dasjenige, das bei einem vollständig randomisierten ODN (ODN 2181 (SEQ ID NO. 432)) auftritt. Die stärkste Stimulierung bei niedrigen Konzentrationen wird bei einem ODN beobachtet, bei dem die Hälfte der Basen so festgelegt sind, dass sie T sind, und die andere Hälfte der Basen randomisiert ist, so dass sie entweder T oder G sind (ODN 2190 (SEQ ID NO. 907)). Da eine jede zweite Base fixiert ist, so dass sie ein T ist, können keine TG-Motive auftreten. Die Daten in 3 zeigen, dass der sich erhöhende TG-Gehalt eines ODN dessen stimulierende Wirkung verbessert.
In noch weiteren Experimenten, deren Ergebnisse hierin nicht als Diagramme dargestellt sind, wies ODN 2190 (SEQ ID NO. 907) verglichen mit ODN 2188 (SEQ ID NO. 905) oder ODN 2189 (SEQ ID NO. 906) eine Stimulierung von NK-Aktivität auf.
Beispiele 6–8
Einführung:
Oben wurde gezeigt, dass Poly-T-Sequenzen in der Lage sind, die Stimulierung von B- und NK-Zellen zu erhöhen. Hier und im Folgenden untersuchen wir die Wirkung einer Vielzahl von nicht-CpG-T-reichen ODN ebenso wie poly-C-ODN hinsichtlich ihrer Fähigkeit, menschliche B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten zu stimulieren.
Materialien und Methoden:
Oligonukleotide:
Phosphothioat-modifizierte ODN wurden von ARK Scientific GmbH (Darmstadt, Deutschland) gekauft. Die verwendeten Sequenzen waren: 1982: 5'-tccaggacttctctcaggtt-3' (SEQ ID NO.: 225), 2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO.: 246), 2041: 5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3' (SEQ ID NO.: 282), 2117: 5'-tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3' (SEQ ID NO.: 358), 2137: 5'-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3' (SEQ ID NO.: 886), 2183: 5'-ttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 433), 2194: 5'-ttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 911), 2196: 5'-tttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 913), 5126: 5'-ggttcttttggtccttgtct-3' (SEQ ID NO.: 1058), 5162: 5'-tttttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 1094), 5163: 5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3' (SEQ ID NO.: 1095), 5168: 5'-cccccccccccccccccccccccccccccc-3' (SEQ ID NO.: 1096) und 5169: 5'-cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3' (SEQ ID NO.: 1097). Die meisten ODN wurden hinsichtlich LPS-Gehalt unter Verwendung des LAL-Tests getestet (BioWhittaker, Belgien) (untere Nachweisgrenze 0,1 EU/ml), wie auch hierin beschrieben. Für alle Tests wurden die ODN in TE-Puffer verdünnt und bei –20° C gelagert. Alle Verdünnungen wurden durchgeführt unter Verwendung von Pyrogen-freien Reagenzien.
Zellpräparation und Zellkultur:
Menschliche PBMC wurden aus peripherem Blut von gesunden Freiwilligen isoliert, das vom Deutschen Rote Kreuz (Ratingen, Deutschland) erhalten war, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, aber alle Materialien wurden von Life Technologies, Deutschland gekauft und wurden auf Endotoxin getestet. Für die B-Zell-, NK-Zell- und Monozytenaktivierungstests wurden PBMC in vollständigem Medium bei einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in 200 μl in 96 Rundbodenplatten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C kultiviert. Unterschiedliche ODNs, LPS (Sigma) oder IL-2 (R&D Systems, USA) wurden als Reize verwendet. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen für die Flusszytometrie geerntet.
Flusszytometrie:
MAKs, die für die Färbung von Oberflächenantigenen verwendet wurden, waren: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 und CD86 (alle von Pharmingen/Becton Dickinson, Deutschland, erhalten). Für Monozyten wurden Fc-Rezeptoren unter Verwendung von menschlichem IgG blockiert (Myltenyi, Deutschland), wie früher beschrieben (Bauer, M et al 1999 Immunology 97:699). Flusszytometriedaten von wenigstens 1000 Zellen einer spezifizierten Subpopulation (B-Zellen, Monozyten, NK-Zellen, NKT-Zellen oder T-Zellen) wurden auf einem FACSCalibur (Becton Dickinson) aufgenommen. Die Daten wurden unter Verwendung des Programms CellQuest (Becton Dickinson) analysiert.
NK-vermittelte Zytotoxizität:
PBMC wurden über Nacht mit oder ohne 6 μg/ml ODN oder 100 U/ml IL-2 bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Am nächsten Morgen wurden K-562-Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff, CFSE, markiert, wie früher für menschliche B-Zellen beschrieben (Hartmann, G., und A. M. Krieg. 2000 J. Immunol. 164:944). PBMC wurden in verschiedenen Verhältnissen (50:1, 25:1 und 12,5:1) zu 2 × 10⁵ Zielzellen hinzugegeben und für 4 Std. bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und mit DNA-spezifischem Farbstoff 7-AAD (Pharmingen) zum Nachweis von apoptotischen Zellen inkubiert. Die Ergebnisse wurden durch Flusszytometrie gemessen.
ELISA:
PBMC (3 × 10⁶ Zellen/ml) wurden mit den angegebenen Konzentrationen an ODN oder LPS für 24 Std. (IL-6, IFNγ und TNFα) oder 8 Std. (IL-1β) in Platten mit 48 Näpfen in einer feuchten Atmosphäre bei 37 °C kultiviert. Überstände wurden gesammelt und Zytokine gemessen unter Verwendung von OPTeia ELISA-Kits (Pharmingen) für IL-6, IFNγ und TNFα oder eines Elipair ELISA-Assay (Hoelzel, Deutschland) für IL-1β gemäß den Protokollen der Hersteller.
Beispiel 6: B-Zellaktivierung, die von ODNs induziert wird, denen CpG Motive fehlen
In den oben in Beispiel 3 beschriebenen Experimenten haben wir gezeigt, dass T-reiche ODN in der Lage waren, B-Zellen zu aktivieren. Wir erweitern diese Studien hier unter Verwendung zusätzlicher ODN und verschiedener Zell- und Reagenzienquellen. In einem ersten Satz an Experimenten verglichen wir das Aktivierungspotential verschiedener nicht-CpG T-reicher ODNs mit dem sehr potenten bekannten CpG ODN 2006 (SEQ ID NO: 246). PBMC (2 × 10⁶ Zellen/ml) eines Blutspenders (n = 2) wurden mit den angegebenen Konzentrationen von ODNs 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) und 5162 (SEQ ID NO: 1094) inkubiert. Die Zellen wurden für 48 Std. bei 37 °C wie oben beschrieben inkubiert und mit mAK für CD19 (B-Zellmarker) und CD86 (B-Zellaktivierungsmarker, B7-2) gefärbt. Die Expression wurde unter Verwendung von Flusszytometrie gemessen.
Unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von ODNs zeigten wir (4), dass T-reiche ODNs ohne ein CpG-Motiv die Stimulierung von menschlichen B-Zellen induzieren können. ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058), das nur eine einzelne Poly-T-Sequenz enthält, aber zu mehr als 50 % T ist, verursachte ein hohes Ausmaß an Aktivierung von B-Zellen. Obwohl es einige Ähnlichkeiten mit SEQ ID NO: 246 gibt (z. B. einen Gehalt von mehr als 80 % T/G), fehlt es diesem ODN klar an irgendeinem bekannten immunstimulatorischen CpG-Motiv. Überraschenderweise wurde für alle getesteten T-reichen ODNs der höchste Stimulationsindex bei Konzentrationen zwischen 3 und 10 μg/ml erhalten. Der höchste Stimulationsindex der getesteten ODNs wurde durch das CpG/T-reiche ODN SEQ ID NO: 246 bei 0,4 μg/ml erreicht. Interessanterweise verringerte sich die Aktivität bei höheren Konzentrationen.
Poly-A, poly-C und poly-T-Sequenzen wurden synthetisiert und auf biologische Aktivität getestet. PBMC (2 × 10⁶ Zellen/ml) eines repräsentativen Spenders (n = 3), wurden wie oben beschrieben durch 0,4 μg/ml, 1,0 μg/ml oder 10,0 μg/ml der folgenden ODNs stimuliert: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO: 913) (Poly-T, 18 Basen), 2194 (SEQ ID NO: 911) (Poly-T, 27 Basen), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) (Poly-T, 30 Basen), 5163 (SEQ ID NO.: 1095) (Poly-A, 30 Basen), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) (Poly-C, 30 Basen) und 5169 (SEQ ID NO.: 1097) (Poly-CG, 30 Basen). Die Expression des Aktivierungsmarkers CD86 (B7-2) auf CD 19-positiven B-Zellen wurde durch Flusszytometrie gemessen.
5 zeigte, dass die Länge der Sequenz, wenigstens für Poly-T-ODNs einen wichtigen Einfluss auf seine Aktivität aufweist. Es wurde gezeigt, dass eine Poly-T-Sequenz, die nur 18 Basen enthielt (SEQ ID NO: 913), weniger stimulierend ist als eine mit 27 Basen (SEQ ID NO: 911) oder eine mit 30 Basen (SEQ ID NO: 1094) mit einer klaren Reihenfolge der Stimulierung: SEQ ID NO: 1094>SEQ ID NO: 911>SEQ ID NO: 913. Poly-A- (SEQ ID NO: 1095) oder Poly-CG- (SEQ ID NO: 1097)-Sequenzen induzierten im Gegensatz dazu die Aktivierung von menschlichen B-Zellen nicht. Überraschenderweise wurde auch entdeckt, dass Poly-C-Sequenzen (SEQ ID NO: 1096) menschliche B-Zellen wenigstens bei hohen Konzentrationen (10 μg/ml) aktivieren kann (5).
Zwei andere T-reiche ODNs, nämlich 1982 (SEQ ID NO: 225) und 2041 (SEQ ID NO: 282), denen CpG-Motive fehlten, wurden auf ihre Wirkung auf menschliche B-Zellen getestet. PBMC (n = 2) wurden mit den angegebenen Konzentrationen von ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO: 225) und 2041 (SEQ ID NO: 282) wie oben beschrieben inkubiert. B-Zellaktivierung (Expression des Aktivierungsmarkers CD86) wurde durch Flusszytometrie gemessen.
6 zeigt, dass T-reiche nicht-CpG ODN bei Konzentrationen von mehr als 1 μg/ml immunstimulatorisch sind. Der Einbau eines CpG-Motivs in 1982 erhöhte die immunstimulatorische Aktivität. Die Verlängerung mit einer Poly-T-Sequenz erhöhte die immunstimulatorische Aktivität dieses bereits T-reichen ODN nicht, sondern verringerte das Aktivierungspotential geringfügig.
Beispiel 7: Immunstimulierung von nicht-CpG-ODNs spiegelt sich in der Verstärkung von NK-Aktivierung, NK-Zytotoxizität und Monozytenaktivierung wider
NK-Zellen ebenso wie Monozyten wurden auf ihre Reaktion auf nicht-CpG ODNs getestet. PBMC (2 × 10⁶ Zellen/ml) wurden mit 6 μg/ml der folgenden ODNs (n = 4) inkubiert: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) und 5126 (SEQ ID NO.: 1058). Nach 24-stündiger Kultivierung bei 37 °C wurden Zellen geerntet und mit mAK für CD3 (T-Zellmarker), CD56 (NK-Zellmarker) und CD69 (früher Aktivierungsmarker) wie oben beschrieben gefärbt. Die Expression von CD69 auf CD56-positiven NK-Zellen wurde durch Flusszytometrie gemessen.
7 zeigt, dass für Poly-T-ODNs ähnliche Wirkungen wie in 5 beschrieben beobachtet werden können. Die Stimulierung von NK-Zellen, ähnlich wie B-Zellen, kann durch die Länge der ODN beeinflusst werden. ODN 2183 (SEQ ID NO: 433) (21 Basen) induzierte die Aktivierung von NK-Zellen, aber in einem geringeren Umfang als das längere ODN 2194 (SEQ ID NO: 911) (27 Basen), wie durch die erhöhte Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 gemessen. Es wurde auch gezeigt, dass ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058) menschliche NK-Zellen aktiviert (7).
Man nimmt an, dass die Anti-Tumoraktivität von CpG ODNs durch die Fähigkeit des ODN bewertet werden kann, NK-vermittelte Zytotoxizität in vitro zu erhöhen. Es wurde gezeigt, dass ODNs, die am 5'- und 3'-Ende Bereiche aus Poly-G enthalten, zu der höchsten Induktion von Zytotoxizität führten (Ballas, Z. K., et al. 1996 J. Immunol. 157:1840). Um den Einfluss von nicht-CpG-T-reichen ODN auf NK-Zytotoxizität zu untersuchen, analysierten wir die Wirkung der ODNs 2194 (SEQ ID NO: 911) und 5126 (SEQ ID NO: 1058) auf NK-vermittelte Lyse (8). NK-vermittelte Lyse von K-562-Zielzellen wurde gemessen nach Über-Nacht-Inkubation von PBMC mit 6 μg/ml des ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), SEQ ID NO: 911 (SEQ ID NO: 911) (Poly-T, 27 Basen) und 5126 (SEQ ID NO: 1058), wie oben beschrieben. SEQ ID NO: 1058 zeigte eine geringe Erhöhung der Lyse durch menschliche NK-Zellen verglichen mit keiner ODN. SEQ ID NO: 911 und SEQ ID NO: 246 erhöhten die Zytotoxizität von menschlichen NK-Zellen in einem sogar größeren Umfang.
Frühere Berichte zeigten, dass nicht nur NK-Zellen, sondern auch NKT-Zellen Mediatoren für zytotoxische Antworten auf Tumorzellen sind (14). Deshalb betrachteten wir die potentielle Aktivierung von menschlichen NKT-Zellen durch T-reiche nicht-CpG ODN. PBMC von einem repräsentativen Spender (n = 2) wurden mit 6 μg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 913) und 5126 (SEQ ID NO.: 1058) für 24 Std. wie oben beschrieben inkubiert. Die Aktivierung von NK-Zellen wurde durch Flusszytometrie nach Färben der Zellen mit mAK für CD3 (T-Zellmarker), CD56 (NK-Zellmarker) und CD69 (früher Aktivierungsmarker) gemessen. Es ist die Expression von CD69 auf CD3- und CD56-doppelt-positiven Zellen gezeigt (NKT-Zellen).
In 9 fand man, dass sowohl SEQ ID NO: 911 ebenso wie SEQ ID NO: 1058 NKT-Zellen stimulierte. Ähnlich wie NK-Zellen war SEQ ID NO: 911 (Poly-T) aktiver als SEQ ID NO: 1058. Zusätzlich, wie oben für B-Zellen und NK-Zellen beschrieben, hat die Länge der ODN einen gewissen Einfluss auf das immunstimulatorische Potential, wobei die längeren ODN stärkere Wirkungen auf NKT-Zellen aufweisen. Ähnliche Ergebnisse wurden für menschliche T-Zellen beobachtet.
Eine andere Art von Zellen des Immunsystems, die bei der Bekämpfung von Infektionen beteiligt ist, sind Monozyten. Diese Zellen setzen nach Aktivierung eine Vielzahl von Zytokinen frei und können zu dendritischen Zellen (DC), professionellen Antigenpräsentierende Zellen reifen (Roitt, I., J. Brostoff, und D. Male. 1998. Immunology. Mosby, London). 10 zeigt die Aktivierung von menschlichen Monozyten nach Kultivierung von PBMC mit unterschiedlichen ODNs. PBMC (2 × 10⁶ Zellen/ml) wurden mit 6 μg/ml 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2178 (SEQ ID NO.:1096), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) und 5163 (SEQ ID NO.: 1095) über Nacht bei 37 °C wie oben beschrieben inkubiert (n = 3). Die Zellen wurden geerntet und auf CD14 (Monozytenmarker) und CD80 (B7-1, Aktivierungsmarker) gefärbt. Die Expression wurde durch Flusszytometrie gemessen.
Wie oben für NK- und B-Zellen gezeigt, induzieren T-reiche Sequenzen (z. B. SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 911) mit unterschiedlicher Länge Monozytenstimulierung, weisen jedoch einen Unterschied im Aktivitätsumfang auf, z. B. SEQ ID NO: 433 > SEQ ID NO: 911. Poly-A- (SEQ ID NO: 1095) ebenso wie poly-C- (SEQ ID NO: 1096 (2178) Sequenzen führten im Gegensatz dazu zu keiner Aktivierung von Monozyten (gemessen durch die Hochregulierung von CD80 bei einer Konzentration von 6 μg/ml ODN).
Beispiel 8: Induktion von Cytokinfreisetzung durch nicht-CpG-ODNs
Als nächstes wurde die Fähigkeit verschiedener T-reicher ODNs untersucht, das Cytokinmillieu zu beeinflussen. RBMC (3 × 10⁶ Zellen/ml) wurden für 24 Std. mit oder ohne 6 μg/ml der angegebenen ODNs oder 1 μg/ml LPS als Positivkontrolle (n =2) kultiviert. Nach Inkubation wurden die Überstände gesammelt und TNFα durch ELISA wie oben beschrieben gemessen und die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. PBMC wurden mit den angegebenen ODNs (1.0 μg/ml) wie in 11 beschrieben kultiviert und IL-6 wurde in den Überständen durch ELISA gemessen und die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
11 und 12 zeigen, dass T-reiche nicht-CpG- und T-reiche/CpG-ODNs die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-6 induzieren können. Für beide Zytokine wurde festgestellt, dass ODN 5126 (SEQ ID NO.:1058) in den meisten Tests so potent ist wie ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911). Es ist bekannt, dass CpG ODNs das Th1/Th2 Gleichgewicht beeinflussen, in dem bevorzugterweise Th1-Zytokine induziert werden (Krieg, A. M., 1999 Biochemica el Biophysica Acta 93321: 1). Um zu testen, ob T-reiche ODN eine ähnliche Verschiebung zu Th1-Zytokinen bedingten, wurde die IFNγ-Produktion in PBMC gemessen. In einem ersten Satz von Experimenten wurde gezeigt, dass, wie für IL-6 und TNFα beschrieben, die ODNs mit SEQ ID NO.:1058 und SEQ ID NO.: 911 die Freisetzung vergleichbarer Mengen dieses Th1-Zytokins IFNγ induzierten. Zusätzlich wurde gezeigt, dass ein anderes proinflammatorisches Zytokin, IL-1β, nach Kultur von PBMC mit diesen zwei ODNs freigesetzt wurde. Obwohl die Mengen dieser durch das T-reiche ODN induzierten Zytokine, dem CpG-Motive fehlen, geringer war als wenn CpG-ODN SEQ ID NO.: 246 verwendet wurde, waren die durch T-reiche ODN induzierten Mengen signifikant höher als die Kontrolle.
Beispiele 9–11
Einführung:
Ein optimales CpG-Motiv für die Immunsystemaktivierung bei Nicht-Nagetiervertebraten ist hierin beschrieben. Man hat festgestellt, dass ein dieses Motiv enthaltende Phosphodiester Oligonukleotid stark die CD86-, CD40-, CD54- und MHC II-Expression, IL-6-Synthese und die Proliferation von primären humanen B-Zellen stimulierte. Diese Wirkungen erfordern die Internalisierung des Oligonukleotids und endosomale Reifung. Dieses CpG-Motiv war mit der anhaltenden Induktion des NF_κB p50/p65-Heterodimers und des transkripionsfaktorkomplexaktivierenden Proteins-1 (AP-1) verbunden. Der Transkriptionsfaktoraktivierung durch CpG-DNA ging die erhöhte Phosphorylierung der Stresskinasen c-jun NH₂-terminalen Kinase (JNK) und p38 und des aktivierenden Transkriptionsfaktors-2 (ATF-2) voraus. Im Gegensatz zu CpG führte die Signalübertragung durch den B-Zellrezeptor zur Aktivierung der extrazellulären Rezeptorkinase (ERK) und zur Phosphorylierung einer anderen Isoform von JNK.
Materialien und Methoden:
Oligodeoxynukleotide:
Unmodifizierte (Phosphodiester, PE) und modifizierte Nukleaseresistente (Phosphothioate, PS) ODN wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) und Hybridon Specialty Products (Milford, MA) gekauft. Die verwendeten Sequenzen sind in Tabelle H angegeben. E.coli-DNA und Kalbsthymus-DNA wurden von Sigma Chemical Co., St. Lous, MO gekauft. Genomische DNA-Proben wurden durch Extraktion mit Phenol-Chlofoform-Isoamyl-Alkohol (25/24/1) und Ethanol-Prezipitation gereinigt. DNA wurde von Endotoxin gereinigt durch wiederholte Extraktion mit Triton x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und auf Endotoxin getestet unter Verwendung des LAL-Tests (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; untere Nachweisgrenze 0,1 EU/ml) und des hochempfindlichen Tests für Endotoxin, der früher beschrieben wurde (untere Nachweisgrenze 0,0014 EU/ml) (Hartmann G. und Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Therapy 6: 893). Der Endotoxin-Gehalt von DNA-Proben war unter 0,0014 U/ml. E.coli- und Kalbsthymus-DNA wurden vor der Verwendung einzelsträngig gemacht durch Kochen für 10 Minuten, gefolgt von Abkühlen auf Eis für 5 Minuten. DNA-Proben wurden in TE-Puffer unter Verwendung von Pyrogen-freien Reagenzien verdünnt.
Tabelle H: Verwendeter Satz von Olinukleotiden¹
Zellpräparation und Zellkultur:
Menschliche mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) wurden aus peripherem Blut von gesunden Freiwilligen durch Ficoll-Paque Dichtegradientenzentrifugation isoliert (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), wie beschrieben (Hartmann G. et al. 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 291)). Zellen wurden in RPMI 1640-Kulturmedium suspendiert, so dass mit 10 % (V/V)-hitzeinaktiviertem (56 °C, 1 Std.) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle von Gibco BRL, Grand Island, NY) supplementiert war (vollständiges Medium). Alle Verbindungen wurden endotoxin-getestet gekauft. Die Lebensfähigkeit wurde vor und nach Inkubation mit ODN durch Trypanblauausschluss (herkömmliche Mikroskopie) oder durch Propidiumiodausschluss (flusszytometrisch Analyse) bestimmt. Bei allen Experimenten waren 96 % bis 99 % der PBMC lebensfähig. Zellen (Endkonzentration 1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in vollständigem Medium in einem befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Unterschiedliche Oligonukleotide (siehe Tabelle I, Konzentrationen wie in den Figurenlegenden angegeben), LPS (von Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder Anti-IgM wurden als Reize verwendet. Chloroquin (5 μg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde verwendet, um die endosomale Reifung/Acidifizierung zu blockieren. Zu den gegebenen Zeitpunkten wurden Zellen für die Flusszytometrie geerntet, wie unten beschrieben.
Für die Signaltransduktionsstudien wurden menschliche primäre B-Zellen durch immunmagnetisches Zellsortieren unter Verwendung der VARIOMACS-Technik (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) wie vom Hersteller beschrieben isoliert. Kurzgesagt wurden PBMC, die von buffy coats von gesunden Blutspendern erhalten waren (Elmer L. DeGowin Blood Center, University of Iowa) mit einem Mikrokugel-konjugierten Antikörper gegen CD19 inkubiert und über eine positive Selektionssäule geführt. Die Reinheit der B-Zellen war größer als 95 %. Nach Stimulierung wurden Ganzzellextrakte (Western Blot) und Zellextrakte (EMSA) für Signaltransduktionsstudien präpariert.
Für CpG Bindungsproteinstudien wurden Ramos-Zellen (menschliche Burkitt-Lymphom B-Zelllinie, ATTC CRL-1923 oder CRL-1596; Intervirologie 5: 319-334, 1975) in vollständigem Medium angezogen. Unbehandelte Zellen wurden geerntet und zytosolische Proteinextrakte hergestellt und auf die Anwesenheit von CpG-Oligonukleotid-bindenden Proteinen durch EMSA und UV-Quervernetzung wie unten beschrieben analysiert.
Flusszytometrie:
Das Färben von Oberflächenantigenen wurde durchgeführt wie früher beschrieben (Hartmann G. et al. 1998 J Pharmacol Exp Ther 285:920). Monoklonale Antikörper gegen HLA-DR wurden von Immunotech, Marseille, Frankreich gekauft. Alle anderen Antikörper wurden von Pharmingen, San Diego, CA gekauft: mAKs gegen CD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 (FUN-1)). IgG_I,K, (MOPC-21) und IgG_2b,K wurden als Kontrolle für spezifisches Färben verwendet. Intrazelluläres Zytokinfärben auf IL-6 wurde wie beschrieben durchgeführt (Hartmann G., und Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Therapy 6:893). Kurz gesagt wurden PBMC (Endkonzentration 1 × 10⁶ Zellen/ml) in Gegenwart von Brefeldin A (Endkonzentration 1 μg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen geerntet und unter Verwendung eines FITC-markierten mAB gegen CD19 (B43), eines PE-markierten Ratte-anti-humanes IL-6-mAK (MQ2-6A3, Pharmingen) gefärbt und der Fix und Perm Kit (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) gefärbt. Flusszytometriedaten von 5.000 Zellen pro Probe wurden auf einem FACScan erhalten (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Nicht-lebensfähige Zellen wurden aus der Analyse durch Propidiumiodidfärbung (2 μg/ml) ausgeschlossen. Die Daten wurden unter Verwendung des Computerprogramms FlowJo (Version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA) analysiert.
Proliferationstest:
CFSE (5-(und-6-)Carboxyfluoreszeindiacetatsuccinimidylester, Molecular Probes, USA) ist eine Fluoreszein-abgeleitete intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung, die in gleichem Maße zwischen Tochterzellen nach Zellteilung aufgeteilt wird. Das Färben von Zellen mit CFSE erlaubt sowohl die Quantifizierung als auch das Immunophänotypisieren (Phycoerythrin-markierte Antikörper) von proliferierenden Zellen in einer Suspension aus gemischten Zellen. Kurz gesagt wurden PBMC zweifach in PBS gewaschen, in PBS, das CFSE mit einer Endkonzentration von 5 μM enthielt, resuspendiert und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und für 5 Tage wie in den Figurenlegenden angegeben inkubiert. Proliferierende CD19-positive G-Zellen wurden durch Verringerung des CFSE-Gehaltes unter Verwendung von Flusszytometrie identifiziert.
Herstellung von Ganzzell-, Zellkern- und Zytosolproteinextrakten
Für die Western Blot-Analyse wurden Ganzzellextrakte hergestellt. Primäre B-Zellen wurden mit Medium, den Phosphodiester-Oligonukleotiden 2080 (SEQ ID NO.: 321) oder 2078 (SEQ ID NO.: 319) bei 30 μg/ml oder anti-IgM (10 μg/ml) behandelt. Die Zellen wurden geerntet, zweifach mit eiskalten PBS gewaschen, das 1 mM Na₃VO₄ enthielt, in Lysepuffer resuspendiert (150 mM NaCl, 10 mM TRIS pH 7,4, 1% NP40, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 30 mg/ml Leupeptin, 50 mg/ml Aprotinin, 5 mg/ml Antipain, 5 mg/ml Pepstatin, 50 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)), für 15 Minuten auf Eis inkubiert und bei 14.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bis –80° C eingefroren. Für die Herstellung von Zellextrakten wurden primäre B-Zellen in hypotonischem Puffer resuspendiert (10 mM HEPES/KOH (pH 7,9), 10 mM KCl, 0,05 % NP40, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 mM PMSF, 30 mg/ml Leupeptin, 50 mg/ml Aprotinin, 5 mg/ml Antipain, 5 mg/ml Pepstatin). Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurde die Suspension bei 1000 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Zellkerne wurden in Extraktionspuffer (20 mM HEPES (pH 7,9), 450 mM NaCl, 50 mM NaF, 20% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 30 mg/ml Leupeptin, 50 mg/ml Aprotinin, 5 mg/ml Antipain, 5 mg/ml Pepstatin) resuspendiert und auf Eis für eine Stunde inkubiert. Die nukleäre Suspension wurde für 10 Minuten bei 16.000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekühlt und bei –80°C gelagert. Zytosolextrakte für die CpG-Bindungsproteinstudien wurden aus unstimulierten Ramos-Zellen hergestellt, die mit hypotonischem Puffer wie oben für die Herstellung der Zellkernextrakte beschrieben, lysiert wurden. Nach Zentrifugation wurde der Überstand als Zytoplasmafraktion entfernt und bei –80°C gelagert. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bradford-Proteintests (Bio-Rad, Hercules, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Western Blot-Analyse:
Gleiche Konzentrationen an Ganzzellproteinextrakten (25 μg/Spur) wurden in SDS-Probenpuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8; 1% β-Mercaptoethanol; 2% SDS; 0,1 % Bromphenolblau; 10% Glycerin) für 4 Minuten gekocht, bevor sie einer Elektrophorese in einem 10% Polyacrylamidgel unterzogen wurden, das 0,1 % SDS enthielt (SDS-PAGE). Nach Elektrophorese wurden die Proteine auf Immobilion-P-Transfermembranen (Millipore Corp. Bedford, MA) übertragen. Die Blots wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch blockiert. Spezifische Antikörper geben die phosphorylierte Form von extrazellulärer Rezeptorkinase (ERK), c-jun NH2-terminaler Kinase (JNK), p 38 und aktivierenden Transkriptionsfaktor-2 (ATF-2) wurden verwendet (New England BioLabs, Beverly, MA). Die Blots wurden in verstärktem Chemilumineszenzreagenz (ECL; Amersham International, Aylesbury, UK) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren entwickelt.
Electrophoretischer Mobilitätsverschiebungtest (EMSA):
Um die DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktoraktivierungsproteins-1 (AP-1) und NF_ΚB, nachzuweisen, wurden Zellkernextrakte (1 μg/Spur) durch EMSA unter Verwendung der dsODNs 5' GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3' (SEQ ID NO.: 838), die die AP-1-Bindungssequenz enthielten, und der NF_ΚB URE von der c-myc-Promotorregion 5' TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3' (SEQ ID NO.: 1142) als Sonden analysiert. ODNs wurden mit T4-Polynukeotidkinase (New England Biolabs) und (γ-³²P)-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) endmarkiert. Bindungsreaktionen wurden mit 1 μg Zellkernproteinextrakt in DNA-bindenden Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40 mM MgCl₂, 20 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 8% Glycerol und 100–400 ng Poly(dI-dC) mit 20.000-40.000 cpm markierten ODN in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt. Die Spezifität der NF_ΚB-Banden wurde durch Kompetitionsstudien mit kalten Oligonukleotiden von nichtverwandten Transkriptionsbindungsstellen (10 – 100 ng) bestätigt. Für den Superverschiebungstest wurden 2 μg spezifische Antikörper für c-Rel, p50 und p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) in die Reaktionsmischung für 30 Minuten hinzugegeben, bevor die radiomarkierte Sonde hinzugegeben wurde. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde Beladungspuffer hinzugegeben und die Sonden auf einem 6% Polyacrylamidgel in Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer (90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,0) elektrophoretisiert. Die Gele wurden getrocknet und dann autoradiographiert.
UV-Quervernetzung und denaturierende Proteinelektrophorese:
Zellkernextrakte wurden mit markiertem Phosphordiesteroligonukleotid inkubiert, wie für die EMSA beschrieben. DNA-Protein-Komplexe wurden mit UV-Licht in einem Stratalinker (Stratagene) für 10 Minuten quervernetzt. Die Sonden wurden mit SDS-Probenpuffer gemischt, für 10 Minuten gekocht und auf ein 7,5% SDS-PAGE geladen. Das Gel wurde auf einem Whatman-Papier getrocknet und autoradiographiert. Das Auftragen der Entfernung gegen das Molekulargewicht der Markerproteine ergab eine Standardkurve, die verwendet wurde, um das ungefähre Molekulargewicht der quervernetzten Protein-ODN-Komplexe zu berechnen. Das Molekulargewicht der Oligonukleotide wurde von diesem Wert abgezogen, um die Größe zu ergeben.
Beispiel 9: Identifizierung eines optimalen CpG-Motivs zur Verwendung alleine oder in Kombination mit einem T-reichen ODN.
Phosphothioatoligonukleotide, die das murine CpG-Motif GACGTT (SEQ. ID. NO: 1143) (z. B. 1826 (SEQ ID NO.: 69)) enthielten und bei Konzentrationen verwendet wurden, die aktiv waren bei murinen B-Zellen, zeigten eine geringe oder keine immunstimulatorische Aktivität bei menschlichen Immunzellen (Yi A. K., Chang M., Peckham D. W., Krieg A. M., and Ashman R. F. 1998. CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J Immunol 160:5898). Man stellte fest, dass bei höheren Konzentrationen dieses ODN eine gewisse stimulatorische Wirkung auf menschliche B-Zellen zeigte.
In früheren Studien betreffend B-Zellaktivierung bei Mäusen hat man festgestellt, dass ein CpG-Dinukleotid, das von zwei 5'-Purinen und und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist und bevorzugterweise das 6mer-Motiv 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 1143) enthält, für ein Phosphodiesteroligonukleotid optimal war, um aktiv zu sein (Krieg A. M., et al. 1995 Nature 374: 546, Yi A. K., Chang M., et al.. 1998 J Immunol 160: 5898).
Um ein optimales Motiv für die Stimulierung einer Immunantwort beim Menschen und Nicht-Nagetiervertebraten zu identifizieren, konstruierten wir eine Reihe von ODN und testeten ihre Aktivität. Zuerst konstruierten wir ein 20mer Phosphodiesteroligonukleotid mit einem TC-Dinukleotid am 5'-Ende vor dem optimalen murinen CPG-Motiv 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 1143) und gefolgt von einem Poly-C-Schwanz (2079: 5' TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3' (SEQ ID NO: 320)). Man hat festgestellt, dass dieses Oligonukleotid, wenn es zu primären menschlichen B-Zellen unter den gleichen Bedingungen hinzugegeben wurde, die für E. coli-DNA optimal sind (wiederholtes Zugeben bei 0 Stunden, 4 Stunden und 18 Stunden; 30 μg/ml zu jedem Zeitpunkt), nach zwei Tagen ein hohes Maß an CD86 Expression auf primären menschlichen P-Zellen stimulierte. Um die Struktur-Funktions-Beziehung der CpG-Motive zu bestimmen, wurden die Basen benachbart den CpG-Dinukleotiden ersetzt, während die zwei CpG-Dinukleotide innerhalb der Sequenz beibehalten wurden. Ein Austausch des Adenins, das zwischen beiden CpG-Dinukleotiden angeordnet war, durch Thymidin (2080 (SEQ ID NO: 321)) führte zu einer geringfügig erhöhten Aktivität. Das Ersetzen durch Guanosin (2100 (SEQ ID NO: 341)) oder Cytidin (2082 (SEQ ID NO: 323)) an dieser Position zeigte keine wesentlichen Änderungen verglichen mit 2079 (SEQ ID NO: 320). Im Gegensatz dazu führte der Austausch des Thymidins 3' zu dem zweiten CpG-Dinukleotid durch die Purine Guanosin (2099 (SEQ ID NO: 340)) oder Adenin (2083 (SEQ ID NO: 324)) zu einem erheblichen Absinken der Aktivität des Oligonukleotids, während das Pyrimidin Cytidin nur eine geringfügige Abnahme bedingte. Das Thymidin unmittelbar 5' zu dem erste CpG-Dinukleotid war ebenfalls wichtig. Das Ersetzen das Thymidins durch eine andere Base (2105 (SEQ ID NO: 346)), Guanosin; 2107 (SEQ ID NO: 348), Adenin; 2104 (SEQ ID NO: 345), Cytidin) führte zu einer ausgeprägten Verringerung der Aktivität des Oligonukleotids. Die Beseitigung des ersten (2108 (SEQ ID NO: 349)) oder zweiten (2106 (SEQ ID NO: 347)) CpG-Dinukleotids verringerte ebenfalls teilweise die Aktivität.
Das Hinzugeben von mehreren 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144)-CpG-Motiven zu dem Phosphodiesteroligonukleotid, das das 8mer-Duplex-CpG-Motiv (5' TCGTCGTT 3'(SEQ ID NO: 1145), 2080 (SEQ ID NO: 321)) enthielt, erhöhte die CD86-Expression auf B-Zellen nicht weiter (2059 (SEQ ID NO: 300)). Ein Oligonukleotid mit der gleichen Sequenz wie 2080 (SEQ ID NO: 321), aber mit einem Phosphothioatrückgrat, zeigte keine Aktivität über dem Hintergrund (2116 (SEQ ID NO: 357)). Dies war überraschend, da das Phosphothioatrückgrat Oligonukleotide stark stabilisieren und die CpG-induzierte Stimulierung erhöhen soll (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A. und Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374: 546). Wir führten daher weitere Struktur-Funktionsanalysen von Phosphothioatoligonukleotiden durch, die die 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144) und 5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145)-Motive enthielten, die zeigten, dass zusätzliche CpG-Motive (2006 (SEQ ID NO: 246)) dazu neigten, die Aktivität von Phosphothioatoligonukleotiden zu erhöhen.
Gereinigte B-Zellen, die aus peripherem Blut durch immunmagnetisches Zellsortieren isoliert wurden, wurden durch CpG-DNA im gleichen Umfang aktiviert wie ungereinigte B-Zellen in PBMC. Die Aktivierung von B-Zellen ist somit eine primäre Antwort und keine Sekundärwirkung, die durch von anderen Zellen sekretierte Zytokine verursacht wird.
Zusätzlich zu dem co-stimulierenden Molekül CD86 ist der funktionale Zustand von B-Zellen durch andere Oberflächenmarker gekennzeichnet. Beispielsweise stimulieren aktiviert T-Helferzellen B-Zellen durch CD40-Ligation, das interzelluläre Adhesionsmolekül-1 (ICAM-1, CD54) vermittelt das Binden an andere Immunzellen und der Histokompatibilitätskomplex II (MHC II) ist für die Antigenpräsentation verantwortlich. Wir haben gefunden, dass die B-Zellexpression von CD40, CD54 und MHC II durch das CpG-Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321) hochreguliert wurde. Das Nicht-CpG-Kontrolloligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) zeigte keine Aktivität verglichen mit dem Medium alleine.
Wenn PBMC für fünf Tage in Gegenwart von 2080 (SEQ ID NO: 321) (hinzugegeben bei 0 Stunden, 4 Stunden, 18 Stunden und jedem nachfolgenden Morgen) inkubiert wurden, war es verblüffend festzustellen, dass eine Subpopulation von Lymphozyten eine größere Zellgröße aufwiesen (FSC) und stärker granulär war (SSC). Um zu untersuchen, ob diese Subpopulation proliferierende B-Zellen darstellt, färbten wir frisch isolierte PBMC mit CFSE (5-(und -6-) Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester) am Tag 0 und inkubierten sie für 5 Tage mit 2080 (SEQ ID NO: 321) wie oben. CFSE ist ein Fluoreszenzmolekül, das irreversibel an Zellproteine bindet. Eine jede Zellteilung verringert die CFSE-Färbung um 50 %. Man hat festgestellt, dass Zellen, die sich nur schwach mit CFSE färbten (proliferierende Zellen), überwiegend CD19-positive B-Zellen waren. Das Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321) induzierte 60 bis 70 % der CD 19-positiven B-Zellen innerhalb von 5 Tage zu proliferieren. Das Kontrolloligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) induzierte weniger als 5 % der B-Zellen zu proliferieren. Proliferierende B-Zellen (niedriges CFSE) zeigten eine größere Zellgröße (FSC) und eine erhöhte Granularität.
Proliferierende B-Zellen exprimierten höhere Titer an CD86 als nicht-proliferierende Zellen (nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit dieser Feststellung führte der oben auf Induktion von CD86-Expression getestete Oligonukleotidsatz zu einem fast identischen Muster an B-Zellproliferation. Das Ersetzen des 3'-Thymidins verringerte die Aktivität mehr als das Verändern des Thymidins in der mittleren Position.
Beispiel 10: B-Zellaktivierung erfordert endosomale Reifung/Acidifizierung
Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass Chloroquin, ein Inhibitor der endosomalen Acidifizierung, CpG-vermittelte Stimulierung von Zellen, die murines Antigen präsentierten, und B-Zellen blockiert, wohingegen LPS-vermittelte Wirkungen nicht beeinflusst wurden (Hacker H., et al 1998 Embo J 17: 6230, Yi A. K. et al 1998 J Immunol 160: 4755, Macfarlane D. E. und Manzel L. 1998 Immunol 160: 1122). Wir haben festgestellt, dass das Hinzugeben von 5 μg/ml Chloroquin vollständig die CpG-DNA-vermittelte Induktion von CD86-Expression auf primären B-Zellen blockierte (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO: 246), 4,7 vs 1,4; E. coli-DNA, 3,4 vs 1,4; nur Medium, 0,9; n = 4). Darüber hinaus inhibierte Chloroquin vollständig die Induktion von B-Zellproliferation durch das Phosphorthioatoligonukleotid 2006 (SEQ ID NO: 246), was mit dem CFSE-Proliferationstest ebenso wie mit dem Standard gemessen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass wie bei murinen Zellen die Aktivierung von menschlichen B-Zellen durch CpG-DNA die Aufnahme von DNA in Endosomen und nachfolgend endosomale Acidifizierung erforderlich macht.
Beispiel 11: Analyse von subzellulären Ereignissen, die sich aus der Stimulierung von menschlichen B-Zellen mit optimalem menschlichen ODN ergeben.
Da sich das CpG-Motiv-Erfordernis für eine maximale B-Zellaktivierung erheblich zwischen Maus (GACGTT) (SEQ ID NO: 1143) und Menschen (TCGTCGTT) (SEQ ID NO: 1145) unterscheidet, waren wir daran interessiert, ob die grundlegenden intrazellulären Signalübertragungsereignisse vergleichbar sind. Eine schnelle Induktion von NF_κB-Bindungsaktivität ist früher bei murinen B-Zellen und Makrophagen festgestellt worden (Stacey K. J., et al 1996 J Immunol 157: 2116, Yi A. K et al 1998 J Immunol 160: 4755). Um die NFκB-Antwon auf CpG-DNA beim Menschen zu testen, wurden menschliche primäre B-Zellen aus peripherem Blut durch immunmagnetisches Zellsonieren isoliert und mit CpG-Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321), dem Nicht-CpG-Kontrolloligonuleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) oder Medium inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Zellen geerntet und Zellkernextrakte hergestellt. In Gegenwart von CpG-Oligonukleotid war die NFκB-Bindungsaktivität innerhalb einer Stunde erhöht und wurde bis zu 18 Stunden (letzter untersuchter Zeitpunkt) aufrechterhalten. Das Nicht-CpG-Kontrolloligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) zeigte keine erhöhte NFκB-Aktivität verglichen mit Zellen, die nur mit Medium inkubiert wurden. Die NFκB-Bande wurde durch kalte Kompetition identifiziert und es wurde im Supershifttest gezeigt, dass sie aus p50- und p65-Untereinheiten besteht.
Der Aktivierungsprotein-1 (AP-1)-Transkriptionsfaktor ist an der Regulation von unmittelbaren frühen Genen und Zytokin-Expression beteiligt (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270: 16483). Bei murinen B-Zellen wird die AP-1-bindende Aktivität in Reaktion auf CpG-DNA induziert (Yi A. K. und Krieg A. M. 1998. Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J Immunol 161: 4493). Um zu bestimmen, ob dieser Transkriptionsfaktor auch von CpG-DNA beim Menschen induziert werden würde, untersuchten wir AP-1-DNA-Bindungsaktivität in primären menschlichen B-Zellen. Die Zellen wurden mit dem CpG-Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321) oder dem Kontrolloligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) inkubiert. Zellkernextrakte wurden hergestellt und die AP-1-Bindungsaktivität wurde durch EMSA analysiert. AP-1-Bindungsaktivität wurde innerhalb einer Stunde verstärkt und erhöhten sich bis zu 18 Stunden (letzter untersuchter Zeitpunkt), was eine nachhaltige Antwort zeigt.
Da AP-1-Aktivität durch viele Reize induziert wird (Angel P. und Karin M. 1991. The rote of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochem Biophys Acta 1072: 129) waren wir an den Signalübertragungswegen oberhalb von AP-1 interessiert. Der AP-1-Transkriptionsfaktorkomplex integriert verschiedene Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Wege (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 270: 16483). Westen Blots wurden unter Verwendung von Ganzzellextrakten aus primären B-Zellen durchgeführt, die mit dem CpG-Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321), der Kontrolle 2078 (SEQ ID NO: 319) oder nur Medium inkubiert wurden. Spezifische Antikörper zu der phosphorylierten Form von JNK, p38, ATF-2 und ERK wurden verwendet. Eine starke Induktion von JNK-Phosphorylierung wurde 30 min und 60 min nach Exposition gegenüber CpG-DNA gefunden, während Nicht-CpG-Oligonukleotide keine Aktivität oberhalb des Hintergrundes aufwiesen. Die Proteinkinase p38, eine weitere Stress-aktivierte Proteinkinase (SAPK) wurde auch in Reaktion auf CpG-DNA innerhalb von 60 min phosphoryliert. ATF-2, ein Substrat von sowohl p38 als auch JNK (Gupta S., Campbell D., Derijard B. und Davis R. J. 1995. Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway. Science 267: 389) und ein Bestandteil des AP-1-Komplexes, zeigte eine schwache Phosphorylierung nach 30 min, die sich nach 60 min erhöhte. CpG-DNA war nicht in der Lage, eine wesentliche Phosphorylierung von ERK zu induzieren. Im Gegensatz dazu löste anti-IgM, das den B-Zellrezeptor stimulierte, die Phosphorylierung von ERK aus. Anti-IgM aktivierte andere Isoformen von JNK als CpG-DNA.
Beispiel 12: Test für in vivo Adjuvantsaktivität
Es wurde ein in vitro Screeningtest, um ODN zu identifizieren, die als Adjuvans in vivo bei Menschen und anderen Nicht-Nagetieren nützlich sind, entwickelt. Da wir nicht nur quantitative, sondern auch qualitative Unterschiede hinsichtlich der Aktivität verschiedener CpG-ODN in Mäusen sahen, screenten wir zuerst einen Satz von CpG- und Nicht-CpG-Kontroll-ODN auf Mauszellen, um in vitro Tests mit einer verlässlichen und starken Korrelation mit in vivo Adjuvantsaktivität mit Hepatits B-Oberflächenantigen (HBsAg) zu finden. Wir testeten dann systematisch einen Satz von mehr als 250 ODN in entsprechenden menschlichen Tests, um Sequenzen mit in vitro immunstimulatorischer Aktivität zu identifizieren. Als nächstes untersuchten wir, ob die ODN mit der höchste Aktivität in diesen menschlichen Tests auch B-Zellproliferation bei Schimpansen und langschwänzigen Affen aktivierten und, schließlich, ob sie als Adjuvans mit HBsAg in Schimpansen und cynomologen Affen in vivo aktiv waren. Diese Studien ergaben, dass die Sequenz, die Anzahl und der räumliche Abstand von einzelnen CpG-Motiven zur immunstimulatorischen Aktivität eines CpG-Phosphothioat-ODN beitragen. Ein ODN mit einem TC-Dinukleotid am 5'-Ende gefolgt von drei 6mer CpG-Motiven (5' GTCGTT 3'), getrennt durch TT-Dinukleotide, zeigte konsistent die höchste Aktivität für Leukozyten vom Menschen, Schimpansen und Rhesusaffen. Schimpansen oder langschwänzige Affen, die gegen Hepatitis B mit diesem CpG ODN-Adjuvants geimpft wurden, entwickelten 15-fach höhere anti-HBs-Antikörpertiter als jene, die nur das Vakzin erhielten.
Materialien und Methoden
Oligodesoxynuleotide: Phosphothioat-modifizierte ODN wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) und Hybridon Specialty Products (Milford, MA) gekauft. Die ODN wurden auf Endotoxin unter Verwendung des LAL-Tests getestet (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; untere Nachweisgrenze 0,1 EU/ml). Für in vitro Tests wurden ODN in TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA) verdünnt und bei –20° C gelagert. Für in vivo Verwendung wurden ODN in Phosphat gepufferter Saline (0,1 M PBS, pH 7,3) verdünnt und bei 4° C gelagert. Alle Verdünnungen wurden ausgeführt unter Verwendung von Pyrogenfreien Reagenzien.
Mausmilzzellkulturen:
Milzzellen wurden aus 6 – 12 Wochen alten weiblichen BALB/c (The Jackson Laboratory) entfernt. 2 × 10⁶ Milzzellen mit 0,2 μM ODN für 4 Stunden (TNF-α) oder 24 Stunden (IL-6, IFN-γ, IL-12) kultiviert und Cytokine durch ELISA wie früher beschrieben nachgewiesen (Yi A. K., Klinman D. M., Martin T. L., Matson S. und Krieg A. M. 1996. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J Immunol 157: 5394). Um CpG-induzierte B-Zellproliferation zu evaluieren wurden Milzzellen hinsichtlich T-Zellen mit einem anti-Thy-1.2 und Komplement und Zentrifugieren über Lympholyte M^® (Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Kanada) verarmt, für 44 Stunden mit den angegebenen ODN kultiviert und dann für 4 Stunden mit 1 μCi ³H-Thymidin wie früher beschrieben gepulst (Krieg A. M, Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A. und Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374: 546). Um zelllytische Aktivität von NK zu untersuchen, wurden murine Milzzellen an B-Zellen verarmt unter Verwendung von Magnetkügelchen, die mit Ziegen-anti-Maus-Ig beschichtet waren, wie früher detailliert dargelegt (Ballas Z. K. und Rasmussen W. 1993. Lymphkine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1⁺CD8 α⁺β^–TCR-αβ B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150: 17). Die Zellen wurden zu 5 × 10⁶/Napf in Platten mit 24 Näpfen kultiviert und bei 18 Stunden zur Verwendung als Effektorzellen in einem vierstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen YAC-1-Zielzellen geerntet. Eine Einheit (LU) wurde als die Anzahl von Zellen definiert, die erforderlich ist, um eine 30 %ige spezifische Lyse zu bedingen.
Immunisierung von Mäusen gegen HBsAg und Evaluierung der humoralen Antwort:
Gruppen von 6 – 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (n = 5 oder 10, Charles River, Montreal, QC) wurden gegen HBsAg wie früher beschrieben immunisiert (Davis H. L., et al 1998 J Immunol 160: 870). Kurz gesagt erhielt eine jede Maus eine einzelne IM-Injektion von 50 μl PBS, die 1 μg rekombinantes HBsAg enthielt (Medix Biotech, Foster City, CA) und 10 μg CpG-ODN oder nicht-CpG-ODN als einziges Adjuvans oder mit Aluminium kombiniert (Alhydrogel „85", Superfos Biosector, Vedbaek, Dänemark; 25 mg Al³⁺/mg HBsAg). Kontrollmäuse wurde mit HBsAg ohne Adjuvans oder mit Aluminium immunisiert. Plasma wurde aus Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Immunisierung gewonnen und AKs spezifisch für HBsAg (anti-HBs) durch Endpunktverdünnungs-ELISA-Test (dreifach) wie früher beschrieben quantifiziert (Davis H. L. et al 1998 J Immunol 160: 870). Endpunkttiter wurden als die höchste Plasmaverdünnung definiert, die zu einem Absorptionswert (OD450) führte, der zweifach höher ist als von Nicht-Immunplasma mit einem Ausschlusswert von 0,05.
Isolierung von Primaten-PBMC und Zellkultur:
Mononukleäre Zelle des peripheren Blutes (PBMC) wurden aus peripherem Blut von gesunden Freiwilligen, Schimpansen oder Rhesus- oder cynomologen Affen durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MOS) wie beschrieben isoliert (Hartmann G., et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 291). Die Zellen wurden in RPMI 1640-Kulturmedium suspendiert, das mit 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem (56° C, 1 Stunde) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle von Gibco BRL, Grand Island, NY) supplementiert war (vollständiges Medium). Zellen (Endkonzentration 1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in vollständigem Medium in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator bei 37° C inkubiert. ODN und LPS (von Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder anti-IgM wurden als Reize verwendet. Zum Messen der lytischen Aktivität von menschlichen NK wurden PBMC bei 5 × 10⁶ Zellen/Napf in Platten mit 24 Näpfen inkubiert. Die Kulturen wurden nach 24 Stunden geerntet und die Zellen als Effektoren in einem standardmäßigen vierstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen K562-Zielzellen wie früher beschrieben verwendet (Ballas Z. K, Rasmussen W. L. und Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J Immunol 157: 1840; Ballas Z. K. und Rasmussen W. 1993. Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1⁺CD8 α⁺ β^– TCR-αβ B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150: 17). Für B-Zellproliferation wurde 1 μCi ³H-Thymidin 18 Stunden vor der Ernte hinzugesetzt und die Menge an ³H-Thymidin Einbau bestimmt durch Szintillationszählen am Tag 5. Standardabweichungen der Dreifachnäpfe waren < 5 %.
Flusscytometrie an Primaten-PBMC:
Oberflächenantigene auf Primaten-PBMC wurden wie zuvor beschrieben gefärbt (Hartmann G et al 1998 J Pharmacol Exp Ther 285: 920). Monoklonale Antikörper gegen CD3 (UCHT1), CD 14 (M5E2), CD 19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) und CD86 (2331 (FUN-1)) wurden von Pharmingen, San Diego, CA gekauft. IgG_1,κ (MOPC-21) und IgG_2,bκ (Hartmann G et al 1999 PNAS 96: 9305) wurden verwendet, um nicht-spezifisches Färben zu kontrollieren. NK-Zellen wurden identifiziert durch CD56-Expression auf CD3-, CD 14- und CD 19-negativen Zellen, wohingegen B-Zellen durch Expression von CD 19 identifiziert wurden. Flusscytometriedaten von 10.000 Zellen pro Probe wurden auf einem FACSan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) aufgenommen. Die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des FSC/SSC-Gates, das für die Analyse verwendet wurde, wurde durch Propidiumiodidfärbung (2 μg/ml) studiert und man hat festgestellt, dass sie größer als 98% ist. Die Daten wurden unter Verwendung des Computerprogramms FlowJo (Version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA) analysiert.
Immunisierung von Schimpansen und cynomologen Affen gegen HBsAg und Evaluierung der humoralen Antwort:
Vierzehn cynomologe Affen (2,0-3,5 kg) wurden mit einer pädiatrischen Dosis Engerix-B (SmithKline Beechman Biologicals, Rixensart, BE) immunisiert, die 10 μg HBsAg enthielt, das an Aluminium adsorbiert war (25 mg Al³⁺/mg HBsAg). Dies wurde alleine (n=5) oder kombiniert mit CpG ODN 1968 (n=5, 500 μg) oder CpG ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (n = 4, 150 μg) verabreicht. Vier Schimpansen (10-20 kg) wurden in der gleichen Art und Weise immunisiert, wobei zwei Kontrollvakzin (nur Engerix-B) und zwei das experimentelle Vakzin (Engerix-B plus 1 mg CpG ODN 2006) erhielten. Alle Vakzine wurden IM in den rechten anterioren Schenkel in einem Gesamtvolumen von 1 ml verabreicht. Die Affen wurden in dem Tierstall des Primate Research Center (Bogor, Indonesien) gehalten und die Schimpansen wurden in Bioqual (Rockville, MD) gehalten. Die Tiere wurden täglich durch Tierpflegespezialisten überwacht. Es wurden keine Symptome eines generell schlechten Gesundheitszustandes oder nachteilige lokale Reaktionen an der Injektionsstelle festgestellt. Plasma wurde durch IV-Punktierung vor und zu verschiedenen Zeiten nach der Immunisierung gewonnen und gefroren (–20°C) gelagert, bis sie auf Antikörper getestet wurden. Anti-HBs-Antikörper wurden nachgewiesen unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (Monolisa anti-HBs; Sanofi-Pasteur, Montreal, QC) und die Titer wurden in mIU/ml auf der Grundlage des Vergleiches mit WHO-definiertem Standard ausgedrückt (Monolisa Anti-HBs Standards; Sanofi-Pasteur).
Ergebnisse
Identifizierung von CpG-ODN mit verschiedenen Profilen für in vitro Immunaktivitäten: Unsere Studien zeigten, dass die genauen Basen an den 5' und 3'-Seiten eines CpG-Dinukleotids innerhalb eines CpG-Motivs einen Einfluss auf das Ausmaß der Immunaktivierung eines synthetischen ODN haben können. Es war jedoch unklar gewesen, ob unterschiedliche CpG-Motive unterschiedliche Immunwirkungen zeigen könnten. Um diese Möglichkeit zu evaluieren, testeten wir einen Satz aus CpG-ODN hinsichtlich ihrer Aktivität, NK-lytische Aktivität und B-Zelleproliferation zu induzieren und die Synthese von TNF-α, IL-6, IFN-γ und IL-12 in murinen Milzzellen zu stimulieren. Die immunstimulatorische Aktivität von ODN ohne CpG-Motiven (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225), ODN 1983 (SEQ ID NO.: 226)) war negativ oder schwach verglichen mit CpG-ODN. ODN mit nicht-optimalen CpG-Motiven (ODN 1628 (SEQ ID NO.: 767), ODN 1768 (SEQ ID NO.: 1)) waren weniger aktiv als ODN, die CpG-Motive enthielten, die von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert waren (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69), ODN 1841 (SEQ ID NO.: 84)). ODN 1826, das zwei optimale murine CpG-Motive enthielt (5' GACGTT 3') (SEQ ID NO.: 1143), wies die höchste Aktivität für 5 von 6 gemessenen Endpunkten auf. Mit Ausnahme von ODN 1628 zeigten alle ODN ein im allgemeinen ähnliches Aktivitätsmuster (NK-Zell-vermittelte Lyse, B-Zellproliferation, IL-12, IL-6, TNF α, IFN-γ). Am Rande bemerkt zeigte ODN 1628, das insoweit in diesem Satz einzigartig war, als dass es zwei G-reiche Regionen enthielt, eine bevorzugte Induktion von IFN-γ-Synthese, aber eine vergleichsweise schwache Stimulierung der anderen Aktivitäten.
Die Identifizierung von in vitro-Tests, die mit in vivo Adjuvansaktivität korrelieren:
Da Adjuvansaktivität ein in vivo Endpunkt ist, waren wir daran interessiert, in vitro Tests zu identifizieren, die die Adjuvansaktivität eines CpG-ODN in vivo vorhersagen würden. Die gleichen ODN, die für in vitro Endpunkte verwendet wurden, wurden daher auf ihre Adjuvansaktivität getestet, um Mäuse gegen HBsAg zu immunisieren. Dies wurde sowohl mit ODN alleine als auch mit ODN kombiniert mit Aluminium durchgeführt, da frühere Studien eine starke Synergie für CpG-ODN und Aluminium-Adjuvans gezeigt hatten (veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 98/40100).
BALB/c-Mäuse, die mit HBsAg ohne Adjuvans immunisiert waren, erreichten nur niedrige Titer an anti-HBs nach 4 Wochen und dies wurde nicht durch das Hinzugeben von Kontroll-ODN beeinflusst. Im Gegensatz dazu erhöhte das Hinzufügen von CpG-ODN die anti-HBs-Titer um das 5- bis 40-fache, abhängig von der verwendeten Sequenz. Wenn Aluminium hinzugegeben wurde, waren die Titer an anti-HBs etwa 6-fach höher als mit HBsAg alleine. Genauer gesagt wies das Kontroll-ODN keine Wirkung auf und die verschiedenen CpG-ODN erhöhten diese Titer um den Faktor 2 bis 36. Ergebnisse, die mit verschiedenen ODN alleine erhalten wurden, korrelierten sehr stark (r = 0,96) mit jenen, die erhalten wurden unter Verwendung des gleichen ODN plus Aluminium. Wenn eine lineare Regression durchgeführt wurde, stellte man einen sehr hohen Korrelationsgrad zwischen bestimmten in vitro Assays und der in vivo Erhöhung von anti-HBs Titern fest. Von all den untersuchten in vitro Endpunkten zeigte die Induktion von NK-lytischer Aktivität die beste Korrelation mit in vivo Adjuvansaktivität (ohne Aluminium, r = 0,98; mit Aluminium, r = 0,95; p < 0,0001). Eine gute Korrelation betreffend die Adjuvansaktivität wurde auch für B-Zellstimulierung (r = 0,84 und 0,7) ebenso wie für Sekretion von TNF-α (r = 0,9 und 0,88), IL-12 (r = 0,88 und 0,86) und IL-6 (r = 0,85 und 0,91) erhalten. Der eine in vitro Test, der nicht mit den in vivo Ergebnissen korrelierte, war IFN-γ-Sekretion (r = 0,57 und 0,68). Diese Daten zeigten, dass die in vitro Tests für NK-lytische Aktivität, B-Zellaktivierung und Produktion von 7NF-α, IL-6 und IL-12 eine wertvolle Information in vitro bereitstellten, um die Adjuvansaktivität eines gegebenen ODN in vivo vorherzusagen.
Screenen eines Phosphothioat-ODN-Satzes, um menschliche NK-Zellen zu aktivieren: In früheren Studien hatte man festgestellt, dass die Synthese von inflammatorischen Zytokinen durch menschliche PBMC induziert wird durch extrem niedrige Mengen an Endotoxin (induzierte TNF-α-Sekretion ist mit gerade 6 pg/ml Endotoxin nachweisbar, zweilogs empfindlicher als murine Immunzellen). Im Gegensatz dazu ist die Aktivierung von menschlichen B-Zellen und Induktion von lytischer Aktivität von menschlichen NK-Zellen mit Endotoxin selbst bei hohen Endotoxin-Konzentrationen niedrig. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wählten wir die Aktivierung von NK-Zellen (lytische Aktivität und CD69-Expression) und B-Zellen (Proliferation und CD86-Expression) als die am höchsten spezifischen und reproduzierbaren Tests mit niedriger Variabilität zwischen den Lebewesen aus und verwendeten diese Tests für in vitro Screening eines Pools von ODN.
Zuerst studierten wir die Wirkung von Phosphothioat ODN, die verschiedene Kombinationen und Permutationen von CpG-Motiven erhalten, auf von NK-Zellen-vermittelte Lyse von Zielzellen. Aus Klarheitsgründen und Leichtigkeit der Darstellung sind lediglich Daten mit ausgewählten repräsentativen CpG- und Kontroll-ODN gezeigt. Menschliche PBMC wurden mit verschiedenen Phosphothioat-ODN (6 μg/ml) für 24 Stunden inkubiert und auf ihre Fähigkeit hin getestet, ⁵¹Cr-markierte K562-Zellen zu lysieren. ODN mit zwei 6-mer-CpG-Motiven (entweder 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143) oder 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144)) in Kombination mit einem TpC am 5'-Ende des ODN (ODN 1840 5' TCCATGTCGTTCCTGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 83), ODN 1851 5' TCCTGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO.: 94) oder mit wenigstens drei 6-mer Motiven ohne ein TpC am 5'-Ende (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253)), zeigte eine mittlere Aktivität.
Eine hohe Aktivität wurde gefunden, wenn das 5'-TpC direkt einem menschlichen 6-mer CpG-Motiv voranging (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) und von zwei 6-mer Motiven gefolgt war (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) und ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)). Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die 6-mer-CpG-Motive waren und von dem 5' 8-mer-CpG-Motiv durch TpT voneinander räumlich getrennt (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)).
Die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 wird schnell auf der Oberfläche von NK-Zellen nach Stimulierung hoch reguliert. Um die Ergebnisse aus dem NK-Zellenlysetest zu bestätigen, wurden PBMC für 18 Stunden mit ODN (2 μg/ml) inkubiert. Die CD69-Expression wurde an CD56-positiven NK-Zellen (CD3-, CD14- und CD19-negativ) untersucht. Obwohl die Induktion von CD69-Expression weniger sequenzbeschränkt war als die Stimulierung von funktionaler NK-Zellaktivität, zeigten Kontroll-ODN (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117, ODN 2010) nur eine niedrige Aktivität, vergleichbar den Hintergrundniveaus. ODN mit zwei menschlichen CpG-Motiven, die durch 5' TTTT 3' (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 209) oder vier menschlichen CpG-Motive ohne räumliche Trennung (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253) getrennt waren, waren beim Induzieren von CD69-Expression vergleichsweise aktiver als beim Stimulieren der lytischen Aktivität von NK- Zellen. Eine optimale funktionale Aktivität von NK-Zellen, ebenso wie CD69-Expression wurde erhalten mit ODNs, die ein TpC-Dinukleotid, das dem menschlichen CpG-Motiv voranging, und zusätzlich zwei menschliche Motive innerhalb der Sequenz aufwies (ODN 2006 SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)).
Aktivität von Phosphothioat-ODN zum Stimulieren von menschlichen B-Zellen: In vorläufigen Experimenten haben wir festgestellt, dass der Prozentsatz an proliferierenden B-Zellen (CFSE-Test, siehe Methodenabschnitt) mit der Oberflächenexpression des co-stimulatorischen CD86 auf B-Zellen korrelierte, wie durch Zytometrie gemessen. Wir verwendeten daher CD86-Expression auf B-Zellen, um einen Satz on ODN hinsichtlich ihrer immunstimulatorischen Aktivität zu screenen. Die PBMC wurden mit 0,6 μg/ml ODN inkubiert. Die Expression von CD86 (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) wurde auf CD 19-positiven B-Zellen untersucht. Ein Poly-C-ODN (ODN 2017 (SEQ ID NO.: 257)) oder ODN ohne CpG-Dinukleotide (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225)) scheiterte daran, menschliche B-Zellen unter diesen experimentellen Bedingungen zu stimulieren. Ein Phosphothioat-ODN (ODN 2116 (SEQ ID NO.: 256) mit einem optimalen menschlichen CpG-Motiv, dass ein TpC (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) voranging, wies eine niedrige Aktivität auf. Die Anwesenheit eines menschlichen 6-mer CpG-Motivs (5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144)) wies keine aktivierende Wirkung auf. Zwei dieser CpG-Motive innerhalb der Sequenzen zeigten keine (ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203), ODN 2016 (SEQ ID NO.: 256)) oder mittlere (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 209)) Aktivität auf, abhängig von dem Sequenzkontext. Wenn das ODN aus drei oder vier Kopien dieses Motivs zusammengesetzt war (ODN 2012 (SEQ ID NO.: 252), ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253), ODN 2014 (SEQ ID NO.: 254)) konnte eine mittlere Aktivität auf B-Zellen nachgewiesen werden. Die Kombination des menschlichen 8-mer CpG-Motivs am 5'-Ende des ODN mit zwei 6-mer CpG-Motiven (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343), ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)) führte zu einer erheblichen Erhöhung der Fähigkeit der ODN, B-Zellen zu stimulieren. Die räumliche Trennung zwischen den einzelnen Motiven war kritisch. Die Trennung von CpG-Motiven durch TpT war bevorzugt (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)) verglichen mit den nicht räumlich getrennten CpG-Motiven (ODN 2005 (SEQ ID NO.:), vergleiche auch ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208) mit ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203)). Das menschliche 6-mer CpG-Motiv (5' GTCGTT 3') war besser als das optimale 6-mer CpG-Motiv der Maus (5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 246)), wenn mit dem menschlichen 8-mer CpG-Motiv an dem 5'-Ende kombiniert (ODN 2006 vs. ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343) und ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)). Ein (TCG)_poly-ODN war inaktiv oder nur schwach aktiv ebenso wie ODN, die CpG-Dinukleotide enthielten, die von Guaninen oder anderen CpG-Dinokleotiden flankiert waren (ODN 2010 (SEQ ID NO.: 250)). Zusammengefasst zeigten diese Ergebnisse für NK-Zellen und B-Zellen in konsistenter Weise, dass von den getesteten ODN ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) die höchste immunstimulatorische Aktivität auf menschliche Immunzellen aufweist.
Vergleichende Analyse der Wirksamkeit von CpG-Phosphothioat-ODNs in verschiedenen Primaten: Verschiedene CpG-Motive sind optimal, um murine und menschliche Immunzellen zu aktivieren. Weiterhin ist die Anzahl und der Ort von CpG-Motiven innerhalb eines aktiven Phosphothioat-ODN bei Mäusen und Menschen unterschiedlich. Wir waren daran interessiert zu erfahren, ob CpG-Phosphothioat-ODN eine ähnliche Aktivität zwischen verschiedenen Primatenspezies aufweisen würden. Wir verglichen einen Satz von CpG-ODN hinsichtlich ihrer Fähigkeit, B-Zellproliferation beim Menschen, Schimpansen und Rhesus- oder cynomologischen Affen zu induzieren. Die Fähigkeit von ODN, menschliche B-Zellproliferation zu stimulieren (Tabelle J) korrelierte gut mit ihrer Fähigkeit, CD86-Expression auf B-Zellen zu induzieren. ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), das die höchste Aktivität bei menschlichen B-Zellen und NK-Zellen zeigte, war auch das aktivste beim Stimulieren der B-Zellproliferation beim Schimpansen und bei Rhesusaffen (Tabelle J). ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) und ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) ergaben die höchste Aktivierung von B-Zellen von cynomologischen Affen in vitro (SI von 25 bzw. 29 bei 6 μg ODN/ml). Überraschenderweise stimulierte CpG ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), das eine ähnlich hohe Aktivität zeigte wie das optimale ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) bei Menschenzellen, nicht die B-Zellproliferation beim Rhesusaffen oder Schimpansen und das ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) zeigte eine niedrige Aktivität. CpG ODN, die ursprünglich mit hoher Aktivität bei Mäusen identifiziert worden sind (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69) zeigte eine geringe Aktivität bei Affen (Tabelle J).
Tabelle J: Proliferative Antwort von PBMC auf Phosphothioat CpG ODN bei Primaten
PBMC wurden aus peripherem Blut hergestellt und mit ODN (0,6 μg/ml) wie angegeben für 5 Tag inkubiert. Die Proliferation wurde gemessen durch Aufnahme von ³H/Thymidin (cpm/1000) während wenigstens 18 Stunden. Mehr als 95% der proliferierenden Zellen waren B-Zellen, wie bestimmt unter Verwendung des CFSE-Tests. Vier menschliche Probanden, sechs Schimpansen und zwei Rhesusaffen wurden getestet.
In vivo Adjuvansaktivität von CpG-ODN bei Schimpansen und cynomologischen Affen: Um zu evaluieren, ob CpG-ODN mit starken in vitro stimulatorischen Wirkungen auf Primatenzellen eine nachweisbare Adjuvansaktivität in vivo hatten, wurden cynomologische Affen und Schimpansen mit Engerix B immunisiert, das HBsAg enthält, das an Aluminium adsorbiert ist, alleine oder mit zugebenem ODN 1968 (500 μg) oder ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (1 mg). Verglichen mit Kontrollen, die kein CpG-ODN erhielten, waren anti-HBs-Titer 4 Wochen nach dem Primen und 2 Wochen nach dem Auffrischen 66- bzw. 16-fach höher bei den Affen und 15- und 3-fach höher bei den Schimpansen (Tabelle K). Somit wurde eine eindeutige Adjuvanswirkung von CpG-ODN gesehen und dies war besonders beeindruckend nach einer einzelnen Immunisierung.
Tabelle K Anti-HBs-Antworten bei Primaten, die gegen HBsAg mit CpG-ODN³ immunisiert waren

³ Tiere wurden durch IM Injektion von Engerix B, das 10 μg HBsAg enthielt, das an Aluminium adsorbiert ist, alleine oder mit zugegebenem CpG-ODN immunisiert. Cynomologische Affen wurden nach 10 Wochen und die Schimpansen 4 Wochen nach dem Primen aufgefrischt. Anti-HBs wurde durch ELISA-Test bestimmt; Werte für Affen sind GMT ± SEM (n=5), wohingegen Einzelwerte für die zwei Schimpansen in einer jeden Gruppe angegeben sind.

Claims

Py-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure ist, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort umfassend die Verabreichung der immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine poly-T-Nukleinsäure ist umfassend: 5'TTTT3'
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei: a) die poly-T-Nukleinsäure 5'X₁X₂TTTTX₃X₄3' umfasst, wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind; und/oder b) die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine Vielzahl von Poly-T-Nukleinsäuremotiven umfasst.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 3, wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC und bevorzugterweise TT ist und/oder X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC und bevorzugterweise TT ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die T-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 80 % T umfasst.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure: a) wenigstens 20 oder wenigstens 24 Nukleotide umfasst; b) ein Nukleotidrückgrat aufweist, das wenigstens eine Rückgratmodifikation enthält, optional eine Phosphothioatmodifikation, und/oder wobei das Nukleotidrückgrat chimär und/oder vollständig modifiziert ist; c) frei von methylierten CpG-Dinukleotiden ist; d) frei von poly-C-Sequenzen ist; e) eine poly-A-Sequenz enthält; f) eine poly-G-Sequenz enthält; g) eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % C umfasst; h) eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % A umfasst; i) oral verabreicht wird; j) lokal verabreicht wird; k) in einer Depotvorrichtung verabreicht wird; l) mukosal an eine Schleimhautoberfläche verabreicht wird; m) weiter ein TG-Motiv umfasst; n) wenigstens zwei poly-C-Sequenzen mit wenigstens 3 aufeinanderfolgenden C-Nukleotidresten enthält; und/oder o) frei von zwei poly-A-Sequenzen mit wenigstens 3 aufeinanderfolgenden A-Nukleotidresten ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 6, die mukosal an eine Schleimhautoberfläche verabreicht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oralen, nasalen, rektalen, vaginalen oder Okularen Oberfläche.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 6, die mukosal an eine Schleimhautoberfläche verabreicht wird, wobei die Immunantwort eine mukosale Immunantwort oder eine systemische Immunantwort ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lebewesen gegenüber einem Antigen exponiert ist und wobei die Immunantwort eine antigenspezifische Immunantwort ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei das Antigen ein Peptidantigen ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei ein Nukleinsäurevektor, der das Antigen codiert, dem Lebewesen verabreicht wird und wobei der Nukleinsäurevektor von der immunstimulatorischen Nukleinsäure getrennt ist.
Ex vivo-Verfahren zum Aktivieren einer isolierten Immunzelle umfassend Kontaktieren der Immunzelle mit einer Menge einer immunstimulatorischen Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Py-reichen Nukleinsäuren und TG-Nukleinsäuren, die wirksam ist, um die Immunzelle zu aktivieren.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Immunzelle ein Leukozyt oder eine dendritische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Immunzelle weiter mit einem Antigen kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Tumorantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen oder einem Parasitenantigen.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lebewesen Asthma aufweist oder das Risiko besteht, dass es Asthma entwickelt, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von Asthma.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lebewesen eine Allergie aufweist oder das Risiko besteht, dass es eine Allergie entwickelt, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von Allergie.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lebewesen Krebs hat oder das Risiko besteht, dass es Krebs entwickelt, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von Krebs.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gallengangkrebs, Gehirnkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Choriokarzinom, Krebs des zentralen Nervensystems, Kolonkrebs, Bindegewebskrebs, Endometriumskrebs, Augenkrebs, Magenkrebs, intraepitheliale Neoplasmen, Kehlkopfkrebs, Lymphome, Hodgkin-Lymphom, Leberkrebs, Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs), Melanom, Neuroblastome, Mundkrebs, Mundhöhlenkrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Mastdarmkrebs, Sarkome, Schilddrüsenkrebs, Nierenkrebs, Knochenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hautkrebs und Hodenkrebs ebenso wie andere Karzinome und Sarkome.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei ebenfalls eine Krebstherapie verabreicht wird.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 20, wobei die Krebstherapie ein Antikörper, ein chemotherapeutisches Agens, ein immuntherapeutisches Agens oder ein Krebsvakzin ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Hund, eine Katze oder ein Pferd ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei ein Antikörper, der spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, ebenfalls verabreicht wird und wobei die Immunantwort zu einer Antigen-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) führt.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lebewesen eine Infektionskrankheit hat oder die Gefahr besteht, diese zu entwickeln, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Infektionserkrankung.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 23 oder 24, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Hühnchen, ein Affe oder ein Fisch ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 23 oder 24, wobei auch ein Antigen dem Lebewesen verabreicht wird.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 26, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem bakteriellen Antigen, einem viralen Antigen, einem Parasitenantigen oder einem Pilzantigen, oder das Antigen abgeleitet ist von einem Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Herpesviridae, Retroviridae, Orthomyroviridae, Toxoplasma, Haemophilus, Campylobacter, Clostridium, E. coli und Staphylococcus.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die TG-Nukleinsäure umfasst 5'N₁X₁TGX₂N₂3' wobei N₁ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (11-N₂) bis (21-N₂) reicht, N₂ optional eine Nukleinsäure ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (11-N₁) bis (21-N₂) reicht, und X₂ optional Thymidin ist.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die TG-Nukleinsäure umfasst 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3' wobei N₁ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9-N₂) bis (19-N₂) reicht, N₂ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9-N₁) bis (19-N₁) reicht, X₃ optional Thymidin ist, X₁X₂ optional Nukleotide sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT und X₃X₄ optional Nukleotide sind, die aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA und CA oder aus der Gruppe bestehend aus TT, TC, TA und TG ausgewählt sind.
Immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Prävention von Erkrankungen bei einem Lebewesen, wobei das Verfahren die Verabreichung der immunstimulatorischen Nukleinsäure auf einer regelmäßigen Basis an das Lebewesen umfasst, um die Erkrankung bei dem Lebewesen zu verhindern.
Immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, zur Verwendung in einem Verfahren zum Induzieren einer angeborenen Immunantwort umfassend Verabreichen der immunstimulatorischen Nukleinsäure an das Lebewesen in einer Menge, die wirksam ist zum Aktivieren einer angeborenen Immunantwort.
Zusammensetzung umfassend eine Depotvorrichtung enthaltend eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure und einer TG-Nukleinsäure, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure frei von nicht methylierten CpG-Motiven ist und, optional, ein Phosphodiesterrückgrat aufweist.
Zusammensetzung einer Nahrungsergänzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure und einer TG-Nukleinsäure, in einer Abgabevorrichtung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Kapsel, einer Pille und einer sublingualen Tablette, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure frei ist von nicht methylierten CpG-Motiven und, optional, ein Phosphothioatrückgrat aufweist.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure und ein Antigen, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure frei von nicht-methylierien CpG-Motiven ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT und X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA und CA, und einer Py-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'X₁X₂TTTTX₃X₄3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA und GC und X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure und ein antimikrobielles Agens, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure frei ist von nicht-methylierten CpG-Motiven und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure und einer TG-Nukleinsäure.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei das antimikrobielle Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem antiviralen Agens, einem Anti-Pilzmittel, einem Anti-Parasitenmittel und einem antibakteriellen Agens.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 3, wobei a) die immunstimulatorische Nukleinsäure wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7 oder wenigstens 8 Poly-T-Motive um fasst; b) wenigstens 2 der Vielzahl von Poly-T-Motiven jeweils wenigstens drei aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfasst; c) wennigstens 2 der Poly-T-Motive jeweils wenigstens vier aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfasst; d) die Vielzahl der Poly-T-Motive wenigstens 3 Poly-T-Motive ist und wobei die wengstens 3 Poly-T-Motive jeweils wenigstens 3 aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfasst; e) die Vielzahl von Poly-T-Motiven wenigstens 4 Poly-T-Motive ist und wobei die wenigstens 4 Poly-T-Motive jeweils wenigstens 3 aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfasst; und/oder f) wenigstens eine der Vielzahl von Poly-T-Nukleinsäuremotiven wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7 oder wenigstens 8 aufeinanderfolgende T-Nukleotidreste umfasst; und/oder g) die Nukleinsäure weiter eine Vielzahl von CpG-Motiven umfasst, wobei die Vielzahl wenigstens 3 Motive oder wenigstens 4 Motive ist und wobei die wenigstens 4 Motive jeweils wenigstens 3 aufeinanderfolgende T-Nukaeotidreste umfassen und die Vielzahl von CpG-Motiven und Poly-T-Motiven bevorzugterweise eingestreut sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine zur Stimulierung einer Immunantwort wirksame Menge von einer isolierten immunstimulatorischen Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 12, 13, 28, 29 und 37 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Stoffzusammensetzung umfassend eine isolierte immunstimulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 12, 13, 28, 29 und 37 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure und eine Krebstherapie, formuliert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer wirksamen Menge, um eine Krebserkrankung zu behandeln oder um das Risiko zu verringern, dass eine Krebserkrankung entwickelt wird, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure und ein Asthma-/Allergiemedikament, formuliert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und in einer wirksamen Menge zur Verhinderung oder Behandlung einer Immunantwort, die mit der Exposition gegenüber einem Mediator von Asthma oder Allergie verbunden ist, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 95 – 119, SEQ ID NO: 121 – 136, SEQ ID NO: 138 - 152, SEQ ID NO: 154 – 210, SEQ ID NO: 212 – 222, SEQ ID NO: 224 – 244, SEQ ID NO: 247 – 260, SEQ ID NO: 263 – 272, SEQ ID NO: 274 – 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303 – 409, SEQ ID NO: 414 – 420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 427 – 758, SEQ ID NO: 760 – 947, SEQ ID NO: 959 – 963, SEQ ID NO: 968 – 1022 und SEQ ID NO: 1024 – 1093, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure im Wesentlichen bestehend aus: 5'M₁TCGTCGTTM₂3' wobei wenigstens eines der Cs nicht methyliert ist, wobei M1 eine Nukleinsäure ist mit wenigstens einem Nukleotid, wobei M₂ eine Nukleinsäure ist mit zwischen 0 und 50 Nukleotiden und wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure weniger als 100 Nukleotide aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine immunstimulatorische Nukleinsäure umfassend 5'TCGTCGTT3' wobei wenigstens eines der Cs nicht methyliert ist, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure weniger als 100 Nukleotide und ein Phosphodiesterrückgrat aufweist, optional weiter ein Antigen umfasst und eine Depotvorrichtung, bevorzugterweise ein Mikropartikel.
TG-immunstimulatorische Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, umfassend Verabreichen der TG-immunstimulatorische Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Lebewesen zu induzieren.
Zusammensetzung umfassend ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz aus TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO: 343).
Zusammensetzung nach Anspruch 46 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Allergie oder Asthma umfassend Verabreichen der Zusammensetzung an ein Nicht-Nagetierlebewesen, das dessen bedarf, in einer Menge, die wirksam ist, um Allergie oder Asthma zu behandeln oder zu verhindern.
TG-immununstimulatorische Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT, X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, TA, AA und CA und die Nukleinsäure frei von einem CpG-Dinukleotid ist, oder eine Py-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'X₁X₂TTTTX₃X₄3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA und GC, X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC und die Nukleinsäure frei ist von einem CpG-Dinukleotid, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort umfassend Verabreichen der TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure oder der Py-reichen Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Lebewesen zu induzieren.
Immunstimulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 45, die eine T-reiche Nukleinsäure ist und bevorzugterweise eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % T, mehr als 35 % T, mehr als 40 % T, mehr als 50 % T oder mehr als 60 % T umfasst.
Py-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure und frei von einem nicht-methylierten CpG-Dinukleotid ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Antigen-unspezifischen angeborenen Immunantwort umfassend Verabreichen der immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Antigen-unspezifische angeborene Immunantwort in dem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren.
Py-reiche immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure und frei von einem nicht-methyliertem CpG-Dinukleotid ist, zur Verwendung in einem Verfahren zum Umleiten einer Th2-Immunantwort auf eine Th1-Immunantwort, umfassend Verabreichen der immunstimulatorischen Nukleinsäure an ein Nicht-Nagetier in einer Menge, die wirksam ist, um eine Th2-Immunantwort auf eine Th1-Immunantwort umzuleiten.
Verwendung einer Py-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure ist, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments zum Verabreichen an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 und 37 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei die immunstimulatorische Nukleinsäure: a) wenigstens 20 oder wenigstens 24 Nukleotide umfasst; b) ein Nukleotidrückgrat aufweist, das wenigstens eine Rückgratmodifikation enthält, optional eine Phosphothioatmodifikation, und/oder wobei das Nukleotidrückgrat chimär und/oder vollständig modifiziert ist; c) frei von methylierten CpG-Dinukleotiden ist; d) frei von Poly-C-Sequenzen ist; e) eine; Poly-A-Sequenz enthält; f) eine; Poly-G-Sequenz enthält; g) eine; Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % C umfasst; h) eine; Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % A umfasst; i) weiter ein TG-Motiv umfasst; j) wenigstens zwei Poly-C-Sequenzen mit wenigstens 3 aufeinanderfolgenden Nukleotidresten umfasst; und/oder k) frei von zwei Poly-A-Sequenzen mit wenigstens 3 aufeinanderfolgenden A-Nukleotidresten ist.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament oral, lokal, in einer Depotvorrichtung und/oder mukosal auf eine Schleimhautoberfläche verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 55, wobei das Medikament mukosal auf eine Schleimhautoberfläche verabreicht werden soll und wobei die Schlemnhautoberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oralen, nasalen, rektalen, vaginalen oder okularen Oberfläche.
Verwendung nach Anspruch 55, wobei das Medikament mukosal an eine Schleimhautoberfläche verabreicht werden soll und wobei die Immunantwort eine Schleimhautimmunantwort oder eine systemische Immunantwort ist.
Verwendung; nach Anspruch 52, wobei das Medikament für die Verabreichung mit einem Antigen ist, wobei die Immunantwort eine Antigen-spezifische Immunantwort ist.
Verwendung; nach Anspruch 58, wobei das Antigen ein Peptidantigen ist.
Verwendung nach Anspruch 58, wobei das Antigen bereitgestellt wird durch einen Nukleinsäurevektor, der ein Antigen codiert, und wobei der Nukleinsäurevektor getrennt ist von der immunstimulatorischen Nukleinsäure.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament für die Behandlung oder Prävention von Asthma bei dem Nicht-Nagetierlebewesen ist und das Nicht-Nagetierlebewesen Asthma aufweist oder die Gefahr besteht, Asthma zu entwickeln.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament für die Behandlung oder Prävention einer Allergie in einem Nicht-Nagetierlebewesen ist und das Nicht-Nagetierlebewesen eine Allergie hat oder die Gefahr besteht, dass es eine Allergie entwickelt.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament für die Behandlung oder Prävention von Krebs in dem Nicht-Nagetierlebewesen ist und das Nicht-Nagetierlebewesen Krebs hat oder die Gefahr besteht, dass es Krebs entwickelt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gallengangkrebs, Gehirnkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Choriokarzinom, Krebs des zentralen Nervensystems, Kolonkrebs, Bindegewebskrebs, Endometriumkrebs, Augenkrebs, Magenkrebs, intraepitheliale Neoplasmen, Kehlkopfkrebs, Lymphome, Hodgkin-Lymphom, Leberkrebs, Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger Krebs und nicht-kleinzelliger), Melanom, Neuroblastome, Mundkrebs, Mundhöhlenkrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Mastdarmkrebs, Sarkome, Schilddrüsenkrebs, Nierenkrebs, Knochenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hautkrebs und Hodenkrebs ebenso wie andere Karzinome und Sarkome.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei das Medikament für die Verabreichung zusammen mit einen Krebstherapie ist.
Verwendung nach Anspruch 65, wobei die Krebstherapie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, einem chemotherapeutischen Agens, einem immuntherapeutischen Agens oder einem Krebsvakzin.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Hund, eine Katze oder ein Pferd ist.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament zusammen mit einem Antikörper verabreicht werden soll, der spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, und wobei die Immunantwort zu einer Antigen-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) führt.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament für die Behandlung oder Prävention einer Infektionskrankheit in einem Nicht-Nagetierlebewesen ist, wobei das Nicht-Nagetierlebewesen eine Infektionskrankheit hat oder das Risiko besteht, diese zu entwickeln.
Verwendung nach Anspruch 68 oder 69, wobei das Lebewesen ein Mensch, ein Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Hühnchen, ein Affe oder ein Fisch ist.
Verwendung nach Anspruch 68 oder 69, wobei das Medikament für die Verabreichung mit einem Antigen ist.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem bakteriellen Antigen, einem viralen Antigen, einem Parasitenantigen oder einem Pilzantigen oder das Antigen abgeleitet ist von einem Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Herpesviridae, Retroviridae, Orthomyroviridae, Toxoplasma, Haemophilus, Campylobacter, Clostridium, E. coli und Staphylococcus.
Verwendung nach Anspruch 54, wobei die TG-Nukleinsäure umfasst 5'N₁X₁TGX₂N₂3' wobei N₁ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (11 – N₂) bis (21 – N₂) reicht, N₂ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (11 – N₁) bis (21 – N₁) reicht und X₂ optional Thymidin ist.
Verwendung nach Anspruch 54, wobei die TG-Nukleinsäure umfasst 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3' wobei N₁ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9 – N₂) bis (19 – N₂) reicht, N₂ optional eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus einer Anzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die von (9 – N₁) bis (19 – N₁) reicht, X₃ optional Thymidin ist, X₁X₂ optional Nukleotide sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT besteht, und X₃X₄ optional Nukleotide sind, die aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA und CA oder aus der Gruppe bestehend aus TT, TC, TA und TG ausgewählt sind.
Verwendung einer immunstimulatorischen Nukleinsäre, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer T-reichen Nukleinsäure, die zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an das Lebewesen auf einer regelmäßigen Basis, um eine Erkrankung bei dem Lebewesen zu verhindern.
Verwendwng einer immunstimulatorischen Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend. aus einer T-reichen Nukleinsäure, die wenigstens zu mehr als 60 % T ist und ein CpG-Dinukleotid enthält, und einer TG-Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an das Lebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine angeborene Immunantwort zu aktivieren.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Medikament eine Zusammensetzung umfasst, wie in einem der Ansprüche 32 bis 36 und 38 bis 44 definiert.
Verwendung einer TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure, die frei von CpG-Dinukleotiden ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Lebewesen zu induzieren.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 46 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Allergie oder Asthma, das an ein Nicht-Nagetierlebewesen verabreicht werden soll, das dessen bedarf, in einer Menge, die wirksam ist, um Allergie oder Asthma zu behandeln oder zu verhindern.
Verwendung einer TG-immunstimulatorischen Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'N₁X₁X₂TGX₃X₄N₂3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA und TT, X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA und CA, und die Nukleinsäure frei von einem CpG-Dinukleotid ist, oder einer Py-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäure umfassend die Sequenz 5'X₁X₂TTTTX₃X₄3' wobei X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA und GC, X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA und GC, und die Nukleinsäure frei von einem CpG-Dinukleotid ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Lebewesen zu induzieren.
Verwendung nach Anspruch 80, wobei die TG-immunstimulatorische Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure ist, und bevorzugterweise eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 % T, mehr als 35 % T, mehr als 40 % T, mehr als 50 % T oder mehr als 60 % T enthält.
Verwendung einer Py-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure und frei von einem nicht-methylierten CpG-Dinukleotid ist, für die Herstellung eines Medikaments für die Verabreichung an ein Nicht-Nagetierlebewesen in einer Menge, die wirksam ist, um eine Antigen-unspezifische angeborene Immunantwort in dem Nicht-Nagetierlebewesen zu induzieren.
Verwendung einer Py-reichen immunstimulatorischen Nukleinsäure, die eine T-reiche Nukleinsäure und frei von einem nicht-methylierten CpG-Dinukleotid ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Nicht-Nagetier in einer Menge, die wirksam ist, um eine Th2-Immunantwort auf eine Th1-Immunantwort umzusteuern.