CN101160399A - 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及3′－OH、5′－OH多核苷酸序列组合物以及激活个体的免疫应答、更优选激活个体的r抗原呈递细胞的方法。在一个实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。本发明也包括体外激活树突细胞的组合物和方法。然后可以将这些树突细胞给予个体。优选的3′－OH、5′－OH多核苷酸序列包含六个碱基，其中至少50％的所述碱基是鸟嘌呤并且所述5′碱基是鸟嘌呤。所述组合物可以包含磷酸二酯主链或硫代磷酸酯主链。

Description

寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用
发明领域
本发明涉及包括含3′-OH、5′-OH硫代磷酸酯和磷酸二酯多核苷酸的组合物及其调节免疫应答的用途。
发明背景
树突细胞(DC)是参与引发初次免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。它们的功能随成熟而变化。未成熟DC能非常有效地加工天然蛋白质抗原，但缺乏足够用于抗原呈递的细胞表面II类MHC和共同刺激分子。成熟DC较少能为呈递而捕获新蛋白质，但是能更有效地刺激静息的CD4和CD8T淋巴细胞。从形态学上讲，成熟DC增加细胞大小和颗粒性。成熟DC提高了细胞表面分子II类MHC、CD40、CD83和共同刺激分子CD80和CD86的水平。成熟DC的激活导致高水平IL-12的合成，从而既增强先天免疫又增强获得性免疫。
合成的寡核苷酸是聚阴离子序列。据报道合成寡核苷酸选择性结合核酸、特异性细胞蛋白、特异性核蛋白或特异性细胞表面受体。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的8-100个碱基的合成硫代磷酸酯寡核苷酸，已显示能刺激免疫***(美国专利第6,239,116号)。具体地说，已发现包含一个CpG基序(5′嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶3′)的合成硫代磷酸酯寡核苷酸，能刺激细胞因子例如IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α及GM-CSF的合成、天然杀伤细胞的裂解活性和B淋巴细胞的增殖(Krieg，Annu.Rev.Immunol.2002，20：709-760)。已报道包括一个CpG基序、其中碱基数目多于14个的合成硫代磷酸酯寡核苷酸，能触发树突细胞的成熟和活化：增加细胞大小和颗粒性；合成IL-12；增加细胞内吞作用；以及正调节细胞表面分子II类MHC、CD40、CD80、CD83和CD86(Sparwasser等，Eur.J.Immunol.1998，28：2045-205；Hartman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9305-9310；Askew等，J.Immunol.2000，165：6889-6895)。已报道包括一个CpG基序、其中碱基数目是30个的合成磷酸二酯寡核苷酸，能刺激合成IFN和正调节DC前体上CD80和CD86的表达(Kadowaski等，J.Immunol.2001 166：2291-2295)。
我们先前已描述了一种包含2-20个碱基的3′-OH、5′-OH合成寡核苷酸并且选自以下的组合物：(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb和a(TyGx)nb，其中x和y为1-7的整数，N为1-12的整数，a和b为一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中寡核苷酸介于2-20个碱基之间。这些组合物诱导一种选自以下的应答：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导胱冬蛋白酶(caspase)激活、诱导细胞凋亡和刺激单核细胞和外周血单核细胞合成细胞因子等(参见PCT公布号WO 01/44465)。
所需的是新的寡核苷酸组合物和利用这些组合物调节免疫细胞(包括树突细胞)功能的方法。
发明概述
本发明通过提供一种包含六碱基3′-OH、5′-OH多核苷酸的寡核苷酸组合物满足了这种需要。在一个实施方案中，所述多核苷酸的磷酸酯主链是磷酸二酯主链。在另一个实施方案中，所述多核苷酸的磷酸酯主链是硫代磷酸酯主链。优选该3′-OH、5′-OH多核苷酸是合成的，更优选该3′-OH、5′-OH多核苷酸选自5′GTGTGT3′(SEQ IDNO：1)、5′GGTGGG3′(SEQ ID NO：2)、5′GGGTGG3′(SEQ IDNO：3)、5′GGGCGG3′(SEQ ID NO：4)、5′GGGAGG3′(SEQ ID NO：5)、5′GGGGGG3′(SEQ ID NO：6)和5′GGCCGG3′(SEQ ID NO：7)。当将所述3′-OH、5′-OH多核苷酸给予人或动物时，能刺激免疫应答。该免疫应答可能是全身的或局部的。在一个实施方案中，所述3′-OH、5′-OH多核苷酸刺激已给予该多核苷酸的人或动物体内的APC。所述3′-OH、5′-OH多核苷酸也可在体外直接给予APC以刺激该APC。然后，可以将经刺激的APC给予人或动物，以激活所述人或动物的免疫应答。
如果给予DC，本发明的3′-OH、5′-OH多核苷酸通过诱导选自以下的应答刺激所述DC：增加IL-1β、IL-12或IFN-γ的产生，增加细胞大小和颗粒性，增加内吞作用，增加细胞表面CD80、CD83、CD86或II类MHC的表达以及减少细胞表面OX-2的表达。
本发明还提供一种将包含有效量的3′-OH、5′-OH多核苷酸和药学上可接受的载体的组合物给予动物或人的方法，以诱导刺激所述动物或人的免疫应答，更优选刺激所述动物或人的一种或多种APC。优选的APC是DC。在另一个实施方案中，给予动物或人除所述3′-OH、5′-OH多核苷酸组合物外的抗原，能使所述动物或人产生抗原特异性免疫应答。优选的抗原是肿瘤抗原和肝炎表面抗原。在某些实施方案中，刺激一种或多种APC使动物或人产生全身免疫应答。在其它实施方案中，所述免疫应答是局部的。本发明也包括将包含有效量的3′-OH、5′-OH多核苷酸和免疫调节剂或其形式的组合物给予动物或人的方法，以诱导刺激所述动物或人的免疫应答。
本发明也提供一种方法，所述方法包括将包含3′-OH、5′-OH多核苷酸和药学上可接受的载体的组合物体外给予含有抗原(包括肿瘤抗原)的APC、更优选DC，其中这种给予导致刺激所述APC。所述方法还可以包括将经刺激的APC引入到动物或人体内，以刺激所述动物或人的免疫应答。短六碱基3′-OH、5′-OH多核苷酸刺激APC(例如DC)的意想不到的和令人惊奇的能力为动物和人提供了重大益处。
本文描述的方法可用于治疗例如肿瘤等疾病、治疗***反应、免疫动物或人以抵抗多种病原体、治疗自身免疫病和预防移植排斥。在某些实施方案中，本发明通过增加IL-12的合成达到了治疗自身免疫病和预防移植排斥的目的。合成的IL-12能抑制自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)和***反应(参见例如Bagenstose等，J.Immunol.1998；160：1612(Downregulation of autoantibodyproduction in autoimmunity by IL-12(在自身免疫中IL-12负调节自身抗体的产生))；Vogel等，Eur.J.Immunol.，1996；26：219(Inhibition ofB1 lymphocyte，a B lymphocyte subset implicated in the development ofautoimmunity，by IL-12(IL-12对涉及自身免疫发生的B淋巴细胞亚群B1淋巴细胞的抑制))；Dey等，Blood，1998；91：3315(Inhibition ofgraft-versus-host disease(GVHD)by IL-12(IL-12对移植物抗宿主疾病(GVHD)的抑制))；Smits等，Int.Arch Allergy Immunol.，2001；126-102(Modification of the pathogenic Th2 immune profile toward a Th1profile by IL-12in the treatment of allergies(在***反应治疗中IL-12改善针对Th1分布型的致病Th2免疫分布型)))。在其它实施方案中，本发明通过免疫接种达到了治疗自身免疫病和预防移植排斥的目的(参见例如Zhang等，J.Mol.Med.1996；74：653(Vaccination againstautoreactive B or T lymphocytes responsible for autoreactive diseases(针对引起自身反应性疾病的自身反应性B或T淋巴细胞的疫苗接种))；Vignes等，Eur.J.Immunol.，2000；30：2460(Vaccination againstalloreactive T lymphocytes responsible for graft rejection(针对引起移植排斥的同种异体反应性T淋巴细胞的疫苗接种))；Liu等，J.Exp.Med.，2002；196：1013(Induction of immune tolerance by delivery of dying cellsto activated DC cells in situ(通过将濒死细胞原位传递到活化DC细胞而诱导免疫耐受性)))。
因此，本发明的一个目的是提供一种有效治疗动物(包括人)的疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效给动物或人进行免疫接种的组合物和方法。
本发明的又一个目的是提供一种有效治疗动物或人的癌症的组合物和方法。
本发明还有一个目的是提供一种有效刺激动物或人的免疫应答的组合物和方法。
本发明更进一步的目的是提供一种有效诱导动物或人的APC、优选DC成熟和/或激活的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效诱导体外刺激含有抗原的APC并将所述经刺激的APC给予动物或人的组合物和方法。
本发明的又一个目的是提供一种有效增加DC产生IL-1β、IL-12和/或IFNγ的组合物和方法。
本发明还有一个目的是提供一种有效增加DC的细胞大小和/或颗粒性的组合物和方法。
本发明更进一步的目的是提供一种有效增加DC内吞作用的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效增加DC细胞表面的CD40、CD80、CD86和/或II类MHC水平的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种有效减少DC细胞表面OX-2水平的组合物和方法。
本发明的又一个目的是提供一种增强其它治疗剂或免疫调节剂的效能的组合物和方法。
本发明还有一个目的是提供一种增强APC、优选DC上一种或多种细胞因子的效能的组合物和方法。
本发明更进一步的目的是提供一种增强DC上GM-CSF的效能的组合物和方法。
在参阅下面公开实施方案的详细描述和所附权利要求书后，本发明这些和其它目的、特征和优势将会是显而易见的。
发明详述
本发明提供一种包括含六碱基的分离的3′-OH、5′-OH多核苷酸序列的组合物，其中至少50％的所述碱基是鸟嘌呤，所述5′碱基是鸟嘌呤，其中所述组合物刺激给予所述组合物的动物或人产生免疫应答。本发明也提供一种方法，所述方法包括将包含有效量的3′-OH、5′-OH多核苷酸和药学上可接受的载体的组合物给予动物或人，以刺激所述动物或人体内的一种或多种抗原呈递细胞(APC)，或优选一种或多种DC。刺激所述动物或人体内的一种或多种APC可产生全身免疫应答或局部免疫应答。本发明也提供一种方法，所述方法将包含有效量的3′-OH、5′-OH多核苷酸的组合物体外给予含有抗原的APC，以刺激所述APC。然后，可以将这些APC与药学上可接受的载体一起给予动物或人，以刺激免疫应答。可以向这些给予动物或人的任一组合物中加入免疫调节剂、赋形剂、稀释剂和/或载体。本发明也包括所述3′-OH、5′-OH多核苷酸在制备用于刺激动物或人的免疫应答和体外刺激抗原呈递细胞的药物中的用途。合成的六碱基3′-OH、5′-OH磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸诱导刺激APC(例如DC)的意想不到的和令人惊奇的能力为动物和人提供了重大益处。
本文所用的术语“3′-OH、5′-OH多核苷酸”是指在其3′端和5′端均具有羟基部分的多核苷酸。更具体地讲，本发明的3′-OH、5′-OH多核苷酸在多核苷酸3′端糖的3′碳处包含一个羟基部分并且在多核苷酸5′端糖的5′碳处包含一个羟基部分。在本发明的一个实施方案中，所述3′-OH、5′-OH多核苷酸由6个核苷酸碱基组成。优选所述3′-OH、5′-OH多核苷酸包含6个核苷酸碱基，其中这些核苷酸碱基中至少50％是鸟嘌呤(G)，并且其中5′核苷酸碱基是G。在一个更优选的实施方案中，所述3′-OH、5′-OH多核苷酸包含5′GGNNGG3′(SEQ ID NO：8)序列或5′GGGNGG3′(SEQ ID NO：9)序列或者由所述序列组成，其中N为G、C、A或T。所述3′-OH、5′-OH多核苷酸可具体包含选自以下的序列或者由所述序列组成：5′GTGTGT3′(SEQ ID NO：1)、5′GGTGGG3′(SEQ ID NO：2)、5′GGGTGG3′(SEQ ID NO：3)、5′GGCCGG3′(SEQ ID NO：4)、5′GGGGGG3′(SEQ ID NO：5)、5′GGGAGG3′(SEQ ID NO：6)和5′GGGCGG3′(SEQ ID NO：7)。在一个实施方案中，将载体中的所述3′-OH、5′-OH多核苷酸给予APC、DC、人或动物。
这些3′-OH、5′-OH多核苷酸可包含磷酸二酯主链或修饰磷酸酯主链，例如硫代磷酸酯主链。含有磷酸二酯主链并且对应于上述序列号的3′-OH、5′-OH多核苷酸在下文如下称谓：5′GTGTGT3′(SEQ IDNO：1)(N1A)、5′GGTGGG3′(SEQ ID NO：2)(N2A)、5′GGGTGG3′(SEQID NO：3)(N3A)、5′GGCCGG3′(SEQ ID NO：4)(N4A)、5′GGGGGG3′(SEQ ID NO：5)(N5A)、5′GGGAGG3′(SEQ ID NO：6)(N6A)和5′GGGCGG3′(SEQ ID NO：7)(N7A)。在这些实施方案中，所述多核苷酸链中的每个核苷酸都是磷酸二酯核苷酸。含有硫代磷酸酯主链并且对应于上述序列号的3′-OH、5′-OH多核苷酸在下文如下称谓：5′GTGTGT3′(SEQ ID NO：1)(N1B)、5′GGTGGG3′(SEQ ID NO：2)(N2B)、5′GGGTGG3′(SEQ ID NO：3)(N3B)、5′GGCCGG3′(SEQ IDNO：4)(N4B)、5′GGGGGG3′(SEQ ID NO：5)(N5B)、5′GGGAGG3′(SEQID NO：6)(N6B)和5′GGGCGG3′(SEQ ID NO：7)(N7B)。在这些实施方案中，所述多核苷酸链中的每个核苷酸都是硫代磷酸酯核苷酸。本发明也包括含一个或多个磷酸二酯核苷酸和一个或多个硫代磷酸酯核苷酸的3′-OH、5′-OH多核苷酸。所述3′-OH、5′-OH多核苷酸优选是N1A、N2B、N3B或N5B，更优选是N3B或N5B。
另外，本文所用的术语“刺激”是指各种各样的DC或APC的激活或成熟，或者免疫应答的激活或增加，这取决于该术语的使用范围。DC的刺激可由以下证据获得证实：细胞大小和/或颗粒性增加；IL-1β、IL-12和/或IFN-γ的产生增加；内吞作用增加；CD80、CD83、CD86、II类MHC或其任何组合的细胞表面表达增加；OX-2的细胞表面表达减少；或它们的任何组合。因此，“树突细胞应答”包括但不限于细胞大小和/或颗粒性增加；IL-1β、IL-12和/或IFN-γ的产生增加；内吞作用增加；CD80、CD83、CD86或II类MHC的细胞表面表达增加；OX-2的细胞表面表达减少；或它们的任何组合。术语“树突细胞”和“DC”包括但不限于间质DC、朗格汉斯细胞衍生的DC、浆细胞样DC和前述细胞的任何祖细胞。本文所用的术语“产生”是指分子的合成和/或分泌。在一个优选的实施方案中，所述树突细胞是间质DC。
相信本文描述的3′-OH、5′-OH多核苷酸不仅能刺激DC，而且能刺激其它APC，包括专职APC，例如但不限于单核细胞、巨噬细胞、郎格汉斯细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肝巨噬细胞、小胶质细胞、神经膜细胞和内皮细胞；和非专职APC，例如但不限于上皮细胞、成纤维细胞、黑素细胞、神经细胞、平滑肌细胞、肌细胞、肝细胞、星形胶质细胞和角化细胞。因此，本发明包括用于激活APC的组合物和方法。
如果涉及免疫应答，术语“刺激”通常是指以抗原非特异性方式激活免疫***或者激活免疫***的组分，除非另有说明。个体免疫应答的刺激可由以下但不限于以下的证据获得证实：细胞增殖、克隆扩充、新蛋白质合成、分化成效应细胞、分化成记忆细胞、抗体类型的水平或数量增加、抗体类别转换、产抗体B淋巴细胞中的体细胞高变、免疫细胞类型的水平或数量增加、免疫细胞在特定部位的募集(游动和迁移)、个体细胞因子的水平或数量增加、个体趋化因子的水平或数量增加、抗原呈递增加、内吞作用增加、共同刺激分子(辅助分子)增加或获得、粘着分子增加或获得、细胞因子受体增加或获得、趋化因子受体增加或获得、细胞介导的细胞毒性增加、形态改变、免疫细胞记忆建立、活性氧中间体的水平或数量增加、一氧化氮的水平或数量增加、神经内分泌分子(如激素、神经递质等)的水平或数量增加以及免疫耐受性或免疫抑制破坏。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞，例如B细胞、T细胞，包括CD4+细胞和CD8+细胞和NK细胞；单核吞噬细胞；粒细胞，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；如本文所描述的树突细胞；和前述细胞的任何祖细胞。抗体类型包括IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和IgY。
在一个实施方案中，所述免疫应答是全身免疫应答。术语“全身免疫应答”在本文中是指不限于机体特定部位的免疫应答。全身免疫应答的一个实例是给予个体抗原和免疫刺激分子后所述个体循环***或淋巴***中的抗体循环水平增加。另一个实例是给予个体免疫刺激分子后所述个体循环***或淋巴***中的细胞因子和/或趋化因子水平增加。另一个实例是在血液或淋巴循环***或免疫***器官例如脾脏、***或肝脏中存在能够响应致敏抗原攻击的敏化免疫效应细胞如T细胞、B细胞或浆细胞。在其它实施方案中，所述免疫应答是局部免疫应答。术语“局部免疫应答”是指主要但不一定完全限于机体具体部位的免疫应答。局部免疫应答可由局部肿胀或发红和/或免疫细胞募集(游动和迁移)到机体具体部位获得证实。例如，粘膜免疫应答可在粘膜给予抗原和/或免疫刺激分子例如本文描述的3′-OH、5′-OH多核苷酸后出现。粘膜应答可以包括但不限于抗体类型的水平或数量增加、IgA抗体的水平或数量增加、γ/δ阳性T淋巴细胞活化、诱导局部免疫耐受性和诱导全身免疫耐受性。
在本发明的几个实施方案中，将所述3′-OH、5′-OH多核苷酸给予个体(即动物或人)，以治疗或预防疾病。本文所用的术语“疾病”是指其中身体健康受损的病症，包括但不限于癌症、病原体(包括病毒、细菌或寄生虫)感染、***反应、自身免疫病和对移植器官的自身免疫应答。在某些实施方案中，所述疾病与DC功能失常相关，包括但不限于赛塞利综合征(Sezary syndrome)(患者具有循环DC深度缺乏)(Wysocka等，Blood 2002，100：3287)、唐氏综合征(Down′ssyndrome)(患者具有树突萎缩)(Takashima等，J.Intellect.Disabil.Res.1994，38：265)、涉及DC不适当激活的自身免疫病(例如DC呈递自体抗原延长)(Erikson等，J.Exp.Med.2003，197：323和Ludewig等，Curr.Opin.Immunol.2001，13：657)、脊髓损伤(患者具有树突萎缩)(Iversen等，Blood 2000，96：2081)和格雷夫斯病(Graves′disease)(所述疾病中甲状腺树突细胞缠结)(Quadbeck等，Scand.J.Immunol.2002，55：612)。术语“治疗”是指疾病症状减轻并不需要治愈所述疾病。另外，本文所用的术语“有效量”是指有效诱导免疫应答的3′-OH、5′-OH多核苷酸的量。可以通过包括但不限于以下的方法来增强3′-OH、5′-OH多核苷酸的治疗功效：化学修饰碱基、糖或磷酸酯主链，利用含有适当序列的细菌质粒化学补充或生物技术扩增所述序列，使所述序列与生物学或化学载体复合；或者使所述序列与针对细胞类型的配体或抗体偶联。
本发明的3′-OH、5′-OH多核苷酸可与药学上可接受的载体混合，作为组合物在体外或体内给予细胞，优选APC，更优选DC。在本发明的一个实施方案中，将包含有效刺激DC量的3′-OH、5′-OH多核苷酸的组合物在体外给予DC。然后，将所述DC与药学上可接受的载体一起给予动物或人，以刺激所述动物或人的免疫应答。在一个优选的实施方案中，所述树突细胞是未成熟DC，其特征包括但不限于下列各项：高胞内水平的II类MHC；高内吞活性；高水平的特异性趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6和CXRC1；低水平的CCR7；高水平的CD36、CD68、CD47和CD91分子；低水平的共同刺激分子CD40、CD54、CD58、CD80和CD83；缺乏DC-LAMP(LAMP；溶酶体相关膜蛋白)；细胞表面存在的DCIR(DC免疫受体)、CLEC-1(C-凝集素受体)、DC-ASGPR(DC-脱唾液酸糖蛋白)、MN(甘露糖受体)、TLR-2和TLR-3(Toll样受体)、FCγR、FcεR、整联蛋白αvβ5和αvβ3。未成熟DC可存在于外周血。在一个更优选的实施方案中，未成熟DC在将3′-OH、5′-OH多核苷酸给予DC之前就含有抗原或者接触了抗原。非限制性获得含有抗原的DC的方法包括抗原脉冲和利用经遗传修饰的DC表达一种或数种抗原。
人们将会理解，可以将有效量的一种或多种3′-OH、5′-OH多核苷酸在体外单独给予DC或者与其它影响含有抗原(包括肿瘤抗原)的DC的免疫调节剂联合给予DC，以有效诱导刺激设计用以再注射到动物或人的DC，从而刺激免疫应答。免疫调节剂包括但不限于下列各项：氢氧化铝；磷酸铝；磷酸钙；聚合物；共聚物，例如聚氧乙稀-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005；弗氏完全佐剂(用于动物)；弗氏不完全佐剂；失水山梨糖醇一油酸酯；角鲨烯；CRL-8300佐剂；QS 21；皂苷；ISCOM；胞壁酰二肽；葡糖胺胞壁酰二肽；海藻糖；细菌提取物，包括分枝杆菌提取物；细菌完整细胞，包括分枝杆菌完整细胞；解毒内毒素；膜脂；从原核生物分离的DNA；CpG合成寡核苷酸；非CpG合成寡核苷酸；适体(apatamer)；质粒免疫刺激分子；聚(I:C)分子；细胞因子；趋化因子；脱乙酰壳多糖及其衍生物；透明质酸及其衍生物；霍乱毒素；百日咳毒素和匙孔嘁血蓝蛋白；或它们的组合。3′-OH、5′-OH多核苷酸或3′-OH、5′-OH多核苷酸加上免疫调节剂可以在单次治疗或多次治疗中任选以不同浓度并且在适合刺激DC的时间段内加入到DC中。所述3′-OH、5′-OH多核苷酸可以在给予所述免疫调节剂之前、同时或之后加入。此外，所述3′-OH、5′-OH多核苷酸可以在给予所述抗原之前、同时或之后加入。
本发明也包括给予动物或人3′-OH、5′-OH多核苷酸和未包含在DC中的抗原的方法，其中这种给予使动物或人产生免疫应答，更优选产生抗原特异性免疫应答。所述抗原可以在给予3′-OH、5′-OH多核苷酸之前、同时或之后给予动物或人。在一个优选的实施方案中，所述抗原与所述3′-OH、5′-OH多核苷酸同时给予。
本文所描述的抗原并不限于任何具体的抗原或抗原类型。在一个实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原，例如源自肿瘤细胞裂解物的肿瘤抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是源自病原体的抗原，更优选在病原体表面表达的抗原。一个源自病原体的表面抗原实例是肝炎表面抗原。如果将所述抗原(未包含在DC中)给予动物或人，则所述抗原可作为蛋白质、肽或多肽给予，或者可以给予编码所述抗原的多核苷酸。编码所述抗原的多核苷酸可包含在含有其它元件的载体中，使得其可以在动物或人体内表达所述抗原多肽。在一个实施方案中，所述抗原和3′-OH、5′-OH多核苷酸包含在不同的载体中。
将经3′-OH、5′-OH多核苷酸刺激的、含有抗原的DC给予动物或人，或者将3′-OH、5′-OH多核苷酸和抗原给予动物或人，导致刺激所述动物或人的免疫应答。在优选的实施方案中，这种给予导致刺激所述动物或人的免疫***以及抗原特异性免疫应答。术语“抗原特异性免疫应答”是指主要直接针对所述抗原的免疫应答。抗原特异性免疫应答包括以下方面或者由以下方面组成：抗体量(抗体效价)增加、抗体类别转换、产抗体B淋巴细胞的体细胞高变、免疫细胞记忆建立、在给予所述抗原的人和动物体内带有针对所述抗原的特异性B细胞受体或T细胞受体的细胞量增加。当抗体以足够亲和力和亲合力结合特定抗原并导致产生抗原-抗体复合物时，所述抗体对所述抗原是“特异性”的
给药形式包括但不限于注射剂、溶液剂、乳膏剂、凝胶剂、植入物、泵、软膏剂、乳剂、混悬剂、微球、颗粒剂、微粒、纳米粒、脂质体、糊剂、贴剂、片剂、透皮递药装置、喷雾剂、气雾剂或其它本领域普通人员熟悉的剂型。本发明的药用制剂可通过本领域已知的方法并使用熟知的和容易获得的成分来制备。例如，所述化合物可以与常用赋形剂、稀释剂或载体一起配制成片剂、胶囊剂、混悬剂、粉剂等。适用于所述制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括下列各项：填充剂和增量剂(例如淀粉、糖、甘露糖醇和硅衍生物)；粘合剂(例如羧甲基纤维素及其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)；湿润剂(例如甘油)；崩解剂(例如碳酸钙和碳酸氢钠)；溶液型阻滞剂(例如石蜡)；吸收加速剂(例如季铵化合物)；表面活性剂(例如鲸蜡醇、甘油一硬脂酸酯)；吸附载体(例如高岭土和膨润土)；乳化剂；防腐剂；甜味剂；稳定剂；着色剂；芳香剂；矫味剂；润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁)；固态聚乙二醇；和它们的混合物。
所述制剂也可这样建立使它们仅在或优选在特定部位释放活性成分，并可在一段时间内释放活性成分(即缓释制剂)。这样的组合还提供进一步控制释放动力学的机制。包衣、被膜和保护骨架可以用聚合物和蜡制备。
可以通过将所述3′-OH、5′-OH多核苷酸和药学上可接受的载体均匀地混合，来制备包含一种或多种3′-OH、5′-OH多核苷酸和药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体包括液体载体、固体载体或它们两者。液体载体是水性载体、非水性载体或它们两者，并且包括但不限于水性悬浮剂、油乳剂、油包水乳剂、水包油包水型乳剂、位点特异性乳剂、长滞留乳剂、粘性乳剂、微乳剂和纳米乳剂。固体载体是生物学载体、化学载体或它们两者，并且包括但不限于病毒载体***、颗粒、微粒、纳米粒、微球、纳米球、微型泵、细菌细胞壁提取物和生物可降解或生物不可降解天然或合成聚合物，使得可以持续释放所述寡核苷酸组合物。可以将乳剂、微型泵和聚合物植入需要递药的附近(Brem等，J.Neurosurg.74：441，1991)。用于使3′-OH、5′-OH多核苷酸与固体载体复合的方法包括但不限于直接吸附到固体载体表面、直接或通过连接部分共价偶联到固体载体表面和共价偶联到用于制备所述固体载体的聚合物上。可以任选通过加入非离子型或离子型聚合物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TWEEN)或透明质酸，使序列稳定。
优选的水性载体包括但不限于水、盐水和药学上可接受的缓冲液。优选的非水性载体包括但不限于矿物油或中性油，包括但不限于甘油二脂、甘油三脂、磷脂、脂质、油和它们的混合物，其中所述油含有合适的多不饱和和饱和的脂肪酸的混合物。实例包括但不限于豆油、低芥酸菜子油、棕榈油、橄榄油和myglyol，其中所述脂肪酸可能是饱和的或不饱和的。所述药学上可接受的载体无论是否用来将3′-OH、5′-OH多核苷酸组合物呈递给细胞，都可以任选包括赋形剂。这些赋形剂包括但不限于抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，并且可以包括悬浮剂和增稠剂。
可以将一种或多种3′-OH、5′-OH多核苷酸单独给予人或动物，或者将其与其它免疫调节剂联合给予人和动物，所述免疫调节剂包括但不限于以下各项：氢氧化铝；磷酸铝；磷酸钙；聚合物；共聚物如聚氧乙稀-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005；弗氏完全佐剂(用于动物)；弗氏不完全佐剂；失水山梨糖醇一油酸酯；角鲨烯；CRL-8300佐剂；QS 21；皂苷；ISCOM；胞壁酰二肽；葡糖胺胞壁酰二肽；海藻糖；细菌提取物，包括分枝杆菌提取物；细菌完整细胞，包括分枝杆菌完整细胞；解毒内毒素；膜脂；从原核生物分离的DNA；CpG合成寡核苷酸；非CpG合成寡核苷酸；适体；编码免疫刺激分子的质粒；聚(I:C)分子；细胞因子；趋化因子；脱乙酰壳多糖及其衍生物；透明质酸及其衍生物；霍乱毒素；百日咳毒素和匙孔嘁血蓝蛋白；或它们的组合。
另外，可以将一种或多种3′-OH、5′-OH多核苷酸单独给予，或与其它治疗剂联合给予，所述治疗剂包括但不限于化疗剂、抗菌剂或抗病毒剂。化疗剂包括但不限于抗代谢剂、DNA损伤剂、微管去稳定剂、微管稳定剂、肌动蛋白解聚剂、生长抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、HMG-Co A抑制剂、嘌呤抑制剂、嘧啶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、CDK抑制剂、血管生成抑制剂和分化增强剂。这些其它治疗剂的给药剂量和方法是本领域普通技术人员已知的。
本发明的3′-OH、5′-OH多核苷酸、含有所述3′-OH、5′-OH多核苷酸的APC或DC细胞、或包含3′-OH、5′-OH多核苷酸及其它特别适合各种剂型的材料如本发明载体的组合物等的给药方法包括但不限于下列给药类型：口服(如口腔或舌下)给药、***给药、直肠给药(如栓剂)、局部给药、胃肠外给药、鼻腔给药(如气雾剂)、吸入给药、鞘内给药、腹腔内给药、静脉内给药、动脉内给药、经皮给药、皮内给药、真皮下给药、皮下给药、肌内给药、组织内(组织或腺体)给药、子宫内给药、***给药、机体腔内给药、肿瘤或内伤部位手术给药、肿瘤内直接给药、器官的腔内或软组织内给药、骨髓内给药以及胃肠道、生殖***、泌尿***和泌尿生殖器***的任何粘膜表面给药。在一个优选的实施方案中，将本发明的3′-OH、5′-OH多核苷酸给予选自以下的粘膜表面：膀胱内、眼、口、鼻、直肠和***表面。以上提及的各种给药形式中所用的技术包括但不限于局部施用、摄入、外科手术给药、注射、喷雾、透皮递药装置、渗透泵、直接在所需部位电淀积或其它本领域普通技术人员熟悉的技术手段。施用部位可以是外部，如表皮上，或是内部，例如胃溃疡，手术部位，或是其它部位。
本发明组合物可以适用于以下形式：乳膏剂、凝胶剂、溶液剂、混悬剂、脂质体、微粒或其它对制剂或组合物给药领域技术人员已知的形式。超细颗粒大小可用于治疗剂的吸入给药。某些合适的皮下给药用制剂的实例包括但不限于植入物、贮库型制剂、针剂、胶囊剂和渗透泵。某些合适的***给药用制剂的实例包括但不限于乳膏剂和环形物。某些合适的口服给药用制剂的实例包括但不限于丸剂、液体制剂、糖浆剂和混悬剂。某些合适的透皮给药用制剂的实例包括但不限于凝胶剂、乳膏剂、糊剂、贴剂、喷雾剂和凝胶剂。某些合适的皮下给药递送装置的实例包括但不限于植入物、贮库型制剂、针剂、胶囊剂和渗透泵。适合胃肠外给药的制剂包括但不限于水性和非水性无菌注射液，所述注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预期受体血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，所述混悬剂可以包括悬浮剂和增稠剂。可以用本领域普通技术人员常规使用的无菌粉针剂、颗粒剂和片剂来制备临时用的注射液和注射用混悬剂。
可以将本发明组合物与例如一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的实施方案可以便利存在于单位剂型中，并且可通过常规的制药技术制备。这些技术包括将含有活性成分的组合物和药用载体或赋形剂混合在一起的步骤。一般而言，通过将活性成分与液体载体均匀地混合在一起来制备所述制剂。优选的单位剂量制剂是那些含有给药成分的一个剂量或单位或合适部分的制剂。人们应理解，除以上具体提及的成分之外，包含本发明组合物的制剂可以包括本领域普通技术人员通常使用的其它药剂。
给药体积将会根据给药途径而变化。这样的体积是将组合物给予动物或人的领域的普通技术人员已知的。根据给药途径，每剂体积优选约0.001-100ml/剂，更优选约0.01-50ml/剂，最优选约0.1-30ml/剂。例如，肌内注射的体积范围可以为约0.1ml至1.0ml。单独给予或者与其它治疗剂联合给予的寡核苷酸组合物可以在单剂量治疗中给予、在多剂量治疗中给予或按疗程和适合待治疗疾病、受体病症和给药途径的时段内连续输注。此外，其它治疗剂可在给予所述寡核苷酸组合物之前、同时或之后给予。
每剂给予的3′-OH、5′-OH多核苷酸的量为优选约0.0001-100mg/kg体重，更优选约0.001-10mg/kg体重，最优选约0.01-5mg/kg体重。给予的具体3′-OH、5′-OH多核苷酸和具体治疗剂、每剂的量、给药时间表和给药途径应该由主治医师使用本领域技术人员已知的方法并且根据以下因素来决定：疾病类型、疾病的严重程度、疾病部位和其它临床因素，例如受体的体型、体重和身体一般状况。另外，体外实验可任选用于帮助鉴定最佳的给予次序和次序加上治疗剂的范围。
下面的实施例将用来进一步地说明本发明，然而，同时该实施例并不构成对本发明的任何限制。相反，需清楚地了解，在阅读本发明说明书之后，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以采取各种各样的其它实施方案、修改及其等同实施方案。
实施例1
3′-OH、5′-OH多核苷酸的制备
3′-OH、5′-OH多核苷酸序列由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)用算盘片断合成技术(Abacus Segmented Synthesis Technique)制备。除非另有说明，临用前将所述序列分散于高压灭菌的去离子水中或者分散于药学上可接受的缓冲液(例如但不限于盐水)中。可以使用下列序列：N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A和N7B。
实施例2
树突细胞
人树突细胞得自Clonetics(San Diego，CA，USA)，并在由Clonetics推荐的培养基中培养。DC得自三个不同的个体(参见表1)。对这些个体的每一个进行主要组织相容性分型，并且显示几个HLA(人白细胞抗原)型。
表1.
DC特征
  个体   性别   年龄   HLA-A   HLA-B   HLA-C   HLA-DRB1
  A   F   32   020130   4162   0317   0408
  B   M   22   020123   3751   0615   0413
  C   F   31   020111   0835   0407   0313
实施例3
与3′-OH、5′-OH多核苷酸一起培养的DC的细胞大小和颗粒性增加
将1.0ml DC按1.0×105细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。利用FACSCalibur流式细胞仪测定细胞大小(FCS：前向侧散射)和颗粒性(SSC：侧向光散射)，并用CELLQuest Pro软件(两者均得自Becton-Dickinson，San Diego，CA，USA)进行分析。从三个不同个体分离的DC在用3′-OH、5′-OH多核苷酸处理后，测定显示FCS＞500单位和SSC＞400单位的DC百分率。
表2
用3′-OH、5′-OH多核苷酸处理后，显示FCS＞500单位和SSC＞400单位的DC百分率。该百分率以FACS测定的每组DC的总群体为基准。
Figure A0381435500211
如表2所示，根据细胞大小(FCS)和颗粒性(SSC)增加测定，许多序列诱导刺激/成熟DC。
实施例4
诱导IL-1β的产生
将1.0ml DC按1.0×105细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，利用商业ELISA(BioSource，Camarillo，CA，USA)测定100μl培养上清液中IL-1β的产生。结果表示为经处理的DC产生的IL-1β与对照细胞产生的IL-1β之比值即“倍数”(x)。
表3
DC产生的IL-1β(相对于未处理的DC的倍数)
Figure A0381435500221
如表3所示，多核苷酸N3B和多核苷酸N5B诱导来源于三个测试个体细胞中IL-1β的产生。
实施例5
诱导IL-12的产生
将1.0ml DC按1.0×105细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，利用商业ELISA(BioSource)测定100μl培养上清液中IL-12的产生。结果表示为经处理的DC产生的IL-12与对照细胞产生的IL-12之比值即“倍数”(x)。
表4
DC产生的IL-12(相对于未处理的DC的倍数)
如表4所示，许多序列诱导产生IL-12。
实施例6
诱导IFN-γ的产生
将1.0ml DC按1.0×105个细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，利用商业ELISA(BioSource，Camarillo，CA，USA)测定100μl培养上清液中IFN-γ的产生。结果表示为经处理的DC产生的IFN-γ与对照细胞产生的IFN-γ之比值即“倍数”(x)。
表5
DC产生的IFN-γ(相对于未处理的DC的倍数)
Figure A0381435500241
如表5所示，多核苷酸N3B和多核苷酸N5B诱导三个测试个体的细胞中IFN-γ的产生。
实施例7
序列加GM-CSF诱导IL-12
将1.0ml来自个体B的DC按1.0×105个细胞/ml与500单位人重组GM-CSF(Clonetics)和100μg的六碱基N1A多核苷酸或N7A多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，利用商业ELISA(BioSource)测定100μl培养上清液中IL-12的产生。结果表示为在不存在或存在重组GM-CSF的情况下，经处理的DC产生的IL-12与对照细胞产生的IL-12之比值即“倍”(x)。
表6
在存在GM-CSF的情况下来自个体B的DC产生的IL-12(相对于未处理的DC的倍数)
如表6所示，可观察到GM-CSF与多核苷酸N1A或多核苷酸N7A对DC产生IL-12的协同作用。
实施例8
增加DC细胞表面的CD40水平
将1.0ml来自个体B和个体C的DC按1.0×105个细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，用FITC-缀合的抗CD40单克隆抗体通过流式细胞仪(FACSCalibur***)测定所述细胞表面CD40的水平，并用CELLQuest Pro(都来自Becton Dickinson)进行分析。结果表示为处理后的CD40hiDC百分率。术语“CD40hi”是指流式细胞仪鉴定的、高于CD40基线表达的细胞群体。
表7
处理后的CD40hi DC百分率
Figure A0381435500261
如表7所示，许多序列具有明显正调节DC细胞表面CD40表达的能力。**p＜0.001 Kolmogorov-Smirnov(D＞0.20)。
实施例9
增加DC细胞表面CD 80水平
将1.0ml来自个体B和个体C的DC按1.0×105个细胞/ml与一起100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，用FITC-缀合的抗CD80(Serotec，Oxford，U.K.)单克隆抗体通过流式细胞仪测定所述细胞表面CD80的水平，并用CELLQuest进行分析。结果表示为处理后的CD80hiDC百分率。
表8
处理后的CD80hiDC百分率
Figure A0381435500271
如表8所示，许多序列明显正调节DC细胞表面CD80的表达。
**p＜0.001Kolmogorov-Smirnov(D＞0.20)。
实施例10
增加DC细胞表面CD 86水平
将1.0ml来自个体B和个体C的DC按1.0×105个细胞/ml与一起100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，用PE-缀合的抗CD86(Serotec)单克隆抗体通过流式细胞仪测定所述细胞表面CD86的水平，并用CELLQuest Pro进行分析。结果表示为处理后的CD86hiDC百分率。
表9
处理后的CD86hiDC百分率
Figure A0381435500281
如表10所示，许多序列明显正调节DC细胞表面CD86表达。**p＜0.001 Kolmogorov-Smirnov(D＞0.20)。
实施例11
增加DC细胞表面MHC-II水平
将1.0ml来自个体B的DC按1.0×105个细胞/ml与100μg的六碱基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，用FITC-缀合的抗MHC II(Serotec)单克隆抗体通过流式细胞仪测定所述细胞表面的MHC II水平，并用CELLQuest Pro进行分析。结果表示为处理后的MHC IIhiDC百分率。
表10
处理后的MHC-IIhiDC百分率
  序列   从个体B中分离的DC
  未处理的   22
  N1A   32**
  N1B   7
  N2A   42**
  N2B   30
  N3A   23
  N3B   25
  N5A   19
  N5B   18
  N6A   25
  N6B   27
  N7A   21
  N7B   31**
如表10所示，多核苷酸N1A、N2A和N7B明显正调节DC细胞表面MHC II的表达。**p＜0.001Kolmogorov-Smirnov(D＞0.12)。
实施例12
减少DC细胞表面OX-2水平
将1.0ml来自个体A的DC按1.0×105个细胞/ml与1μg、10μg或100μg的六碱基N3A或N6A多核苷酸一起接种到6孔平底组织培养板中并孵育48小时。孵育48小时后，用FITC-缀合的抗OX-2(BioSPARK，Greenwich，CT，USA)单克隆抗体通过流式细胞仪测定所述细胞表面的OX-2水平，并用CELLQuest Pro进行分析。已发现一种DC表面抗原OX-2可抑制刺激Th1细胞因子产生并提供免疫细胞耐受信号(Gorczynski等，J.Immunol.1999 162：774-781)。结果表示为处理后的OX-2hiDC百分率。
表11
处理后OX-2hiDC百分率
  序列   OX-2百分率
  未处理的   66
  N3A 1.0μg   61
  N3A 10.0μg   51**
  N3A 100.0μg   51**
  N6A 1.0μg   64
  N6A 10.0μg   62
  N6A 100.0μg   64
如表12所示，多核苷酸N3A明显负调节DC细胞表面OX-2的表达。**p＜0.001 Kolmogorov-Smirnov(D＞0.20)。
实施例13
增加DC的内吞作用
在不存在或存在100μg的六碱基N2A、N2B、N3A、N3B、N5A、N5B和N6B多核苷酸的情况下，将1.0ml来自个体B的DC按1.0×105个细胞/ml与1mg/ml FITC-葡聚糖(20kDa；Sigma-Aldrich)一起在4℃(对照细胞表面FITC-葡聚糖的结合)和37℃(评价内吞作用)接种到6孔平底组织培养板中并孵育24小时。用冰冷却的磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞三次，并通过流式细胞仪用CELLQuest Pro进行分析。结果表示为相对内吞率(标准化Δ平均荧光值(ΔMFV))。ΔMFV＝在37℃暴露于FITC-葡聚糖的DC的MFV-在4℃暴露于FITC-葡聚糖的DC的MFV。ΔMFV＝(序列ΔMFV/对照ΔMFV)×100。
表12
处理后DC的相对内吞率
Figure A0381435500311
如表12所示，N2A、N2B、N3A、N5A和N5B多核苷酸增加DC的内吞率。
实施例14
癌症免疫接种抗原脉冲的DC
给来自B-16黑素瘤细胞的肿瘤细胞裂解物在体外加载从C57BL/6小鼠分离的DC。在抗原脉冲期间包括N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸。给75只C57BL/6小鼠皮下注射约2×106个B-16黑素瘤细胞。
肿瘤接种后7天，将小鼠分成15组，每组5只小鼠。第1组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC免疫接种；第2组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N1A多核苷酸免疫接种；第3组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N1B多核苷酸免疫接种；第4组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N2A多核苷酸免疫接种；第5组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N2B多核苷酸免疫接种；第6组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N3A多核苷酸免疫接种；第7组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N3B多核苷酸免疫接种；第8组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N4A多核苷酸免疫接种；第9组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N4B多核苷酸免疫接种；第10组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N5A多核苷酸免疫接种；第11组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N5B多核苷酸免疫接种；第12组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N6A多核苷酸免疫接种；第13组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N6B多核苷酸免疫接种；第14组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N7A多核苷酸免疫接种；第15组小鼠用2×104B-16肿瘤裂解物脉冲的DC+100μg N7B多核苷酸免疫接种。
1周后重复前面描述的免疫接种。2周后，分析肿瘤的体积和重量。第2-15组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠的肿瘤质量小。通过IFN-γELISPOT，利用注射肿瘤裂解物脉冲的DC之前和之后的小鼠外周血单核细胞，分析特异性针对B-16抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。第2-15组小鼠中针对B-16的CTL的频率比第1组小鼠中的高。
实施例15
免疫接种百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)脉冲的DC
给107个热灭活的百日咳博德特氏菌在体外加载从C57BL/6小鼠分离的DC。在抗原脉冲期间包括N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸。将70只C57BL/6小鼠分成15组，每组5只。第1组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC；第2组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N1A多核苷酸；第3组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N1B多核苷酸；第4组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N2A多核苷酸；第5组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N2B多核苷酸；第6组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N3A多核苷酸；第7组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N3B多核苷酸；第8组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N4A多核苷酸；第9组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N4B多核苷酸；第10组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N5A多核苷酸；第11组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N5B多核苷酸；第12组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N6A多核苷酸；第13组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N6B多核苷酸；第14组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N7A多核苷酸；第15组小鼠免疫接种107个热灭活的百日咳博德特氏菌脉冲的DC+100μg的N7B多核苷酸。
以上所述的免疫接种每间隔一周重复二次。最后一次给予DC后2周，小鼠用5×106的百日咳博德特氏菌(鼻内给予)进行攻击。攻击后杀死动物，并测定血清中的百日咳博德特氏菌特异性IgG水平、肺中细菌负荷量和肺中百日咳博德特氏菌特异性抗体分泌细胞量。第2-15组小鼠显示比第1组小鼠高的百日咳博德特氏菌特异性IgG水平。第2-15组小鼠显示比第1组小鼠少的肺中百日咳博德特氏菌负荷量。第2-15组小鼠显示比第1组小鼠高的肺中百日咳博德特氏菌特异性抗体分泌细胞水平。
实施例16
免疫接种肝炎表面抗原
用重组乙型肝炎表面抗原(HbsAg；Cortex Biochemical，SanLeandro，CA，USA)并结合氢氧化铝(Alum；SuperFos Biosector，Vedback，Denmark)和/或N3A、N6A或N6B多核苷酸，免疫6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(Charles River，St-Constant，Qc，Canada)。每只小鼠(每组5只小鼠)第0天和第21天接受总量为50μL的单次胫骨肌肉肌内注射，所用注射液含有：盐水(第1组)、1μg HbsAg(第2组)、1μg HbsAg+10μg Alum(第3组)、1μg HbsAg+10μg Alum+10μg N3A(第4组)、1μg HbsAg+10μg Alum+100μg N3A(第5组)、1μgHbsAg+10μg Alum+10μg N3B(第6组)、1μg HbsAg+10μg Alum+100μgN3B(第7组)、1μg HbsAg+10μg Alum+10μg N6A(第8组)、1μgHbsAg+10μg Alum+100μg N6A(第9组)、1μg HbsAg+10μg Alum+10μgN6B(第10组)和1μg HbsAg+10μg Alum+100μg NB(第11组)。第31天回收小鼠血浆。
通过终点稀释实验法ELISA检测和量化HbsAg特异性抗体。简而言之，用一固相HbsAg蛋白(每孔0.1μg，4℃过夜)捕获血浆中的抗HbsAg抗体(37℃1小时)，然后，按照生产商(Clonetyping system，Southern Biotechnology Inc.，Birmingham，AL，USA)的使用说明书，用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(总IgG)、IgG1和IgG2a进行检测。产生比对照组(第1组)高两倍的吸收值(OD 450)的血浆最高稀释度定义为终点效价。数据按每组5只小鼠的平均值±SD表示并示于表13中。
表13
Figure A0381435500351
Figure A0381435500361
如表13所示，N3A(第4组：1μg HbsAg+10μg Alum+10μg N3A和第5组：1μg HbsAg+10μg Alum+100μg N3A)和N6A(第9组：1μgHbsAg+10μg Alum+100μg N6A)具有通过增加抗HbsAg的IgG、IgG1和IgG2a的效价，显著刺激抗HbsAg免疫应答的能力。
实施例17
口服免疫接种肝炎表面抗原
用重组乙型肝炎表面抗原结合N6A或N6B多核苷酸，免疫6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(Charles River，St-Constant，Qc，Canada)。每只小鼠(每组5只小鼠)第0天、第7天和第14天接受50μL总体积的口服溶液，所述溶液含有：盐水(第1组)、10μg HbsAg(第2组)、10μgHbsAg+1μg N6A(第3组)、10μg HbsAg+10μgN6A(第4组)、10μgHbsAg+100μg N6A(第5组)、10μg HbsAg+1μg N6B(第6组)、10μgHbsAg+10μg N6B(第7组)和10μg HbsAg+100μg N6B(第8组)。第21天回收小鼠血浆和洗肠液。洗肠液(用于IgA测定)通过轻轻地吸取0.2ml含有蛋白酶抑制剂(10μg胃蛋白酶抑制剂、10μg亮抑蛋白酶肽、10μg抗蛋白酶和50μg苯甲脒)的PBS获得。
通过ELISA检测和量化抗HbsAg特异性抗体。简而言之，用一固相HbsAg蛋白(每孔1.0μg，4℃过夜)捕获血浆或洗肠液中的抗HbsAg抗体(37℃1小时)，然后，按照生产商(Clonetyping system，Southern Biotechnology Inc.)的使用说明书，用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgA(用于洗肠液)和山羊抗小鼠总IgG(用于血浆)进行检测。数据按每组5只小鼠的OD(450nm)用平均值±SD表示并示于表14中。IgA的OD按1∶2洗肠液稀释度获得，同时总IgG的OD按1∶16血清稀释度获得。
表14
小鼠口服免疫HbsAg的OD(450nm)
Figure A0381435500371
如表14所示，N6A(第3组：10μg HbsAg+1μg N6A；第4组：10μg HbsAg+10μg N6A和第5组：10μg HbsAg+100μg N6A)和N6B(第8组：10μg HbsAg+100μg N6B)在口服给药后，显著刺激抗HbsAg的免疫应答。
以上引用的所有专利、出版物和文摘均通过引用全文结合到本文中。人们应该理解上述仅涉及本发明的优选实施方案，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，在所附权利要求书的定义范围内，可以对本发明进行各种修改或改变。

Claims (17)

1.一种包括含六个碱基的分离的3′-OH、5′-OH多核苷酸序列的组合物，其中
a)至少50％的所述碱基是鸟嘌呤；
b)所述5′碱基是鸟嘌呤；且
c)所述组合物刺激给予所述组合物的动物或人的免疫应答，或者所述组合物刺激体外给予所述组合物的抗原呈递细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列包含5′GGNNGG3′，其中N为G、C、A或T。
3.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列包含5′GGGNGG3′，其中N为G、C、A或T。
4.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列是5′GTGTGT3′、5′GGTGGG3′、5′GGGTGG3′、5′GGGCGG3′、5′GGGAGG3′或5′GGGGGG3′。
5.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列是5′GGGTGG3′或5′GGGAGG3′。
6.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列包含磷酸二酯主链。
7.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸序列包含硫代磷酸酯主链。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物刺激所述动物或人体内的一种或多种抗原呈递细胞。
9.权利要求1或8的组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
10.权利要求1的组合物，其中刺激的免疫应答包括选自以下的一种或多种树突细胞应答：细胞大小和/或颗粒性增加，IL-1β、IL-12或IFNγ的产生增加，CD40、CD80、CD86或MHC II细胞表面表达增加，OX-2细胞表面表达减少以及内吞作用增加。
11.权利要求1的组合物，其中所述免疫应答是全身免疫应答或粘膜免疫应答。
12.权利要求1的组合物，所述组合物还包含抗原多肽。
13.权利要求1的组合物，所述组合物还包含编码抗原的多核苷酸。
14.权利要求1的组合物，所述组合物还包含免疫调节剂。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物刺激给予所述组合物的抗原呈递细胞，并且其中将所述经刺激的抗原呈递细胞给予动物或人。
16.前述权利要求中任一项的组合物在制备用于刺激动物或人的免疫应答的药物中的用途。
17.权利要求1-15中任一项的组合物在体外刺激抗原呈递细胞中的用途。
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