KR20190017872A - 염증 및 면역 반응 유도를 감소시키는 조작된 바이러스 벡터 - Google Patents

염증 및 면역 반응 유도를 감소시키는 조작된 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

변형된 바이러스 게놈은 염증 및 면역 항바이러스 반응의 유도를 감소시킬 수 있다. 이는 NF-κB 활성 감소, 바이러스 형질도입률 증가, 및 트랜스진 발현 증가로 나타난다. 바이러스 게놈은 TLR9에 결합할 수 있지만 그의 활성화를 유도할 수 없는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열을 도입시킴으로써 변형된다. 올리고뉴클레오티드 서열은 합성, 박테리아, 인간의 것일 수 있거나, 또는 임의의 다른 공급원으로부터의 것일 수 있다.

Description

염증 및 면역 반응 유도를 감소시키는 조작된 바이러스 벡터
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 HG008525 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
관련 출원 데이터
본 출원은 2016년 6월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/347,302에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 바이러스 기반 요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 바이러스에 관한 것이다.
유전자 요법은 다중의 인간 질환을 예방, 치료 및 치유할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있다 [1]. 2012년, 글리베라(Glybera)™ (알리포겐 티파보벡)는 서방 세계에서 사용 승인을 받은 최초의 바이러스 유전자 요법이 되었다 [2]. 글리베라™는 인간 지단백질 리파제 (LPL) 결핍증 환자에서 LPL 유전자를 근육 세포로 전달하는 바이러스 벡터로서 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 이용한다 [3]. 미국 및 유럽에서 다수의 AAV 임상 시험이 현재 진행되고 있거나, 또는 계획 중에 있다 [4-6].
AAV는 길이가 대략 5 kb인 단일-가닥 선형 DNA 게놈을 패키징하는 작은 외피 비보유 바이러스이고, 유전자 전달 비히클로서 사용하기 위해 적합화되었다 [4]. AAV의 코딩 영역은 DNA 복제 기점으로서 작용하고, 1차 패키징 신호로서의 역할을 하는 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되어 있다 [7 , 8]. 양성 및 음성 가닥 둘 다 비리온 내로 동등하게 잘 패키징되고, 감염 가능하다 [9- 11]. 추가로, 두 ITR 중의 작은 결실은 자기-상보성 벡터의 패키징을 허용하며, 여기서 게놈은 바이러스 탈피막 이후 자기-어닐링한다. 이를 통해 세포는 더욱 효율적으로 형질도입되지만, 코딩 능력은 절반으로 감소된다 [12 , 13]. AAV가 어떤 인간 질환과도 연관은 없지만, 인간 중 >70%는 하나 또는 대개의 혈청형에 대해 양성 혈청 반응을 보인다 [14 , 15]. AAV 벡터에 대해 전형적인 투여 경로로는 정맥, 근육내, 망막하 및 두개내 주사를 포함한다. 단일유전자성 질환을 치료하기 위해 야생형 유전자를 전달하기 위해서 AAV 유전자 요법이 가장 빈번하게 사용되며, AAV 벡터는 간, 골격, 심장 근육, 망막 및 중추 신경계에서 세포 형질도입을 위해 사용되어 왔다 [16-26]. 추가로, 현재 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 전달하기 위해, 감염성 질환, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 중화 항체를 광범위하게 전달하기 위해 AAV를 사용하는 것에 관한 관심이 증가하고 있다 [27-32].
유전자 요법에서의 여러 진보에도 불구하고, 중요한 관심사는 바이러스 벡터에 의해 유발되는 염증 반응이다 [33 , 34]. 이는 1999년 제시 겔싱어(Jesse Gelsinger)가 임상 시험에서 아데노바이러스를 이용한 유전자 요법 4일 후, 과도한 염증으로 인해 사망하였을 때에 널리 공개된 사례를 통해 가장 잘 예시된다 [35]. 아데노바이러스와 비교하여 AAV는 훨씬 더 약한 염증을 유도하는 것으로 밝혀져 있으며 [36 , 37], 동시에 글리베라™ 요법은 글리베라™ 투여 전 3일을 시작으로 12주 동안 면역억제를 추가로 포함한다 [38]. 이러한 면역억제 및 항염증 약물 (시클로스포린 A, 미코페놀레이트 모페틸, 및 메틸프레드니솔론)은 치료 동안 환자의 면역계를 손상시키고, 모든 환자는 추후의 재투여를 방해하면서, AAV 캡시드에 대한 중화 항체를 추가로 발생시켰다. 추가로, 다수의 AAV 유전자 요법 임상 시험은 예방적으로 면역억제를 이용하지 않고, 오직 염증 또는 조직 손상의 징후에 대해서만 코르티코스테로이드제를 투여하는데, 이는 가변적인 치료 효능과 연관이 있다 [22 , 23]. 흥미롭게도, AAV 벡터는 염증 및 면역 반응을 촉발할 수 있는 그의 능력과 일치하여, 감염성 질환 및 암에 대한 백신 비히클로서도 또한 개발되었다 [39-41].
염증은 성공적인 AAV-매개 트랜스진 발현의 중요한 결정 요인인 것으로 연구되어 왔다. 연구 결과, 마우스에서의 AAV 투여 후, 인공 유도 전신 염증, 예컨대, 종양 괴사 인자 (TNF)의 상향조절이 간에서 트랜스진 발현을 감소시킨 것으로 나타났다 [42]. 이는 AAV 코딩된 트랜스진에 대한 면역학적 내성이 염증 반응이 충분할 경우에는 파괴될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 또 다른 연구를 통해, AAV 감염 이후 뮤린 간에서의 염증의 특징이 규명되었고, 혈청 중 간 효소의 일시적 증가, 및 또한 간문맥 및 소엽성 염증과 일치하는 간 병상도 발견되었다 [43]. 특히, 저자는 AAVrh.32.33 바이러스 사용이 다른 시험된 AAV 혈청형보다도 더 높은 간 효소를 유도하였고, 이는 또한 트랜스진 발현을 검출 수준 아래로까지 감소시켰다는 것을 관찰하게 되었고, 이는 다시 염증 및 면역 반응이 불량한 트랜스진 발현과 연관이 있다는 것을 제안한다.
혈우병 B 임상 시험에서, 환자 중 서브세트는 상승된 간 효소를 보였고, 이러한 일시적인 트랜스아미니티스는 트랜스진 코딩된 인자 IX 수준 감소를 동반하였다 [22 , 23]. 트랜스아미니티스 환자에 대해 코르티코스테로이드제 요법의 테이퍼링 과정이 사용되었고, 이후, 혈청 중 아미노트랜스퍼라제 수준은 정상화되었고, 인자 IX 발현의 추가 감소는 구제된 것으로 관찰되었다. 전반적으로, 이러한 관찰결과는 AAV 형질도입된 간세포의 면역-매개 파괴와 양립할 수 있고, 이는 AAV 투여에 의해 촉발된 염증 및 면역 반응은 안전상의 우려 사항이며, 인간에서 치료 효능을 방해할 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 본질적으로 염증 유도를 회피하는 바이러스 벡터를 개발하는 것이 이로울 것이다. 추가로, 약물을 이용하는 전신 면역억제 대신 특이적인 면역 반응을 촉발하는 것을 피하는 것이 유익할 것이다.
앞서, AAV의 DNA 게놈은 세포내이입 경로를 통해 AAV가 세포 내로 이입되는 동안 톨-유사(Toll-like) 수용체 9(TLR9)에 의해 감지되는 것으로 밝혀졌다 [36 , 44]. TLR9는 면역 세포, 예컨대, B 세포, 단핵구, 대식세포 및 플라스마사이토이드 수지상 세포의 엔도솜 막 상에서 발견되는 패턴 인식 수용체 (PRR)이고, AAV 게놈에서 관찰되는 비메틸화된 CpG 모티프에 결합한다 [45 , 46]. 이는 TLR9의 이량체화를 유도하고, 이는 (p52-RelA 복합체로도 또한 공지된) NF-κB를 활성화시키고, 타입 I 인터페론 (IFN)을 유도하는 신호 전달 캐스케이드를 촉발한다. 분비된 IFN은 다수의 인터페론 자극을 받은 유전자 (ISG)의 발현을 유도하고, 항바이러스성 상태를 확립시킴과 동시에, NF-κB는 결국 다중의 염증유발성 시토카인, 예컨대, 염증 및 면역 세포를 동원하는 TNF의 전사식 상향조절을 구동시킨다. 중요하게는, 마우스에서 TLR9의 유전적 제거는 간에서 AAV 처리시 염증 시토카인의 유도를 폐기시키고, 이는 또한 AAV에 대한 항체 및 T 세포 형성을 감소시킨다 [36]. 따라서, TLR9는 AAV 감염 동안 조기 염증 및 선천성 면역 반응을 자극하는 데 있어 중요한 역할을 하며, 이는 또한 적응 면역을 프라이밍시키는 데에도 기여한다. 마지막으로, 2개의 다른 패턴 인식 수용체, TLR2 및 TLR4는 AAV 구조 단백질에 대한 반응을 촉발하는 것으로 연루되어 왔다 [47 , 48].
TLR9 분야에서, 세포 배양물 중 TLR9 활성화를 차단시키는 데 보편적으로 사용되는 도구는, TLR9에 결합하지만 그를 활성화시키지는 않는, 짧은 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드이다 [49 , 50]. 일부는 합성 서열이고, 나머지는 유기체로부터 유래된 것인, 수개의 상기와 같은 서열이 공지되어 있으며, 이들은 대개 서열 상동성을 가지지 않는다 [51- 59]. 구조 연구를 통해, 억제성 올리고뉴클레오티드가 어떻게 TLR9에 밀착 결합하지만 TLR9 활성화 및 하류 신호전달에 요구되는 TLR9 이량체화를 촉발하지는 않는지가 밝혀졌다 [60]. TLR9에 직접적으로 결합하여 그의 활성화를 길항시키는 것 이외에도, 다른 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드에 대해서도 TLR9 활성화, 또는 TLR9-매개 염증을 차단하는 다른 기전이 가정되거나, 또는 밝혀졌다 [49에 리뷰]. 이는 수용체-매개 세포내이입 또는 식세포 작용에 대한 경쟁, TLR9 이동 또는 기능적으로 활성인 생성물로의 TLR9 프로세싱 억제, 엔도솜 산성화 또는 엔도솜 중의 중요한 프로테아제의 활성 억제, 또는 TLR9 하류의 신호전달 단백질 차단을 포함한다. 이들 억제성 올리고뉴클레오티드가 세포 배양 배지 중에서 TLR9 리간드 (예컨대, DNA 바이러스, 또는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드)와 함께 트랜스로 공급될 때, 이는 자극성 리간드에 의한 그의 활성화는 방지하면서, 세포내이입되고, TLR9에 결합할 수 있다. 억제성 올리고뉴클레오티드를 트랜스로 보충하는 것이 면역학 실험에서 널리 채용되고 있지만, 면역학 분야에서 상기 서열을 바이러스 게놈 내로 도입하는 것이 염증 및 면역 반응 유발을 회피할 수 있도록 하는지 여부에 대해서는 알려져 있지 않다.
아데노바이러스와 비교하여 AAV는 훨씬 더 약한 염증 반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있으며, 동시에 글리베라™ 알리포겐 티파보벡 치료법은 글리베라™ 알리포겐 티파보벡 투여 전 3일을 시작으로 12주 동안 면역억제를 추가로 포함한다. 이러한 면역억제 약물은 치료 동안 T 세포 활성화를 강력하게 방해하고, 이로써, 환자의 면역계를 손상시킨다. 투여시 염증 반응을 회피하고, 감소된 염증 반응을 유도하거나, 또는 염증 반응을 유도하지 않는 바이러스 벡터를 조작하는 것이 도움이 될 것이다. 추가로, 면역 억제가 전신 억제가 아니라면, 그리고, 그러한 면역 억제가 일시적인 것이라면 유익할 것이다. 염증 및 면역 반응을 방지하는 것은 또한 트랜스진 발현을 개선시킬 수 있고, 추후 목적을 위한 바이러스 벡터의 재투여를 허용할 수 있다.
요법을 위한 바이러스 벡터의 효능 개선, 및 생물학적 생성물의 생체내 제조가 관련 기술분야에서 계속해서 요구되고 있다.
본 발명의 한 측면에 따라, 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 포유동물 세포에 원하는 기능을 전달하기 위한 재조합 바이러스를 제공한다. 재조합 바이러스는 TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함한다.
또 다른 실시양태는 포유동물을 치료하는 것에 관한 측면이다. 본 방법은 재조합 바이러스를 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 재조합 바이러스는 TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함한다.
추가의 또 다른 측면은 재조합 바이러스의 바이러스 게놈을 제조하는 방법이다. 억제성 핵산 서열은 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 억제성 핵산 서열은 TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는다.
한 측면에 따라, 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 역위 말단 반복부 (ITR) 및 TLR9-매개 염증을 억제하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 핵산 분자이다. 분자는 TLR9-매개 염증을 억제하는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 포유동물 세포에 원하는 기능을 전달하기 위한 재조합 바이러스이다. 재조합 바이러스는 TLR9-매개 염증을 억제하는 억제성 핵산 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 재조합 바이러스의 바이러스 게놈을 제조하는 방법이다. 핵산 서열은 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 핵산 서열은 TLR9-매개 염증을 억제한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 핵산 벡터를 제공한다. 벡터는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 TLR9-매개 염증을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 게놈을 갖는 변형된 바이러스의 면역원성을 감소시키는 방법이다. 본 방법은 핵산 서열을 게놈 내로 삽입하는 것을 포함한다. 핵산 서열은 TLR9-매개 염증을 억제한다. 변형된 바이러스는 억제성 서열을 함유하지 않는 바이러스와 비교하여 숙주에서의 감소된 염증 반응을 유발한다.
본 발명의 또 다른 측면은 바이러스에 의해 도입된 트랜스진의 숙주 세포에서의 발현을 증가시키는 방법이다. 본 방법은 게놈을 갖는 변형된 바이러스를 숙주 내로 도입하는 것을 포함한다. 게놈은 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 TLR9-매개 염증을 억제한다. 변형된 바이러스는 억제성 서열을 함유하지 않는 바이러스와 비교하여 숙주 세포에서의 더 높은 트랜스진 발현을 생성한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 TLR9-매개 염증을 억제하는 핵산 서열을 캡시드화하는 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이다.
본 명세서를 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해지는 상기 및 다른 측면 및 실시양태는 바이러스 벡터 및 비리온을 사용하여 포유동물을 더욱 잘 치료할 수 있도록 하고, 숙주 세포, 숙주 조직, 및 숙주 동물에서 트랜스진의 생성물을 생성하기 위하여 바이러스 벡터 및 비리온을 더욱 잘 사용할 수 있도록 하는 도구를 관련 기술분야에 제공한다.
상기 기술된 측면들 중 임의의 것 및 그들 모두는 하기 특징 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
바이러스 게놈은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈일 수 있다.
바이러스 게놈은 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 바리셀라, 바리올라 바이러스, B형 간염, 시토메갈로바이러스, JC 폴리오마바이러스, BK 폴리오마바이러스, 원두 바이러스, 헤르페스 조스터, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 7, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 및 인간 파르보바이러스 B19로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바이러스 게놈은 단일 가닥일 수 있다.
바이러스 게놈은 비리온 내에 패키징될 수 있다.
바이러스 게놈은 인간 세포에서 발현가능할 수 있는 유전자를 포함할 수 있다.
바이러스 게놈은 표적 종양 세포를 용해시키기 위한 세포독성 바이러스일 수 있다.
억제성 핵산 서열은 c41 올리고뉴클레오티드 서열 TGGCGCGCACCCACGGCCTG (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 c41 서열 (서열식별번호: 1)의 복수개의 카피를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 2개의 카피를 포함할 수 있다.
링커 서열은 AAAAA (서열식별번호: 8)이다.
억제성 핵산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT (서열식별번호: 2);
ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA (서열식별번호: 3);
ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG (서열식별번호: 4);
ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA (서열식별번호: 5);
ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G (서열식별번호: 6); 및
G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT (서열식별번호: 7).
억제성 핵산 서열은 박테리아 서열일 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 비-인간 유전자를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 바이러스 게놈의 하류에 또는 바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에 삽입될 수 있다.
바이러스 게놈은 포스포디에스테르 결합에 의해 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결될 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 검출가능한 마커를 포함할 수 있다.
검출가능한 마커는 유도가능한 것일 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 9에 제시된 인간 텔로미어 서열을 포함할 수 있다.
바이러스 게놈은 자기-상보성일 수 있다.
바이러스 게놈은 복수개의 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결될 수 있다.
복수개의 억제성 핵산 서열은 억제성 서열 및 그의 역 상보체를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은, 각 카피가 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 3개의 카피를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT (서열식별번호: 16);
ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT (서열식별번호: 17);
ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA (서열식별번호: 18);
ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA (서열식별번호: 19);
ODN 폴리-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열식별번호: 20);
ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA (서열식별번호: 21);
ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 22);
ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 23); 및
ODN 21158: CCTGGCGGGG (서열식별번호: 24).
억제성 핵산 서열은 ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)일 수 있다.
억제성 서열은 링커에 공유적으로 연결될 수 있다.
억제성 서열은 링커 상류에 있을 수 있다.
억제성 핵산 서열은 ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 복수개의 카피를 포함할 수 있다.
ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 복수개의 카피는 각각 링커에 의해 이격되어 있을 수 있다.
억제성 핵산 서열은, 각 카피가 링커에 의해 이격되어 있는, ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 카피를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 인간 서열일 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 비-인간 핵산 서열을 포함할 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 인간 유전자를 포함할 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 인간 핵산 서열을 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 삽입될 수 있다.
억제성 핵산 서열은 바이러스 게놈의 프로모터의 상류에 삽입될 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 유도가능 프로모터를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 1의 2개의 반복 단량체를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 1의 3개의 반복 단량체를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9의 3개의 반복 단량체를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9의 5개의 반복 단량체를 포함할 수 있다.
투여하는 단계가 반복될 수 있다.
바이러스 게놈은 비리온 내에 패키징될 수 있다.
삽입하는 단계는 DNA 리가제를 이용할 수 있다.
바이러스 게놈은, 비리온 내에 있을 때, 단일 가닥일 수 있다.
재조합 바이러스의 바이러스 게놈은 인간 세포로의 전달 및 인간 세포에서의 발현을 위한 유전자를 포함할 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 각 핵산 서열을 이격시키는 링커를 포함할 수 있다.
바이러스 게놈, 재조합 바이러스, 벡터, 또는 핵산 서열은 핵산 서열의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 카피를 포함할 수 있다.
억제성 핵산은 유전자에 공유적으로 연결될 수 있다.
억제성 핵산 서열은 c41 올리고뉴클레오티드 서열 TGGCGCGCACCCACGGCCTG (서열식별번호: 1)와 95% 동일할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 9와 95% 동일할 수 있다.
억제성 핵산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 동일할 수 있다:
ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT (서열식별번호: 2);
ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA (서열식별번호: 3);
ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG (서열식별번호: 4);
ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA (서열식별번호: 5);
ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G (서열식별번호: 6); 및
G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT (서열식별번호: 7).
억제성 핵산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 동일할 수 있다:
ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT (서열식별번호: 16);
ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT (서열식별번호: 17);
ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA (서열식별번호: 18);
ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA (서열식별번호: 19);
ODN 폴리-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열식별번호: 20);
ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA (서열식별번호: 21);
ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 22);
ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 23); 및
ODN 21158: CCTGGCGGGG (서열식별번호: 24).
억제성 핵산 서열은 서열식별번호: 6 및/또는 서열식별번호: 9의 복수개의 카피를 포함할 수 있다.
억제성 핵산 서열은, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, 서열식별번호: 6 및/또는 서열식별번호: 9의 2개의 카피를 포함할 수 있다.
도 1. 바이러스 유전자 요법, 및 염증 및 면역 반응을 도시한 개략도.
도 2. 바이러스 진입 및 염증 및 면역 반응 동안의 TLR9 감지 AAV DNA를 보여주는 개략도. 문헌 [Rogers et al., 2011, Frontiers in Microbiology, "Innate Immune Responses to AAV Vectors," vol. 2, article 194]부터의 것.
도 3a-3b. 도 3a는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인, c41의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 보여주는 것이다. 도 3b는 AAV-eGFP 및 AAV-eGFP-c41 게놈의 조직을 보여주는 것이다. ITR, 역위 말단 반복부; LPA, 후기 폴리아데닐화 신호. 본 경우에 도시된 관심 트랜스진은 eGFP이다. 삽입부는 c41 서열의 것이다. 도 3b에 도시된 스페이서는 서열식별번호: 8에 제시되어 있다.
도 4는 모의 감염된, 또는 AAV 바이러스 (DJ 캡시드, 자기-상보성 AAV 게놈, eGFP 코딩)로 감염된 HEK293 TLR9 세포에서의 NF-κB 활성을 보여주는 것이다. **, p<0.005; n.s., 비유의적. 본 실험은 미가공 바이러스 제제를 사용하였다.
도 5. 모의 감염된, 또는 c41을 포함하거나 또는 포함하지 않는 AAV 바이러스로 감염된 HEK293 TLR9 세포에서의 GFP 발현을 보여주는 유세포 분석 히스토그램. 본 실험은 미가공 바이러스 제제를 사용하였다.
도 6a-6b. 도 6a는 포유동물 텔로미어로부터의 (TTAGGG)4 (서열식별번호: 6) 모티프를 함유하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인 "텔로미어"의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 9)을 보여주는 것이다. 도 6b는 AAV-eGFP-텔로미어 게놈의 조직을 보여주는 것이다. 삽입부는 "텔로미어" 서열의 것이다. 도 6b에 도시된 스페이서는 서열식별번호: 8에 제시되어 있다.
도 7a-7b. 도 7a는 유세포 분석법에 의해 분석된, 유사한 양의 명시된 AAV 바이러스에 의한 B 세포주 감염 후 2일째의 형질도입된 세포 (GFP+)의 백분율을 보여주는 것이다. 도 7b는 ELISA에 의해 검정된, 감염 후 18시간째의 1차 인간 CD14+ 단핵구의 상청액 중의 TNF 생산량을 보여주는 것이다.
도 8a-8b. 자기-상보성 AAV 벡터 조작. (도 8a) "c41" 및 "텔로미어"의 DNA 서열. (도 8b) AAV 벡터 (scAAV-eGFP) 및 변형된 벡터의 게놈 조직. LpA: 폴리A 신호.
도 9a-9c. 시험관내 인간 면역 세포에서의 다양한 AAV 벡터에 대한 염증 반응. (도 9a) 1차 인간 대식세포를 AAV2 바이러스 (MOI: 105 vg/세포)로 감염시키고, 18 h 후 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 TNF 수준에 대하여 분석하였다. 5 uM ODN 2006인 CpG 함유 올리고뉴클레오티드가 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. (도 9b, 도 9c) 2명의 상이한 공여자로부터의 1차 인간 CD14+ 단핵구를 (a)와 유사하게 감염시키고, TNF 수준에 대하여 분석하였다. 제시된 데이터는 n = 3회의 기술적 반복 실험의 평균 ± s.d.이다. scAAV-eGFP 대비 *P<0.05 (독립표본 t 검정).
도 10a-10e. AAV 벡터의 추가적 특징 규명. (도 10a) "대조군"의 DNA 서열. (도 10b) 변형된 벡터의 게놈 조직. (도 10c) 1차 인간 대식세포를 (도 9a)와 유사한 AAV2 바이러스로 감염시키고, ELISA에 의해 TNF 수준에 대하여 분석하였다. (도 10d) 1차 인간 단핵구를 (도 9b, 도 9c)와 유사하게 감염시키고, ELISA에 의해 TNF 수준에 대하여 분석하였다. 제시된 데이터 (도 10c, 도 10d)는 n = 3회의 기술적 반복 실험의 평균 ± s.d.이다. scAAV-eGFP 대비 *P<0.05 (독립표본 t 검정). (도 10e) 성체 C57BL/6 마우스를 (도 12a, 도 12b 및 도 12c)와 유사한 명시된 AAV2 바이러스로 감염시키고, 간 조각을 qRT-PCR에 의해 명시된 유전자 발현에 대하여 분석하였다. 제시된 데이터는 각 조건당 n = 5마리의 마우스에 대한 평균 ± s.d.이되, scAAV-eGFP-3x대조군의 경우, n = 3마리의 마우스에 대한 평균 ± s.d.이다. 염수 조건 대비 *P<0.05 (독립표본 t 검정). n.s.: 비유의적 (P>0.05).
도 11a-11b. (도 11a) AAV2 바이러스 둘 다의 상이한 로트를 사용하여 1차 인간 대식세포를 (도 9a)와 유사하게 감염시키고, TNF 수준에 대하여 분석하였다. (도 11b) HeLa 세포를 AAV2 바이러스로 명시된 MOI로 감염시키고, 48 h 후 세포를 수거하고, 유세포 분석법에 의해 GFP 발현에 대하여 분석하였다. GFP 양성 세포의 백분율이 제시되어 있다. 제시된 데이터는 n = 3회의 기술적 반복 실험의 평균 ± s.d.이다. scAAV-eGFP 대비 *P<0.05 (독립표본 t 검정).
도 12a-12c. 생체내 성체 마우스에서의 다양한 AAV 벡터의 정맥내 투여에 대한 염증 반응. (도 12a, 도 12b 및 도 12c) 성체 C57BL/6 마우스를 꼬리 정맥 주사에 의해 명시된 AAV2 바이러스 (1011 vg/마우스)로 감염시켰다. 2 h 후, 동물을 안락사시키고, 간 조각을 qRT-PCR에 의해 명시된 유전자 발현에 대하여 분석하였다. 각 유전자에 대하여 염수 주사를 1배 발현으로 설정하였다. 제시된 데이터는 각 조건당 n = 3마리의 마우스 (도 12a), 또는 각 조건당 n = 4마리의 마우스 (도 12b 및 도 12c)에 대한 평균 ± s.d.이다. 염수 조건 대비 *P<0.05 (독립표본 t 검정). n.s.: 비유의적 (P>0.05).
도 13. 단일-가닥 AAV 벡터 (ssAAV-eGFP) 및 ssAAV-eGFP-5x 텔로미어의 게놈 조직.
도 14a-14c. 생체내 신생 마우스에서의 다양한 AAV 벡터의 망막하 투여 이후의 염증 및 면역 반응. (도 14a, 도 14b 및 도 14c) 신생 CD1 마우스 (P1)는 망막하 주사에 의해 명시된 AAV8 바이러스 (1.8 x108 vg/마우스 눈)를 받았다. P21일 때, 동물을 안락사시키고, 안배를 절개하였다. 망막 및 안배의 나머지 부분을 qRT-PCR에 의해 명시된 유전자 발현에 대하여 분석하였다. 각 유전자에 대하여 염수 주사를 1배 발현으로 설정하였다. 각 삼각형 표시는 동물을 나타낸다. 제시된 데이터는 n = 3마리의 마우스 (염수) 및 n = 5마리의 마우스 (각 바이러스)에 대한 것이고, 평균 값이 제시되어 있다.
도 15a-15c. 생체내 신생 마우스에서의 다양한 AAV 벡터의 망막하 투여 이후의 망막 중 면역 세포 마커의 분석. (도 15a, 도 15b 및 도 15c) (도 14a-14c)와 유사하게, 망막을 qRT-PCR에 의해 명시된 유전자 발현에 대하여 분석하였다. Aif1 (Iba1)은 소교세포에서 발현되는 것으로 공지되어 있는 반면, Cd4 및 Cd8a는 각각 헬퍼 및 세포용해성 T 세포의 마커이다. 각 유전자에 대하여 염수 주사를 1배 발현으로 설정하였다. 각 삼각형 표시는 동물을 나타낸다. 제시된 데이터는 n = 3마리의 마우스 (염수) 및 n = 5마리의 마우스 (각 바이러스)에 대한 것이고, 평균 값이 제시되어 있다.
도 16. 눈에서의 GFP 발현. 신생 CD1 마우스 (P1)는 망막하 주사에 의해 명시된 AAV8 바이러스 (1.8x108 vg/마우스 눈)를 받았다. P30일 때, 동물을 안락사시키고, 플랫 탑재된 안배에서 GFP 발현을 시각화하였다. 제시된 데이터는 각 조건당 n = 2마리의 마우스에 대한 것이다.
도 17a-17b. 도 17a는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인 c41의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 보여주는 것이다. 도 17b는 AAV-eGFP 및 AAV-eGFP-c41 게놈의 조직을 보여주는 것이다. ITR, 역위 말단 반복부; LPA, 후기 폴리아데닐화 신호. 본 경우에 도시된 관심 트랜스진은 eGFP이다. 삽입부는 c41 서열의 것이다. 도 17b에 도시된 스페이서는 서열식별번호: 8에 제시되어 있다.
도 18a-18b. 도 18a는 포유동물 텔로미어로부터의 (TTAGGG)4 (서열식별번호: 6) 모티프를 함유하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인 "텔로미어"의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 9)을 보여주는 것이다. 도 18b는 AAV-eGFP-텔로미어 게놈의 조직을 보여주는 것이다. 삽입부는 "텔로미어" 서열의 것이다. 도 18b에 도시된 스페이서는 서열식별번호: 8에 제시되어 있다.
본 발명자들은 숙주 면역계 및 염증계로부터 그 자신의 방어책을 보유하는 바이러스 벡터 및 비리온을 개발하였다. 이들 벡터 및 비리온은 포유동물 세포에서 염증 및 면역 반응을 활성화시키는 숙주 단백질인 톨-유사 수용체 9 (TLR9)의 활성화시키는 짧은 핵산 서열을 보유한다.
TLR9의 억제를 위한 짧은 뉴클레오티드 서열은 임의 기원의 것일 수 있다. 이는 박테리아, 인간, 합성인 것이거나, 또는 다른 공급원으로부터의 것일 수 있다. 한 특정 서열은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 길이가 20개의 뉴클레오티드 길이인 "c41" [TGGCGCGCACCCACGGCCTG (서열식별번호: 1)]이다. 또 다른 특정 서열은 인간 텔로미어로부터의 것이고, (TTAGGG)4 (서열식별번호: 6)를 포함한다. 다른 억제성 서열은 서열식별번호: 2-5, 7, 9, 및 16-24에 제시되어 있다. 상기 서열과 적어도 80%의 상동성/동일성을 공유하는 억제성 서열 또한 사용될 수 있다. 상기 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 및/또는 적어도 99%의 상동성/동일성을 공유하는 억제성 서열 또한 사용될 수 있다. 억제성 서열의 다중 카피는 탠덤 배열로, 또는 스페이서 또는 링커 서열 또는 바이러스 게놈의 다른 부분에 의해 바이러스 벡터 중에서 이격되어 있는 상태로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개의 카피가 사용된다. 일부 실시양태에서, 억제성 서열의 하나 이상의 카피는 플러스 가닥이고, 일부는 바이러스 게놈의 마이너스 가닥이다.
억제성 올리고뉴클레오티드 서열은 별개의 작용제로서보다는 바이러스 게놈 또는 비리온의 일부로서 숙주 세포 내로 도입된다. 이는 올리고뉴클레오티드 서열의 효과가 전신으로부터는 국부적으로 일어나도록 한다. 또한, 몇주 동안 지속될 수 있는 약물을 이용한 면역 억제와 달리, 면역 회피는 AAV 또는 다른 바이러스 진입 동안에 일어나는 바, 일시적인 것이다. 추가로, 이는 바이러스 또는 바이러스 게놈 이용시, 유익한 길항제 활성이 요구되는 곳에서 상기 활성이 확실하게 이루어지도록 한다. 바이러스 또는 바이러스 게놈은 숙주 세포에서는 복제되지 않고, 이때, 올리고뉴클레오티드의 효과는 일시적인 것이 될 것이다. 바이러스 또는 바이러스 게놈이 복제된다면, 효과는 복제와 함께 공존하게 될 것이다.
억제성 핵산 서열은 재조합 DNA 조작의 임의의 수단을 사용하여 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 이는 시험관내 또는 생체내 재조합을 포함할 수 있다. 시험관내 재조합은 예를 들어, DNA 리가제 또는 다른 핵산 연결 효소를 사용하여 달성될 수 있다. 생체내 재조합은 숙주 세포 기구를 이용하여 별개의 공여자 분자가 재조합되도록 하는 상동성을 공유하는 상기 별개의 공여자 분자로 숙주 세포를 공동 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 단일의 공여자 분자는 생체내에서 숙주 세포 서열과 재조합될 수 있다. 이러한 접근법의 조합 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 삽입은 한 데옥시리보뉴클레오티드의 또 다른 데옥시리보뉴클레오티드에의 표준 연결 (포스포디에스테르 결합)을 포함할 것이다. 그러나, 억제성 핵산 서열과 바이러스 게놈의 나머지 부분 사이에 비-표준 연결이 사용되는 환경이 존재할 수 있다. 임의적으로, 억제성 핵산 서열은 바이러스 게놈의 비번역 영역에 위치한다.
게놈은 임의적으로 치료적 유전자 및/또는 마커 유전자를 함유할 수 있다. 전형적으로, 상기 유전자는 비-바이러스 유전자, 또는 바이러스 게놈 중에는 자연적으로는 존재하지 않는 유전자가 될 것이다. 유전자는 포유동물 숙주 세포 또는 동물에서 발현가능할 수 있다. 발현은 바이러스 프로모터, 또는 상기 유전자와 함께 도입되는 프로모터의 제어하에서 이루어질 수 있다. 발현은 예로서, 유도가능, 억제성, 조건 반응성, 또는 구성적 발현일 수 있다. 치료 유전자는 숙주에 유익한 RNA 또는 단백질 생성물을 코딩하는 것이다. 유익하다는 것은 예를 들어, 건강을 개선시키거나, 감염으로부터 방어하거나, 또는 결핍을 치료하는 것일 수 있다. 마커는 바이러스 또는 그의 생성물 또는 성분의 위치, 복제 수준, 증식 수준, 전사 수준, 또는 번역 수준을 추적할 수 있도록 할 수 있다. 적합한 마커로는 쉽게 검출가능한 것, 예컨대, 형광 단백질, 발색 단백질 등을 포함한다. 임의적으로, 마커 단백질의 검출을 위해, 또는 검출가능한 물질의 현상을 위해 제2 작용제가 사용될 수 있거나, 또는 첨가될 수 있다. 도입되는 유전자는 인간 또는 비-인간, 이종성 (또 다른 종으로부터의 것) 또는 동종성 (동일한 종으로부터의 것) 또는 내인성 (동일한 대상체로부터의 것)인 것일 수 있다.
임의의 DNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 또는 이중 가닥이든 상관없이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 바이러스의 예로는 제한 없이, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 바리셀라, 바리올라 바이러스, B형 간염, 시토메갈로바이러스, JC 폴리오마바이러스, BK 폴리오마바이러스, 원두 바이러스, 헤르페스 조스터, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 7, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 인간 파르보바이러스 B19, 및 엔테로바이러스의 야생형 또는 변이체를 포함한다. 바이러스는 제한 없이, 세포독성, 세포용해성일 수 있거나, 또는 잠복 감염을 유발할 수 있다. 바이러스 게놈이 변형된 바이러스 벡터 또한 사용될 수 있다. 한 예로서, 더 적은 개수의 바이러스 단백질을 코딩하도록 변형된 게놈이 사용될 수 있다. 추가로 예로서, 어떤 바이러스 단백질도 코딩하지 않도록 변형된 바이러스 게놈이 사용될 수 있다. 바이러스 게놈은 비제한적인 예로서, 역위 말단 반복부 및/또는 조작된 바이러스 게놈의 캡시드 내로의 패키징을 용이하게 하는 다른 비-코딩 유전 요소를 포함할 수 있다.
바이러스 게놈은 네이키드 DNA로서, 리포솜 중에서, 중합체와 복합체를 형성하여, 축합된 또는 압축된 상태로, 금 입자 중에서, 비리온 중에서, 또는 적용에 적합한 임의의 다른 수단에 의해 포유동물 숙주 세포로 전달될 수 있다. 전형적으로, 완전한 바이러스 게놈이 투여되겠지만, 일부 상황하에서는 부분 게놈을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 부분 게놈은 숙주 세포 또는 또 다른 게놈 또는 바이러스 엔티티에 의해 제공되는 헬퍼 기능에 의해 보완될 수 있다. 부분 게놈은 예를 들어, 치료적 페이로드가 크고, 패키징을 위해서는 일부 필수 바이러스 기능이 생략되어야 하는 경우에 사용될 수 있다.
재조합 바이러스는 해당 목적에 효과적인 임의의 경로를 따라 포유동물 또는 포유동물 세포에 투여될 수 있다. 투여는 예컨대, 혈액을 통한 전신 투여일 수 있다. 이는 경구적으로, 피하로, 국소적으로, 협측으로, 항문으로, 근육내로, 정맥내로, 종양내로, 두개내로, 경막내로, 망막하로 등의 경로로 전달될 수 있다. 투여를 위해 임의의 적합한 담체 또는 비히클 또한 사용될 수 있다. 세포 또는 포유동물이 재조합 바이러스에 대하여 더욱 허용성 또는 수용성을 가지도록 하기 위해 상기 세포 또는 포유동물을 전처리하는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 바이러스를 "필요로 하는" 포유동물은 바이러스가 도움이 되는 포유동물일 수 있다. 이는 질환 또는 결핍증을 앓는 포유동물일 수 있다. 진단 또는 분석이 진행되는 포유동물일 수 있다. 이는 비록 질환 또는 결핍증을 앓고 있지는 않더라도, 투여된 재조합 바이러스로부터 도움을 받을 수 있는 포유동물일 수 있다.
종합해 보면, 본 발명자들의 결론은 c41 또는 인간 텔로미어 서열의 AAV 게놈 내로의 도입이 (a) 바이러스 패키징 및 감염을 저하시키지 않고, (b) TLR9-매개 염증을 방지하고, (c) 염증유발성 시토카인 유도를 감소시키고, (d) 트랜스진 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. TLR9 활성화는 또한 항바이러스 상태를 촉발하는 인터페론 발현을 유도하는 바, 트랜스진 발현 증가는 면역 반응 감소에 기인하는 것일 수 있다. 하기에서 본 발명자들이 제시하는 조작된 면역-회피 특성은 (TLR9에 대해) 특이적이고, 일시적인 것이며 (예컨대, 바이러스 진입 동안에 발생할 수 있으며), 전신 면역 억제를 생성하지 않는다 (단지 AAV-감염된 면역 세포만을 표적화한다).
본 발명자들이 사용한 억제성 핵산 서열 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 것들이, AAV와 같이, 인간 및 다른 포유동물에 대하여 잠재적 유용성을 갖는 다른 바이러스 내로 도입될 수 있지만, 이는 비바람직할 수 있는 염증/면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 종양을 사멸시키거나, 또는 위축시키기 위해, 암 세포를 우선적으로 감염시키고, 용해시키는 종양용해성 바이러스가 사용된다. 이들 바이러스는 (유전자 요법을 위해 사용되는 AAV 벡터와 달리) 복제성을 띠고, 이에 상기 바이러스는 남은 종양을 위축시키기 위하여 새 비리온을 방출할 수 있다. 예로는 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 및 엔테로바이러스의 야생형 또는 변이체를 포함한다. 일부 보고에 따르면, 면역계는 보통 종양용해성 바이러스를 불활성화시키기 위해 시도하고, 이는 상기 종양용해성 바이러스가 암 세포를 감염시키지 못하게 하는 바, 화학요법에 의한 면역억제는 종양용해성 바이러스 요법을 증강시킬 수 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 가능하게는, 단순 헤르페스 바이러스와 같은 종양용해성 바이러스의 게놈 내에 억제성 올리고뉴클레오티드를 도입함으로써 면역 제거를 회피할 수 있거나, 또는 더욱 장기간 동안 종양용해가 지속될 수 있게 할 수 있다.
상기 개시내용은 본 발명을 일반적으로 기술한다. 본원에 개시된 모든 참고문헌은 참조로 명백하게 포함된다. 단지 예시 목적으로 본원에 제공되고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기의 구체적인 예를 참조함으로써 더욱 완벽하게 이해할 수 있다. 본 발명의 개시내용은 특허청구범위에서 명백하게 언급된 모든 실시양태를 포함한다. 추가로, 종속항에서 개시된 모든 특징은 다른 독립항에 관하여 특징의 기반이 되는 독립항에 동등하게 적용된다. 따라서, 종속항과 다른 독립항의 상기 조합이 명백하게 고려되고, 개시된다.
실시예 1 - 변형된 바이러스 게놈 구축
면역 세포에서 특이적으로 TLR9 활성화를 회피할 수 있는 능력을 갖는 AAV 벡터를 조작하기 위해, 본 발명자들은 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 AAV 벡터의 3' 비번역 영역 내로, 길이가 5-뉴클레오티드 길이인 스페이서 (AAAAA; 서열식별번호: 8)에 의해 이격되어 있는 2개의 c41 카피를 삽입하였다 (도 3b). 이어서, 본 발명자들은 야생형 AAV-eGFP 바이러스 및 (2개의 c41 삽입부를 보유하는) AAV-eGFP-c41 바이러스를 제조하였다. 상기 바이러스 둘 다의 감염 역가는 유사하였는데 (~109 감염 단위/ml, HeLa 세포 상에서 적정함으로써 측정), 이는 c41의 바이러스 게놈 내로의 부가가, 유전자 요법을 위해 대량 생산되어야 하는 바이러스 벡터의 중요한 고려 사항이 되는 바이러스 패키징 및 감염성을 방해하지 못했다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 2 - 변형된 바이러스 게놈은 NF-κB 활성화를 감소시킨다.
염증 반응을 측정하기 위해, 본 발명자들은 NF-κB의 전사 제어하에, AAV DNA 게놈을 감지하는 TLR9를 안정적으로 발현하고, 알칼리성 포스파타제도 또한 발현하는 HEK293 세포 (HEK293 TLR9 세포)를 사용하였다. 염증을 나타내는 것인, NF-κB가 활성화되었을 때, 알칼리성 포스파타제가 배지 내로 분비되고, 제공된 기질에 작용하여 배지는 변색되고, 이는 플레이트 판독기 상에서 측정될 수 있다. 본 발명자들은 HEK293 TLR9 세포를 모의 감염시키거나, 또는 AAV-eGFP 또는 AAV-eGFP-c41로 상기 세포를 감염시켰다. 문헌 내용과 일치하게, AAV-eGFP 감염은 작지만, 통계적으로 유의적인 NF-κB 활성 증가를 유도하였다 (도 4). 그에 반해, 모의 감염된 세포와 비교하여 AAV-eGFP-c41 감염은 유의적으로 상이하지 않았으며, 이는 바이러스가 염증 반응 유도를 회피할 수 있다는 것으로 나타내는 것이다.
실시예 3 - 변형된 바이러스 게놈인 더 많은 세포를 형질도입시켰고, 더 많은 트랜스진을 발현한다.
본 발명자들은 유세포 분석법을 사용하여 eGFP 발현에 대하여 상기 3가지 조건 (도 4에 기술)을 분석하였다. 본 발명자들은 AAV-eGFP-c41이 AAV-eGFP보다 더 많은 세포를 형질도입시켰다는 것을 발견하게 되었다 (34.6% GFP+ 대비 52.7% GFP+) (도 5). 추가로, AAV-eGFP-c41 감염으로부터의 GFP+ 세포가 AAV-eGFP 감염으로부터의 GFP+ 세포의 ~2배 정도 더 많은 eGFP를 발현하였다 (2,749 대비 5,335인 평균 형광 강도 [MFI]).
요약하면, 본 발명자들은 바이러스 게놈에 억제성 올리고뉴클레오티드를 도입하여 TLR9-매개 염증을 회피하도록 AAV 벡터를 조작하였다.
실시예 4 - AAV 게놈에의 c41 또는 텔로미어 서열 도입이 더 많은 세포를 형질도입시켰고, TNF 유도를 감소시켰다.
본 발명자들은 TLR9 신호전달을 차단하는 것으로 밝혀진 억제성 (TTAGGG)4 모티프 (서열식별번호: 6)를 함유하는 포유동물 텔로미어로부터 유래된 서열인 "텔로미어"의 3개의 카피를 삽입하였다 (도 6a 및 도 6b). AAV-eGFP-텔로미어 바이러스는 HeLa 세포 상에서 적정되었을 때, AAV-eGFP 및 AAV-eGFP-c41과 유사한 바이러스 역가를 수득하였고, 이는 "텔로미어" 도입이 바이러스 패키징 및 감염성을 방해하지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명자들이 유사한 양의 AAV-eGFP 또는 AAV-eGFP-c41 또는 AAV-eGFP-텔로미어 바이러스로 B 세포주를 감염시켰을 때, AAV-eGFP-c41 및 AAV-eGFP-텔로미어 바이러스 둘 다 AAV-eGFP보다 더 많은 세포를 형질도입시켰다 (도 7a). 이러한 관찰결과 역시 AAV의 게놈 내에 억제성 서열 도입이 트랜스진 발현을 증가시킨다는 것을 시사하는 것이다.
이어서, 본 발명자들은 혈액으로부터 1차 인간 CD14+ 단핵구를 수거하고, 상기 단핵구를 상기와 유사한 감염 조건에 가하였다. TNF가 NF-κB 활성화에 의해 유도되는 프로토타입 염증유발성 시토카인인 바, 본 발명자들은 상청액에 대해 ELISA를 수행하여 TNF 생산에 대하여 분석하였다. 모의-감염과 비교하여 AAV-eGFP 감염은 TNF 생산을 증가시킨 반면, AAV-eGFP-c41 및 AAV-eGFP-텔로미어 감염은 TNF 생산이 전혀 증가되지 않거나, 거의 증가되지 않은 것으로 나타났으며 (도 7a-7b), 이는 두 바이러스가 염증 반응 유도를 회피할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 5 - 자기-상보성 AAV 벡터 조작
연구원들은 흔히 세포 배양물 중에서의 TLR9 신호전달을 길항시키기 위해 짧은 억제성 올리고뉴클레오티드 (전형적으로 길이가 10-30개의 뉴클레오티드 길이인 것)를 사용한다. 그러나, 이들 억제성 올리고뉴클레오티드가 훨씬 더 큰 바이러스 게놈 (즉, 서열이 양쪽 단부에서 훨씬 더 큰 서열에 공유적으로 연결되어 있는 것)과 관련하여 기능성을 유지하는지 여부는 알려져 있지 않다. 이러한 가능성에 대해 시험하기 위해, 본 발명자들은 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 자기-상보성 (sc) AAV 벡터를 이용하였고, 각각 박테리아 및 포유동물 텔로미어로부터 유래된 [52, 57, 58, 61], "c41" 또는 "텔로미어"의 3개의 카피를, 벡터 게놈을 보유하는 플라스미드 내로 삽입하였다 (도 8a 및 8b). sc AAV 벡터가 단일-가닥 (ss) AAV 벡터보다 마우스 간에서 TLR9 활성화를 촉발함에 있어 더욱 효과가 컸고, 더 많은 염증을 유도한 것으로 나타났는 바, 이에 본 발명자들은 sc AAV 벡터를 시작으로 수행하였다. "c41" 및 "텔로미어"가 강한 2차 구조를 갖는 것으로 예측되는 바, 본 발명자들은 억제성 올리고뉴클레오티드 카피 사이에 AAAAA 링커를 사용하였다. 추가로, 3xc41 및 3x 텔로미어 서열을 폴리A 서열 다음에 및 우측 역위 말단 반복부 (ITR)의 상류에 배치시켰고, 이로써, 상기 서열은 바이러스 진입 동안에는 DNA 게놈에 존재하지만, 성공적으로 형질도입되었을 때에는 후속 mRNA 전사체에는 존재하지 않게 될 것이다 ("scAAV-eGFP-3xc41" 및 "scAAV-eGFP-3x 텔로미어"). 마지막으로, 바이러스 게놈 중의 억제성 올리고뉴클레오티드의 위치가 중요한지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 또한 3x 텔로미어가 좌측 ITR과 프로모터 사이에 위치하는 벡터 ("scAAV-3x 텔로미어-eGFP")를 생성하였다.
실시예 6 - 시험관내 1차 인간 대식세포 및 단핵구에서의 염증 반응
본 발명자들은 다양한 AAV 벡터를 AAV2 혈청형 내로 패키징하고, 세포당 105 바이러스 게놈 (vg)의 감염 다중도 (MOI)로 1차 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염시켰다. 예상대로, 본 발명자들은 대식세포의 scAAV-eGFP가 상청액 중, 발열, 아폽토시스 및 염증을 자극시키는 데 있어서의 역할이 잘 기술되어 있고, TLR9 신호전달 및 NF-κB 활성화시에 생산되는 프로토타입 염증 시토카인인 TNF의 강건한 유도를 유도하였다는 것을 발견하게 되었다 (도 9a). 그에 반해, scAAV-eGFP-3x41 및 scAAV-eGFP-3x 텔로미어 둘 다 TNF 유도를 >95%만큼 현저하게 감소시켰고, 이는 상기 바이러스에의 "c41" 또는 "텔로미어" 도입이 야생형 (WT) 벡터와 비교하여 염증 반응 유도를 회피시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 추가로, scAAV-3x 텔로미어-eGFP 또한 TNF 유도를 >95%만큼 방지할 수 있었고, 이는 삽입된 억제성 올리고뉴클레오티드가 바이러스 게놈의 다른 부분에 배치될 수 있고, 염증을 차단할 수 있는 능력을 유지한다는 것을 입증하는 것이다. 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로의 모의 감염, 및 TLR9/NF-κB 및 염증을 강력하게 활성화시키는 것으로 공지된 상업적으로 이용가능한 CpG 함유 올리고뉴클레오티드인 ODN 2006으로의 처리가 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 본 발명자들은 1차 인간 CD14+ 단핵구를 시험하였고, scAAV-eGFP는 강건한 TNF 유도를 촉발한 반면, scAAV-eGFP-3xc41 및 scAAV-eGFP-3x 텔로미어는 TNF 유도 대부분을 무효화시켰다는 것을 다시 발견하게 되었다 (도 9b). 유사하게, scAAV-3x 텔로미어-eGFP는, 비록 억제가 ~85%이기는 하였지만 (이는 세포 유형 간의 또는 공여자 조직 간의 차이에 기인하는 것일 수 있다), TNF 유도를 감소시켰다. TNF 유도 회피는 또한 또 다른 공여자로부터 수득된 1차 CD14+ 단핵구에서 재현되었다 (도 9c).
추가의 특징 규명으로서, 본 발명자들은 TLR9를 차단하지 않는 랜덤 서열인 "대조군"의 3개의 카피, 또는 1개의 "텔로미어" 카피를, 벡터 게놈을 보유하는 플라스미드 내로 삽입하였다 (도 10a, 도 10b). 본 발명자들은 TLR9 실험에서 음성 대조군 올리고뉴클레오티드로서 사용되었는 바, 상기 서열을 "대조군"으로서 선택하였다. 본 발명자들은 scAAV-eGFP-1x 텔로미어가 인간 대식세포에서 scAAV-eGFP와 비교하여 TNF 유도를 감소시킬 수 있지만, scAAV-eGFP-3x 텔로미어만큼 효율적으로 감소시키지는 못한다는 것을 발견하게 되었다 (도 10c). 1개의 텔로미어 카피가 염증을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 본 발명자들은 또한 scAAV-eGFP-3x대조군이 인간 단핵구에서 scAAV-eGFP만큼 효율적으로 TNF 분비를 유도하였다는 것을 관찰하게 되었고, 이는 TLR9를 억제하는 서열 삽입이 염증을 차단시키는 데 요구된다는 것을 시사하는 것이다 (도 10d).
AAV 벡터가 생물제제로서 간주되고, 로트-대-로트 변동성을 나타낼 수 있는 바, 본 발명자들은 scAAV-eGFP 및 scAAV-eGFP-3x 텔로미어 AAV2 바이러스 둘 다의 또 다른 배치를 제조하였고, WT 벡터와 비교하여 scAAV-eGFP-3x 텔로미어가 TNF 유도를 ~75% 감소시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다 (도 11a). 다중 바이러스 프렙 및 공여자 단핵구 및 대식세포에 기초하여 (도 9a-9c, 도 10a-10e 및 도 11a-11b), 본 발명자들은 "c41" 또는 "텔로미어"의 3개의 카피를 함유하는 본 발명자들의 조작된 벡터가 WT 벡터와 비교하여 TNF 유도를 대략 75 - 98%만큼 감소시킨다고 결론지었다. 평균적으로, scAAV-eGFP와 비교하여 scAAV-eGFP-3x 텔로미어는 TNF 유도를 ~85% 감소시켰다. 중요하게, 본 발명자들은 상기 AAV2 벡터 중 임의의 것 제조로부터 수득된 (바이러스 게놈에 대한 qPCR에 의해 검정된) 바이러스 역가에 있어 어떤 차이도 관찰하지 못했으며, 이는 조작된 벡터가 패키징에 있어 결함은 없다는 것을 시사하는 것이다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 본 발명자들이, AAV 감염도를 적정하는 데 널리 사용되는 허용 세포주인 HeLa 세포를 다양한 범위의 MOI로 scAAV-eGFP 및 scAAV-eGFP-3x 텔로미어로 감염시켰을 때, 본 발명자들은 4개의 바이러스 역가 로그값에 걸쳐 형질도입 (GFP+ 세포 비율(%))에 있어 어떤 차이도 관찰하지 못했으며, 이는 조작된 벡터가 세포를 형질도입시키는 데 있어 동등한 능력을 갖는다는 것을 입증하는 것이다 (도 11b).
실시예 7 - 생체내 마우스의 간 조직에서의 염증 반응
AAV의 정맥내 전달은 흔히 유전자 요법을 위해 간세포를 형질도입시키는 데 사용된다. AAV의 정맥내 투여시, 마우스의 간 중의 쿠퍼 세포 (간 상주성 항원 제시 세포)는 1-9 h 경과 후, sc AAV 게놈을 감지하고, 염증 및 선천성 면역 반응을 촉발할 수 있다는 것이 이전 연구를 통해 밝혀졌다 [36]. 이들 반응으로는 염증유발성 시토카인, 예컨대, TNF 및 IL6 및 타입 I 인터페론, 예컨대, IFN-β 유도를 포함한다. TLR9-/- 마우스는 간에서 상기 염증 및 선천성 면역 반응을 보이지 않았으며, 이는 TLR9가 생체내에서 선천성 면역 감지기로서의 중요한 역할을 한다는 것을 입증하는 것이다. 추가로, 면역 세포, 예컨대, 호중구, 대식세포 및 자연살 세포 (NK)는 AAV 투여 2 h 후, 간에 침윤한다. 본 발명자들의 조작된 벡터가 생체내 간에서 염증을 감소시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 꼬리 정맥 주사를 통해 PBS 또는 동량의 scAAV-eGFP 또는 scAAV-eGFP-3x 텔로미어를 투여하였다. "텔로미어"는 인간 서열로부터 유래되고, 이는 임상 용도로 바람직할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 scAAV-eGFP-3x 텔로미어를 선택하였다. 이전 연구와 일치하게, scAAV-eGFP는 간에서 Tnf 및 Il6 발현 증가를 자극하였는데 (염수와 비교하여 대략 3 내지 10배), 이는 염증을 나타내는 것이다 (도 12a). 그에 반해, scAAV-eGFP-3x 텔로미어는 염증 마커 증가를 거의 보이지 않거나, 또는 전혀 보이지 않았다. 본 발명자들은 후속 실험에서 더 많은 마우스를 시험하였고, 염수와 비교하여 scAAV-eGFP가 간에서 통계적으로 유의적인 Tnf 유도를 자극시킨 반면, scAAV-eGFP-3x 텔로미어 및 scAAV-eGFP-3xc41은 자극시키지 않았다는 것을 발견하게 되었는데 (도 12b 및 12c), 이는 간에서의 염증 유도를 회피할 수 있는 그의 능력을 입증하는 것이다. 마지막으로, 본 발명자들은 scAAV-eGFP와 비교하여 scAAV-eGFP-3x대조군이 간에서 염증을 방지할 수 없다는 것을 확인하게 되었다 (도 10e).
실시예 8 - 단일-가닥 AAV 벡터 조작, 및 생체내 마우스의 눈 조직에서의 염증 반응 측정
이어서, 본 발명자들은 AAAAA 링커를 갖는 "텔로미어"의 5개의 카피, 이어서, 안티-센스 배향의 또 다른 5개의 카피를 플라스미드 내로 삽입하여 단일-가닥 AAV 벡터, ssAAV-eGFP를 조작하여 ssAAV-eGFP-5x 텔로미어를 수득하였다 (도 13). 바이러스 게놈의 양성 및 음성 가닥 둘 다, 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있는 동등한 가능성을 가지고 있기 때문에, 이를 통해 각 패키징된 바이러스 게놈은 확실하게 "텔로미어"의 5개의 카피를 올바른 배향으로 가질 수 있을 것이다. 2개의 AAV8 바이러스를 제조하고, 정제하였다. 다시, 본 발명자들은 두 벡터 사이의 역가에서 어떤 차이도 관찰하지 못하였으며, 이는 패키징 효율이 유사하다는 것을 시사하는 것이다 (데이터 제시되지 않음). ssAAV-eGFP가 이전에 마우스에서의 망막하 주사를 위해 사용되어 왔고, 눈에서 광수용기를 효율적으로 변환시키는 바, 이에 그를 선택하였다 [62].
여거 연구에서 눈 및 뇌에서의 AAV 유전자 요법이 일반적으로 안전한 것으로 보인다고 제안되었다 [63]. 눈은 흔히 면역 특권 부위로 간주됨과 동시에, 이는 TLR9를 발현하고, CpG 모티프에 대해 반응하는 것으로 보고된 중추 신경계의 상주성 대식세포인 소교세포를 보유하는 것으로 공지되어 있다 [64-67]. 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque)에서의 망막하 주사에 의한 AAV 벡터 전달에 관한 최근 연구에서는 동물에서의 용량과 관련된 전안부 및 후안부 염증이 보고되었고, 중증의 안구 염증에 기인하여 조기에 마카크를 안락사시켰다 [68]. 추가로, 안락사시킨 동물로부터의 유리체 흡인물에는 호중구 및 대식세포가 존재하는 것으로 나타났다. 개 모델을 이용한 또 다른 연구에서 AAV 벡터의 망막하 주사시 유사하게 전포도막염 및 후포도막염이 관찰되었고, 17개의 눈 중 3개에서 다초점 맥락망막염이 발생되었으며, 이는 유사하게 벡터의 더 높은 용량과 연관이 있는 것이었다 [69]. 이러한 관찰결과는 AAV 벡터가 눈에서 선천성 면역 감시를 받고, 유해한 염증 및 면역 반응을 촉발할 수 있다는 것을 강하게 시사한다.
염수 또는 유사한 양의 ssAAV-eGFP 또는 ss-AAV-eGFP-5x 텔로미어를 망막하 주사를 통해 신생 마우스의 눈 내로 전달하고, 염증 및 면역 유전자의 발현을 측정하였다. 염수 주사를 받은 3마리의 마우스 망막에서 Tnf 발현은 균일하게 낮았고, 이를 1배 발현으로 설정하였다 (도 14a). 그에 반해, ssAAV-eGFP를 받은 5마리의 마우스 중 2마리는 Tnf의 경미한 상향조절을 보인 반면 (1.9배 및 8.3배), 3마리의 동물은 Tnf의 큰 유도를 보였고 (62.2배, 534배, 및 1,003배), 동물 5마리의 평균은 321배였다. 이러한 관찰결과는 염증에 있어 변동성이 존재하지만, 일부 동물은 ssAAV-eGFP 망막하 주사시 망막에서 매우 강한 염증 반응을 일으킨다는 것을 나타낸다. 상기 변동성은 각 주사 방법 또는 각 동물의 면역 상태 차이에 기인하는 것일 수 있다. 놀랍게도, ssAAV-eGFP-5x 텔로미어를 받은 5마리의 동물의 평균 Tnf 유도는 5.6배였고, 변동성은 훨씬 더 작았으며, 이는 ssAAV-eGFP-5x 텔로미어가 강력한 염증 유도를 피할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 크기는 더 낮지만, 안배의 나머지 부분에서도 유사한 결과가 관찰되었으며, 이는 염증이 망막으로 제한되지 않았다는 것을 나타내는 것이다 (도 14b). 본 발명자들은 또한 망막에서, 항바이러스 면역 반응에 중요한 타입 II 인터페론인 Ifng 발현을 측정하였고 [70], 유사한 패턴을 관찰하였다 (도 14c). 선행 연구에서는 AAV의 망막하 주사가 눈에서 면역 세포 침윤을 촉발할 수 있다고 제안하였다. 그러므로, 본 발명자들은 또한 상이한 유형의 면역 세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 알려진 유전자의 발현을 분석하였다. 본 발명자들은 염수와 비교하여 ssAAV-eGFP 주사시 (소교세포에 특이적인 마커인 Iba1을 코딩하는 [71, 72]) Aif1의 발현이 18.2배 더 높게 나타났다는 것을 발견하게 되었고, 이는 망막에서의 소교세포의 증식 및/또는 활성화를 시사하는 것이다 (도 15a). 그에 반해, ssAAV-eGFP-5x 텔로미어는 Aif1 발현을 단지 1.9배 유도한 것으로 나타났다. 추가로, 본 발명자들은 각각 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 CD8+ 세포용해성 T 세포의 마커인 Cd4 및 Cd8a가 ssAAV-eGFP에 의해 45.8배 및 41.8배 유도된 반면, ssAAV-eGFP-5x 텔로미어는 단지 1.5배 및 3.4배의 유도를 보였다는 것을 발견하게 되었다 (도 15b 및 도 15c). 다시, ssAAV-eGFP로 처리된 마우스 사이에서도 상당한 변동성이 존재하였으며, 여기서 동물의 서브세트는 강건한 유도를 보였다. 이러한 결과는 망막하 주사에 의한 ssAAV-eGFP 투여가 망막에서 T 세포 침윤을 자극시킬 수 있는 반면, ssAAV-eGFP-5x 텔로미어는 그러한 침윤을 강력하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 종합해 보면, 본 발명자들의 데이터는 ssAAV-eGFP가 망막 및 주변 조직에서 강건한 염증 및 면역 반응을 유도하고, 유의적인 변동성이 관찰되는 반면, ssAAV-eGFP-5x 텔로미어는 상기 반응의 상당부를 완화시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
시험관내 및 생체내 둘 다에서 염증 간에 현저한 차이가 있다고 가정하고, 본 발명자들은 장기간의 유전자 발현에 있어 어떤 차이가 있는지 여부를 측정하고자 하였다. 본 발명자들은 마우스 망막하 주사 후 29d인 P30일 때, 플랫 탑재된 안배를 조사하였고, ssAAV-eGFP와 비교하여 ssAAV-eGFP-5x 텔로미어로 처리된 눈에서 더 많은 세포가 GFP+인 것으로 나타났고, GFP 발현은 더욱 강력하였다는 것을 발견하게 되었으며, 이는 유전자 발현이 증강되었다는 것을 시사하는 것이다 (도 16). 따라서, 조작된 벡터는 망막에서 염증 및 면역 반응을 감소시킬 수 있고, 이는 또한 트랜스진 발현을 증강시킬 수 있다.
실시예 9 - 물질 및 방법
동물
C57BL/6 마우스 (수컷, 7-9주령)는 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratory)로부터 구입하였고, CD1 마우스는 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구입하였다.
AAV 벡터
본 연구에서는 자기-상보성 (sc) 또는 단일-가닥 (ss) AAV 벡터를 사용하였다. 자기-상보성 벡터는 한 ITR 중에 말단 분해 서열을 포함하지 않는다. 모든 벡터 게놈은 AAV2 ITR에 의해 플랭킹되어 있다. scAAV-eGFP는 셀 바이오랩스(Cell Biolabs) (VPK-430)로부터 구입하였고, 이는 앞서 기술된 바 있다 [73]. scAAV-eGFP는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 발현하였고, SV40 인트론 및 SV40 폴리A 서열을 포함하였다. ssAAV-eGFP는 앞서 기술된 바 있고 [62], 원래는 하버드 DF/HCC DNA 리소스 코어(Harvard DF/HCC DNA Resource Core) (클론 ID: EvNO00061595)로부터 얻었다. ssAAV-eGFP는 CMV 인핸서/프로모터, 인간 β-글로빈 인트론, eGFP, 및 β-글로빈 폴리A 서열을 함유하였다. 슈도모나스 아에루기노사로부터 유래된 "c41"의 서열 (5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'; 서열식별번호: 1) 및 포유동물 텔로미어로부터 유래된 "텔로미어"의 서열 (5'-TTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'; 서열식별번호: 9; 맨 처음의 T 뉴클레오티드는 기능을 위해 임의적인 것이다)은 기술된 바 있다 [52, 57, 58, 61]. 널리 사용되는 "텔로미어" 올리고뉴클레오티드 (인비보겐(Invivogen) 제조, 카탈로그 코드 "tlrl-ttag")는 공개된 연구와 비교하여 추가의 T (굵은체)를 보유하였고, 따라서, 본 서열에 포함되었다. 본 연구를 진행하는 동안, 인비보겐은 그의 제조된 "텔로미어" 올리고뉴클레오티드 (카탈로그 코드 "tlrl-ttag151")에서 추가의 T를 제거하였다. 추가로, "대조군" (5'-GCTAGATGTTAGCGT-3'; 서열식별번호: 34)은 TLR9 활성화를 억제하지 않는 음성 대조군 서열로서 사용되었다 (인비보겐, 카탈로그 코드 "tlrl-2088c").
scAAV-eGFP를 조작하기 위해, 서열을 우측 ITR의 5' 바로 옆에서 발견되는 고유한 SpeI 부위 내로 삽입하였다. 서브클로닝을 촉진시키기 위하여, 삽입된 서열의 5' 바로 옆에 고유한 ClaI 부위를 생성하여 서열의 ClaI/SpeI 서브클로닝이 진행될 수 있도록 하였다. "c41," "텔로미어," 또는 "대조군"의 3개의 카피를 삽입하고, AAAAA 링커로 이격시켜 각각 scAAV-eGFP-3xc41, scAAV-eGFP-3x 텔로미어 및 scAAV-eGFP-3x 대조군을 수득하였다. 대안적으로, 1개의 "텔로미어" 카피를 AAAAA 링커 (서열식별번호: 8)와 함께 삽입하여 scAAV-eGFP-1x 텔로미어를 수득하였다. 본 발명자들은 또한 고유한 AvrII 부위를 사용하여 좌측 ITR과 CMV 프로모터 사이에 3x 텔로미어를 삽입하여 scAAV-3x 텔로미어-eGFP를 수득하였다.
ssAAV-eGFP를 조작하기 위해, KpnI-5x 텔로미어(센스)-5x 텔로미어(안티-센스)-NheI를 우측 ITR에 인접한 XbaI 부위의 5' 바로 옆에 삽입하였다. 다시, AAAAA를 "텔로미어" 카피 사이의 링커로서 사용하였다. 단일-가닥 AAV 벡터는 바이러스 게놈의 양성 또는 음성 가닥을 패키징할 수 있는 기회가 동일하기 때문에 "텔로미어"의 센스 서열 및 안티-센스 서열 둘 다를 부가하였고, 이를 통해 모든 패키징된 AAV 게놈은 모두 확실하게 우측 배향으로 "텔로미어"의 5개의 카피를 보유하게 될 것이다.
HEK293 세포를 3중으로 형질감염시켜 자기-상보성 벡터를 AAV2 (비진 바이오사이언시스(Vigene Biosciences)) 내로 패키징하고, 아이오딕사놀 구배 초원심 분리를 이용하여 정제시킨 후, 이어서, PBS 중에서 아미콘 울트라-15 칼럼을 사용하여 500 ul로 농축시켰다. ITR 유래 프라이머 및 AAV 표준을 사용하여 qPCR에 의해 정제된 바이러스를 적정하였다. 바이러스의 최종 수율은 0.5 - 3 x 1013 vg 범위였다.
앞서 기술된 프로토콜 [74, 75]에 기초하여 단일-가닥 벡터를 AAV8 내로 패키징하였다. 간략하면, 폴리에틸렌이민을 사용하여 AAV 벡터, rep2-cap8 패키징 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 HEK293T 세포 내로 형질감염시키고, 형질감염 72 h 후 상청액을 수집하였다. 8.5% w/v PEG8000 및 0.4 M NaCl을 사용하여 AAV8 바이러스를 침전시키고, 7,000 g로 원심분리하였다. 펠릿을 용해 완충제 (150 mM NaCl 및 20 mM 트리스, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, MgCl2를 최종 농도 1 mM까지 첨가하였다. 재현탁된 바이러스를 25 U/ml 벤조나제 (시그마(Sigma))와 함께 37℃에서 15 min 동안 인큐베이션시키고, 아이오딕사놀 구배 상에서 전개시켰다. 아미콘 100K 칼럼 (EMD 밀리포어(EMD Millipore)를 사용하여 PBS로 회수된 AAV 벡터를 3회에 걸쳐 세척하고, 100 - 500 ul의 PBS로 농축시켰다. 비교를 위해 이전 AAV 표준의 연속 희석액을 사용함으로써, 단백질 겔을 전개시켜 바이러스를 측정하였다.
시험관내 연구를 위한 1차 인간 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포
미확인 건강한 공여자로부터의 시험관내 연구를 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 구입하였다 (젠바이오(ZenBio)). 본 연구는 하버드 의과 대학(Harvard Medical School)의 윤리적 가이드라인에 따라 수행되었다. CD14+ 단핵구는 제조사의 설명서 (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec))에 따라 항-CD14 자기 마이크로비드를 사용하여 PBMC로부터 양성 선택하였거나, 또는 스템셀 테크놀러지즈(Stemcell Technologies)로부터 구입하였다. 단핵구 유래 대식세포를 수득하기 위해, 단핵구를 50 ng/ml의 재조합 인간 대식세포 콜로니 자극 인자 (rhM-CSF, 페프로테크(Peprotech)로부터 구입)와 함께 5 내지 6 d 동안 배양하여 대식세포로 분화될 수 있도록 하였다. 단핵구 및 대식세포를 신선한 상태로 사용하거나, 또는 후속 연구를 냉동보관하였다.
1x105개의 단핵구 또는 대식세포를 각각 96 웰 둥근 바닥 플레이트 또는 96 웰 평평한 바닥 플레이트 중 190 ul의 RPMI 성장 배지 중에서 시딩하고, PBS 중 명시된 MOI로 10 ul AAV2 바이러스로 감염시켰다. 모의 감염 (10 ul PBS 첨가), 및 TLR9를 활성화시키고, 염증을 촉발하는 것으로 알려진 CpG 함유 올리고뉴클레오티드인 ODN 2006 (최종 농도 5 uM, 인비보겐)이 음성 대조군 및 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 감염 18 h 후, 상청액을 수집하고, 저속 원심분리에 의해 정화시킨 후, 인간 TNF (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 대하여 ELISA를 수행하였다.
HeLa 세포 감염
HeLa 세포는 AAV2 벡터에 대해 고도의 허용성을 띠며, AAV2 벡터 제제의 형질도입 역가를 측정하는 데 보편적으로 사용된다 [76]. 간략하면, HeLa 세포를 12 웰 중에서 밤새도록 시딩하였고, 감염시 전면생장률은 대략 80% (~3x105개의 세포)였다. 세포를 명시된 MOI로 연속 10배 희석된 바이러스의 희석액으로 감염시키고, PBS 중에서 1% 파라포름알데히드로 고정시키기 전에 48 h 동안 인큐베이션시킨 후, GFP+ 세포에 대한 유세포 분석법 분석을 수행하였다. PBS 모의 감염 세포를 사용하여 GFP+ 신호를 측정하였다.
생체내 간 연구
앞서 기술된 바와 같이 [36], 꼬리 정맥 주사에 의해 100 ul PBS 또는 AAV2 바이러스 (1011 vg/동물)를 정맥내로 성체 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 2 h 후, 동물을 희생시키고, 간의 우측 중간엽 부분을 RNA레이터(RNAlater) 용액 (써모 사이언티픽) 중에 저장하였다. RNA 추출 키트 (OMEGA 바이오-테크(OMEGA Bio-Tek))를 사용하여 10 - 30 mg의 기계로 파쇄된 간 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. 대용량 RNA-투-cDNA(RNA-to-cDNA) 키트 (써모 사이언티픽)를 사용하여 유사한 양의 RNA를 cDNA로 역전사시키고, 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix) (써모 사이언티픽), 및 명시된 표적 유전자 (IDT)에 대한 FAM 리포터 염료와 함께 상업적으로 이용가능한 미리 디자인된 프라이머/프로브를 사용하여 유사한 양의 cDNA를 정량적 PCR (qPCR)로 검정하였다. ΔΔCT 방법을 사용하여 하우스키핑 유전자 Actb 또는 Gapdh에 대해 정규화하여 각 유전자에 대한 발현 수준을 계산하고, 염수 주사맞은 마우스 대비로 배수 수준로 표현하였다. 모든 qPCR 반응은 리얼플렉스4 마스터사이클(realplex4 Mastercycle) (에펜도르프 (Eppendorf)) 상에서 진행되었다.
생체내 눈 연구
앞서 기술된 바와 같이 [74, 75] 생후 1일된 (P1) CD1 신생 동물의 눈 내로의 망막하 주사를 수행하였다. 펨토제트(FemtoJet) (에펜도르프)에 의해 조절되는 풀링식의 각진 유리 피펫을 사용하여 망막하 공간 내로 대략 0.2 ul AAV8 바이러스 (1.8x108 vg/눈)를 도입하였다. P21일 때, 동물을 희생시키고, 안배를 절개하였다. 망막 및 안배의 나머지 부분에 대해 간 연구에서 기술된 바와 같이 RNA 추출, 역전사, 및 qPCR을 수행하였다. 조직학적 방법에 의해 GFP 발현을 시각화하기 위해, P30일 때 눈을 잘라 내고, 4% 파라포름알데히드 중에서 2 h 동안 고정시키고, PBS 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 각막, 수정체, 홍체, 유리체 및 주변 근육을 제거하여 안배를 절개하였다. 키엔스 BZ-x700 현미경 상에서 x10 대물렌즈를 이용하여 플랫 탑재된 안배의 영상을 촬영하였다. 군들 간의 비교를 위해 사용된 영상은 동일한 영상화 세션에 동일한 영상화 환경에서 촬영하였다.
통계
독립표본 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 모든 사례에서의 두 독립표본 실험군 사이의 차이를 비교하였다. P 값이 <0.05인 경우에 통계적으로 유의적인 것으로 간주되었다. 어떤 미리 지정된 효과 크기도 가정되지 않았고, 일반적으로 각 조건에 대하여 3 내지 5회의 반복 실험이 사용되었다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
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gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 2280 acaagtaaag cggccgctct agaggatcca agcttatcga taccgtcgac ctcgagggcc 2340 cagatctaat tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc tggtgtggct 2400 aatgccctgg cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag 2460 gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca 2520 tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt taaattattt 2580 ctgaatattt tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg 2640 aagagctagt tcaaaccttg ggaaaataca ctatatctta aactccatga aagaaggtga 2700 ggctgcaaac agctaatgca cattggcaac agcccctgat gcctatgcct tattcatccc 2760 tcagaaaagg attcaagtag aggcttgatt tggaggttaa agttttgcta tgctgtattt 2820 tacattactt attgttttag ctgtcctcat gaatgtcttt tcactaccca tttgcttatc 2880 ctgcatctct cagccttgac tccactcagt tctcttgctt agagatacca cctttcccct 2940 gaagtgttcc ttccatgttt tacggcgaga tggtttctcc tcgcctggcc actcagcctt 3000 agttgtctct gttgtcttat agaggtctac ttgaagaagg aaaaacaggg ggcatggttt 3060 gactgtcctg tgagcccttc ttccctgcct cccccactca cagtgacccg gaatccctcg 3120 acatctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 3180 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 3240 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 3300 gcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 3360 gcctgaatgg cgaatggaat tccagacgat tgagcgtcaa aatgtaggta tttccatgag 3420 cgtttttcct gttgcaatgg ctggcggtaa tattgttctg gatattacca gcaaggccga 3480 tagtttgagt tcttctactc aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac 3540 aacggttaat ttgcgtgatg gacagactct tttactcggt ggcctcactg attataaaaa 3600 cacttctcag gattctggcg taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt 3660 tagctcccgc tctgattcta acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat 3720 agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 3780 ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 3840 ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 3900 ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 3960 ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4020 gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4080 tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4140 ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaattta aatatttgct tatacaatct 4200 tcctgttttt ggggcttttc tgattatcaa ccggggtaca tatgattgac atgctagttt 4260 tacgattacc gttcatcgat tctcttgttt gctccagact ctcaggcaat gacctgatag 4320 cctttgtaga gacctctcaa aaatagctac cctctccggc atgaatttat cagctagaac 4380 ggttgaatat catattgatg gtgatttgac tgtctccggc ctttctcacc cgtttgaatc 4440 tttacctaca cattactcag gcattgcatt taaaatatat gagggttcta aaaattttta 4500 tccttgcgtt gaaataaagg cttctcccgc aaaagtatta cagggtcata atgtttttgg 4560 tacaaccgat ttagctttat gctctgaggc tttattgctt aattttgcta attctttgcc 4620 ttgcctgtat gatttattgg atgttggaat tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 4680 tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 4740 agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 4800 tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 4860 tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 4920 aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 4980 tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 5040 gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 5100 atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 5160 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 5220 tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 5280 caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 5340 ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 5400 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 5460 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 5520 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 5580 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 5640 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 5700 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 5760 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 5820 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 5880 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 5940 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 6000 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 6060 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 6120 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 6180 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 6240 gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 6300 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 6360 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 6420 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 6480 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 6540 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 6600 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 6660 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6720 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 6780 tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 6840 gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac 6900 gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 6940 <210> 33 <211> 7257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 33 cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120 atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180 tgctctagcg gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat gagcttggcc 240 cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaacat 300 taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat 360 tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 420 gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa 480 cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact 540 tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta 600 aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt 660 acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg 720 ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 780 ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc 840 cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt 900 tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac 960 accgggaccg atccagcctc ccctcgaagc tgatcctgag aacttcaggg tgagtctatg 1020 ggacccttga tgttttcttt ccccttcttt tctatggtta agttcatgtc ataggaaggg 1080 gagaagtaac agggtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa 1140 aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa 1200 tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag 1260 aataacagtg ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ttctgcatat aaatatttct 1320 gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc 1380 taccattctg cttttatttt atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag 1440 gcccttttgc taatcatgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg 1500 ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattcc gcgggcccgg gatccaccgg 1560 tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 1620 agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 1680 ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 1740 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 1800 acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 1860 ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 1920 acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 1980 tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 2040 agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 2100 agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 2160 acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 2220 acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 2280 acaagtaaag cggccgctct agaggatcca agcttatcga taccgtcgac ctcgagggcc 2340 cagatctaat tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc tggtgtggct 2400 aatgccctgg cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag 2460 gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca 2520 tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt taaattattt 2580 ctgaatattt tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg 2640 aagagctagt tcaaaccttg ggaaaataca ctatatctta aactccatga aagaaggtga 2700 ggctgcaaac agctaatgca cattggcaac agcccctgat gcctatgcct tattcatccc 2760 tcagaaaagg attcaagtag aggcttgatt tggaggttaa agttttgcta tgctgtattt 2820 tacattactt attgttttag ctgtcctcat gaatgtcttt tcactaccca tttgcttatc 2880 ctgcatctct cagccttgac tccactcagt tctcttgctt agagatacca cctttcccct 2940 gaagtgttcc ttccatgttt tacggcgaga tggtttctcc tcgcctggcc actcagcctt 3000 agttgtctct gttgtcttat agaggtctac ttgaagaagg aaaaacaggg ggcatggttt 3060 gactgtcctg tgagcccttc ttccctgcct cccccactca cagtgacccg gaatccctcg 3120 acaggtacct ttagggttag ggttagggtt agggaaaaat ttagggttag ggttagggtt 3180 agggaaaaat ttagggttag ggttagggtt agggaaaaat ttagggttag ggttagggtt 3240 agggaaaaat ttagggttag ggttagggtt agggaaaaac cctaacccta accctaaccc 3300 taaatttttt ccctaaccct aaccctaacc ctaaattttt tccctaaccc taaccctaac 3360 cctaaatttt ttccctaacc ctaaccctaa ccctaaattt tttccctaac cctaacccta 3420 accctaaatt ttttgctagc tctagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta 3480 atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 3540 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 3600 tcagtgagcg agcgagcgcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 3660 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggaattcc agacgattga gcgtcaaaat 3720 gtaggtattt ccatgagcgt ttttcctgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat 3780 attaccagca aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat 3840 caaagaagta ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc 3900 ctcactgatt ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct 3960 ttaatcggcc tcctgtttag ctcccgctct gattctaacg aggaaagcac gttatacgtg 4020 ctcgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 4080 ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 4140 cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 4200 ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 4260 tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 4320 gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 4380 ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 4440 gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttaaat 4500 atttgcttat acaatcttcc tgtttttggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat 4560 gattgacatg ctagttttac gattaccgtt catcgattct cttgtttgct ccagactctc 4620 aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatg 4680 aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt 4740 tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag 4800 ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag 4860 ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat 4920 tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg ttggaattcc tgatgcggta 4980 ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 5040 ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 5100 ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 5160 ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt 5220 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 5280 cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 5340 tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 5400 gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 5460 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 5520 tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 5580 ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 5640 atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 5700 cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 5760 attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 5820 gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 5880 ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 5940 gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 6000 agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 6060 gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 6120 gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 6180 ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 6240 tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 6300 tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6360 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 6420 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 6480 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6540 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 6600 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6660 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6720 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 6780 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 6840 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 6900 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 6960 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 7020 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 7080 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 7140 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 7200 ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatg 7257 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence; negative control <400> 34 gctagatgtt agcgt 15

Claims (90)

  1. TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함하는 핵산 분자.
  2. TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결된 바이러스 게놈을 포함하는, 포유동물 세포에 원하는 기능을 전달하기 위한 재조합 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈인 재조합 바이러스.
  4. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 바리셀라, 바리올라 바이러스, B형 간염, 시토메갈로바이러스, JC 폴리오마바이러스, BK 폴리오마바이러스, 원두 바이러스, 헤르페스 조스터, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 7, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 및 인간 파르보바이러스 B19로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스.
  5. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 단일 가닥인 재조합 바이러스.
  6. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 비리온 내에 패키징되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  7. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 인간 세포에서 발현가능한 유전자를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  8. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 표적 종양 세포를 용해시키기 위한 세포독성 바이러스인 재조합 바이러스.
  9. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 올리고뉴클레오티드 서열 TGGCGCGCACCCACGGCCTG (서열식별번호: 1)를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  10. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 서열 (서열식별번호: 1)의 복수개의 카피를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 2개의 카피를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 링커 서열이 AAAAA (서열식별번호: 8)인 재조합 바이러스.
  13. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스:
    ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT (서열식별번호: 2);
    ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA (서열식별번호: 3);
    ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG (서열식별번호: 4);
    ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA (서열식별번호: 5);
    ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G (서열식별번호: 6); 및
    G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT (서열식별번호: 7).
  14. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 박테리아 서열인 재조합 바이러스.
  15. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 비-인간 유전자를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  16. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 바이러스 게놈의 하류에 또는 바이러스 게놈의 3' 비번역 영역에 삽입되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  17. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 포스포디에스테르 결합에 의해 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  18. 제2항에 있어서, 검출가능한 마커를 추가로 포함하는 재조합 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 검출가능한 마커가 유도가능한 것인 재조합 바이러스.
  20. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 9에 제시된 인간 텔로미어 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  21. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 자기-상보성인 재조합 바이러스.
  22. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 복수개의 억제성 핵산 서열에 공유적으로 연결되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 복수개의 억제성 핵산 서열이 억제성 서열 및 그의 역 상보체를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  24. 제10항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 각 카피가 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 3개의 카피를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  25. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스:
    ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT (서열식별번호: 16);
    ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT (서열식별번호: 17);
    ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA (서열식별번호: 18);
    ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA (서열식별번호: 19);
    ODN 폴리-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열식별번호: 20);
    ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA (서열식별번호: 21);
    ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 22);
    ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 23); 및
    ODN 21158: CCTGGCGGGG (서열식별번호: 24).
  26. 제13항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)인 재조합 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 억제성 서열이 링커에 공유적으로 연결되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  28. 제26항에 있어서, 억제성 서열이 링커 상류에 있는 것인 재조합 바이러스.
  29. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 복수개의 카피를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  30. 제29항에 있어서, ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 복수개의 카피가 각각 링커에 의해 이격되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  31. 제30항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 각 카피가 링커에 의해 이격되어 있는, ODN TTAGGG (서열식별번호: 6)의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 카피를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  32. 제30항에 있어서, 링커가 AAAAA인 재조합 바이러스.
  33. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 인간 서열인 재조합 바이러스.
  34. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 비-인간 핵산 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  35. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈이 인간 유전자를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  36. 제2항에 있어서, 바이러스 게놈 인간 핵산 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  37. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 삽입되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  38. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 바이러스 게놈의 프로모터의 상류에 삽입되어 있는 것인 재조합 바이러스.
  39. 제2항에 있어서, 유도가능 프로모터를 추가로 포함하는 재조합 바이러스.
  40. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 1의 2개의 반복 단량체를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  41. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 1의 3개의 반복 단량체를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  42. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  43. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9의 3개의 반복 단량체를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  44. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9의 5개의 반복 단량체를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  45. 치료를 필요로 하는 포유동물에게 제2항의 재조합 바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 바리셀라, 바리올라 바이러스, B형 간염, 시토메갈로바이러스, JC 폴리오마바이러스, BK 폴리오마바이러스, 원두 바이러스, 헤르페스 조스터, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 7, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 및 인간 파르보바이러스 B19로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 단일 가닥인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 비리온 내에 패키징되어 있는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 발현가능한 유전자의 인간 세포로의 전달을 위한 유전자 요법 벡터인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 표적 종양 세포를 용해시키기 위한 세포독성 바이러스인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 올리고뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 포함하는 것인 방법.
  53. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 서열 (서열식별번호: 1)의 복수개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  54. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 2개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 링커 서열이 AAAAA (서열식별번호: 8)인 방법.
  56. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 박테리아 서열인 방법.
  57. 제45항에 있어서, 바이러스 게놈이 인간 세포로의 전달 및 인간 세포에서의 발현을 위한 유전자를 포함하는 것인 방법.
  58. 제45항에 있어서, 투여하는 단계가 반복되는 것인 방법.
  59. 억제성 핵산 서열을 바이러스 게놈 내로 삽입하는 것을 포함하며, 여기서 억제성 핵산 서열은 TLR9에 결합하지만 TLR9 활성화는 촉발하지 않는 것인, 재조합 바이러스의 바이러스 게놈을 제조하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 바이러스 게놈을 비리온 내에 패키징하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제59항에 있어서, 삽입하는 단계가 DNA 리가제를 이용하는 것인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 바리셀라, 바리올라 바이러스, B형 간염, 시토메갈로바이러스, JC 폴리오마바이러스, BK 폴리오마바이러스, 원두 바이러스, 헤르페스 조스터, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 7, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 및 인간 파르보바이러스 B19로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  63. 제59항에 있어서, 바이러스 게놈이, 비리온 내에 있을 때, 단일 가닥인 방법.
  64. 제59항에 있어서, 바이러스 게놈이 발현가능한 유전자의 인간 세포로의 전달을 위한 유전자 요법 벡터인 방법.
  65. 제59항에 있어서, 바이러스 게놈이 표적 종양 세포를 용해시키기 위한 세포독성 바이러스인 방법.
  66. 제59항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 올리고뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 포함하는 것인 방법.
  67. 제59항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 서열 (서열식별번호: 1)의 복수개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  68. 제59항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, c41 서열 (서열식별번호: 1)의 2개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 링커 서열이 AAAAA (서열식별번호: 8)인 방법.
  70. 제59항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 박테리아 서열인 방법.
  71. 제59항에 있어서, 재조합 바이러스의 바이러스 게놈이 인간 세포로의 전달 및 인간 세포에서의 발현을 위한 유전자를 포함하는 것인 방법.
  72. 역위 말단 반복부 (ITR) 및 TLR9-매개 염증을 억제하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  73. TLR9-매개 염증을 억제하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는, 포유동물 세포에 원하는 기능을 전달하기 위한 재조합 바이러스.
  74. 핵산 서열을 바이러스 게놈 내로 삽입하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 TLR9-매개 염증을 억제하는 것인, 재조합 바이러스의 바이러스 게놈을 제조하는 방법.
  75. TLR9-매개 염증을 억제할 수 있는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터.
  76. 제75항에 있어서, 복수개의 상기 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터.
  77. 제75항에 있어서, 링커가 각 핵산 서열을 이격시키는 것인 핵산 벡터.
  78. 제75항에 있어서, 핵산 서열의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 카피를 포함하는 핵산 벡터.
  79. 제75항에 있어서, 핵산이 유전자에 공유적으로 연결되어 있는 것인 핵산 벡터.
  80. 핵산 서열을 게놈 내로 삽입하는 것을 포함하는, 게놈을 갖는 변형된 바이러스의 면역원성을 감소시키는 방법이며, 억제성 핵산 서열은 TLR9 매개 염증을 억제하며, 여기서 변형된 바이러스는 핵산 서열을 함유하지 않는 바이러스와 비교하여 숙주에서의 감소된 염증 반응을 유발하는 것인 방법.
  81. 게놈을 갖는 변형된 바이러스를 숙주 내로 도입하는 것을 포함하는, 바이러스에 의해 도입된 트랜스진의 숙주 세포에서의 발현을 증가시키는 방법이며, 게놈은 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 TLR9 매개 염증을 억제하며, 여기서 변형된 바이러스는 핵산 서열을 함유하지 않는 바이러스와 비교하여 숙주 세포에서의 더 높은 트랜스진 발현을 생성하는 것인 방법.
  82. TLR9-매개 염증을 억제하는 핵산 서열을 캡시드화하는 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물.
  83. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 c41 올리고뉴클레오티드 서열 TGGCGCGCACCCACGGCCTG (서열식별번호: 1)와 95% 동일한 것인 재조합 바이러스.
  84. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 9와 95% 동일한 것인 재조합 바이러스.
  85. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 동일한 것인 재조합 바이러스:
    ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT (서열식별번호: 2);
    ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA (서열식별번호: 3);
    ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG (서열식별번호: 4);
    ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA (서열식별번호: 5);
    ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G (서열식별번호: 6); 및
    G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT (서열식별번호: 7).
  86. 제2항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 동일한 것인 재조합 바이러스:
    ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT (서열식별번호: 16);
    ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT (서열식별번호: 17);
    ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA (서열식별번호: 18);
    ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA (서열식별번호: 19);
    ODN 폴리-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열식별번호: 20);
    ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA (서열식별번호: 21);
    ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 22);
    ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT (서열식별번호: 23); 및
    ODN 21158: CCTGGCGGGG (서열식별번호: 24).
  87. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 9를 포함하는 것인 방법.
  88. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 서열식별번호: 6 및/또는 서열식별번호: 9의 복수개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  89. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이, 링커 서열에 의해 이격되어 있는, 서열식별번호: 6 및/또는 서열식별번호: 9의 2개의 카피를 포함하는 것인 방법.
  90. 제45항에 있어서, 억제성 핵산 서열이 인간 서열인 방법.
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