DE60016551T2

DE60016551T2 - Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration

Info

Publication number: DE60016551T2
Application number: DE60016551T
Authority: DE
Inventors: Tatsurou Kyotanabe-shi Kawamura
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: EP1113270A3; EP1113270B1; EP1113270A2; US6969612B2; JP2001249134A; US20010006819A1; EP1113270A8; DE60016551D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines gelösten Stoffes, der in einer zu detektierenden Lösung gelöst vorliegt, und insbesondere ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines Proteins und bevorzugt die Konzentration einer optisch aktiven Substanz, die kein Protein ist.
Als ein herkömmliches Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gibt es ein Verfahren, in welchem Trichloressigsäure in einer zu detektierenden Lösung zur Koagulierung des Proteins vermischt wird, um dadurch die Lösung einzutrüben, und die Proteinkonzentration wird aus der resultierenden Trübung bestimmt. Jedoch ist es mit einem solchen Verfahren schwierig, die zu detektierenden Lösung bei einer Temperatur von 25°C oder höher stabil einzutrüben. Deshalb ist es manchmal unmöglich, die Messung bei einer Temperatur von 25 bis 40°C, was zu Hause eine normale Umgebungstemperatur ist, durchzuführen.
Als ein herkömmliches Gerät für die Urinanalyse gibt es ein Gerät, in welchem ein Testpapier oder dergleichen, das mit einem Reagens imprägniert ist, in den Urin eingetaucht wird, und eine Farbreaktion davon wird mittels eines Spektroskops oder dergleichen untersucht, um die Komponenten des Urins zu bestimmen. Die hierin eingesetzten Testpapiere erfordern eine individuelle Herstellung gemäß den entsprechenden Prüfpunkten wie etwa Glukose und Protein.
Die EP-A-0 845 673 beschreibt ein Messverfahren, das zur Messung der Konzentrationen von spezifischen Bestandteilen, insbesondere dem Urinproteinspiegel und dem -zuckerspiegel, am meisten zweckmäßig ist. Nachdem eine proteinhaltige flüssige Probe mittels Erwärmung eingetrübt worden ist oder während der Erwärmung der Probe, wird Licht in die flüssige Probe projeziert. Die Proteinkonzentration wird aus der Intensität des durch die Probe transmittierten Lichts oder des von der Probe gestreuten Lichts bestimmt.
Die JP-A-58209946 beschreibt eine Beschichtungszusammensetzung zum Backen.
Die JP-A-07138119 beschreibt ein Zahnhaftmittel mit einem Derivat der Gallussäure oder einem Derivat der Tanninsäure.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das vorstehende Problem zu lösen. Es ist nämlich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration bereitzustellen, welches hochstabil und leicht bei einer Temperatur von 0 bis 40°C oder Umgebungstemperatur zu Hause einzuhalten und zu handhaben ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Möglichmachung einer einfachen und hochgenauen Urinanalyse vorzusehen.
Um das vorstehend beschriebene Problem zu lösen ist es das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung eines Reagens als einem Reagens zur Änderung der optischen Charakteristik von nur dem Protein gekennzeichnet, welches aus der aus Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Ferner ist das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung in einer bevorzug ten Ausführungsform durch die Zugabe eines pH-Einstellmittels in einer zu detektierenden Lösung zur Regulierung des pH-Werts der zu detektierenden Lösung auf 1,5 bis 5,8 gekennzeichnet.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Anspruch 1 definiert.
Hierin ist es bevorzugt, dass eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts bestimmt wird, und dass die Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten Lichts bestimmt wird.
Die Gegenwart oder die Anwesenheit einer Fehlerbehafteten Messung aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in der zu detektierenden Lösung kann mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 7 detektiert werden.
Außerdem sieht die vorliegende Erfindung bevorzugt ein Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration in einer Lösung vor, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Messen der Intensitäten wenigstens eines transmittierten Lichts oder eines gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung vor und nach dem Vermischen eines Reagens darin, (b) Bestimmen einer Proteinkonzentration der zu detektierenden Lösung, basierend auf den Intensitäten wenigstens, (c) Messen eines Winkels der Polarisationsrotation der zu detektierenden Lösung vor dem Vermischen eines Reagens darin, des transmittierten Lichts oder des gestreuten Lichts und (d) Bestimmen einer Konzentration einer optisch aktiven Substanz in der zu detektierenden Lösung, die kein Protein ist, aus der Proteinkonzentration, neben dem Winkel der Polarisationsrotation, der in Schritt (c) gemessen wurde, und (e) Korrigieren des gemessenen Winkels der Polarisationsrotation, basierend auf der so gemessenen Proteinkonzentration.
Dieses Verfahren wendet das gleiche Prinzip wie das vorstehend erwähnte zur Messung einer Proteinkonzentration an. Somit wird als Reagens ein Reagens eingesetzt, das aus der aus Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Zusätzlich wird der pH-Wert der zu detektierenden Lösung in der gleichen Art und Weise reguliert.
Während die neuen Merkmale der Erfindung im Einzelnen in den angehängten Ansprüchen aufgeführt sind, wird die Erfindung hinsichtlich ihrem Aufbau und ihrem Gehalt zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den angehängten Zeichnungen besser verständlich und sie wird detaillierter erläutert.
Kurzbeschreibung der Ansichten der Zeichnung
1 ist eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
2 ist eine Draufsicht des gleichen Geräts.
3 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und der Intensität des gestreuten Lichts zeigt.
4 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
5 ist eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
6 ist eine Draufsicht des gleichen Geräts.
7 ist ein Graph, der die Änderung der Intensität des gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
8 ist ein Graph, der die Änderung der Intensität des transmittierten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
9 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung und der Menge der Änderung der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
10 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und dem Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
11 ist eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
12 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und dem Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
13 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung und der Intensität des gestreuten Lichts zeigt.
14 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
15 ist ein Graph, der die Änderung der Intensität des gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
16 ist ein Graph, der die Änderung der Intensität des transmittierten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
17 ist Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und der Menge der Änderung der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
18 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und des Verhältnisses der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
19 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung und das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts zeigt.
Das in der Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte Tanninreagens ist ein allgemeiner Ausdruck für komplizierte aromatische Verbindungen, die im Pflanzenreich weit verbreitet sind, und viele phenolische Hydroxylgruppen aufweisen (Dictionary of Chemistry, Tokyo Kagaku Dojin), wobei deren Molekularge wichte zwischen 600 und 2000 liegen (Encyclopaedia Chimica, Kyoritsu Shuppan).
Tanninsäure ist eine Substanz, die durch die Formel C₇₆H₅₂O₄₆ dargestellt wird und die CAS-Registry Number 1401-55-4 besitzt. m-Galloyl-Gallussäure ist eine Substanz, die durch die Formel C₁₄H₁₀O₉ dargestellt wird und die CAS Registry Number 536-08-3 besitzt.
Diese Reagentien reagieren mit Protein in einer zu detektierenden Lösung, um eine der Proteinkonzentration entsprechende Eintrübung zu verursachen. Die Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung kann durch Vermischen dieser Reagentien darin gemessen werden. Zum Beispiel werden, falls Urin als eine zu detektierende Lösung eingesetzt wird, diese Reagentien im Urin vermischt, um die Proteinkomponente zu koagulieren und um dadurch die optische Charakteristik zu verändern. Dann kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Proteinkonzentration in der zu detektierende Lösung aus der Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach dem Vermischen des Reagens ((Intensität des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens)/(Intensität des gestreuten Lichts vor dem Vermischen des Reagens)) und/oder aus dem Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach dem Vermischen des Reagens zu der vor dem Vermischen des Reagens ((Intensität des transmittierten Lichts nach dem Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten Lichts vor dem Vermischen des Reagens)) bestimmt werden.
Falls die Proteinkonzentration hoch ist (annähernd 250 bis 500 mg/dl oder höher), gibt es hierin Fälle, in denen das Protein nicht vollständig koaguliert oder nicht entsprechend der Konzentration koaguliert. In diesen Fällen ist es unmöglich, die Proteinkonzentration zu messen, weil das Protein nicht vollständig eintrübt oder nicht eine der Konzentration entsprechende Trübung verursacht. Selbst in solchen Fällen, in denen eine Messung nicht durchgeführt werden kann, ist es möglich, das Protein durch Vermischen eines pH-Einstellmittels in die Lösung zur Regulierung von dessen pH-Wert nach dem Vermischen des ph-Einstellmittels auf 1,5 bis 5,8 einzutrüben.
Es ist anzumerken, dass die vorstehenden, erfindungsgemäß eingesetzten Reagentien manchmal als ein pH-Einstellmittel fungieren. In solch einem Fall ist die Zugabe eines pH-Einstellmittels nicht notwendig.
Auf diese Art und Weise kann, selbst falls die Proteinkonzentration hoch ist, eine der Proteinkonzentration entsprechende Trübung herbeigeführt werden, und deshalb kann die Proteinkonzentration gemessen werden. Falls Urin als eine zu detektierende Lösung eingesetzt wird, ist es besonders zweckmäßig, eine Säure aus der Gruppe auszuwählen, welche aus Kaliumhydrogenphthalat, Essigsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure besteht, und zwar als eine in das Reagens und/oder die zu detektierende Lösung zu vermischende Säure, weil diese Säuren leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht zu handhaben sind, und außerdem die Möglichkeit einer Induzierung der Präzipitation eines Phosphats, eines Carbonats oder dergleichen ermöglichen, und somit sehr gut einsetzbar sind.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration ist es möglich, eine Proteinkonzentration zu bestimmen, die im Urin oder anderen Körperflüssigkeiten wie etwa cerebrospinale Flüssigkeit, Blutserum, Plasma und Speichel, Nahrungsmitteln wie etwa Molkereiprodukte, Spirituosen und Essig, industriellen Flüssigkeiten wie etwa Nährlösung, eine in der künstlichen Dialyse einge setzte Flüssigkeit und deren Abfallflüssigkeit und dergleichen enthalten ist.
Es ist ebenso möglich, eine Proteinkonzentration und die einer optisch aktiven Substanz, außer Protein, wie etwa Glukose zum gleichen Zeitpunkt durch Messung des Rotationswinkels einer zu detektierenden Lösung, gefolgt von der Mischung des Reagens in die zu detektierende Lösung zur Messung dessen Proteinkonzentration zu bestimmen.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung ebenso bevorzugt ein Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Lösung umfasst, welches die Schritte der Messung der Intensitäten von wenigstens einem transmittierten Licht oder einem gestreuten Licht einer zu detektierenden Lösung vor und nach dem Vermischen eines Reagens darin, welches aus der aus Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und das Messen eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung vor dem Vermischen des Reagens darin umfasst, wobei die Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung basierend auf den Intensitäten von wenigsten den transmittierten Licht oder dem gestreuten Licht bestimmt wird und die Konzentration irgendeiner optisch aktiven Substanz, außer Protein, in der zu detektierenden Lösung aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt wird.
Als solches ist die vorliegende Erfindung insbesondere zur Messung und zum Testen einer Proteinkonzentration im Urin und einem Zuckerwert im Urin unter Verwendung von Urin als eine zu detektierende Lösung effektiv, weil es die Zuverlässigkeit und Genauigkeit des Tests verbessert und im Wesentlichen dessen Schritte vereinfacht.
Wie vorstehend beschrieben ist es bevorzugt, dass das Reagens den pH-Wert der zu detektierenden Lösung auf 1,5 bis 5,8 reguliert und wenigstens eine Säure als ein pH-Einstellmittel enthält, das aus der aus Kaliumhydrogenphthalat, Essigsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Deshalb wird das Reagens bevorzugt in dem Zustand einer in Wasser gelösten wässrigen Lösung eingesetzt. Eine Konzentration des Reagens in der wässrigen Lösung liegt bevorzugt bei 250 g/dl oder geringer.
Ferner ist es bevorzugt, dass die Konzentration des pH-Einstellmittels auf den höchstmöglichen Wert eingestellt wird, so lange das pH-Einstellmittel sich in einem für das Reagens anwendbaren Temperaturbereich nicht abscheidet.
In den folgenden Abschnitten werden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
Ausführungsform 1
Eine detaillierte Beschreibung wird an einem Beispiel mit Bezugnahme auf 1 gegeben, in welchem eine wässrige Tanninlösung mit einer Konzentration von 1 g/dl und eine zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von 1:1 vermischt wurden, um das Protein zu koagulieren und dadurch die Lösung einzutrüben, und die Intensität des gestreuten Lichts der zu detektierenden Lösung wurde gemessen und die Proteinkonzentration wurde aus der Intensität bestimmt.
1 ist eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einem Verfahren zur Messung einer Proteinkonzent ration gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzten Geräts zeigt. 2 ist eine Draufsicht, die das optische System des gleichen Geräts zeigt. In diesen Figuren steht das Bezugszeichen 1 für ein Halbleiterlasermodul als eine Lichtquelle, welche ein im Wesentlich paralleles Licht 2 mit einer Wellenlänge von 780 nm, einer Intensität von 3,0 mW und einem Strahlendurchmesser von 2,0 mm projiziert. Eine Probenzelle 3 ist ein rechtwinkliger aus Glas hergestellter Behälter mit einer Grundfläche von 10 × 10 mm und einer Höhe von 50 mm mit einer oben liegenden Öffnung, wobei dessen Seite transparente optische Fenster sind. Die Probenzelle 3 ist zur Einstrahlung des im Wesentlichen parallelen Lichts 2 in die darin enthaltene zu detektierende Lösung fähig, während das gestreute Licht 7 herauskommt. Das transmittierte Licht und das gestreute Licht werden jeweils mittels eines Photosensors 4 zur Detektion eines Lichts, welches durch die Lösung hindurch gegangen ist, und eines Photosensors 5 für das gestreute Licht 7, welches während des Durchlaufs des Lichts durch die Lösung auftritt, detektiert. Ein Computer 6 steuert die Lichtquelle 1 und analysiert die Ausgangssignale aus den Photosensoren 4 und 5.
Die Schritte der Messung einer Proteinkonzentration unter Verwendung einer wässrigen Proteinlösung als eine zu detektierende Lösung wurden mit dem in 1 beschriebenen Messgerät durchgeführt. Es ist anzumerken, dass die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur von ungefähr 40°C durchgeführt wurden, wobei die Temperatur einer zu detektierenden Lösung, eines Reagens und eines Messgeräts jeweils bei ungefähr 40°C lagen.
Als erstes wurden jeweils 1 ml einer zu detektierenden Lösung und einer wässrigen Tanninlösung mit einer Konzentration von 1 g/dl in ein Becherglas gegeben, gefolgt von einem Rühren. Als nächstes wurde die so erhaltene vermischte Lösung in die Probenzelle 3 eingeführt, woraufhin der Computer die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig die Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und 5 maß.
Wenn das wässrige Tanninlösungsreagens in die zu detektierenden Lösung gemischt worden war, koagulierten die Proteinkomponenten, wobei sie die zu detektierende Lösung eintrübt, um dadurch die Intensität des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts zu steigern. Durch Analysieren eines jeden der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 zu diesem Zeitpunkt wurde die Proteinkonzentration bestimmt.
Wässrige Proteinlösungen (Serumalbumin) mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15, 30, 60 und 100 mg/dl wurden hergestellt. Die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, d.h. die Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und 5, wurden unter Verwendung dieser Lösungen mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Jedes der Ergebnisse wurde in der 3 bzw. 4 geplottet. In 3 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die Intensität des gestreuten Lichts (das Ausgabesignal aus Photosensor 5) an. In 4 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die Intensität des transmittierten Lichts (das Ausgabesignal des Photosensors 4) an. Es ist anzumerken, dass alle hier eingesetzten Lösungen transparent wie Wasser waren und die Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts vor dem Vermischen mit dem wässrigen Tanninlösungsreagens die gleichen wie Wasser waren. Zusätzlich wurde im Falle einer zu detektierenden Lösung mit einer Konzentration von 0, d.h. von Wasser, keine Änderung der Intensität des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts nach Vermischen des wässrigen Tanninlö sungsreagens beobachtet und sie war im Wesentlichen transparent.
In 3 wurde jeder der gemessenen Werte mit einer durchgezogenen Linie verbunden, und die gemessenen Werte in dem Konzentrationsbereich von 0 bis 15 mg/dl, in der sich die Intensität des gestreuten Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie aus diesen Linien ersichtlich ist, fallen die durchgezogene und die gestrichelte Linie zusammen, und zwar bis die Proteinkonzentration annähernd 15 mg/dl erreichte, und deshalb war die Intensität des gestreuten Lichts proportional zur der Proteinkonzentration. Wenn jedoch die Proteinkonzentration höher wurde, wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, der zu der Proteinkonzentration proportional war. Als Grund wurde der Folgende angenommen. Falls die Proteinkonzentration höher wurde, so stieg die Wahrscheinlichkeit, dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht erneut gestreut wurde, während das gestreute Licht sich von dem Punkt, an dem es entstand, zu dem Äußeren der Probezelle sich fortsetzte, wodurch die Wahrscheinlichkeit, dass das gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, sank. Deshalb konnte bei der Berechnung der Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts der Konzentration in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl oder niedriger), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer bestimmt werden.
In 4 steht die Abszisse für die Proteinkonzentration und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung) gibt die Intensität des transmittierten Lichts an. Jeder der gemessenen Werte wurde durch eine durchgezogene Linie verbunden und die gemessenen Werte im Proteinkonzentrationsbereich von 15 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten Lichts mit der Proteinkonzentration linear änderte, wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 4 gezeigt ist, lag der Messwert nicht auf der gestrichelten Linie, falls die Proteinkonzentration niedrig war, wie etwa 2 und 5 mg/dl. Es wurde angenommen, dass der Grund dafür darin lag, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von verschiedenen Störungen anfälliger war, weil die Änderung des transmittierten Lichts verglichen mit der im gesamten Ausgabesignal (= 1,0 V) im Falle, dass eine zu detektierende Lösung ohne Trübung eingesetzt wurde, zu klein war. Daraus wurde bestätigt, dass bei der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des transmittierten Lichts die zu detektierende Lösung bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl oder höher) lag, um die Einflüsse der verschiedenen Störungen zu vermeiden.
Deshalb war es bevorzugt, dass die wie vorstehend erhaltenen 3 und 4 als Standard-Kalibrierkurven (analytische Kurven) für einen niedrigen Konzentrationsbereich bzw. einen hohen Konzentrationsbereich verwendet wurden. Obwohl die 3 und 4 Beispiele zeigten, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und das Reagens, und die Umgebungstemperatur bei 40°C lagen, war es möglich, die Messungen mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb ermöglicht, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als Reagens, das erfindungsgemäße Verfahren eine mit einer Temperatur von 25°C oder höher durchgeführte Messung, wobei es bei einer möglichen Umgebungstemperatur zu Hause verwendet werden könnte.
Wie vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung durch Vermischen eines wässrigen Tanninlösungsreagens in die zu detektierende Lösung zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts davon bestimmt werden.
Ferner konnte durch Messung beider Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration einer zu detektierenden Lösung in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts und der in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten Lichts ein genau messbarer Konzentrationsbereich der zu detektierenden Lösung, d.h. ein dynamischer Bereich, im wesentlichen auf geweitet werden. Dies eliminierte Herkömmlicherweise benötigte Schritte wie etwa die Verdünnung einer zu detektierenden Lösung in einem hohen Konzentrationsbereich, um dadurch die praktischen Effekte für eine höhere Genauigkeit, Effizienz und Laborsicherheit der Messung und des Tests stark zu verbessern.
In dieser Ausführungsform lag die Konzentration des wässrigen Tanninlösungsreagens bei 1 g/dl. In diesem Fall lag die Konzentration des Reagens nach dem Vermischen in die zu detektierende Lösung bei 0,5 g/dl, weil das Mischungsverhältnis des Reagens zu der detektierenden Lösung bei 1:1 lag. Jedoch könnte eine Proteinkonzentration mit jeder anderen Konzentration des Reagens nach dem Vermischen in einem Bereich von 5 × 10^–3 bis 5 g/dl durch Ausbilden einer Kalibrierkurve, die der Tanninkonzentration nach dem Vermischen des Reagens entspricht, gemessen werden. Falls die Tanninkonzentration geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninkonzentration höher als der vorstehende Bereich war, gab es Fälle, in denen das koagulierte Protein schnell präzipitierte, um eine nicht gleichförmige Trübung zu verursachen, wobei die zu detektierende Lösung an einer der Konzentration entsprechenden Eintrübung rund um diesen Bereich, in dem im wesentlichen paralleles Licht 2 hindurchging, gehindert wurde, so dass die Durchführung einer stabilen Messung schwierig war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden Konzentrationsbereichs durchzuführen.
Ausführungsform 2
5 ist eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einem Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzten Geräts zeigt. 6 ist eine Draufsicht des optischen Systems des gleichen Geräts. In diesen Figuren stehen die Bezugszeichen 1 bis 7 für die gleichen Komponenten, die durch die entsprechenden Bezugszeichen in den 1 und 2 angegeben wurden, und deren Konfigurationen sind ebenso die gleichen wie die in den 1 und 2. Am Boden der Probenzelle 3 wurde ein Einlass 8 für ein Reagens vorgesehen, durch welchen das Reagens in einer vorbestimmten Menge in die zu detektierende Lösung in der Probenzelle 3 mit einer Pipette 9 zugemischt wurde. Der Computer 6 steuerte die Lichtquelle 1 und die Pipette 9, während der Analyse der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5.
In dieser Ausführungsform wurde eine wässrige Tanninsäurelösung in die zu detektierende Lösung zur Koagulierung des Proteins gemischt, um dadurch die zu detektierende Lösung einzutrüben, und die Proteinkonzentration wurde basierend auf der Änderung der Trübung nach dem Vermischen der wässrigen Tanninsäurelösung bestimmt. Genauer gesagt wurde ein wässriges Tanninsäurelösungsreagens mit einer Konzentration von 3 × 10^–4 M (entspricht 0,05 g/dl) und die zu detektie rende Lösung in einem Volumenverhältnis von 1 zu 9 zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und/oder des gestreuten Lichts vor und nach dem Vermischen des Reagens vermischt, und die Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung wurde aus den Intensitäten bestimmt. Hierin lag die Konzentration an Tanninsäure in der zu detektierenden Lösung nach dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10^–5 M (entspricht 5 × 10^–3 g/dl). Wie in Ausführungsform 1 wurden die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur von ungefähr 40°C durchgeführt, und die Temperatur der zu detektierenden Lösung, des Reagens und des Messgeräts lagen jeweils bei ungefähr 40°C.
Eine Proteinkonzentration wurde durch Verwendung eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit dem vorstehenden Messgerät folgendermaßen getestet.
Als erstes wurden 1,8 ml einer zu detektierenden Lösung in die Probezelle 3 eingeführt, woraufhin der Computer 6 die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig startete die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 aufzuzeichnen. Als nächstes steuerte der Computer 6 die Pipette 9 in einer solchen Art und Weise, dass 0,2 ml eines wässrigen Tanninsäurelösungsreagens in die Probezelle 3 durch den Einlass 8 gemischt wurde. Beim Vermischen des Tanninsäurereagens in der zu detektierenden Lösung koagulierten die Proteinkomponenten der zu detektierenden Lösung, um die Lösung einzutrüben, um dadurch die Intensität des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts zu steigern. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren eines jeden Ausgabesignals aus den Photosensoren 4 und 5 nach dem Vermischen des Reagens bestimmt.
Die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, d.h., die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5, welche durch Verwendung einer zu detektierenden Lösung mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl mit dem vorstehenden Verfahren gemessen wurden, wurden in den 7 bzw. 8 geplottet. In den 7 und 8 steht die Abszisse für die verstrichene Zeit (Sekunde) nach Vermischen des Reagens, und die Ordinate gibt die Intensitäten des durch die Photosensoren detektierten Lichts an, wobei sie die Änderung der Intensitäten des gestreuten Lichts oder des transmittierten Lichts anzeigen, welche von 60 Sekunden vor bis 300 Sekunden nach dem Vermischen des Reagens auftraten.
Die Korrelation zwischen der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts und der Proteinkonzentration und die Korrelation zwischen dem Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts und der Proteinkonzentration wurden in den 9 bzw. 10 geplottet. In der 9 gibt die Ordinate die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens ((Intensität des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens) – (Intensität des gestreuten Lichts vor Vermischen des Reagens)) an. In 10 gibt die Ordinate das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens an ((Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten Lichts vor Vermischen des Reagens)). Die Ergebnisse der Messung von Urin mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 15, 30, 60 und 100 mg/dl als zu detektierende Lösung wurde in den 9 und 10 geplottet, zusätzlich zu der zu detektierenden Lösung mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl. In diesen Fällen waren alle zu detektierenden Messlösungen optisch so transparent wie Wasser und die Intensitäten des transmittierten Lichts und des gesteuerten Lichts vor Vermischen des Reagens waren die gleichen wie Wasser.
In 9 wurde jeder Messwert durch eine durchgezogene Linie verbunden und die gemessenen Werte in dem Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 30 mg/dl, in dem die Menge der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts (die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens) sich linear mit der Proteinkonzentration änderten, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Durch Verwendung dieser durchgezogenen Linie als Kalibrierkurve konnte die Proteinkonzentration erhalten werden. Wie aus diesen Linien ferner ersichtlich ist, lagen die durchgezogene und die gestrichelte Linie übereinander, bis die Proteinkonzentration annährend 30 mg/dl erreichte, und deshalb war die Menge der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts proportional zu der Proteinkonzentration. Als die Proteinkonzentration jedoch höher wurde, wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, welcher proportional zu der Proteinkonzentration war. Als Grund wurde das Folgende angenommen. Wenn die Proteinkonzentration hoch wurde, so wurde die Wahrscheinlichkeit hoch, dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht wiederum gestreut werden würde, während das gestreute Licht von dem Punkt, an dem es auftrat, zu dem äußeren der Probezelle sich fortsetzte, um dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass das gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, zu senken. Deshalb könnte bei der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts die Konzentration in einer höheren Genauigkeit in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder niedriger), in dem die Linearität sichergestellt war, bestimmt werden.
In 10 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung) gibt das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen Linie verbunden und die gemessenen Werte in einem Proteinkonzentrationsbereich von 60 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 10 gezeigt ist, gab es bei einer Proteinkonzentration von nicht höher als 30 mg/dl Fälle, in denen der gemessene Wert nicht auf der gestrichelten Linie lag. Als Grund wurde angenommen, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von verschiedenen Störungen anfälliger war, weil die Änderung des transmittierten Lichts verglichen mit den gesamten Ausgabesignal zu klein war. Daraus wurde gefunden, dass bei Berechnung einer Proteinkonzentration von der Intensität des transmittierten Lichts die zu detektierten Lösung bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder höher) lag, um die Einflüsse von verschiedenen Störungen zu vermeiden.
Wie vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung durch Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts oder des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens detektiert werden. Ferner konnte durch Messen beider Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration einer zu detektierenden Lösung in einem niedrigen Konzentrationsbereich von der Intensität gestreuten Lichts und der in einem hohen Konzentrationsbereich von der Intensität des transmittierten Lichts ein mit hoher Genauigkeit messbarer Konzentrationsbereich der zu detektierenden Lösung, d.h. ein dynamischer Bereich, aufgeweitet werden.
Gemäß dieser Ausführungsform konnte eine Proteinkonzentration unter Verwendung eines Urins, welcher durch Präzipitation von verschiedenen Salzarten trübe gemacht worden war, bestimmt werden. Dies wird im Folgenden beschrieben.
Als erstes wurde ein trüber Urin mit einer Proteinkonzentration von 30 mg/dl in die Probenzelle 3 als eine zu detektierende Lösung eingeführt. Hierin lag das Ausgabesignal des Photosensors 5 (Intensität des gestreuten Lichts) bei ungefähr 0,05 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 5 vor Vermischen des Reagens 0,0 V im Falle einer zu detektierenden Lösung ohne Trübung aus 7 war, konnte angegeben werden, dass die Differenz zwischen diesen Ausgabesignalen das Niveau an Trübung angegeben werden, das in der zu detektierenden Lösung dieser Ausführungsform inhärent war. Die diesen Wert entsprechende Proteinkonzentration war 10 bis 12 mg/dl bei Verwendung der in 9 gezeigten durchgezogene Linie als einer Kalibrierkurve. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Reagens in die zu detektierende Lösung dazugemischt und die Änderung der Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und/oder 5 wurde beobachtet. Das Ausgabesignal des Photosensors 5 nach 300 Sekunden nach Zumischung des Reagens betrug 0,19 V. Deshalb lag die Differenz zwischen diesem Signal und dem Ausgabesignal nach 0 Sekunden nach Vermischen des Reagens bei 0,14 V. Die dieser Differenz zwischen dem Ausgabesignal (0,14 V) entsprechende Proteinkonzentration lag bei 30 mg/dl, wenn die in 9 gezeigte durchgezogene Linie als eine Kalibrierkurve genommen wird. Diese Konzentration stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen worden war. Daraus konnte bestätigt werden, dass die Proteinkonzentration in der zu detektierenden trüben Lösung aus der Differenz zwischen den Ausgabesignalen des Photosensors 5 vor und nach Vermischen des Reagens durch Verwendung der Kalib rierkurve aus 9, welche aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten worden war, genau bestimmt werden konnte.
Wie vorstehend beschrieben konnte die Konzentration einer Lösung ohne irgendeinen Einfluss aufgrund der Trübung oder dergleichen durch Berechnung der Konzentration der Lösung aus der Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens genau bestimmt werden.
Unterdessen lag das Ausgabesignal des Photosensors 4 (Intensität des transmittierten Lichts) vor Vermischen des Reagens bei 0,55 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 4 vor Vermischen des Reagens bei 0,6 V in einer zu detektierenden transparenten Lösung ohne Trübung lag, wie in 8 gezeigt ist, konnte die Differenz der Trübung der Lösung zugerechnet werden. Das Ausgabesignal betrug 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens 0,45 V und deshalb betrug das Verhältnis dieser Signale 0,82. Die dem Verhältnis der Ausgabesignale (0,82) entsprechende Proteinkonzentration lag bei 30 mg/dl, wenn die in 10 gezeigte durchgezogene Linie als Kalibrierkurve hergenommen wird. Diese Konzentration stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen worden war. Daraus konnte bestätigt werden, dass die Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung durch das Verhältnis der Ausgabesignale des Photosensors 4 nach Vermischen des Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens und durch Umwandlung von diesem zu einer Proteinkonzentration unter Verwendung von 10 als Kalibrierkurve, die aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten worden war, genau bestimmt werden konnte.
In dieser Ausführungsform wurde die Konzentration der Lösung aus den Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts unmittelbar vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens bestimmt. Jedoch kann der Zeitraum geeigneter Weise gemäß dem Messgerät, der Charakteristik der zu detektierenden Lösung und des Tanninsäurereagens wie etwa der Konzentration eingestellt werden.
Obwohl die Beispiele in den 7 bis 10 gezeigt wurden, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und des Reagens und die Umgebungstemperatur jeweils bei 40°C lag, war es ebenso möglich, die Messung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb ermöglicht das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als Reagens, die Durchführung der Messung bei einer Temperatur von 25°C oder höher, und könnte bei einer möglichen Umgebungstemperatur zu Hause eingesetzt werden.
In dieser Ausführungsform wurden ein wässriges Tanninsäurelösungsreagens mit einer Konzentration von 3 × 10^–4 (entspricht 0,05 g/dl) und eine zu detektierende Lösung mit einen Volumenverhältnis von 0,1 bis 0,9 vermischt, um die Tanninsäurekonzentration in der zu detektierenden Lösung auf 3 × 10^–5 (entspricht 5 × 10^–3 g/dl) nach Vermischen des Reagens zu regulieren. Die Proteinkonzentration könnte jedoch mit irgendeiner anderen Konzentration des Reagens nach dem Vermischen im Bereich von 3 × 10^–5 bis 3 × 10^–2 M (entspricht 5 × 10^–3 bis 5 g/dl) durch Ausbildung einer Kalibrierkurve, die der Tanninsäurekonzentration nach Vermischen des Reagens entspricht, gemessen werden. Falls die Tanninsäurekonzentration geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninsäurekonzentration höher als der vorstehende Bereich war, präzipitierte das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhinderte, dass die zu detektierende Lösung rund um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging, sich entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, dass die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs durchgeführt wurde.
In dieser Ausführung lag das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens bei 9:1. Selbst falls eine Tanninsäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10^–5 M (entspricht 5 × 10^–3 g/dl) lag, welche die gleiche wie in dem vorstehend Beispiel war, änderte sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich war. Deshalb war es notwendig, eine dem Mischungsverhältnis entsprechende Kalibrierkurve zu erzeugen. Wenn hierin das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, wurde die Trübung der zu detektierenden Lösung verglichen mit der zu detektierenden Lösung mit der gleichen Proteinkonzentration niedriger. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein wässriges Tanninsäurelösungsreagens mit einer hohen Tanninsäurekonzentration einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden Lösung hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier konnte bestätigt werden, dass eine Tanninsäurekonzentration, in der weder eine Präzipitation noch eine Denaturierung auftrat, nicht höher als 1,5 M (entspricht 250 g/dl) war. Deshalb war es effektiv, die Konzentration des wässrigen Tanninsäurelösungsreagens auf nicht höher als diese Konzentration einzustellen.
Ausführungsform 3
In dieser Ausführungsform wurde die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Hindernisses aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in einer zu detektierenden Lösung durch Messen der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 und Vergleich der gemessenen Werte unter Verwendung des in den 5 und 6 gezeigten Geräts mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 detektiert.
Falls irgendein suspendiertes Teilchen wie etwa eine Blase in einer zu detektierenden Lösung vorhanden war und in den optischen Weg des im Wesentlichen parallelen Lichts 2 eindrang, wurde das im Wesentlichen parallele Licht 2 gestreut, und dadurch wurde die genaue Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und/oder des gestreuten Lichts mit einem Fehler behaftet. In diesem Falle sank die Intensität des transmittierten Lichts substantiell. Andererseits sank entweder die Intensität des gestreuten Lichts substantiell oder sie stieg an, und zwar in Abhängigkeit des Sichtwinkels des Photosensors 5, des Orts des suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase, die in dem optischen Weg vorhanden war, und dergleichen.
Falls kein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase vorhanden war, bestand eine bestimmte Beziehung zwischen der Intensität des gestreuten Lichts und der Intensität des transmittierten Lichts, wie in den 9 und 10 gezeigt ist. Zum Beispiel lag die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens bei 0,14 V und das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens lag bei 0,82 in dem Falle, in dem die Proteinkonzentration der zu detektierenden Lösung 30 mg/dl betrug. Falls wie vorstehend jedoch ein Hindernis auftrat, wurde ein zu der vorstehenden Beziehung inkonsistenter Wert gemessen. Deshalb konnte die Anwesenheit oder Abwesenheit des vorstehend erwähnten Hindernisses detektiert werden, und zwar durch eine Überprüfung, ob die durch den gemessenen Wert des Photosensors 4 erhaltene Proteinkonzentration, basierend auf der Kalibrierkurve der 10, mit der aus den gemessenen Werten des Photosensors 5 vor und nach Vermischen des Reagens, basierend auf der Kalibrierkurve der 9, erhaltene Konzentrationen identisch waren.
Wie vorstehend beschrieben wurde, konnte gemäß dieser Ausführungsform ein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase zur Verhinderung einer fehlerbehafteten Messung detektiert werden, und zwar durch Messen beider Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des wässrigen Tanninsäurelösungsreagens und durch Vergleichen der Intensitäten. Dies verbesserte die Zuverlässigkeit der Messung und trägt für einen praktischen Effekt bei, nämlich zur Ermöglichung einer verbesserten Zuverlässigkeit und Laborsicherheit für die Messungen und Tests.
Ausführungsform 4
In dieser Ausführungsform wurde der Rotationswinkel einer zu detektierenden Lösung gemessen, bevor darin das Reagens zugemischt wurde. Eine wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösung wurde in die zu detektierende Lösung gemischt, um das Protein zu koagulieren, so dass die zu detektierende Lösung eingetrübt wurde, die Proteinkonzentration wurde aus der Änderung der Trübung nach Vermischen des Reagens gemessen und die Konzentration irgendeiner optisch aktiven Substanz, außer Protein, wurde aus den gemessenen Werten bestimmt.
11 ist ein Diagramm, das den Aufbau eines in dieser Ausführungsform eingesetzten Messgeräts veranschaulicht. Ein Halbleiterlasermodul als eine Lichtquelle 11 projiziert ein im wesentliches paralleles Licht 12 mit einer Wellenlänge von 670 nm, einer Intensität von 3,0 mW und einem Strahldurchmesser von 2,0 mm. Ein Polarisator 17 lässt nur eine polarisierte Lichtkomponente durch, welche parallel zu der Ebene dieses Blattes ist. Eine Probenzelle 13 für das Halten einer zu detektierenden Lösung ist durch eine Solenoidspule 14 rundherum umwickelt, so dass ein magnetisches Feld an die zu detektierende Lösung in Richtung der Ausbreitung des im wesentlichen parallelen Lichts 12 angelegt werden kann und besitzt eine substantielle optische Weglänge von 50 mm und eine begrenzte Füllmenge von 5 ml. Dies moduliert und steuert die Richtung der Polarisation durch Modulieren und Steuern des durch die Solenoidwicklung 14 hindurch tretenden Stroms unter Verwendung des optischen Faradayeffekts der zu detektierenden Lösung. Das Grundprinzip des Verfahrens zur Messung eines Rotationswinkels unter Einsatz des Faradayeffekts, der in der zu detektierenden Lösung inhärent ist, ist in der offen gelegten Japanischen Patentschrift Nr. Hei 9-145605 beschrieben.
Die Probenzelle 13 ist mit einem Einlass 15 für das Reagens und einem Belüftungsloch 16 für den Eintritt und Austritt von Luft versehen. Ein Analysator 18 ist derart angeordnet, dass er nur eine polarisierte Lichtkomponente durchlässt, welche senkrecht zu der Ebene dieses Blattes ist. Das im Wesentlichen parallele Licht 12, welches durch den Analysator 18 hindurch passiert, wird an einem Photosensor 19 detektiert. Ein Signalgenerator 21 erzeugt ein moduliertes Signal, welches den durch die Solenoidspule 14 hindurch passierenden Strom moduliert, zu einem Spulenantriebsgerät 20. Das Spulenantriebsgerät 20 steuert den durch die Solenoidspule 14 hindurch passierenden Strom. Ein Einschluss verstärker 22 ermöglicht die phasensensitive Detektion am Ausgangsignal des Photosensors 19 unter Verwendung des modulierten Signals der Solenoidspule 14 als einem Referenzsignal. Bei der Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung liefert der Computer 23 ein Steuerungsstromsignal zu dem Spulenantriebsgerät 20 in der Art und Weise, dass das Ausgangssignal des Einschlussverstärkers 22 Null wird.
Genauer gesagt werden nach der Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung ein wässriges m-Galloyl-Gallussäurelösungreagens mit einer Konzentration von 7,8 × 10 M (entspricht 250 g/dl) und die zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von 1:49 vermischt, um die Intensitäten des transmittierten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens zu messen. Dann wurde die Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung aus dieser Intensität erhalten und die Konzentration irgendeiner optischen aktiven Substanz, außer Protein, wurde aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt. Hier lag die Konzentration der wässrigen m-Galloyl-Gallussäurelösung nach Vermischen des Reagens bei 1,6 × 10^–1 M (entspricht 5 g/dl). Im Folgenden wird dies detaillierter erläutert.
In dieser Ausführungsform wurde ein Modulationsstrom mit einer Amplitude von 0,001 A und einer Frequenz von 1,3 kHz durch die Solenoidspule 14 hindurch passieren lassen. Dadurch wurde das Steuerstromsignal zur Berechnung des Rotationswinkels detektiert, und zwar wenn das Ausgangssignal des Einlassverstärkers 22 gleich Null wurde. Hier wurde ein Verfahren genommen, in welchem der Rotationswinkel aus dem Steuerstromsignal bestimmt wurde, welches ein magnetisches Feld gab, in dem der Rotationswinkel aufgrund von Protein oder Glukose als einer optisch aktiven Substanz in einer zu detektierenden Lösung identisch mit dem Rotationswinkel des Lösungsmittels Wasser der zu detektierenden Lösung in der Richtung der Polarisation aufgrund eines Faradayeffekts, verursacht durch das Anlegen eines magnetischen Felds, war.
Mit einer Pipette 24 wurden 0,1 ml einer wässrigen m-Galloyl-Gallussäurelösung in die zu detektierende Lösung in der Probenzelle 13 aus dem Einlassventil 15 über eine Röhre 25 gemischt. Der Computer 23 steuerte die Lichtquelle 11 und die Pipette 24, während das Ausgangssignal mittels des Photosensors 19 analysiert wurde.
Eine Glukosekonzentration (Zuckerwert im Urin) und eine Proteinkonzentration im Urin wurden mittels eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit dem vorstehenden Gerät folgendermaßen getestet.
Als erstes wurde die zu detektierende Lösung in die Probezelle 13 eingeführt, woraufhin der Computer 23 die Lichtquelle 11 und das Spulenantriebsgerät 20 zur Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung in Betrieb setzte.
Als nächstes stoppte der Computer 23 die Operation des Spulenantriebsgeräts 20 und gleichzeitig startete die Aufnahme eines Ausgabesignals des Photosensors 19. Dann steuerte der Computer 23 die Pipette 24 in einer solchen Art, dass das wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösungsreagens in die zu detektierende Lösung in der Probezelle 13 aus dem Einlassventil 15 gemischt wurde. Unter der Annahme, dass die Änderung des Ausgangssignals des Photosensors 19 nach Vermischen des Reagens die Änderung der Intensität des transmittierten Lichts war, wurde eine Kalibrationslinie entsprechend 10 basierend auf dem analytisierten Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der Intensität vor Vermischen des Reagens unter Verwen dung von Urin mit entsprechenden Proteinkonzentrationen von 0, 2, 5, 15 und 60 mg/dl als zu detektierende Lösungen mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 erzeugt. Diese Kalibrierkurve ist in 12 gezeigt.
In dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 100 mg/dl und einer Proteinkonzentration im Urin von 15 mg/dl als die zu detektierende Lösung als ein Beispiel der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der Rotationswinkel bei 0,017°. Der spezifische Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670 nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg. Unter der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf der Glukose basierte, lag die Glukosekonzentration, d.h., der Zuckerwert im Urin bei 85 mg/dl. Unterdessen lag die Proteinkonzentration, bestimmt aus 12, bei 15 mg/dl, weil das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts 0,41 war. Da der spezifische Rotationswinkel des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg lag, war der Rotationswinkel für das Protein –0,003°. Deshalb wurde der wahre Rotationswinkel für Glukose mit 0,02° durch Subtraktion von –0,003° von den vorstehend erwähnten 0,017° berechnet und die Glukosekonzentration wurde als 100 mg/dl berechnet.
Daraus wurde bestätigt, dass ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin gleichzeitig durch Messung des Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung vor Vermischen des wässrigen m-Galloyl-Gallussäurelösungreagens und durch Messen des Verhältnisses der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens genau bestimmt werden konnte.
Wie vorstehend beschrieben konnte gemäß dieser Ausführungsform die Konzentration an Protein und die von Glukose, welche eine weitere optisch aktive Substanz neben dem Protein ist, gleichzeitig bestimmt werden und deshalb war das Verfahren dieser Ausführungsform praktisch insbesondere dann praktikabel, wenn eine zu detektierende Lösung Urin war. Dies wird im Folgenden erläutert.
Falls eine Proteinkonzentration im Urin normal ist, ist Glukose die vorherrschende optisch aktive Substanz im Urin. Deshalb kann der Zuckerwert im Urin grob durch Messen des Rotationswinkels von Urin untersucht werden. Jedoch kann eine Urinanalyse genauer durch Bestimmen einer Proteinkonzentration im Urin mit einem anderen Messverfahren als den, das auf einem Rotationswinkel basiert, gemessen werden. Der Grund liegt darin, dass beim Messen einer Proteinkonzentration im Urin basierend auf dem Rotationswinkel die Kombination des Rotationswinkels für Glukose und der für Protein als der Rotationswinkel von Urin beobachtet werden, da das Protein ebenso eine optisch aktive Substanz wie Glukose ist. Deshalb können in dieser Ausführungsform ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin genau bestimmt werden, und zwar durch das Erhalten der Proteinkonzentration aus der Änderung der optischen Charakteristik nach Vermischen des Reagens, neben dem Messen des Rotationswinkels, und durch Korrigieren des gemessenen Rotationswinkels, basierend auf der so gemessenen Proteinkonzentration.
Wenn übrigens das Reagens in die zu detektierende Lösung vor Messung des Rotationswinkels gemischt wurde, koagulierte die Proteinkomponente, um dadurch zu verhindern, dass das durch die Lösung transmittierte Licht detektiert wird, oder um dadurch eine Proteindenaturierung zu verursachen, so dass der Rotationswinkel verändert wird. Somit war es nicht möglich, den Zuckerwert im Urin und die Proteinkonzentration im Urin genau zu bestimmen.
In dieser Ausführungsform wurde der Rotationswinkel und die Intensität des transmittierten Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer Wellenlänge von 670 nm gemessen. Im Allgemeinen steigt der spezifische Rotationswinkel einer Substanz mit der Abnahme der Wellenlänge an, bis die Wellenlänge die Wellenlänge erreicht, an der die der Substanz inhärente Absorption (rund 180 nm im Falle von Glukose) beginnt. Außerdem steigt die Trübung aufgrund der Koagulation von Protein mit sinkender Wellenlänge. Deshalb ist es hinsichtlich der Empfindlichkeit vorteilhafter, dass der Rotationswinkel, die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer kürzeren Wellenlänge gemessen werden. Falls jedoch die zu detektierende Lösung Urin ist, wird Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm oder kürzer durch einen im Urin enthaltenen Farbstoff wie etwa Urochrom absorbiert. Aus diesem Grund ist die Genauigkeit der Messung manchmal verschlechtert, wenn die Messung mit einem Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm oder kürzer durchgeführt wird. Deshalb war es praktikabel, dass die Messung unter Verwendung eines Lichts mit einer Wellenlänge von 500 nm oder länger durchgeführt wurde.
In dieser Ausführungsform lag das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens bei 49:1. Selbst wenn die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure nach Vermischen des Reagens bei 1,6 × 10^–1 M (entspricht 5 g/dl) lag, welches die gleiche wie in dem vorstehenden Beispiel war, änderte sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich war. Deshalb war es notwendig, eine Kalibrierkurve entsprechend dem Mischungsverhältnis zu erzeugen. Weil das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, sank hierin die Trübung der zu detektierenden Lösung mit gleicher Konzentration. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein wässriges m-Galloyl-Gallussäurelösungsreagens mit einer hohen m-Galloyl-Gallussäurekonzentration einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden Lösung hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier wurde bestätigt, dass die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure, in der weder eine Präzipitation noch eine Denaturierung auftrat, bei 7,8 M (entspricht 250 g/dl) oder niedriger lag. Deshalb war es effektiv, die Konzentration des wässrigen m-Galloyl-Gallussäurslösungsreagens auf nicht höher als diese Konzentration einzustellen.
Ausführungsform 5
In dieser Ausführungsform wurde ein wässrige Tannin/Zitronensäure-Lösung mit einer Tanninkonzentration von 1 g/dl und einer Zitronensäurekonzentration von 20 g/dl als Reagens eingesetzt. Der pH-Wert des Reagens lag annähernd bei 1,4 bis 1,5.
Das vorstehende Reagens und die zu detektierende Lösung wurden mit einem Volumenverhältnis von 1.1 zur Koagulation des Proteins vermischt, um dadurch die Lösung einzutrüben, die Intensität des gestreuten Lichts der Lösung wurde gemessen und die Proteinkonzentration wurde aus der Intensität bestimmt.
Der Schritt der Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung einer wässrigen Proteinlösung als eine zu detektierende Lösung wurde mit dem in 1 beschriebenen Messgerät durchgeführt. Es ist anzumerken, dass die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur von ungefähr 40°C durchgeführt wurden und die Temperatur einer zu detek tierenden Lösung, eines Reagens und eines Messgeräts jeweils bei ungefähr 40°C lagen.
Als erstes wurden 1 ml einer zu detektierenden Lösung und einer wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung mit einer Tanninkonzentration von 1 g/dl und einer Zitronensäurekonzentration von 20 g/dl in ein Becherglas geschüttet, gefolgt von Rühren. Als nächstes wurde die so erhaltene gemischte Lösung in die Probenzelle 3 eingeführt, woraufhin der Computer 6 die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 analysierte.
Beim Vermischen des Reagens der wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung und der zu detektierenden Lösung koagulierten die Proteinkomponenten, um die Lösung einzutrüben, dadurch wurde die Intensität des transmittierten Lichts gesenkt und die des gestreuten Lichts gesteigert. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 zu diesem Zeitpunkt bestimmt.
Wässrige Proteinlösungen (Serumalbumin) mit entsprechender Konzentration von 0, 2, 5, 15, 30, 60, 100, 250 und 500 mg/dl wurden hergestellt. Die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, d.h. die Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und 5, wurden unter Verwendung dieser Lösungen mit den vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Jedes der Ergebnisse wurde in der 13 bzw. 14 geplottet. In 13 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die Intensität des gestreuten Lichts (das Ausgabesignal aus Photosensor 5) an. In 14 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die Intensität des transmittierten Lichts (das Ausgabesignal des Photosensors 4) an. Es ist anzumerken, dass alle hier eingesetzten Lösungen transparent wie Wasser waren und die Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts vor dem Vermischen mit dem vorstehenden Reagens die gleichen wie Wasser waren. Zusätzlich wurde im Falle einer zu detektierenden Lösung mit einer Konzentration von 0, d.h. von Wasser, keine Änderung der Intensität des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens beobachtet und die zu detektierende Lösung war im Wesentlichen transparent.
In 13 wurde jeder der gemessenen Werte mit einer durchgezogenen Linie verbunden, und die gemessenen Werte in dem Konzentrationsbereich von 0 bis 15 mg/dl, in der sich die Intensität des gestreuten Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie aus diesen Linien ersichtlich ist, fallen die durchgezogene und die gestrichelte Linie zusammen, und zwar bis die Proteinkonzentration annähernd 15 mg/dl erreichte, und deshalb war die Intensität des gestreuten Lichts proportional zur der Proteinkonzentration. Wenn jedoch die Proteinkonzentration höher wurde, wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, der zu der Proteinkonzentration proportional war. Als Grund wurde der Folgende angenommen. Falls die Proteinkonzentration höher wurde, so stieg die Wahrscheinlichkeit, dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht erneut gestreut wurde, während das gestreute Licht sich von dem Punkt, an dem es entstand, zu dem Äußeren der Probezelle sich fortsetzte, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass das gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, sank. Deshalb konnte bei Berechnung der Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts die Konzentration in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl oder niedriger), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration in einem mittleren und einem hohen Konzentrationsbereich (über 15 mg/dl oder höher), welche nicht mit der Linearität übereinstimmten, konnten durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie gezeigten Kalibrierkurve bestimmt werden.
Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Konzentration im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden kann, da die zu detektierende Lösung keine vollständige Sättigung erreichte.
Falls hierin Zitronensäure nicht in die wässrige Tanninlösung gemischt wurde, gab es einen Fall, in dem die Intensität des gestreuten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 5) bei einer Konzentration von 500 mg/dl gleich 1,0 V oder niedriger wurde, was zu einer fehlerhaften Operation führte, in welche die Konzentration als ungefähr 120 mg/dl oder niedriger angenommen wurde.
Wie jedoch in dieser Ausführungsform gezeigt ist, war es durch Verwendung eines durch Vermischen von Zitronensäure in einer wässrigen Tanninlösung hergestellten Reagens möglich, eine der Konzentration entsprechende Trübung zur verursachen, und zwar selbst für den Fall einer zu detektierenden Lösung mit einer hohen Konzentration wie etwa 500 mg/dl.
In 14 steht die Abszisse für die Proteinkonzentration und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung) gibt die Intensität des transmittierten Lichts an. Jeder der gemessenen Werte wurde durch eine durchgezogene Linie verbunden und die gemessenen Werte im Proteinkonzentrationsbereich von 15 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der In tensität des transmittierten Lichts mit der Proteinkonzentration linear änderte, wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 4 gezeigt ist, lag der Messwert nicht auf der gestrichelten Linie, falls die Proteinkonzentration niedrig war, wie etwa 2 und 5 mg/dl. Es wurde angenommen, dass der Grund dafür darin lag, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von verschiedenen Störungen anfälliger war, weil die Änderung des transmittierten Lichts verglichen mit der im gesamten Ausgabesignal (= 1,0 V) im Falle, dass eine zu detektierende Lösung ohne Trübung eingesetzt wurde, zu klein war. Daraus wurde bestätigt, dass bei der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des transmittierten Lichts, die zu detektierende Lösung bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 bis 100 mg/dl oder höher) lag, um die Einflüsse der verschiedenen Störungen zu vermeiden.
Falls jedoch die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 100 mg/dl oder höher) lag, unterschied sich die durchgezogene Linie graduell von der linearen gestrichelten Linie. Der Grund wurde folgendermaßen angenommen. Wenn die Trübung extrem hoch wurde, trat das folgende Phänomen als ein Ergebnis der Streuungen wie etwa Mehrfachstreuung auf: Ein Licht, welches mehrere Wege durchwandert, erreicht den Photosensor 4; das Ausgabesignal des Photosensors 4 sinkt (ungefähr 10^–4 V), um hinsichtlich des Einflusses verschiedener Störungsarten anfälliger zu werden. Deshalb konnte bei Bestimmung einer Proteinkonzentration aus der Intensität des transmittierten Lichts die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich (von ungefähr 15 bis 100 mg/dl), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration in einem mittleren und hohen Konzentrationsbereich (über 100 mg/dl), welche die Linearität nicht sicherstellte, konnte durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie gezeigten Kalibrierkurve bestimmt werden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Proteinkonzentration im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden konnte, weil die zu detektierende Lösung nicht vollständig gesättigt war.
Falls hierin Zitronensäure nicht in die wässrige Tanninlösung gemischt wurde, gab es Fälle, in denen die Intensität des transmittierten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 4) bei einer Proteinkonzentration von 500 mg/dl gleich 0,05 V oder höher wurde, was zu fehlerhaften Operationen führte, in welchen die Konzentration als ungefähr 120 mg/dl oder niedriger angenommen wurde. Durch Verwendung eines durch Vermischen von Zitronensäure in einer wässrigen Tanninlösung hergestellten Reagens war es jedoch möglich, die der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, selbst falls die zu detektierende Lösung eine hohe Konzentration wie etwa 500 mg/dl besaß, wie in dieser Ausführungsform gezeigt wurde. Deshalb konnte eine hohe Genauigkeit durch Verwendung der so erhaltenen gestrichelten Linie der 3 und 4 zur Berechnung der Konzentrationen in einem hohen Konzentrationsbereich bzw. einem niedrigen Konzentrationsbereich sichergestellt werden.
Obwohl in den 13 und 14 Beispiele gezeigt sind, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und des Reagens, und die Umgebungstemperatur bei 40°C lagen, war es möglich die Messungen mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. In diesem Fall war es jedoch bevorzugt, die gestrichelte Linie und die feste Linie, die denen in 13 und 14 für die entsprechenden Temperaturen entsprechen, zu verwenden. Deshalb ermöglicht, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als Reagens, das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Durchführen von Messungen bei einer Temperatur von 25°C o der höher, und könnte bei möglichen Umgebungstemperaturen zu Hause eingesetzt werden.
Wie vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung durch Vermischen eines wässrigen Reagens der Tannin/Zitronensäure-Lösung in die zu detektierende Lösung zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts davon bestimmt werden.
Ferner konnte durch Messung beider Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration einer zu detektierenden Lösung in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts und der in einem mittleren Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten Lichts ein genau messbarer Konzentrationsbereich der zu detektierenden Lösung, d.h. ein dynamischer Bereich, im wesentlichen aufgeweitet werden. Dies eliminierte Herkömmlicherweise benötigte Schritte wie etwa die Verdünnung einer zu detektierenden Lösung in einem hohen Konzentrationsbereich, um dadurch die praktischen Effekte für eine höhere Genauigkeit, Effizienz und Laborsicherheit der Messung und des Tests stark zu verbessern.
Die pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt durch Vermischen von zu detektierenden wässrigen Proteinlösungen (Serumalbumin) mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15, 30, 60, 100, 250 und 500 mg/dl und des vorstehenden Reagens der wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung waren im Bereich von 1,5 bis 1,9. In dieser Ausführungsform wurde das eingesetzte Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die wässrige Tanninlösung hergestellt. Jedoch könnte ein ähnlicher Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5 bis 5,8 fähig ist, eingesetzt werden. Der ähnliche Effekt könnte ebenso durch Zugabe einer Säure in die zu detektierende Lösung zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens auf 1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Sorte oder die Menge der in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure und/oder in das Reagens unterschiedlich war, wurden unterschiedliche Kalibrierkurven erhalten (entsprechend den gestrichelten Linien und den durchgezogenen Linien der 13 und 14). Deshalb war es notwendig, unterschiedliche Kalibrierkurven zu erzeugen (entsprechend den gestrichelten und durchgezogenen Linien der 13 und 14). Falls der pH-Wert der zu detektierenden Lösung nicht in dem vorstehend erwähnten Bereich lag, gab es Fälle, in dem das Protein nicht vollständig koagulierte, so dass es unmöglich war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
In dieser Ausführungsform lag die Tanninkonzentration in dem Reagens der wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung bei 1 g/dl. In diesem Fall lag die Konzentration des Reagens nach dem Mischen in der zu detektierenden Lösung bei 0,5 g/dl, weil das Mischungsverhältnis des Reagens zu der Lösung bei 1:1 lag. Jedoch könnte im Falle, dass die Konzentration des Reagens unterschiedlich von dem vorstehenden Wert war, eine Proteinkonzentration durch Erzeugen einer Kalibrierkurve (entsprechend den gestrichelten Linien und den durchgezogenen Linien der 13 und 14) gemäß der Tanninkonzentration nach Vermischen des Reagens in die zu detektierende Lösung gemessen werden, so lange sie im Bereich von 5 × 10^–3 bis 5 g/dl lag. Falls die Tanninkonzentration niedriger als der vorstehende Bereich war, gab es Fälle, in denen das Protein nicht koagulierte, so dass es schwierig war eine stabile Messung durchzuführen. Falls die Tanninkonzentration höher als der vorstehende Bereich war, präzipitierte das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhindert, dass die zu detektierende Lösung in Übereinstimmung mit der Konzentration rund um die Region, in dem im Wesentlichen paralleles Licht 2 hindurch passierte, eingetrübt wurde, so dass eine stabile Messung schwer durchgeführt werden konnte. Deshalb war es praktisch bevorzugt, dass die Messung innerhalb des vorstehenden Konzentrationsbereichs durchgeführt wurde.
In dieser Ausführungsform wurde bestimmt, dass hinsichtlich der Konzentration in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl oder niedriger), eines mittleren Konzentrationsbereichs (von ungefähr 15 bis 100 mg/dl) und eines hohen Konzentrationsbereichs (ungefähr 100 mg/dl oder höher), Ergebnisse mit einer höheren Genauigkeit erhalten werden konnte, und zwar durch Messung einer Konzentration in dem niedrigen Konzentrationsbereich basierend auf der Intensität des gestreuten Lichts und durch Messung der Konzentration in dem mittleren Konzentrationsbereich basierend auf der Intensität des transmittierten Lichts. Jedoch sollte angemerkt werden, dass die entsprechenden Werte des niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationsbereichs in Abhängigkeit der optischen Weglänge der Probenzelle 3 des durchlaufenden Abstands des gestreuten Lichts 7 in der zu detektierenden Lösung, des Orts des optischen Systems, de Art des Reagens oder dergleichen variieren könnten, und nicht auf die vorstehenden Werte beschränkt war. Momentan kann eine Proteinkonzentration von 15 mg/dl oder niedriger durch Messen der Intensität des transmittierten Lichts berechnet werden, wenn die optische Weglänge des transmittierten Lichts auf nicht länger als der Weglänge in dieser Ausführungsform (länger als 10 mm) eingestellt war. Jedoch reduziert eine solche Ausdehnung der optischen Weglänge das Ausgabesignal des Photosensors 4 (annähernd 10^–4 V), im Falle eines Hochkonzentrationsbereichs, so dass die Bestimmung der Konzentration erschwert ist. Außerdem dehnt die Ausdehnung der optischen Weglänge inhärent die Gerätegröße aus und ist deshalb nicht praktisch bevorzugt. Der größte Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung erhalten wurde, war, dass ein messbarer Konzentrationsbereich oder ein dynamischer Bereich durch Verwendung von sowohl der Intensität des gestreuten Lichts als auch der Intensität des transmittierten Lichts ausgeweitet werden konnte, falls der Aufbau oder die Größe des Geräts bestimmten Schranken unterlagen.
Ausführungsform 6
In dieser Ausführungsform wurde eine wässrige Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in die zu detektierende Lösung zur Koagulierung des Proteins gemischt, um dadurch die zu detektierende Lösung einzutrüben, und die Proteinkonzentration wurde basierend auf der Änderung der Trübung nach dem Vermischen der wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung bestimmt. Genauer gesagt wurde eine wässrige Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung mit einer Konzentration von 3 × 10^–4 M (entspricht 0,05 g/dl) und einer Zitronensäure-Konzentration von 5 g/dl wurde als Reagens eingesetzt. Der pH-Wert dieses Reagens lag bei ungefähr 1,8 bis 2,0.
Genauer gesagt wurden die wässrige Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung und die zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von 1 zu 9 zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und/oder des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens vermischt. Dann wurde die Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung aus den Intensitäten bestimmt. Hierin lag die Konzentration an Tanninsäure nach dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10^–5 M (entspricht 5 × 10^–3 g/dl). Wie in Ausführungsform 5 wurden die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur von ungefähr 40°C durchgeführt, und die Temperatur der zu detektierenden Lösung, des Reagens und des Messgeräts lagen jeweils bei ungefähr 40°C.
Eine Proteinkonzentration wurde durch Verwendung eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit dem vorstehenden in 5 dargestellten Messgerät folgendermaßen getestet.
Als erstes wurden 1,8 ml einer zu detektierenden Lösung in die Probezelle 3 eingeführt, woraufhin der Computer 6 die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig startete, die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 aufzuzeichnen. Als nächstes steuerte der Computer 6 die Pipette 9 in einer solchen Art und Weise, dass 0,2 ml eines Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in die Probezelle 3 durch den Einlass 8 gemischt wurde. Beim Vermischen des Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in der zu detektierenden Lösung koagulierten die Proteinkomponenten der zu detektierenden Lösung, um die Lösung einzutrüben, um dadurch die Intensität des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts zu steigern. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren eines jeden Ausgabesignals aus den Photosensoren 4 und 5 nach dem Vermischen des Reagens bestimmt.
Die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, das heißt die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5, welche durch Verwendung einer zu detektierenden Lösung mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl mit dem vorstehenden Verfahren gemessen wurden, wurden in den 15 bzw. 16 geplottet. In den 15 und 16 steht die Abszisse für die verstrichene Zeit (Sekunde) nach Vermischen des Reagens, und die Ordinate gibt die Intensitäten des durch die entsprechenden Photosensoren detektier ten Lichts an, wobei sie die Änderung der Intensitäten des gestreuten Lichts oder des transmittierten Lichts anzeigen, welche von 60 Sekunden vor bis 300 Sekunden nach dem Vermischen des Reagens auftraten.
Die Korrelation zwischen der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts und der Proteinkonzentration und die Korrelation zwischen dem Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts und der Proteinkonzentration wurden in den 17 bzw. 18 geplottet. In der 17 gibt die Ordinate die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens ((Intensität des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens) – (Intensität des gestreuten Lichts vor Vermischen des Reagens)) an. In 18 gibt die Ordinate das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens an ((Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten Lichts vor Vermischen des Reagens)). Die Ergebnisse der Messungen von Urin mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 15, 30, 60, 100, 250 und 500 mg/dl als zu detektierende Lösung wurde in den 17 und 18 geplottet, zusätzlich zu der zu detektierenden Lösung mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl. In diesen Fällen waren alle zu detektierenden Messlösungen optisch so transparent wie Wasser und die Intensitäten des transmittierten Lichts und des gesteuerten Lichts waren die gleichen wie Wasser.
In 17 wurde jeder Messwert durch eine durchgezogene Linie verbunden und der gemessene Wert in dem Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 30 mg/dl, in dem sich die Menge der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts (die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens) linear mit der Prote inkonzentration änderte, wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Durch Verwendung dieser festen Linie als Kalibrierkurve konnte die Proteinkonzentration erhalten werden.
Wie aus diesen Linien ferner ersichtlich ist, lagen die durchgezogene und die gestrichelte Linie übereinander, bis die Proteinkonzentration annährend 30 mg/dl erreichte, und deshalb war die Menge der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts proportional zu der Proteinkonzentration. Als die Proteinkonzentration jedoch höher wurde, wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, welcher proportional zu der Proteinkonzentration war. Als Grund wurde das Folgende angenommen. Wenn die Proteinkonzentration hoch wurde, so wurde die Wahrscheinlichkeit hoch, dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht wiederum gestreut werden würde, während das gestreute Licht von dem Punkt, an dem es auftrat, zu dem äußeren der Probezelle sich fortsetzte, um dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass das gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, zu senken. Deshalb könnte bei der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des gestreuten Lichts die Konzentration in einer höheren Genauigkeit in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder niedriger), in dem die Linearität sichergestellt war, bestimmt werden.
Eine Proteinkonzentration in einem hohen Konzentrationsbereich (über 30 mg/dl oder höher), welche nicht mit der Linearität übereinstimmten, konnten durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie gezeigten Kalibrierkurve bestimmt werden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Konzentration im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden konnte, da die zu detektierende Lösung nicht vollständig gesättigt war.
Falls hierin Zitronensäure nicht in die wässrige Tanninsäurelösung gemischt wurde, gab es einen Fall, in dem die Intensität des gestreuten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 5) der zu detektierenden Lösung mit einer Konzentration von 500 mg/dl etwa 0 V wurde, was zu einer fehlerhaften Operation führte, in welcher die Konzentration als ungefähr 0 mg/dl oder niedriger angenommen wurde.
Wie jedoch in dieser Ausführungsform gezeigt ist, war es durch Verwendung eines durch Vermischen von Tanninsäurelösung in einer wässrigen Tanninlösung hergestellten Reagens möglich, eine der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, und zwar selbst im Falle einer zu detektierenden Lösung mit einer hohen Konzentration wie etwa 500 mg/dl.
In 18 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung) gibt das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen Linie verbunden und der gemessene Wert in einem Proteinkonzentrationsbereich von 30 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 18 gezeigt ist, gab es bei einer Proteinkonzentration von nicht höher als 30 mg/dl einen Fall, in dem der gemessene Wert nicht auf der gestrichelten Linie lag. Als Grund wurde angenommen, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von verschiedenen Störungen anfälliger war, weil die Änderung des transmittierten Lichts verglichen mit dem gesamten Ausgabesignal zu klein war. Daraus wurde gefunden, dass bei Berechnung einer Proteinkonzentration von der Intensität des transmittierten Lichts die zu detektierten Lösung bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder höher) lag, um die Einflüsse von verschiedenen Störungen zu vermeiden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Proteinkonzentration im Konzentrationsbereich bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden konnte, weil keine Sättigung beobachtet wurde.
Wenn Zitronensäure hierin nicht in die wässrige Tanninsäurelösung gemischt wurde, kam es zu Fällen, in denen die Intensität des transmittierten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 4) der zu detektierenden Lösung mit einer Konzentration von 500 mg/dl kleiner als 0,6 V wurde, was zu einer fehlerhaften Operation führte, in welcher die Konzentration als annähernd nicht mehr als 0 mg/dl angenommen wurde. Bei Verwendung des Reagens, hergestellt durch Zitronensäure in einer wässrigen Tanninsäurelösung, war es jedoch möglich, eine der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, selbst falls die zu detektierende Lösung eine hohe Konzentration aufwies, wie etwa 500 mg/dl, wie in dieser Ausführungsform gezeigt ist.
Deshalb konnte eine hohe Genauigkeit durch Verwendung der so erhaltenen gestrichelten Linie der 17 und 18 sichergestellt werden, um die Konzentration in einem hohen Konzentrationsbereich bzw. die in einem niedrigen Konzentrationsbereich zu bestimmen. Wie vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung durch Messen der Intensität des transmittierten Lichts oder der Intensität des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens erhalten werden.
Ferner konnte durch Messen von beiden Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration einer zu detektierenden Lösung geringen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts und der in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten Lichts konnte der mit hoher Genauigkeit messbare Konzentrationsbereich der zu detektierende Lösung, das heißt der dynamisch Bereich, substantiell ausgeweitet werden.
Gemäß dieser Ausführungsform konnte eine Proteinkonzentration unter Verwendung eines Urins, welcher durch Präzipitation von verschiedenen Salzarten trübe gemacht worden war, bestimmt werden. Dies wird im Folgenden beschrieben.
Als erstes wurde ein trüber Urin mit einer Proteinkonzentration von 30 mg/dl in die Probenzelle 3 als eine zu detektierende Lösung eingeführt. Hierin lag das Ausgabesignal des Photosensors 5 (Intensität des gestreuten Lichts) bei ungefähr 0,05 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 5 vor Vermischen des Reagens 0,0 V im Falle einer zu detektierenden Lösung ohne Trübung aus 15 war, konnte angegeben werden, dass die Differenz zwischen diesen Ausgabesignal das Niveau an Trübung angegeben werden, das in der zu detektierenden Lösung dieser Ausführungsform inhärent war. Die diesen Wert entsprechende Proteinkonzentration war 10 bis 12 mg/dl bei Verwendung der in 17 gezeigten durchgezogene Linie als einer Kalibrierkurve. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Reagens in die zu detektierende Lösung dazugemischt, um die Änderung der Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und/oder 5 zu beobachten. Das Ausgabesignal des Photosensors 5 nach 300 Sekunden nach Zumischung des Reagens betrug 0,19 V. Deshalb lag die Differenz zwischen diesem Signal und dem Ausgabesignal nach 0 Sekunden nach Vermischen des Reagens bei 0,14 V. Die dieser Differenz zwischen dem Ausgabesignal (0,14 V) entsprechende Protein konzentration lag bei 30 mg/dl, wenn die in 17 gezeigte durchgezogene Linie als eine Kalibrierkurve genommen wird. Diese Konzentration stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen worden war. Daraus konnte bestätigt werden, dass die Proteinkonzentration in der zu detektierenden trüben Lösung aus der Differenz zwischen den Ausgabesignalen des Photosensors 5 vor und nach Vermischen des Reagens durch Verwendung der Kalibrierkurve aus 17, welche aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten worden war genau bestimmt werden konnte.
Wie vorstehend beschrieben konnte die Konzentration einer Lösung ohne irgendeinen Einfluss aufgrund von Trübung oder dergleichen durch Berechnung der Konzentration der Lösung aus der Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens genau bestimmt werden.
Unterdessen lag das Ausgabesignal des Photosensors 4 (Intensität des transmittierten Lichts) vor Vermischen des Reagens bei 0,55 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 4 vor Vermischen des Reagens bei 0,6 V in einer zu detektierenden transparenten Lösung ohne Trübung lag, wie in 16 gezeigt ist, konnte die Differenz der Trübung der Lösung zugerechnet werden. Da das Ausgabesignal 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens 0,45 V betrug, betrug das Verhältnis dieser Signale 0,82. Die dem Verhältnis der Ausgabesignale (0,82) entsprechende Proteinkonzentration lag bei 30 mg/dl, wenn die in 18 gezeigte durchgezogene Linie als Kalibrierkurve hergenommen wird. Diese Konzentration stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen worden war. Daraus konnte bestätigt werden, dass die Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung durch das Verhältnis der Ausgabesignale des Photosensors 4 nach Vermischen des Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens und durch Umwandlung von diesem zu einer Proteinkonzentration unter Verwendung von 18 als Kalibrierkurve, die aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten worden war, genau bestimmt werden konnte.
In dieser Ausführungsform wurde die Konzentration der Lösung aus den Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts unmittelbar vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens bestimmt. Jedoch kann der Zeitraum geeigneter Weise gemäß dem Messgerät, der Charakteristik der zu detektierenden Lösung und des Tanninsäurereagens wie etwa der Konzentration eingestellt werden.
In den 15 bis 18 wurden Beispiele gezeigt, in denen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und des Reagens, und die Umgebungstemperatur jeweils bei 40°C lag. Jedoch war es ebenso möglich, die Messung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb ermöglicht das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als Reagens, die Durchführung der Messung bei einer Temperatur von 25°C oder höher, und könnte bei einer möglichen Umgebungstemperatur zu Hause eingesetzt werden.
Die pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt durch Vermischen der in dieser Ausführungsform als zu detektierende Lösung eingesetzten Urine und der vorstehenden Reagentien der wässerigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung, lagen bei 2,4 bis 3,0. In dieser Ausführungsform wurde das eingesetzte Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die wässrige Tanninlösung hergestellt. Jedoch könnte ein ähnlicher Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5 bis 5,8 fähig ist, eingesetzt werden. Der ähnliche Effekt könnte ebenso durch Zugabe einer Säure in die zu detektierende Lösung zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens auf 1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Art oder die Menge der in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure und/oder in das Reagens unterschiedlich war, änderten sich die Kalibrierkurven (entsprechend den gestrichelten Linien und den durchgezogenen Linien der 17 und 18). Deshalb war es notwendig, unterschiedliche Kalibrierkurven zu erzeugen (entsprechend den gestrichelten und durchgezogenen Linien der 17 und 18) in diesem Fall. Falls der pH-Wert nicht in dem vorstehend erwähnten Bereich lag, konnte das Protein nicht vollständig koagulieren, so dass es unmöglich war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
Falls hierin die zu detektierende Lösung Urin war, war es besonders praktikabel, eine Säure als eine in das Reagens und/oder in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure aus der Gruppe auszuwählen, die aus Kaliumhydrogenphtalat, Essigsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure besteht, weil diese Säuren leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht zu handhaben sind und außerdem die Möglichkeit der Induzierung der Präzipitation von Phosphat, Carbonat, oder dergleichen reduzieren und somit sehr praktikabel sind.
In dieser Ausführungsform wurden eine wässrige Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung mit einer Konzentration von Tanninsäure von 3 × 10^–4 (entspricht 0,05 g/dl) und einer Konzentration von Zitronensäure von 5 g/dl, die als Reagens eingesetzt wurde, und eine zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von 0,1 bis 0,9 vermischt, um die Konzentration von Tanninsäure auf 3 × 10^–5 (entspricht 5 × 10^–3 g/dl) und die Konzentration von Zitronensäure auf 0,5 g/dl nach dem Vermischen des Reagens zu regulieren. Selbst wenn jedoch jede dieser Konzentrationen nach dem Vermischen des Reagens nicht in den vorstehenden Bereichen lag, konnte die Proteinkonzentration durch Erzeugen von Kalibrierkurven, die den Konzentration von Tanninsäure und Zitronensäure nach dem Vermischen des Reagens in der zu detektierende Lösung entsprachen, gemessen werden, so lange die Tanninsäurekonzentration von 3 × 10^–5 bis 3 × 10^–2 M (entspricht 5 × 10^–3 bis 5g/dl) lag und der pH-Wert von 1, 5 bis 5, 8 nach dem Vermischen des Reagens lag. Falls die Tanninsäurekonzentration geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninsäurekonzentration höher als der vorstehende Bereich war, präzipitierte das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhinderte, dass die zu detektierende Lösung rund um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging, sich entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, dass die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs durchgeführt wurde.
In dieser Ausführung lag das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens bei 9.1. Selbst falls die Tanninsäure- und Zitronensäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens in dem gleichen Bereich wie im vorstehenden Beispiel lagen, änderte sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich war. Deshalb war es notwendig, eine dem Mischungsverhältnis entsprechende Kalibrierkurve zu erzeugen. Wenn hierin das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, wurde die Trübung der zu de tektierenden Lösung verglichen mit der zu detektierenden Lösung mit der gleichen Proteinkonzentration niedriger. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäurelösung mit einer hohen Tanninsäurekonzentration einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden Lösung hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier konnte bestätigt werden, dass eine Tanninsäurekonzentration, in der weder eine Präzipitation noch eine Denaturierung bei einer Temperatur von 0 bis 40°C auftrat, welche eine mögliche Umgebungstemperatur zu Hause ist, bei der das Reagens eingesetzt wird, nicht höher als 1,5 M (entspricht 250 g/dl) war. Deshalb war es praktisch vorteilhaft, die Konzentration des wässrigen Tanninsäurelösungsreagens auf nicht höher als diese Konzentration einzustellen.
Ähnlich war es ebenso Vorteilhaft, Zitronensäure in einer hohen Konzentration einzusetzen. Jedoch war es notwendig, dass die Zitronensäurekonzentration nicht höher als die Konzentration ist, in der weder eine Präzipitation noch eine Denaturierung bei einer Temperatur von 0 bis 40°C, welche die vorstehende Umgebungstemperatur ist, auftrat. Hierin war es ebenso notwendig, dass die Konzentration in dem Bereich lag, in dem keine Präzipitation oder Denaturierung aufgrund einer Wechselwirkung zwischen Tanninsäure und Zitronensäure auftrat.
Ausführungsform 7
Die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Hindernisses aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in einer zu detektierenden Lösung durch Messen der Ausgabe signale der Photosensoren 4 und 5 und Vergleich der gemessenen Werte unter Verwendung des in den 5 und 6 gezeigten Geräts mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 detektiert. Falls irgendein suspendiertes Teilchen wie etwa eine Blase in einer zu detektierenden Lösung vorhanden war und in den optischen Weg des im Wesentlichen parallelen Lichts 2 eindrang, wurde das im Wesentlichen parallele Licht 2 gestreut, und dadurch wurde die genaue Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und/oder des gestreuten Lichts mit einem Fehler behaftet. In diesem Falle sank die Intensität des transmittierten Lichts substantiell. Andererseits sank entweder die Intensität des gestreuten Lichts substantiell oder sie stieg an, und zwar in Abhängigkeit des Sichtwinkels des Photosensors 5, des Orts des suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase, die in dem optischen Weg vorhanden war, und dergleichen.
Falls kein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase vorhanden war, bestand eine bestimmte Beziehung zwischen der Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, wie in den 17 und 18 gezeigt ist. Zum Beispiel lag die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung bei 0,14 V und das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens lag bei 0,82 in dem Falle, in dem die Proteinkonzentration der zu detektierenden Lösung 30 mg/dl betrug. Falls wie vorstehend jedoch ein Hindernis auftrat, wurde ein zu der vorstehenden Beziehung inkonsistenter Wert gemessen. Deshalb konnte die Anwesenheit oder Abwesenheit des vorstehend erwähnten Hindernisses detektiert werden, und zwar durch eine Überprüfung, ob die durch den gemessenen Wert des Photosensors 4 erhaltene Proteinkonzentration, basierend auf der Kalibrierkurve der 18, mit der aus den gemessenen Werten des Photosensors 5 vor und nach Vermischen des Tanninsäure/Zitronensäurereagens, basierend auf der Kalibrierkurve der 17, erhaltenen Konzentrationen identisch waren oder nicht.
Wie vorstehend beschrieben wurde, konnte gemäß dieser Ausführungsform ein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase zur Verhinderung einer fehlerbehafteten Messung detektiert werden, und zwar durch Messen beider Intensitäten des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung und durch Vergleichen der Intensitäten. Dies verbesserte die Zuverlässigkeit der Messung und trägt für einen praktischen Effekt bei, nämlich zur Ermöglichung einer verbesserten Zuverlässigkeit und Laborsicherheit für die Messungen und Tests.
Ausführungsform 8
In dieser Ausführungsform wurde der Rotationswinkel einer zu detektierenden Lösung gemessen, bevor darin das Reagens zugemischt wurde. Eine wässrige m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung wurde in die zu detektierende Lösung gemischt, um das Protein zu koagulieren, so dass die zu detektierende Lösung eingetrübt wurde. Die Proteinkonzentration wurde aus der Änderung der Trübung nach Vermischen des Reagens gemessen und die Konzentration irgendeiner optisch aktiven Substanz, außer Protein, wurde aus den gemessenen Werten bestimmt.
Genauer gesagt werden nach der Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung ein Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung mit einer m-Galloyl-Gallussäurekonzentration von 0,047 M (entspricht 1,5 g/dl) und mit einer Zitronensäurekonzentration von 0,3 g/dl und die zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von 1:49 vermischt, um die Intensitäten des transmittierten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens zu messen. Hierin lag der pH-Wert des Reagens bei ungefähr 2,6 bis 2,8.
Dann wurde die Proteinkonzentration aus dieser Intensität erhalten und die Konzentration irgendeiner optischen aktiven Substanz, außer Protein, wurde aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt. Hier lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach Vermischen des Reagens bei 9,4 × 10^–4 M (entspricht 0,03 g/dl) und die Konzentration der Zitronensäure lag bei 0,006 g/dl. Im Folgenden wird dies detaillierter erläutert.
Eine Glukosekonzentration (Zuckerwert im Urin) und eine Proteinkonzentration im Urin wurden mittels eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit den in 11 gezeigten Geräten, die in Ausführungsform 4 eingesetzt wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Ausführungsform 4 getestet.
Als erstes wurde die zu detektierende Lösung in die Probezelle 13 eingeführt, woraufhin der Computer 23 die Lichtquelle 11 und das Spulenantriebsgerät 20 zur Messung eines Rotationswinkels der Lösung in Betrieb setzte.
Als nächstes stoppte der Computer 23 die Operation des Spulenantriebsgeräts 20 und gleichzeitig startete die Aufnahme eines Ausgabesignals des Photosensors 19. Dann steuerte der Computer 23 die Pipette 24 in einer solchen Art, dass das Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung in die zu detektierende Lösung in der Probezelle 13 aus dem Einlassventil 15 gemischt wurde. Unter der Annahme, dass die Änderung des Ausgangssignals des Photosensors 19 nach Vermischen des Reagens die Änderung der Intensität des transmittierten Lichts war, wurde eine Kalibrationslinie entsprechend 18 unter Verwendung von Urin mit entsprechenden Proteinkonzentrationen von 0, 2, 5, 15, 60, 100 und 250 mg/dl als zu detektierende Lösungen, basierend auf dem analytisierten Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der Intensität vor Vermischen des Reagens, mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 6 erzeugt. Diese Kalibrierkurve ist in 19 gezeigt.
In 19 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung) gibt das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen Linie verbunden und die gemessenenen Werte in einem Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 30 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Die Proteinkonzentration konnte durch Verwendung der durchgezogenen Linie als Kalibrierkurve bestimmt werden. Falls jedoch die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 100 mg/dl oder höher) lag, unterschied sich die durchgezogene Linie graduell von der linearen gestrichelten Linie, wie in 19 gezeigt ist. Der Grund wurde folgendermaßen angenommen. Wenn die Trübung extrem hoch wurde, trat das folgende Phänomen als ein Ergebnis der Streuungen wie etwa Mehrfachstreuung auf: Die Polarisierung des im Wesentlichen parallelen Lichts 12 sinkt, um dadurch die Menge des durch den Analysator 18 transmittierten Lichts zu steigern; ein Licht, welches mehrere Wege durchwandert, erreicht den Photosensor 19; das Ausgabesignal des Photosensors 19 sinkt (ungefähr 10^–4 V), um hinsichtlich des Einflusses verschiedener Störungsarten anfälliger zu werden. Deshalb konnte bei Bestimmung einer Proteinkonzentration aus der Intensität des transmittierten Lichts die Konzentration im Konzentrationsbereich von ungefähr 0 bis 60 mg/dl), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration im Konzentrationsbereich von größer als 100 mg/dl, in welchem die Linearität nicht sichergestellt war, konnte durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie erhaltenen Kalibrierkurve bestimmt werden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Proteinkonzentration im Bereich von bis zu 250 mg/dl direkt gemessen werden konnte, weil die zu detektierende Lösung nicht vollständig gesättigt war.
Falls hierin Zitronensäure nicht in die wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösung gemischt wurde, gab es Fälle, in denen das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts (Ordinate der 19) ungefähr 0,1 wurde, was zu einer fehlerhaften Operation führte, in welcher die Konzentration als ungefähr 40 mg/dl angenommen wurde. Durch Verwendung eines durch Vermischen von Zitronensäure in einer wässrigen Galloyl-Gallussäurelösung hergestellten Reagens war es jedoch möglich, die der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, selbst falls die zu detektierende Lösung eine hohe Konzentration wie etwa 250 mg/dl besaß, wie in dieser Ausführungsform gezeigt wurde.
In dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 100 mg/dl und einer Proteinkonzentration im Urin von 15 mg/dl in einem Beispiel der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der Rotationswinkel bei 0,017°. Der spezifische Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670 nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg. Unter der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf der Glukose basierte, lag die Glukosekonzentration, d.h., der Zuckerwert im Urin bei 85 mg/dl. Unterdessen lag die Proteinkonzentration, bestimmt aus 19, bei 15 mg/dl, weil das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts 0,41 war. Da der spezifische Rotationswinkel des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg lag, war der Rotationswinkel für das Protein –0,003°. Deshalb wurde der wahre Rotationswinkel für Glukose mit 0,02° durch Subtraktion von 0,003° von den vorstehend erwähnten 0,017° berechnet und die Glukosekonzentration wurde als 100 mg/dl berechnet.
In dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 50 mg/dl und einer Proteinkonzentration im Urin von 80 mg/dl in einem weiteren Beispiel der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der Rotationswinkel bei –0,006°. Der spezifische Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670 nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg. Unter der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf der Glukose basierte, wurde die Glukosekonzentration mit 0 oder niedriger berechnet, was nicht mit dem Messwert übereinstimmte. Unterdessen lag die Proteinkonzentration, bestimmt aus 19, bei 80 mg/dl, weil das Verhältnis der Intensität des transmittierten Lichts 8 × 10^–3 war. Da der spezifische Rotationswinkel des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg lag, war der Rotationswinkel für das Protein –0,016°. Deshalb wurde der wahre Rotationswinkel für Glukose mit 0,01° durch Subtraktion von –0,016° von den vorstehend erwähnten –0,006° berechnet und die Glukosekonzentration wurde als 50 mg/dl berechnet.
Daraus wurde gemäß dieser Ausführungsform bestätigt, dass ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin gleichzeitig durch Messung des Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung vor Vermischen des Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung und durch Messen des Verhältnisses der Intensität des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens genau bestimmt werden konnte.
Wie vorstehend beschrieben konnten gemäß dieser Ausführungsform die Protein- und Glukosekonzentrationen, welche eine weitere optisch aktive Substanz neben dem Protein ist, gleichzeitig bestimmt werden und deshalb war das Verfahren dieser Ausführungsform praktisch insbesondere dann praktikabel, wenn eine zu detektierende Lösung Urin war. Dies wird im Folgenden erläutert.
Falls eine Proteinkonzentration im Urin normal war, war Glukose die vorherrschende optisch aktive Substanz im Urin. Deshalb konnte der Zuckerwert im Urin grob durch Messen des Rotationswinkels von Urin untersucht werden. Jedoch konnte eine Urinanalyse genauer durch Bestimmen einer Proteinkonzentration im Urin mit einem anderen Messverfahren als den, das auf einem Rotationswinkel basiert, gemessen werden. Der Grund lag vermutlich darin, dass der durch das Verfahren erhaltene Rotationswinkel des Urins den von Glukose stammenden Rotationswinkel und den von Protein stammenden Rotationswinkel umfasste, weil sowohl Protein als auch Glukose optisch aktive Substanzen waren.
Deshalb konnten, wie in dieser Ausführungsform gezeigt ist, ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin genau bestimmt werden, und zwar durch das Erhalten der Proteinkonzentration aus der Änderung der optischen Charakteristik nach Vermischen des Reagens und durch Korrigieren des gemessenen Rotationswinkels, basierend auf der so gemessenen Proteinkonzentration.
Wenn übrigens das Reagens in die zu detektierende Lösung vor Messung von dessen Rotationswinkel gemischt wurde, koagulierte die Proteinkomponente, um zu verhindern, dass das durch die Lösung transmittierte Licht detektiert wird, oder das Protein denaturierte, um den Rotationswinkel zu verändern, und deshalb war es nicht möglich, den Zuckerwert im Urin und die Proteinkonzentration im Urin genau zu bestimmen.
In dieser Ausführungsform wurde ein Beispiel gezeigt, in dem der Rotationswinkel und die Intensität des transmittierten Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer Wellenlänge von 670 nm gemessen wurde. Im Allgemeinen steigt der spezifische Rotationswinkel einer Substanz mit der Abnahme der Wellenlänge an, bis die Wellenlänge die Wellenlänge erreicht, an der die der Substanz inhärente Absorption (rund 180 nm im Falle von Glukose) beginnt. Außerdem steigt die Trübung aufgrund der Koagulation von Protein mit sinkender Wellenlänge. Aus diesem Grund war die Genauigkeit der Messung manchmal verschlechtert, falls die Messung mit einem Licht der Wellenlänge von 500 nm oder kürzer durchgeführt wurde. Deshalb war es hinsichtlich der Empfindlichkeit vorteilhaft, dass der Rotationswinkel, die Intensitäten des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer kürzeren Wellenlänge gemessen wurden.
Falls jedoch die zu detektierende Lösung Urin ist, wird Licht mit einer Wellenlänge von nicht länger als 500 nm durch einen im Urin enthaltenen Farbstoff wie etwa Urochrom absorbiert. Die Messung ist wenig genau. Deshalb war es praktikabel, dass bei der Messung Licht mit einer Wellenlänge von nicht kürzer als 500 nm eingesetzt wurde.
In dieser Ausführungsform lag das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens bei 49:1. Selbst wenn die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure und Zitronensäure nach Vermischen des Reagens die gleiche wie die im vorstehenden Beispiel war, änderte sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich war. Deshalb war es notwendig, eine Kalibrierkurve entsprechend dem Mischungsverhältnis zu erzeugen. Weil das Mischungsverhältnis der zu detektierenden Lösung zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, sank hierin die Trübung der zu detektierenden Lösung im Vergleich zu der Lösung mit der gleichen Konzentration. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die m-Galloyl-Gallussäurekonzentration nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein Reagens mit einer hohen m-Galloyl-Gallussäurekonzentration einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden Lösung hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier wurde bestätigt, dass die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure, bei der weder eine Abscheidung noch eine Denaturierung auftrat, bei einer Temperatur von 0 bis 40°C, welche eine mögliche Umgebungstemperatur zu Hause ist, nicht höher als 7,8 M (entspricht 250 g/dl) war. Demgemäß wurde die Konzentration des wässrigen m-Galloyl-Gallussäurslösungsreagens auf nicht höher als diese Konzentration eingestellt.
Die pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt durch Vermischen von wässrigen Proteinlösungen (Serumalbumin) mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15, 60, 100 und 250 mg/dl und des vorstehenden Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung waren im Bereich von 4,5 bis 5,8. In dieser Ausführungsform wurde das eingesetzte Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösung hergestellt. Jedoch könnte ein ähnlicher Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5 bis 5,8 fähig ist, eingesetzt werden. Der ähnliche Effekt könnte ebenso durch Zugabe einer Säure in die zu detektierende Lösung zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens auf 1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Sorte oder die Menge der in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure und/oder in das Reagens unterschiedlich war, wurde eine unterschiedliche Kalibrierkurve erhalten (entsprechend der gestrichelten Linie und dern durchgezogenen Linie der 19). Deshalb war es notwendig, eine unterschiedliche Kalibrierkurve zu erzeugen (entsprechend der gestrichelten und durchgezogenen Linie der 19). Falls der pH-Wert der zu detektierenden Lösung nach dem Vermischen des Reagens nicht in dem vorstehend erwähnten Bereich lag, gab es Fälle, in dem das Protein nicht vollständig koagulierte, so dass es unmöglich war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
Falls hierin die zu detektierende Lösung Urin war, war es besonders zweckmäßig eine Säure als eine in das Reagens und/oder in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure aus der Gruppe auszuwählen, die aus Kaliumhydrogenphtalat, Essigsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure besteht, weil diese Säuren leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht zu handhaben sind und außerdem die Möglichkeit der Induzierung der Präzipitation von Phosphat, Carbonat, oder dergleichen reduzieren und somit sehr praktikabel sind.
In dieser Ausführungsform lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure in dem Reagens bei 0,047 M (entspricht 1,5 g/dl). Da das Mischungsverhältnis des Reagens zur zu detektierenden Lösung 49:1 war, lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach dem Vermischen des Reagens bei 9,4 × 10^–4 M (entspricht 0,03 g/dl). Jedoch könnte die Pro teinkonzentration mit jeder Konzentrationen im Bereich von 5 × 10^–3 bis 5 g/dl durch Erzeugen einer Kalibrierkurve (entsprechend der gestrichelten und durchgezogenen Linien in 19), die der Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach dem Vermischen des Reagens entsprach, gemessen werden. Falls die der m-Galloyl-Gallussäurekonzentration geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung schwierig war. Falls die m-Galloyl-Gallussäurekonzentration höher als der vorstehende Bereich war, präzipitierte das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhinderte, dass die zu detektierende Lösung rund um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging, sich entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, dass die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs durchgeführt wurde.
Wie vorstehend gezeigt, kann erfindungsgemäß eine Proteinkonzentration bei einer Temperatur von 0 bis 40°C, welche eine mögliche Raumtemperatur zu Hause ist, gemessen werden. Außerdem kann durch ein Mischen einer Säure in ein Reagens eine Proteinkonzentration in einem hohen Konzentrationsbereich (annähernd 250 bis 500 mg/dl oder höher) ebenso gemessen werden. Ferner kann ein messbarer Konzentrationsbereich einer zu detektierenden Lösung ausgeweitet werden und gleichzeitig kann die Anwesenheit oder Abwesenheit irgendeines Hemmnisses der Messung aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase detektiert werden. Als ein Ergebnis kann eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Ferner ist es möglich, eine sehr genaue, praktikable und sichere Messung einer Konzentration einer Lösung, insbeson dere einer Proteinkonzentration im Urin, wie im Labor, durchgeführt werden.
Ferner ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl die Konzentration an Protein als auch jeder optisch aktiven Substanz, außer Protein, in einer zu detektierenden Lösung durch detektieren. Falls die zu detektierende Lösung Urin ist, können die erforderlichen Schritte für die Urinanalyse wesentlich vereinfacht werden, da die Proteinkonzentration in Urin und der Zuckerwert im Urin gleichzeitig genau bestimmt werden können, wodurch sie stark zu einem praktischen Effekt beitragen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Proteinkonzentration stabil bei einer Temperatur von nicht höher als 25°C, welches eine mögliche Raumtemperatur zu Hause ist, zu messen, und ferner den messbaren Konzentrationsbereich auszudehnen, während eine Hemmung aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase und dergleichen verhindert werden soll, und zwar unter Verwendung eines Reagens, das durch Vermischen einer Säure in eine Lösung mit Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure hergestellt worden ist. Durch Vermischen des Reagens in eine zu detektierende Lösung zur Eintrübung der Lösung werden die Intensitäten wenigstens eines transmittierten Lichts oder eines gestreuten Lichts der zu detektierenden Lösung gemessen und eine Proteinkonzentration davon wird basierend auf der Intensität bestimmt. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Lösung und ein Verfahren der Urinanalyse bereit, wobei eine Proteinkonzentration nach Messung des Rotationswinkels gemessen wird.

Claims

Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Messen der Intensität wenigstens eines transmittierten Lichts oder gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung, nachdem darin ein Reagens, ausgewählt aus der aus Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure bestehenden Gruppe, zugemischt worden ist, (b) Bestimmen der Proteinkonzentration in der zu detektierenden Lösung basierend auf der Intensität.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt (a) die Lichtintensität zusätzlich vor dem Vermischen des Reagens gemessen wird und wobei in Schritt (b) die Proteinkonzentration basierend auf den Lichtintensitäten bestimmt wird.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend den folgenden Schritt: (a') Regulieren des pH-Werts einer zu detektierenden Lösung auf 1,5 bis 5,8, nachdem darin in Schritt (a) das Reagens zugemischt worden ist.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß Anspruch 3, wobei der pH-Werts der zu detektierenden Lösung durch Zugabe eines pH-Einstellmittels, ausgewählt aus der aus Kaliumhydrogenphthalat, Essigsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure bestehenden Gruppe, in die in Schritt (a') zu detektierenden Lösung reguliert wird.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration eines Reagens in einer zu detektierenden Lösung, nachdem das Reagens darin zugemischt worden ist, im Bereich von 5 × 10^–3 bis 5 g/dl im Schritt (a) liegt.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts bestimmt wird, und wobei eine Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten Lichts bestimmt wird.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß Anspruch 1, welches den folgenden Schritt umfasst: (c) Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer fehlerhaften Messung aufgrund eines suspendierten Teilchen in der zu detektierenden Lösung durch Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts und der Intensitäten des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens, und durch Vergleichen der Beziehung zwischen der transmittierten Lichtintensität und der gestreuten Lichtintensität und den Beziehungen zwischen den Intensitäten eines transmittierten Lichts und eines gestreuten Lichts, die erhalten wurden, als die Behinderung durch ein suspendiertes Teilchen nicht vorhanden war.
Das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration in einer Lösung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, welches weiterhin die folgenden Schritte umfasst: (c) Messen eines Rotationswinkel der Polarisationsebene des Lichts in der zu detektierenden Lösung, bevor darin das Reagens zugemischt worden ist, (d) Korrigieren des gemessenen Rotationswinkels der Polarisationsebene des Lichts, basierend auf der in Schritt (b) bestimmten Proteinkonzentration und (e) Bestimmen der Konzentration jeglicher optisch aktiver, von Protein unterschiedlichen Substanz in der zu detektierenden Lösung aus dem Rotationswinkel der Polarisationsebene des Lichts, der in Schritt (d) korrigiert worden ist.