DE2920276A1

DE2920276A1 - Nephelometrisches immunbestimmungsverfahren und nephelometer

Info

Publication number: DE2920276A1
Application number: DE19792920276
Authority: DE
Inventors: Tokio Hachioji; Michio Itoh; Teruaki Kobayashi; Daizo Tokinaga; Kazuo Yasuda; Mitsuyoshi Yuasa
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1978-05-19
Filing date: 1979-05-18
Publication date: 1979-11-22
Also published as: JPS54151495A; US4401387A; DE2920276C2; JPS5925460B2

Description

2920278

- 5 - .
BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein nephelometrisches Immunbestimmungsverfahren zur Messung verschiedener Komponenten, die in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin enthalten sind, beispielsweise verschiedener Arten von Immunglobulinen etc., und betrifft ferner ein Nephelometer hierfür. Bei einer nephelometrischen IiranunbeStimmung, bei weleher ein Antigen-Antikörperkomplex, der durch eine Antigen-Antikörperreaktion gebildet worden ist/ mittels eines Iiichtstreuungsphotometers gemessen wird, gibt es eine Beziehung, wie sie schematisch in Fig. 1 gezeigt ist, zwischen der Intensität des gestreuten Lichts und der Antigenkonzentration, weshalb zu einer bestimmten Streulichtintensität jeweils zwei verschiedene Werte von Antigenkonzentrationen gehören. Selbst wenn durch geeignete Einstellung des Verdünnungsverhältnisses usw. der Probe die Messung im Bereich 1 der Fig. 1 durchgeführt wird, enthält die gemessene Probe manchmal eine unerwartet hohe Antigenkonzentration, so daß die Gefahr besteht/ daß sich die Messung tatsächlich in den ÄntigenüberSchußbereich 2 der Fig. T erstreckt. Bei einem bekannten Verfahren wurden daher jeweils zwei Spezimen mit voneinander verschiedenen Verdünnungsverhältnissen für jede Probe hergestellt und gemessen. Durch Studium des Proportionalzusammenhangs zwischen der Lichtstreuintensität und dem Verdünnungsverhältnis wird festgestellt, daß das Spezimen in den Bereich 1 der Fig. 1 fällt und der korrekte Wert für die Antigenkonzentration erhalten worden ist. Die Messung ist daher mühsam und erfordert eine große Zahl von Spezimen.

Bekanntes ist in der japanischen Patentanmeldung 53-13429 und in CD. Deaton et al, "Use of Laser Nephelometry in the Measurement of Serum Proteins", Clin. ehem., Bd. 22, Nr. 9, 1465-1471 {1976) beschrieben.

I09847/094S

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer nephelometrischen Immunbestimmung und eines Nephelometers, mit welchen der wahre Wert mit einer einzigen Probenkonzentration ermittelt werden kann.

Dies wird dadurch gelöst, daß Licht auf eine einen Antigen-Antikörperkomplex enthaltende Probe projiziert wird, daß wenigstens zwei Streulichtintensitäten bei unterschiedlichen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht gemessen werden, und daß die wahre Antigenkonzentration durch Vergleich der Streulichtintensitäten herausgefunden wird.

Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung beschrieben. Auf dieser ist bzw. sind

Fig. 1 eine Kurve, welche schematisch die Meßwerte einer immunologischen Messung erläutert, die auf einer nephelometrisehen Immunbestimmung beruht,

Fign. 2A schematische Blockschaltbilder, welche eine Beispiel eines Ge:
angewandt ist,

^un spiel eines Geräts zeigt, in welchem die Erfindung

Fign. 3 Kurven, zur Erläuterung von Meßwerten, wie sie gemäß

^un der Erfindung erhalten werden, 25

Fig. 5 ein Systemflußdiagramm zur Erläuterung der Erfindung,

Fig. 6 eine Skizze, die die Form einer Zelle zeigt,

Fign. 7A Skizzen, die jeweils die Form einer Zelle zeigen,

^{bis 7G} und

Fign. 8, Blockschaltbilder, die jeweils eine Diskriminator-

^un vorrichtung zeigen.

909847/0946

Die Erfindung besteht darin, daß Licht auf eine einen Antigen-Antikörperkomplex enthaltende Probe projiziert wird und daß wenigstens zwei Streulichtintensitäten an voneinander verschiedenen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht gemessen werden.

Damit.kann eine genaue Messung selbst für eine Meßprobe mit hoher Antigenkonzentration durchgeführt werden.

Fig. 2A ist ein Blockschaltbild/ welches ein Beispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.

Licht 34 einer Lichtquelle 32, die mit einer elektrischen Spannungsquelle 31 betrieben wird, tritt in eine in einer Zelle befindliche zu messende Probe 36 durch eine Linseneinheit 33 ein. Nach verschiedenen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht 34 gestreutes Licht 37 und 38 wird durch Photodetektoren 39 und 40 nachgewiesen. Die Ausgangssignale dieser Photodetektoren 39 und 40 werden Vorverstärkern 41 und 42 zugeführt und durch Verstärker 43 und 44 verstärkt. Eine wahre Antigenkonzentration wird mittels eines Diskriminators 45 diskriminiert.

Ferner gibt es auch das Verfahren, bei welchem, wie in Fig. 2B gezeigt, nach verschiedenen Winkeln gestreutes Licht 37 und 38 mit Hilfe von Lichtleitern 46 und 47 über einen Schalter 48 aufeinanderfolgend an einen Photodetektor geführt wird. Was die verschiedenen Winkel anbelangt, so werden Winkel, die sich um wenigstens 5° voneinander unterscheiden, bevorzugt.

Insbesondere werden Winkeldifferenzen von wenigstens 10° bevorzugt. Ein bevorzugtes Beispiel ist der Fall, wo der Winkel des einen Streulichts im Bereich zwischen 30 und

3.0 45°, beispielsweise bei 35°, gewählt wird, während der Winkel des anderen Streulichts im Bereich zwishen 80 und 100°, beispielsweise bei 90°, gewählt wird.

Das eine und das andere Streulicht können gleichzeitig oder aufeinanderfolgend nachgewiesen werden. Das heißt, es ist möglich, wie in Fig. 2A gezeigt, das eine und das andere Streulicht gleichzeitig unter Verwendung der zwei Detektoren zu messen. Es ist ebenfalls möglich, das eine und das andere Streulicht aufeinanderfolgend nach einem Verfahren zu messen, bei welchem ein einzelner Detektor bewegt wird, ferner nach dem Verfahren, daß das Streulicht an den beiden voneinander verschiedenen Stellen an den einzigen Photodetektor, wie in Fig. 2B gezeigt, mit Hilfe von Lichtleitern geführt wird, oder nach ähnlichen Verfahren.

Zwei Streulichtintensitäten an verschiedenen Winkeln stehen beispielsweise in der durch die Kurven 3 und 4 in Fig. 3 angegebenen Weise zueinander in Beziehung.

Im einzelnen drücken sich, wenn die Messung bei Streuwinkeln C\ und ß durchgeführt wird, die Streulichtintensitäten I₀₁ und Iß folgendermaßen als Funktion der Antigenkonzentration C aus.

I_x - f^ (C)

Ib - f. (O ⁽¹⁾

Sowohl im Falle des Winkels ος als auch im Falle des Winkels ß existieren zwei Antigenkonzentrationswerte für eine bestimmte Streulichtintensität. Es seien C_x-* C_xw>' bzw. C_xß, C_xß' die Antigenkonzentrationen, die sich aus den Funktionen (1) ergeben, und I_XCN bzw. I_xß die Streulichtintensitäten am Winkel <\ bzw. ß im Falle der Messung einer Probe unbekannter Konzentration. Es seien dabei C_x^' und C_xß' die Antigenkonzentrationen, die in den Antigenüberschußbereich fallen. Es kann nun diskriminiert werden, welcher der Werte C_x^ und C_x.^¹ bzw. C_xß und C_xß' die wahre Antigenkonzentration der unbekannten Probe ist.

809847/0948

In einem Beispiel eines Diskriminierverfahrens kann die folgende Diskriminante angewandt werden:

" ^{ln C}xß| < |^{ln c}xo<! * ^{ln c}xß'

(2)

Wenn die Diskriminante (2) gilt, ist die Antigenkonzentration der unbekannten Probe die Konzentration C_x&/ oder C_xß oder der Mittelwert dieser beiden Konzentrationen. Wenn sie nicht gilt, ist die Antigenkonzentration die Konzentration C_xC^' oder C_xß' oder der Mittelwert dieser beiden Konzentrationen.

Betrachtet man ferner einen Fall, wo die wahre Konzentration zwischen einer Konzentration, die dem Maximum der Kurve 3 in Fig. 3 entspricht, und einer Konzentration, die dem Maximum der Kurve 4 entspricht, liegt, kann ein Verfahren angewandt werden, bei welchem das Minimum der folgenden vier Werte \ In 0_χ<χ - In C_{x ß} J, \ In C_XOJ - In C_xß' j , lln C_x^ - In C_Xß'l und j In C_x^¹ - In C_xß | aufgesucht wird, und wenn dieser beispielsweise j In C„ ' - In C_xß j ist,

die Konzentration C_xc.' oder C_xß' oder der Mittelwert dieser Konzentrationen als der wahre Wert angesehen wird.

Als weiteres Diskriminierverfahren ist es möglich, die· Antigenkonzentration C in einen Bereich einzustellen, welcher

den Antigenüberschußbereich nicht enthält, und die Streu-25

lichtintensitäten I₀^ und Iß als Funktionen dieser Antigenkonzentration C auszudrücken:

¹^ - ^fX<^C) (3)

¹B = ^fß<^C>

oder als Näherung hierzu:

1 I ft 6 A
I / U el <k

In I₀^ = A,__v In C + B₀^

(A)

In Iß = Aß In C + B_ß ^l '

wobei Aj_x, B₀^, Aß und Bß Konstanten bezeichnen.

Es werden virtuelle Konzentrationen C_xo, und C_xß einer Probe unbekannter Antigenkonzentration aus der Umkehrfunktion der Funktion (3) (oder der Gleichung (4)) sowie aus den tatsächlichen Meßwerten I ^ und Iß der mit der unbekannten Probe bei den Winkeln c< und ß gewonnenen Streulichtintensitäten berechnet.

Auf der Grundlage der Werte C_x^ und C_xß kann entschieden werden, ob sie die wahre Konzentration der unbekannten Probe sind oder nicht.

Im folgenden wird ein konkretes Beispiel dieses Diskriminierverfahrens ausgeführt. Wenn eine Diskriminante:

<a (5)

oder

- ^C

<a (6)

^cxß

gilt, wird der Wert C oder C _R als die wahre Konzentration der unbekannten Probe entschieden. Wenn die Diskriminante nicht gilt, wird die Probe als Probe mit Antigenüberschuß oder als eine unmeßbare Probe betrachtet und die Konzentration nicht bestimmt, a im Ausdruck (5) oder (6) ist ein Wert, welcher empirisch festgelegt wird. Wenn die Differenz der beiden Meßwinkelc\und ß groß ist, läßt sich die wahre Konzentration selbst dann feststellen, wenn für a ein großer Wert festgelegt wird. Im Falle der Messung bei den beiden Winkeln 35° und 90° ist eine ausreichend genaue -Entscheidung selbst möglich, wenn a ungefähr 0,1 gemacht wird.

9847/ÖS43

Nach diesem Diskriminierverfahren kann eine Meßprobe, wie beispielsweise chyliferes Serum (chyliferous serum), als anomale Probe nachgewiesen werden.

Nach einem wiederum anderen Diskriminierverfahren wird nur ein Fall, wo die Intensität des gestreuten Lichts in einem bestimmten Winkel nicht größer als ein vorgegebener Wert ist und wo das Verhältnis der Streulichtintensitäten an zwei Winkel nicht größer als ein weiterer vorgegebener Wert ist/ als Messung innerhalb eines normalen Meßbereichs/ der keinen Antigenüberschuß darstellt, entschieden. Das Prinzip dieses Diskriminierverfahrens wird nun in Verbindung mit einem konkreten Beispiel erläutert. Fig. ist eine Kurve, die dadurch gewonnen wurde, daß Standardproben von Immunglobulin G (IgG) bei verschiedenen Konzentrationen Antigen-Antikörperreaktionen unterworfen wurden, daß Streulichtintensitäten in einer Richtung von 35° und einer Richtung von 90° gemessen wurden und daß nach Abziehen eines Antiserum-Leerwerts das Verhältnis I35/I90 zwischen der Ausgangsgröße des Streulichtdetektors in Richtung 35° und der Ausgangsgröße des Streulichtdetektors in Richtung 90° als Funktion der Ausgangsgröße I90 des Streulichtdetektors in Richtung 90° aufgetragen wurde. Mit zunehmender Konzentration der Standardproben ergibt sich eine Kurve a-b-c- ... -hin Fig. 4. Die Punkte a, b, c, d und e fallen in einen Antikörperüberschußbereich, in welchem die normale Konzentrationsbestimmung möglich ist, der Punkt f ist eine Spitze der maximalen Lichtstreuintensität Igor und die Punkte g und h sind Daten in einem AntigenüberSchußbereich. Wenn daher ein Wert Y_c, der etwas " größer als alle tatsächlich gemessenen Werte I35/I90 der Standardproben im Antikörperüberschußbereich ist, und ein Wert X_c, der etwas kleiner als der tatsächlich gemessene Maximalwert IgQ der Standardproben ist, vorweg auf der

Grundlage der Messung der Standardproben ausgewählt werden, läßt sich entscheiden, ob eine Probe unbekannter Konzentration im normalen Antikörperüberschußbereich liegt oder nicht, indem die Größe des Verhältnisses I35/I90 eier unbekannten Probe und des Werts Y_c und ferner die Größe des Werts Igg der unbekannten Probe und des Werts X_c miteinander vergli chen werden.

In diesem Fall wurde die Intensität I35 als Zähler und die Intensität Igg als Nenner genommen. Im umgekehrten Fall, wo das Verhältnis I90/I35 verwendet und der Wert Y_c vorweg so ausgewählt wird, daß er etwas größer als alle tatsächlich gemessenen Werte !90/¹SS ^er Standardproben im Antikörperüberschußbereich ist, läßt sich durch I90/I35 > > Y_c und I90 < X_c entscheiden, daß die unbekannte Probe im normalen Antikörperüberschußbereich liegt.

In der oben erwähnten Fig. 4 stellt die Abszisse die Streulichtintensität I90 dar. Es ist jedoch ein ähnliches Entscheidungsverfahren auch möglich, wenn die Streulichtintensität I35 als Abszisse genommen wird. Kurz gesagt, beruht das Prinzip dieses Entscheidungsverfahrens auf der Tatsache, daß bei Auftragung des Verhältnisses zweier Streulichtintensitäten an zwei Winkeln als Funktion der Streulichtintensität an einem der beiden Winkel die Punkte im Antigenüberschußbereich (g und h im Falle der Fig. 4) an Stellen liegen, die von Punkten im normalen Antikörperüberschußbereich weit entfernt sind. Dieses Entscheidungsverfahren funktioniert daher dadurch, daß die oben definierten Werte X_ und Y_ aus den Messungen von Standardproben c t*

geeignet ausgewählt werden, so daß nur die Punkte im normalen Antikörperüberschußbereich in einen von vier Quadranten fallen, die in der in Fig. 4 gezeigten Weise durch die Werte X_c und Y_c bestimmt werden.

Das heißt, die Diskrimination der wahren Antigenkonzentration gemäß der Erfindung bedeutet nicht nur, daß der Wert der wahren Antigenkonzentration der gemessenen Probe erhalten wird, sondern auch, daß selbst wenn die Antigenkonzentration der gemessenen Probe ein anomaler Wert außerhalb vorausgesehener Antigenkonzentrationen ist, dies festgestellt wird.

Günstigerweise wird in der Vorrichtung gemäß der Erfindung die Lichtstreuung unter Verwendung einer Durchlaufzelle zur Aufnahme einer Meßprobe gemessen. Bei Verwendung einer Durchlaufzelle ist es nämlich leichter, den Prozeß von der Präparation einer Probe bis zur Messung des Streulichts sowie die Datenverarbeitung zu automatisieren. Wie in Fig. 5 dargestellt, werden ein Probenserum 51, eine Verdünnungslösung 52 und ein Antiserum 53 in geeigneten Mengen in Reaktionsgefäße gegossen. Nach einem Rühren werden sie einer Inkubation bei konstanter Temperatur über einen geeigneten Zeitraum unterworfen. Nachfolgend wird eine Reaktionsprobe 54 in eine Streulichtmeßzelle 35 gesaugt und das gestreute Licht gemessen. Nach Durchführung der notwendigen Verarbeitung erhält man die Daten. Hierbei können Herstellung und Inkubation der Probe dem Mechanismus bzw. dem Verfahren eines herkömmlichen klinischen automatischen · Analysiergeräts entsprechen. Vorzugsweise sollte jedoch die Streulichtmeßzelle neuartig sein. Wenn auch ein Verfahren, bei welchem die Inkubation und die Streulichtmessung mit ein und derselben verfügbaren Zelle erfolgt, ebenfalls in Betracht gezogen wird, ist jedoch ein Verfahren, bei welchem die Inkubation in einem eigens hierfür vorgesehenen Gefäß durchgeführt und die Reaktionsprobe in die Zelle (Durchlaufzelle) gesaugt wird, hinsichtlich des Mechanismus höchst einfach und läßt eine hohe Genauigkeit erwarten.

909847/0946

Die Photodetektoren 39 und 40 sind am Beispiel sich bewegender dargestellt, die Streulicht an verschiedenen Winkel messen können, es kann sich bei ihnen jedoch auch um feststehende Photodetektoren handeln.

Fig. 6 zeigt zu Vergleichszwecken ein Beispiel für eine Durchlaufzelle eines automatischen klinischen Analysiergeräts. Das besondere Merkmal dieser Zelle ist ihre Kleinheit und ein Aufbau, welcher eine glatte und gleichmäßige Flüssigkeitsströmung liefert. Andererseits hat die Durchlaufzelle für die Streulichtmessung einen Aufbau, welcher eine Betrachtung des gestreuten Lichts unter verschiedenen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht gestattet. Um ferner das Einfangen von Nebenlich in diesem Fall zu verhindern, muß der Schnitt zwischen dem einfallenden Licht und der Zellenwand nicht zu erblicken sein. Der Aufbau der Durchlaufzelle für das automatische klinische Analysiergerät sollte vorzugsweise klein sein und eine glatte Strömung gestatten, wie in Fig. 6 zu sehen, andererseits ist es wegen obiger Einschränkung bei der Durchlaufzelle zur Messung des Streulichts schwierig ist, einen Aufbau vorzusehen, der ein glattes Strömen der Lösung gestattet. Obwohl das Fassungsvermögen dieser Zelle nur durch die Verbreitung des einfallenden Lichts und die Blickfläche für das Streulicht bestimmt wird, wird es gewöhnlich groß, verglichen mit dem Fassungsvermögen der Durchlaufzelle für das automatische klinische Analysiergerät. In der Durchlaufzelle wird so verfahren, daß eine bereits gemessene Lösung durch eine erst zu messende Lösung ersetzt wird, indem diese in die Zelle eingeführt wird. Ein sich hierbei ergebendes Problem liegt im Erhaltenbleiben der ersteren, d.h. der Kontamination.

Es wird oftmals ein Polymerpuffer hoher Viskosität zur Beschleunigung einer Antigen-Antikörperreaktion bei der nephelometrischen Immunbestimmung verwendet. Neben der Kompliziert-

909847/0946

2320276

hext des Zellenaufbaus bildet dies eine Ursache erhöhter Kontamination.

Die Fign. 7(A) und 7(B) zeigen Beispiele hexaedrischer DurchlaufzeIlen, welche als Durchlaufzelle für die automatische klinische Analyse hergestellt worden sind. Bei allen diesen Zellen werden bei glatter Strömung der Lösung Lösungsteile, die in einer Ecke der Zelle sitzen, nicht ersetzt. Es ist daher notwendig, die Lösung abrupt anzusaugen und ein Umrühren der Lösung in der Zelle zu bewirken. Wenn die Ansaug- und die Entleerungsöffnung für die Lösungen in gegenüberliegenden Flächen vorgesehen sind, eignet sich wegen zu großer Kontamination die Durchlaufzelle daher nicht für den praktischen Gebrauch.

Hydrodynamische Untersuchungen haben ergeben, daß für ein zufriedenstellendes Umrühren der Lösungen über das Innere der Zelle hinweg und für ein Ersetzen der alten Lösung durch neue die Ansaug- und die Entleerungsöffnung für die Lösungen in ein und derselben Fläche der Zelle oder in Lagen, die einer solchen Bedingung nahekommen, vorgesehen sein müssen. In diesem Fall ist es wünschenswert, daß die durch die Ansaugöffnung einströmende Lösung auf die gegenüberliegende Fläche in rechtem Winkel oder einem nahe dabeiliegenden Winkel auftrifft. Die Fign. 7(C) bis 7(G) zeigen Beispiele für DurchlaufzeIlen, die im Einklang mit obigen Untersuchungen über ein Ausprobieren hergestellt worden sind.

Beispiele experimenteller Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bei diesem Experiment wurde, um die Eigenschaften der Probenlösung den Eigenschaften von Lösungen, die tatsächlich verwendet werden, gleichzumachen, eine Lösung verwendet, in welcher 3% Polyäthylenglycol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 7500 und 0,2% Eialbumin 0,01 M Phosphatpuffer zugesetzt waren. Die experimentelle Temperatur

909847/094*

wurde auf 308 K (35° C) eingestellt. Die Viskosität der Lösung betrug dabei 1,35 cp. Das Durchlaufvolumen der Lösung wurde zu 2 ml gemacht, und die Durchlaufgeschwindigkeit betrug ungefähr 0,8 ml/s. In Tabelle 1 gibt Nr. 1 das Ergebnis einer Durchlaufzelle für die automatische klinische Analyse an, mit welcher das Experiment zu Vergleichszwecken durchgeführt wurde. Die Nummern 2 bis 4 geben die Ergebnisse für Fälle an, wo die Ansaug- und die Entleerungsöffnung in einander gegenüberliegenden Flächen vorgesehen waren. Die Nummern 5 bis 11 geben die Ergebnisse von Streulichtmessungs-Durchlaufzellen für die Verwendung gemäß der Erfindung an. Wie aus der Tabelle ersichtlich, kann die Kontamination ohne weiteres auf unter 1% gedrückt werden, wenn das Fassungsvermögen der Zelle, vorzugsweise, höchstens 0,3 ml bei oben beschriebenem Zellaufbau gemacht wird.

Das für die Lichtstreumessung notwendige Fassungsvermögen der Zelle beträgt vorzugsweise 0,1 ml oder mehr. Deshalb beträgt das bevorzugte Fassungsvermögen der Durchlaufzelle 0,1 bis 0,3 ml.

Eine Durchlaufzelle dieses Typs hat ein weites Anwendungsgebiet, zu dem beispielsweise die quantitative Analyse von Lipid und die Messung von Bakterien auf der Grundlage der Lichtstreuung gehören.

TABELLE

Nr.	Form der Zelle	Fassungsvermögen der Zelle	Kontamination
1	Figur 6	0,25	5,1
2	Figur 7A	0,63	12,7
3	Figur 7A	0,59	11,3
4	Figur 7A	0,50	10,0
5	Figur 7C	0,61	3,4
6	Figur 7C	0,43	1/1
7	Figur 7D	0,63	5,9
8	Figur 7D	0,49	3,3
9	Figur 7E	0,44	2,2
10	Figur 7F	0,36	1,4
11	Figur 7G	0,32	1,0

Fig. 8 zeigt ein Blockschaltbild eines Beispiels für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diskriminierverfahrens. In der Figur bezeichnet θ-^ ein Signal, welches den Meßwinkel angibt, unter welchem die Lichtstreuung gemessen wird, und I^ und Iß bezeichnen Streulichtintensitäten an den Winkeln c*. und ß.

Die auf der weiter oben stehenden Gleichung (1) berührenden Konzentrationswerte C_x^, C_x c^ , C_xß und C_xß' werden von einer Interpolationsschaltung und die wahre Konzentration wird durch eine Entscheidungsschaltung geliefert. Wenn in einem Tabellenspeicher gespeicherte Antxgenkonzentrationen keine solchen im Bereich von Antigenüberschuß enthalten, werden die auf den Gleichungen (3) und (4) beruhenden Werte C_xcy

"909847/094«

und C β von der Interpolationsschaltung geliefert, und die Entscheidungsschaltung liefert die wahre Konzentration oder ein Signal, das angibt, daß die gemessene Probe eine anomale Probe ist.

Fig. 9 ist ein Blockschaltbild eines weiteren Beispiels einer ähnlichen Vorrichtung, umsetzer enthalten Speicher, in welchen zwei Arten von Konzentrationswerten für Streulichtintensitäten an den einzelnen Winkeln gespeichert sind, und liefern die Werte C_x , C_x^¹, C_xß und C_xß · . Wenn die Differenz der Werte C_X(^ und C_xß (oder j C_xr\ - C_Xß\/C_xOi) kleiner als ein fester Wert ist, wird ein Signal mit positivem Wert der bestimmten Konzentration durch eine Entscheidungsschaltung und der Wert C oder C_xß durch einen Selektor geliefert. Das gleiche gilt für den Fall der Werte C_x0J und C_xß'.

Wenn die Speicher Antigenkonzentrationen speichern, die keine solchen im Antigenuberschußberexch enthalten, und wenn nur die Werte Ο_χ>χ und C_xß von den Wandlern geliefert werden, kann der Wert der wahren Antigenkonzentration oder ein Signal geliefert werden, das angibt, daß die gemessene Probe eine anomale Probe ist (beispielsweise eine Antigenüberschuß-Meßprobe oder eine Meßprobe chyliferen Serums).

Eine dritte Vorrichtung ist in Fig. 10 gezeigt. Signale I ^ und Iß von Photodetektoren an zwei Winkeln βς und ß werden über Analog-Digitalwandler (AD-Wandler) Registern eingegeben, und eine Dividierschaltung liefert das Verhältnis Ι^,/Ιβ. Die Werte X_c und Y_c werden von Festwertvorgabeeinrichtungen auf eine Entscheidungsschaltung gegeben, welche I_ß < X_c und Ijji/Iß < Y_c entscheidet und die Ergebnisse liefert.

Im folgenden wird nun ein Beispiel beschrieben. Unter Verwendung der in Fig. 2A gezeigten Vorrichtung wurde in Humanserum enthaltenes Immunglobulin G (im folgenden als "IgG" abgekürzt) gemessen.

909847/0946

Es wurde eine Infrarot-Leuchtdiode (mit einem maximalen Vorwärtsstrom von 200 mA, einer optischen Ausgangsleistung von 40 mW und einer Scheitelwellenlänge von 800 nm) als Lichtquelle 32 verwendet, wobei die Lichtabstrahlung durch Gleichspannung mittels der Spannungsquelle 31 bewirkt wurde. Das von der Infrarot-Leuchtdiode ausgehende Licht wurde zu dem durch die Linseneinheit 33 einfallenden Licht 34 gemacht und gelangte auf die zu messende Probe 36 in der aus Glas hergestellten zylindrischen Zelle 35.

Das von der gemessenen Probe herkommende Streulicht 37 und 38 in den Richtungen 35° und 90° in Bezug auf das einfallende Licht wurde durch die Photodetektoren 39 und 40 nachgewiesen. Als Photodetektoren wurden Silizium-Photosensoren (PN-Silizium-Photodioden) verwendet. Die Ausgangssignale der Silizium-Photosensoren wurden auf die Vorverstärker 41 und 42 gegeben und durch die Verstärker 43 und 44 verstärkt. Die Diskrimination geschah mit dem Diskriminator 45. Das einfallende Licht 34 und das Streulicht 37 und 38 wurden durch Spalte geführt.

Unter Verwendung der obigen Vorrichtung wurden Standardkurven für IgG gewonnen.. 50. ml von Standard-IgG-Lösungen verschiedener Konzentrationen wurden 5 ml von 16-mal verdünntem Antihuman-IgG-Serum (Kaninchen) zugesetzt. Nach einem Rühren wurde jede der Lösungen bei 308 K (35° C) 30 Minuten lang inkubiert. Jede so erhaltene Probe wurde in die zylindrische Glaszelle 35 gebracht, wonach die Streulichtintensitäten in den Richtungen 35° und 90° gemessen wurden. Dabei ergaben sich die in Fig. 3 gezeigten Beziehungen zwischen den Streulichtintensitäten und der IgG-Konzentration. Die Kurven 3 und 4 sind die den Streulichtintensitäten unter 35° und 90° entsprechenden Standardkurven.

009 Bit 7 /09

Nachfolgend wurde die IgG-Konzentration von Humanserum, die unbekannt war, ermittelt. 50 μΐ von 5-mal verdünntem Humanserum wurde 5 ml Antihuman-IgG-Serum (16-mal verdünnt, Kaninchen) zugesetzt, wonach die entsprechenden Streulichtintensitäten in den Richtungen 35° und 90° in der gleichen Weise wie oben gemessen wurden. Die IgG-Konzentration wurde aus diesen Streulichtintensitäten und den Standardkurven der Fig. 3 bestimmt.

Das Ergebnis war, daß sich, selbst wenn das Humanserum IgG in hoher Konzentration enthielt, die IgG-Konzentration einfach und genau quantitativ analysieren ließ.

Gemäß der Erfindung kann auf diese Weise, selbst wenn die Meßprobe ein zu messendes Objekt in großen Men-■15 gen enthält, die Konzentration des zu messenden Objekts einfach berechnet werden, ohne daß wie beim Stand der Technik hierzu komplizierte Prozeduren durchgeführt werden müssen. Dementsprechend läßt sich die Zeitdauer, die für die Messung einer Probe erforderlich ist, gegenüber dem bekannten Verfahren verkürzen. Ein weiterer

Effekt besteht darin, daß sich die Kosten für Reagenzien, die für eine Probe notwendig sind, vermindern lassen. •In Obigem wurde der Fall der Messung an zwei Winkeln abgehandelt, es ist jedoch in gleicher Weise möglich, durch eine Messung an drei oder mehr Winkeln die wahre Konzentration zu berechnen oder eine anomale Probe zu ermitteln. In einem solchen Fall ist die Zuverlässigkeit des gewonnenen Weirts natürlich erhöht.

Ki/fg

S09847/Q94S

eers

Claims

PATENT*..-iW/.LTE

SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK

MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 90 POSTADRESSE: POSTFACH 9SO16O, D-SOOO MÖNCHEN 95

HITACHI, LTD. .18. Mai 1979

DEA-5902

Nephelometrisches Immunbestimmungsverfahren und Nephelometer

PATENTANSPRÜCHE

1 .J Nephelometrisches Immunbestimmungsverfahren, dadurch gekennzeichnet , daß Licht auf eine zu messende einen Antigen-Antikörperkomplex enthaltende Probe projiziert wird, daß wenigstens zwei Streulichtintensitäten an unterschiedlichen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht gemessen werden und daß eine wahre Antigen-Konzentration durch Vergleich der Streulichtintensitäten diskriminiert wird.

909847/0940
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die unterschiedlichen Winkel Winkel sind, welche sich um wenigstens 5° voneinander unterscheiden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das eine Streulicht Streulicht bei einem Winkel im Bereich zwischen 30 und 45° in Bezug auf
das einfallende Licht und daß das andere Streulicht Streulicht bei einem Winkel im Bereich zwischen 80 und 100° in Bezug auf das einfallende Licht ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Messung der Streulichtintensi- täten eine Messung ist, welche die Streulichtintensitäten gleichzeitig mit zwei Photodetektoren feststellt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß als zu messende Probe

eine Probe verwendet wird, welche in eine Durchlaufzelle, die eine Ansaugöffnung und eine Entleerungsöffnung in ein und derselben Seite aufweist, eingeströmt ist.
6. Nephelometer zur ImmunbeStimmung, g e k e η η zeichnet durch eine Zelle (35) , welche eine zu

messende einen Antigen-Antikörperkomplex enthaltende

9Q9847/094S

Probe (36) aufnimmt/ eine Lichtquelle (32) , welche Licht (34) auf die zu messende Probe projiziert, wenigstens einen Photodetektor (39; 39, 40), welcher auf dem Antigen-Antikörperkomplex berührende Streulichtintensitäten an unterschiedlichen Winkeln in Bezug auf das einfallende Licht nachweist, und eine Einrichtung zum Vergleich und zur Verarbeitung von AusgangsSignalen des wenigstens einen Photodetektors.
7. Nephelometer nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet , daß zwei Photodetektoren (39, 40) verwendet werden, welche an sich um wenigstens 5° unterscheidenden Winkeln bezüglich des einfallenden Lichts angeordnet sind.
8. Nephelometer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß einer der beiden Photodetektoren (39) an einer Stelle angeordnet ist, an der er Streulicht unter einem Winkel im Bereich zwischen 30 und 45° in Bezug auf das einfallende Licht nachweist, und daß der andere Photodetektor (40) an einer Stelle angeordnet ist, an der er Streulicht unter einem Winkel im Bereich zwischen 80 und 100° in Bezug auf das einfallende Licht nachweist.

90984 7/0945
9. Nephelometer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß ein einziger Photodetektor vorgesehen und seine Lage zum Nachweis von Streulichtintensitäten an unterschiedlichen Winkeln veränderbar ist. 5
10. Nephelometer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein einziger Photodetektor (39) vorgesehen ist, und daß Streulichtintensitäten an unterschiedlichen Winkeln durch Lichtleiter (46, 47) aufeinanderfolgend an den Detektor geleitet werden.
11. Nephelometer nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Zelle eine Durchlaufzelle ist.
12. Nephelometer nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Durchlaufzelle eine Durchlaufzelle ist, bei welcher eine Ansaugöffnung und eine Entleerungsöffnung in ein und derselben Fläche vorgesehen ist.
13. Nephelometer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß das Fassungsvermögen der Durchlaufzelle höchstens 0,3 ml und mindestens 0,1 ml beträgt.