JP2901004B2 - Ｄｎａの塩基配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列決定法Info
- Publication number
- JP2901004B2 JP2901004B2 JP1090844A JP9084489A JP2901004B2 JP 2901004 B2 JP2901004 B2 JP 2901004B2 JP 1090844 A JP1090844 A JP 1090844A JP 9084489 A JP9084489 A JP 9084489A JP 2901004 B2 JP2901004 B2 JP 2901004B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- fragment
- group
- determining
- different
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はDNAの塩基配列決定に関する。
従来DNAの塩基配列決定はオートラジオグラフィを用
いて行なっていた。一方、最近、蛍光標識を用いた実時
間検出システムが発展してきた。それらでは末端塩基種
を対応する４種の蛍光色素でDNA断片を標識し、１つの
泳動路上に注入して一定長さを泳動させた後レーザーを
照射して発する蛍光を観測する。蛍光の波長と検出時間
からDNA断片の末端塩基種を知り、塩基配列を決定す
る。また、４種の断片群を単一の蛍光体で標識し、４種
の断片群を別々の泳動路上に注入して蛍光測定し、配列
を決定する方式もある。
いて行なっていた。一方、最近、蛍光標識を用いた実時
間検出システムが発展してきた。それらでは末端塩基種
を対応する４種の蛍光色素でDNA断片を標識し、１つの
泳動路上に注入して一定長さを泳動させた後レーザーを
照射して発する蛍光を観測する。蛍光の波長と検出時間
からDNA断片の末端塩基種を知り、塩基配列を決定す
る。また、４種の断片群を単一の蛍光体で標識し、４種
の断片群を別々の泳動路上に注入して蛍光測定し、配列
を決定する方式もある。
これらの技術では測定しようとする試料毎に試料の調
製作業を必要とし、手間がかかる難点があった。このよ
うな手間を省略する手法として異なるDNA試料を別々の
ベクターに組み込み、単一の試験管内で同時に相補鎖合
成を行ない、電気泳動分離、フィルター転写後それぞれ
の試料とだけ結合する放射性標識されたDNAプローブを
付着させてDNA断片を検出し配列決定する手法が提案さ
ている。一度測定した後はこの放射性標識付プローブを
洗い流して別のプローブを付着させれば別の試料の配列
決定データが得られる。このように１回の反応と泳動で
多種の試料のDNA塩基配列決定ができる（Science 240,1
85（1988））。しかし、この手法はDNAバンドパターン
をフィルターに固定化することが必要で放射性標識以外
には使用できない。蛍光プローブを使用しようとする
と、フィルターからの散乱光などのために十分な感度が
得られないからである。
製作業を必要とし、手間がかかる難点があった。このよ
うな手間を省略する手法として異なるDNA試料を別々の
ベクターに組み込み、単一の試験管内で同時に相補鎖合
成を行ない、電気泳動分離、フィルター転写後それぞれ
の試料とだけ結合する放射性標識されたDNAプローブを
付着させてDNA断片を検出し配列決定する手法が提案さ
ている。一度測定した後はこの放射性標識付プローブを
洗い流して別のプローブを付着させれば別の試料の配列
決定データが得られる。このように１回の反応と泳動で
多種の試料のDNA塩基配列決定ができる（Science 240,1
85（1988））。しかし、この手法はDNAバンドパターン
をフィルターに固定化することが必要で放射性標識以外
には使用できない。蛍光プローブを使用しようとする
と、フィルターからの散乱光などのために十分な感度が
得られないからである。
本発明の目的はこのような難点を解消し、多数試料を
同時に処理して、かつ蛍光検出を可能とする手法を提供
するものである。
同時に処理して、かつ蛍光検出を可能とする手法を提供
するものである。
本発明者らは、研究の結果、種々の試料を異なるベク
ターにクローニングし、これらを混合物の形態で前記各
ベクターに対応してそれぞれ特異的にハイブリダイズし
得、かつ、それぞれ異なる蛍光体で標識した異種プライ
マーを用いて相補鎖合成し、得られた処理混合物から、
４種の末端塩基種を有するDNA断片群を調製し、これら
４種の群毎に別の泳動路上を泳動させ、各群の発する蛍
光を検出する手法をとることにより、上記目的が良好に
達成されることを見出し、この新知見に基づいてさらに
研究を重ねて本発明を完成するに至った。
ターにクローニングし、これらを混合物の形態で前記各
ベクターに対応してそれぞれ特異的にハイブリダイズし
得、かつ、それぞれ異なる蛍光体で標識した異種プライ
マーを用いて相補鎖合成し、得られた処理混合物から、
４種の末端塩基種を有するDNA断片群を調製し、これら
４種の群毎に別の泳動路上を泳動させ、各群の発する蛍
光を検出する手法をとることにより、上記目的が良好に
達成されることを見出し、この新知見に基づいてさらに
研究を重ねて本発明を完成するに至った。
したがって、本発明のDNAの塩基配列決定法は、それ
ぞれ異なるベクターに組み込まれた異なる複数の一本鎖
のDNA試料と、それぞれ塩基配列が異なり、異なる発光
波長をもつ蛍光体で標識され、前記各ベクターの１種類
のみにハイブリダイズするプライマーとを調製するステ
ップと、前記各DNA試料と前記各プライマーとを全て混
合して処理し、前記各ベクターに前記プライマーをハイ
ブリダイズさせて、処理混合物を４分割するステップ
と、前記４分割された処理混合物から、前記各DNA試料
に由来し、DNA断片の末端塩基種がアデニン、シトシ
ン、グアニン、及びチミンのいずれかであるDNA断片
群、即ち、前記各DNA試料に由来するアデニン断片群、
シトシン断片群、グアニン断片群、及びチミン断片群
を、相補鎖合成により調製するステップと、前記各断片
群を電気泳動して、前記各断片群毎に前記発光波長の差
に基づいて前記DNA試料に由来するDNA断片の分離検出を
行なうステップとを有することを特徴とするDNAの塩基
配列決定法である。
ぞれ異なるベクターに組み込まれた異なる複数の一本鎖
のDNA試料と、それぞれ塩基配列が異なり、異なる発光
波長をもつ蛍光体で標識され、前記各ベクターの１種類
のみにハイブリダイズするプライマーとを調製するステ
ップと、前記各DNA試料と前記各プライマーとを全て混
合して処理し、前記各ベクターに前記プライマーをハイ
ブリダイズさせて、処理混合物を４分割するステップ
と、前記４分割された処理混合物から、前記各DNA試料
に由来し、DNA断片の末端塩基種がアデニン、シトシ
ン、グアニン、及びチミンのいずれかであるDNA断片
群、即ち、前記各DNA試料に由来するアデニン断片群、
シトシン断片群、グアニン断片群、及びチミン断片群
を、相補鎖合成により調製するステップと、前記各断片
群を電気泳動して、前記各断片群毎に前記発光波長の差
に基づいて前記DNA試料に由来するDNA断片の分離検出を
行なうステップとを有することを特徴とするDNAの塩基
配列決定法である。
ベクターとしては、例えば、M13ベクター、YACベクタ
ー、pUCベクター等が用いられ、一本鎖のDNA試料は、例
えば、目的DNAをこれらににクローニングした後、アル
カリ変性させるなどして１本鎖DNAとして調製する。
ー、pUCベクター等が用いられ、一本鎖のDNA試料は、例
えば、目的DNAをこれらににクローニングした後、アル
カリ変性させるなどして１本鎖DNAとして調製する。
プライマーは、上記ベクターの一部と相補的な18〜20
塩基からなるオリゴヌクレオチドを合成し、これを蛍光
標識することにより得られ、配列がそれぞれ異なること
により、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイ
ブリダイズし得る構成となっている。プライマーを標識
する蛍光体としては、FITC（Fluoreseince isothicayan
ate,発光極大波長515nm）,NBD-F（発光極大波長540n
m）,TRITC（発行極大波長575nm）,Texas Red（発光極大
波長605nm）等を用いることができる。
塩基からなるオリゴヌクレオチドを合成し、これを蛍光
標識することにより得られ、配列がそれぞれ異なること
により、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイ
ブリダイズし得る構成となっている。プライマーを標識
する蛍光体としては、FITC（Fluoreseince isothicayan
ate,発光極大波長515nm）,NBD-F（発光極大波長540n
m）,TRITC（発行極大波長575nm）,Texas Red（発光極大
波長605nm）等を用いることができる。
上記プライマーをベクターにハイブリダイズさせる処
理、及び、相補鎖合成は、いずれも常法にしたがって行
うことができる。
理、及び、相補鎖合成は、いずれも常法にしたがって行
うことができる。
各群の分離検出は、例えば、各群を別々の泳動路で泳
動させて、各群が所定距離泳動した部位をレーザー照射
することによって発する蛍光を波長分割手段で分割し、
前記分割した各波長を二次元蛍光検出器で個別に検出す
ることにより試料の分離検出を行うとともに、発光する
泳動路の位置に基づいて末端塩基種の種類を特定するこ
とにより、複数の異なる塩基配列を持った、一本鎖のDN
A試料の塩基配列を同時に決定することができる。
動させて、各群が所定距離泳動した部位をレーザー照射
することによって発する蛍光を波長分割手段で分割し、
前記分割した各波長を二次元蛍光検出器で個別に検出す
ることにより試料の分離検出を行うとともに、発光する
泳動路の位置に基づいて末端塩基種の種類を特定するこ
とにより、複数の異なる塩基配列を持った、一本鎖のDN
A試料の塩基配列を同時に決定することができる。
上記、泳動路は、石英板、ガラス板等のゲル保持板間
に形成されたポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲ
ルのゲル板により構成することができる。
に形成されたポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲ
ルのゲル板により構成することができる。
異種プライマーを発光波長の異なる蛍光体で標識し、
前記各プライマーでハイブリダイズした異種のDNA断片
からなる試料は混合物の状態で塩基種毎に相補鎖合成す
る。前記相補鎖合成した混合物について、各末端塩基種
の群毎に別の泳動路上を泳動させる。一定距離泳動させ
た所をレーザー照射して発する蛍光を検出して通過する
DNA断片を検出する。発光波長から試料の種類を、ま
た、泳動路の位置から末端塩基種を、それぞれ特定し、
試料毎の塩基配列を決定することができる。
前記各プライマーでハイブリダイズした異種のDNA断片
からなる試料は混合物の状態で塩基種毎に相補鎖合成す
る。前記相補鎖合成した混合物について、各末端塩基種
の群毎に別の泳動路上を泳動させる。一定距離泳動させ
た所をレーザー照射して発する蛍光を検出して通過する
DNA断片を検出する。発光波長から試料の種類を、ま
た、泳動路の位置から末端塩基種を、それぞれ特定し、
試料毎の塩基配列を決定することができる。
以下、本発明の一実施例を第１〜３図により説明す
る。
る。
まず、塩基配列を決定しようとする２種の二本鎖DNAa
及びDNAbを単離する。これらの正逆方向（表、裏）合計
４種の塩基配列を決定する。このために、これらDNAを
それぞれ、４種の異なるM13ベクター１〜４を用いて、D
NAの塩基配列の決定を行う。
及びDNAbを単離する。これらの正逆方向（表、裏）合計
４種の塩基配列を決定する。このために、これらDNAを
それぞれ、４種の異なるM13ベクター１〜４を用いて、D
NAの塩基配列の決定を行う。
すなわち、前記二本鎖DNAaの表の一本鎖DNAa1と裏の
一本鎖DNAa2、前記DNAbの表の一本鎖DNAb1と裏の一本鎖
DNAb2が前記４種の異なるベクター１〜４に組み込まれ
た組換ベクターからなる４種類の一本鎖のDNA試料５〜
８を調製する。
一本鎖DNAa2、前記DNAbの表の一本鎖DNAb1と裏の一本鎖
DNAb2が前記４種の異なるベクター１〜４に組み込まれ
た組換ベクターからなる４種類の一本鎖のDNA試料５〜
８を調製する。
一方、それぞれ塩基配列が異なり、前記ベクター１〜
４の一種類にのみハイブリダイズし得る塩基配列を持っ
たプライマー９〜12を、それぞれ異なる発光波長の標識
蛍光体、Fluoreseince isothicayanate（FITC;発光波長
515nm）,4-fluoro-7-nitrobenzofurazan（NBD-F;発光波
長540nm）,TRITC（tetramethyl rhodamine isothiocyan
ate;発光波長573nm），およびTexas Red（発光波長605n
m）で標識する。
４の一種類にのみハイブリダイズし得る塩基配列を持っ
たプライマー９〜12を、それぞれ異なる発光波長の標識
蛍光体、Fluoreseince isothicayanate（FITC;発光波長
515nm）,4-fluoro-7-nitrobenzofurazan（NBD-F;発光波
長540nm）,TRITC（tetramethyl rhodamine isothiocyan
ate;発光波長573nm），およびTexas Red（発光波長605n
m）で標識する。
ついで、各DNA試料５〜８と各プライマー９〜12の全
てを一緒に混合することによりハイブリダイゼイション
処理を行う。この際、各プライマー９〜12は、それぞ
れ、各DNA試料５〜８のベクター１〜４の一種類にのみ
ハイブリダイズし得るものであるから、第１図に示すよ
うに、5-9,6-10,7-11,8-12の組み合わせで前記標識され
たプライマーが前記各ベクターにハイブリダイズされた
各DNA試料5-9,6-10,7-11及び8-12の処理混合物が得られ
る。
てを一緒に混合することによりハイブリダイゼイション
処理を行う。この際、各プライマー９〜12は、それぞ
れ、各DNA試料５〜８のベクター１〜４の一種類にのみ
ハイブリダイズし得るものであるから、第１図に示すよ
うに、5-9,6-10,7-11,8-12の組み合わせで前記標識され
たプライマーが前記各ベクターにハイブリダイズされた
各DNA試料5-9,6-10,7-11及び8-12の処理混合物が得られ
る。
つぎに、前記処理混合物を４分割し、これら４分割し
た各試料の処理混合物に対し、それぞれ、末端塩基種が
アデニン、シトシン、グアニン、及び、チミンとなるよ
うに個別にデオキシヌクレオチドおよびダイデオキシヌ
クレオチドを調合し、酵素反応（第１図において、それ
ぞれ、A,C,G及びＴ処理として図示）して相補鎖合成を
行う。前記相補鎖合成により、前記各試料５〜８に由来
し、その混合物中のDNA断片の末端塩基種が前記４種の
いずれかであるDNA断片群、すなわち、DNA断片の末端塩
基種がアデニンであるＡ群（前記各ベクターにハイブリ
ダイズされた各DNA試料の末端塩基種がアデニンである
群、すなわち、第２図の5-9-A,6-10-A,7-11-A及び8-12-
Aからなる群）、DNA断片の末端塩基種がシトシンである
Ｃ群（前記各ベクターにハイブリダイズされた各DNA試
料の末端塩基種がシトシンである群、すなわち、第２図
の5-9-C,6-10-C,7-11-C及び8-12-Cからなる群）、DNA断
片の末端塩基種がグアニンであるＧ群（前記各ベクター
にハイブリダイズされた各DNA試料の末端塩基種がグア
ニンである群、すなわち、第２図の5-9-G,6-10-G,7-11-
G及び8-12-Gからなる群）、及び、DNA断片の末端塩基種
がチミンであるＴ群（前記各ベクターにハイブリダイズ
された各DNA試料の末端塩基種がチミンである群、すな
わち、第２図の5-9-T,6-10-T,7-11-T及び8-12-Tからな
る群）を個別に作成する。
た各試料の処理混合物に対し、それぞれ、末端塩基種が
アデニン、シトシン、グアニン、及び、チミンとなるよ
うに個別にデオキシヌクレオチドおよびダイデオキシヌ
クレオチドを調合し、酵素反応（第１図において、それ
ぞれ、A,C,G及びＴ処理として図示）して相補鎖合成を
行う。前記相補鎖合成により、前記各試料５〜８に由来
し、その混合物中のDNA断片の末端塩基種が前記４種の
いずれかであるDNA断片群、すなわち、DNA断片の末端塩
基種がアデニンであるＡ群（前記各ベクターにハイブリ
ダイズされた各DNA試料の末端塩基種がアデニンである
群、すなわち、第２図の5-9-A,6-10-A,7-11-A及び8-12-
Aからなる群）、DNA断片の末端塩基種がシトシンである
Ｃ群（前記各ベクターにハイブリダイズされた各DNA試
料の末端塩基種がシトシンである群、すなわち、第２図
の5-9-C,6-10-C,7-11-C及び8-12-Cからなる群）、DNA断
片の末端塩基種がグアニンであるＧ群（前記各ベクター
にハイブリダイズされた各DNA試料の末端塩基種がグア
ニンである群、すなわち、第２図の5-9-G,6-10-G,7-11-
G及び8-12-Gからなる群）、及び、DNA断片の末端塩基種
がチミンであるＴ群（前記各ベクターにハイブリダイズ
された各DNA試料の末端塩基種がチミンである群、すな
わち、第２図の5-9-T,6-10-T,7-11-T及び8-12-Tからな
る群）を個別に作成する。
つぎに、第３図の多色蛍光検出型電気泳動装置の図に
示すように、200mm×300mmの大きさの石英板間の0.3mm
の間隙の間に形成された６％ポリアクリルアミドゲルか
らなる泳動分離ゲル板10の試料注入ウエル12,13,14,15
に、上記A,C,G,Tの各群を注入具11により、それぞれ、
滴下し、これを泳動させる。ついで各群が前記ウエル下
底から約25cmの距離泳動した部位を前記ゲル板の側面か
らレーザー16によりレーザー照射することによって発す
る蛍光を像分割プリズムとフィルター（図示せず）で前
記各試料５〜８のそれぞれ異なる蛍光体標識に対応する
波長に分光させ、前記分光した各波長の蛍光を二次元蛍
光検出器17の結像部位に各試料５〜８に対応する蛍光線
画像として結像させる。
示すように、200mm×300mmの大きさの石英板間の0.3mm
の間隙の間に形成された６％ポリアクリルアミドゲルか
らなる泳動分離ゲル板10の試料注入ウエル12,13,14,15
に、上記A,C,G,Tの各群を注入具11により、それぞれ、
滴下し、これを泳動させる。ついで各群が前記ウエル下
底から約25cmの距離泳動した部位を前記ゲル板の側面か
らレーザー16によりレーザー照射することによって発す
る蛍光を像分割プリズムとフィルター（図示せず）で前
記各試料５〜８のそれぞれ異なる蛍光体標識に対応する
波長に分光させ、前記分光した各波長の蛍光を二次元蛍
光検出器17の結像部位に各試料５〜８に対応する蛍光線
画像として結像させる。
二次元蛍光検出器17の結像部位に結像された各蛍光線
画像は、モニター21に各試料５〜８に対応する４本の線
画像22として表示されるとともに、コントローラ18、デ
ータ処理器19を経て表示器20に表示される。
画像は、モニター21に各試料５〜８に対応する４本の線
画像22として表示されるとともに、コントローラ18、デ
ータ処理器19を経て表示器20に表示される。
第４図は、前記モニター21に表示された線画像22の拡
大図であって、４本の線画像は、上から順に前記試料５
〜８に対応し、…で示したＡ領域、Ｃ領域、Ｇ領域及び
Ｔ領域は、それぞれ、各試料のＡ群、Ｃ群、Ｇ群及びＴ
群に対応する領域を示す。
大図であって、４本の線画像は、上から順に前記試料５
〜８に対応し、…で示したＡ領域、Ｃ領域、Ｇ領域及び
Ｔ領域は、それぞれ、各試料のＡ群、Ｃ群、Ｇ群及びＴ
群に対応する領域を示す。
したがって、上記データを演算処理することにより、
各試料の塩基配列を同時に決定することができる。
各試料の塩基配列を同時に決定することができる。
なお、本実施例では光源としてアルゴンレーザー（48
8nm）およびHe-Neレーザー（543nm）を用いた。アルゴ
ンレーザーとHe-Neレーザーを一体化して同一場所を照
射しても良いが、2mmあるいはそれ以上離れた位置を照
射しても良い。使用した上記標識蛍光体のうち、FITCお
よびNBD-Fの励起にはArレーザーを、TRITCおよびTexas
Redの励起にはHe-Neレーザーを使用した。試料数が多い
ときにはこれらに加えて更に発光波長の長い蛍光体を使
用することもできる。この場合、He-Neレーザ（633nm）
や半導体レーザーを使用することもできる。
8nm）およびHe-Neレーザー（543nm）を用いた。アルゴ
ンレーザーとHe-Neレーザーを一体化して同一場所を照
射しても良いが、2mmあるいはそれ以上離れた位置を照
射しても良い。使用した上記標識蛍光体のうち、FITCお
よびNBD-Fの励起にはArレーザーを、TRITCおよびTexas
Redの励起にはHe-Neレーザーを使用した。試料数が多い
ときにはこれらに加えて更に発光波長の長い蛍光体を使
用することもできる。この場合、He-Neレーザ（633nm）
や半導体レーザーを使用することもできる。
本発明によれば、多数の試料を同時に混合物の形態の
まま処理することができるので操作の手間が省ける利点
がある。また、A,C,G,Tを異なる色素で標識し、同一泳
動路上を泳動させる方式では標識色素の違いによる泳動
時間の差などを補正する必要があるが本法では同じ試料
は同一色素で標識できるので補正の必要はない利点もあ
る。
まま処理することができるので操作の手間が省ける利点
がある。また、A,C,G,Tを異なる色素で標識し、同一泳
動路上を泳動させる方式では標識色素の違いによる泳動
時間の差などを補正する必要があるが本法では同じ試料
は同一色素で標識できるので補正の必要はない利点もあ
る。
第１図〜第２図は本発明の試料調整の模式図、第３図は
本発明に使用する多色蛍光検出型電気泳動装置の概念
図、第４図は、第３図に多色蛍光検出型電気泳動装置に
おけるモニターに表示された線画像の拡大図である。 a,b……二本鎖DNA、a1……ａの表の一本鎖DNA、a2……
ａの裏の一本鎖DNA、b1……ｂの表の一本鎖DNA、b2……
ｂの裏の一本鎖DNA、1,2,3,4……それぞれ、異なるベク
ター,5,6,7,8……DNA試料、9,10,11,12……異なる色素
で標識されたプライマー、5-9,6-10,7-11,8-12……異な
るプライマーでハイブリダイズされたDNA試料、Ａ処理
……末端塩基種がＡとなる相補鎖合成、Ｃ処理……末端
塩基種がＣとなる相補鎖合成、Ｇ処理……末端塩基種が
Ｇとなる相補鎖合成、Ｔ処理……末端塩基種がＴとなる
相補鎖合成、Ａ群……末端塩基がＡのDNA断片群、Ｃ群
……末端塩基がＣのDNA断片群、Ｇ群……末端塩基がＧ
のDNA断片群、Ｔ群……末端塩基がＴのDNA断片群、10…
…泳動分離ゲル、11……注入具、12〜15……試料注入ウ
ェル、16……レーザー、17……二次元蛍光検出器、18…
…コントローラ、19……データ処理器、20……表示装
置、21……モニター、22……モニターされた線画像、Ａ
領域……Ａ群に対応する領域、Ｃ領域……Ｃ群に対応す
る領域、Ｇ領域……Ｇ群に対応する領域、Ｔ領域……Ｔ
群に対応する領域。
本発明に使用する多色蛍光検出型電気泳動装置の概念
図、第４図は、第３図に多色蛍光検出型電気泳動装置に
おけるモニターに表示された線画像の拡大図である。 a,b……二本鎖DNA、a1……ａの表の一本鎖DNA、a2……
ａの裏の一本鎖DNA、b1……ｂの表の一本鎖DNA、b2……
ｂの裏の一本鎖DNA、1,2,3,4……それぞれ、異なるベク
ター,5,6,7,8……DNA試料、9,10,11,12……異なる色素
で標識されたプライマー、5-9,6-10,7-11,8-12……異な
るプライマーでハイブリダイズされたDNA試料、Ａ処理
……末端塩基種がＡとなる相補鎖合成、Ｃ処理……末端
塩基種がＣとなる相補鎖合成、Ｇ処理……末端塩基種が
Ｇとなる相補鎖合成、Ｔ処理……末端塩基種がＴとなる
相補鎖合成、Ａ群……末端塩基がＡのDNA断片群、Ｃ群
……末端塩基がＣのDNA断片群、Ｇ群……末端塩基がＧ
のDNA断片群、Ｔ群……末端塩基がＴのDNA断片群、10…
…泳動分離ゲル、11……注入具、12〜15……試料注入ウ
ェル、16……レーザー、17……二次元蛍光検出器、18…
…コントローラ、19……データ処理器、20……表示装
置、21……モニター、22……モニターされた線画像、Ａ
領域……Ａ群に対応する領域、Ｃ領域……Ｃ群に対応す
る領域、Ｇ領域……Ｇ群に対応する領域、Ｔ領域……Ｔ
群に対応する領域。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/58 C12N 15/00 G01N 27/26
Claims (6)
- 【請求項１】それぞれ異なるベクターに組み込まれた異
なる複数の一本鎖のDNA試料と、それぞれ塩基配列が異
なり、異なる発光波長をもつ蛍光体で標識され、前記各
ベクターの１種類のみにハイブリダイズするプライマー
とを調製するステップと、 前記各DNA試料と前記各プライマーとを全て混合して処
理し、前記各ベクターに前記プライマーをハイブリダイ
ズさせて、処理混合物を４分割するステップと、 前記４分割された処理混合物から、前記各DNA試料に由
来し、DNA断片の末端塩基種がアデニン、シトシン、グ
アニン、及びチミンであるDNA断片群、即ち、前記各DNA
試料に由来するアデニン断片群、シトシン断片群、グア
ニン断片群、及びチミン断片群を、相補鎖合成により調
製するステップと、 前記各断片群を電気泳動して、前記各断片群毎に前記発
光波長の差に基づいて前記DNA試料に由来するDNA断片の
分離検出を行なうステップとを有することを特徴とする
DNAの塩基配列決定法。 - 【請求項２】請求項１に記載のDNAの塩基配列決定法に
おいて、前記分離検出を行なうステップでは、前記各断
片群を異なる泳動路で泳動させて、各泳動路において、
前記発光波長の差に基づいて前記各DNA試料に由来するD
NA断片の分離検出を行ない、前記複数の一本鎖のDNA試
料の塩基配列を決定することを特徴とするDNAの塩基配
列決定法。 - 【請求項３】請求項２に記載のDNAの塩基配列決定法に
おいて、前記各泳動路の泳動開始点から所定の位置を、
レーザー光照射して前記蛍光体から発する蛍光を検出す
ることを特徴とするDNAの塩基配列決定法。 - 【請求項４】請求項３に記載のDNAの塩基配列決定法に
おいて、前記各泳動路での前記発光波長の差に基づく前
記DNA断片の分離検出を、前記蛍光を分光して、分光さ
れた各波長の光を検出器により検出することを特徴とす
るDNAの塩基配列決定法。 - 【請求項５】請求項４に記載のDNAの塩基配列決定法に
おいて、前記検出器が２次元光検出器であることを特徴
とするDNAの塩基配列決定法。 - 【請求項６】それぞれ異なる発光波長をもつ蛍光体で標
識され、複数種類の一本鎖のDNA試料の各DNA試料にそれ
ぞれハイブリダイズするプライマーと、前記各DNA試料
とを混合して、前記各DNA試料と前記プライマーとをハ
イブリダイズさせて、末端塩基種がアデニン、シトシ
ン、グアニン、及びチミンであるDNA断片群、即ち、ア
デニン断片群、シトシン断片群、グアニン断片群、及び
チミン断片群の各断片群に分けて、前記蛍光体で標識さ
れたDNA断片を相補鎖合成により合成し、前記各断片群
を異なる泳動路で電気泳動して、前記各断片群毎に前記
発光波長の差に基づいて前記DNA試料に由来するDNA断片
の分離検出を行ない、前記複数種類のDNA試料の塩基配
列を決定することを特徴とするDNAの塩基配列決定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1090844A JP2901004B2 (ja) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Ｄｎａの塩基配列決定法 |
| DE19904011991 DE4011991A1 (de) | 1989-04-12 | 1990-04-12 | Verfahren zur dna-basensequenzbestimmung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1090844A JP2901004B2 (ja) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Ｄｎａの塩基配列決定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02268700A JPH02268700A (ja) | 1990-11-02 |
| JP2901004B2 true JP2901004B2 (ja) | 1999-06-02 |
Family
ID=14009896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1090844A Expired - Fee Related JP2901004B2 (ja) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Ｄｎａの塩基配列決定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2901004B2 (ja) |
| DE (1) | DE4011991A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4218152A1 (de) * | 1992-06-02 | 1993-12-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren |
| US5605798A (en) | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
| US6194144B1 (en) | 1993-01-07 | 2001-02-27 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
| CA2158642A1 (en) * | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Hubert Koster | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| US5654419A (en) * | 1994-02-01 | 1997-08-05 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent labels and their use in separations |
| US5543026A (en) * | 1994-02-07 | 1996-08-06 | The Perkin-Elmer Corporation | Real-time scanning fluorescence electrophoresis apparatus for the analysis of polynucleotide fragments |
| DE4410655C2 (de) * | 1994-03-26 | 2001-06-28 | Heiko Schwertner | Verfahren und Vorrichtung zur schnellen kontinuierlichen Sequenzanalyse von verschiedenen linearen polymeren Substanzen nach einer einheitlichen Vorgehensweise |
| US7803529B1 (en) | 1995-04-11 | 2010-09-28 | Sequenom, Inc. | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| US6140053A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-31 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| DE19782096T1 (de) | 1996-11-06 | 2000-03-23 | Sequenom Inc | Immobiliserung von Nucleinsäuren in hoher Dichte |
| AU8234898A (en) | 1997-07-11 | 1999-02-08 | Brax Group Limited | Characterising nucleic acid |
| US6723564B2 (en) | 1998-05-07 | 2004-04-20 | Sequenom, Inc. | IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices |
| JP3607904B2 (ja) * | 2002-02-14 | 2005-01-05 | 中国電力株式会社 | フジツボ類の付着防除方法 |
| CN111272715B (zh) * | 2018-12-04 | 2023-03-14 | 长春长光华大智造测序设备有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像*** |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0294524B1 (en) * | 1987-06-09 | 1997-11-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing |
-
1989
- 1989-04-12 JP JP1090844A patent/JP2901004B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-04-12 DE DE19904011991 patent/DE4011991A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０ ｐ．１８５−１８８（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4011991A1 (de) | 1990-10-18 |
| JPH02268700A (ja) | 1990-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2901004B2 (ja) | Ｄｎａの塩基配列決定法 | |
| US5307148A (en) | Fluorescence detection type electrophoresis apparatus | |
| US6440664B1 (en) | Apparatus for sequencing of nucleic acids using multiple dyes | |
| JP3400650B2 (ja) | 電気泳動分離検出方法及び装置 | |
| EP0870059B1 (en) | Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of hla types | |
| SE456348B (sv) | Forfarande for elektroforetisk analys av dna fragment | |
| JP2002272463A (ja) | 一塩基多型の型を判定する方法 | |
| US6251591B1 (en) | Quantitative method for detecting nucleotide concentration | |
| Wiemann et al. | Simultaneous on-line DNA sequencing on both strands with two fluorescent dyes | |
| US7241597B2 (en) | Method for assaying DNA fragments in mixture | |
| JP3097205B2 (ja) | 電気泳動分離検出方法 | |
| JP2683549B2 (ja) | オリゴヌクレオチドを標識するキット | |
| US6436641B1 (en) | Method and apparatus for DNA sequencing | |
| JP2826366B2 (ja) | 蛍光検出型電気泳動装置 | |
| JPH11196874A (ja) | Ｄｎａ断片分析法 | |
| JPH1084999A (ja) | 多型解析方法 | |
| US6333156B1 (en) | Method for detecting oligonucleotides and determining base sequence of nucleic acids | |
| JP3202013B2 (ja) | 核酸の検出方法に用いるためのプローブ | |
| JP3186259B2 (ja) | キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 | |
| JPH0792163A (ja) | 遺伝子の塩基配列異常を有するキャリアの一次スクリーニング方法 | |
| USRE43096E1 (en) | Tagged extendable primers and extension products | |
| JP2001245699A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| JP2649794C (ja) | ||
| JPH0591896A (ja) | 核酸ハイブリツド検定法 | |
| JPH06189796A (ja) | 遺伝子診断法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |