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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Kits, die nützlich zum
Bestimmen der Länge
repetitiver Nukleinsäuresequenzen
sind. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren und Kits,
die nützlich
zum Bestimmen der Länge
repetitiver Nukleinsäuresequenzen
unter Verwendung einer diskontinuierlichen Primerverlängerungsreaktion sind.
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LITERATURANGABEN
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- Ausubel et al. Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology
Band 1, Kapitel 2, Abschnitt I, John Wiley & Sons, New York (1993)
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HINTERGRUND
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Verfahren
zur genetischen Polymorphismusanalyse haben weite Verbreitung in
Grundlagenforschung, klinischer Diagnostik, Gerichtsmedizin und auf
anderen Gebieten gefunden. Ein besonders nützliches Verfahren zum Nachweis
genetischer Polymorphismen beruht auf Variationen in der Länge repetitiver
Sequenzen, wobei solche Verfahren wechselnd als Analyse kurzer Tandemwiederholungen (short
tandem repeat analysis, STR), Analyse variabler Anzahlen an Tandemwiederholungen
(variable number of tandem repeat analysis, VNTR), Minisatellitenanalyse
und Mikrosatellitenanalyse bezeichnet werden.
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Der
Nachweis von Längenpolymorphismen in
repetitiven Nukleinsäuresequenzen
beruhte bislang auf der Gelelektrophorese zur Bestimmung der Länge der
repetitiven Sequenz. Jedoch weist die Gelelektrophorese einige bedeutsame
Nachteile im Zusammenhang mit der Analyse repetitiver Sequenzlängenpolymorphismen
auf. Erstens sind molekulare Längenmessungen,
die auf elektrophoretischer Mobilität beruhen, aufgrund einer komplizierten Beziehung
zwischen molekularer Größe und elektrophoretischer
Mobilität
von Natur aus ungenau. Zweitens wird der Grad, bis zu dem der elektrophoretische Vorgang
vervielfältigt
werden kann, durch die Anzahl der Elektrophoresebahnen und durch
die Größe der unterschiedlichen
Loci, die man in einer einzelnen Bahn laufen lässt, begrenzt, d.h. es müssen Loci
ausgewählt
werden, die elektrophoretisch nicht co-migrieren.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst eine diskontinuierliche
Primerverlängerungsreaktion,
wobei ein Primer in diskreten Schrittgrößen so verlängert wird, dass bei jeder
Schrittgröße der Primerverlängerung
der Primer um einen Betrag verlängert
wird, der einer einzelnen repetitiven Einheit entspricht. Nachfolgend
zu jeder Erhöhung der
diskreten Primerverlängerung
wird ein Nachweisschritt durchgeführt, in welchem eine Signalmodulation
nachgewiesen wird, wenn der Primer um einen Betrag verlängert worden
ist, der gleich der gesamten Länge
eines repetitiven Bereichs ist. Auf diese Weise wird durch Zählen der
Anzahl der Erhöhungsschritte
der diskreten Primerverlängerung,
die benötigt
werden, um eine Signalmodulation zu bewirken, die Anzahl repetitiver
Einheiten bestimmt, die den repetitiven Bereich ausbilden.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein exaktes und reproduzierbares
Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten bereitzustellen,
die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz
ausbilden.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum
Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten bereitzustellen, die
einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz ausbilden,
das eine große
Anzahl an Messungen parallel durchführen kann.
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Es
ist noch ein zusätzliches
Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl
repetitiver Einheiten bereitzustellen, die einen repetitiven Bereich
einer repetitiven Nukleinsäuresequenz
ausbilden, das keine elektrophoretische Trennung benötigt.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kits und Reagentien bereitzustellen,
die zum Durchführen
eines Verfahrens zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten,
die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz
ausbilden, nützlich
sind und die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen.
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In
einem ersten Aspekt werden die oben genannten und anderen Ziele
der Erfindung durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver
Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure gemäß anhängendem
Patentanspruch 1 erreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung umfasst der Schritt des Durchführens einer
zweiten Primerverlängerungsreaktion
zusätzlich
das Umsetzen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids
mit einem Primerterminationsreagens.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung ist das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
an einem festen Träger
befestigt. Vorzugsweise ist einer der Primer oder die Zielnukleinsäure an den
festen Träger
befestigt.
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In
noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts
der Erfindung ist die Markierung ein fluoreszierendes oder chemilumineszierendes
Molekül.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung ist die Markierung über einen
spaltbaren Linker an das verlängerbare
Nukleotid geknüpft.
In einer zusätzlichen
bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung wird die Zielnukleinsäure vor
der Analyse vervielfältigt.
Vorzugsweise wird solch eine Vervielfältigung mittels einer PCR erreicht.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung umfasst der Schritt des Behandelns
der Markierung, um die Markierung nichtnachweisbar zu machen, entweder
das Abspalten der Markierung vom markierten, verlängerbaren
Nukleotid oder das Zerstören
einer Signal-erzeugenden Eigenschaft der Markierung.
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In
einem zweiten Aspekt werden die oben genannten und andere Ziele
der Erfindung durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver
Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure gemäß dem anhängenden
Patentanspruch 12 erreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des zweiten Aspekts der Erfindung ist das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
an einem festen Träger
befestigt. Vorzugsweise ist entweder der Primer oder die Zielnukleinsäure an dem
festen Träger
befestigt.
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In
noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts
der Erfindung ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
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In
einer zusätzlichen
bevorzugten Ausführungsform
des zweiten Aspekts der Erfindung wird die Zielnukleinsäure vor
der Analyse vervielfältigt. Vorzugsweise
wird solch eine Vervielfältigung
mittels einer PCR erreicht.
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In
einem dritten Aspekt werden die oben genannten und andere Ziele
der Erfindung durch die Verwendung eines Kits zum Bestimmen der
Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer
Zielnukleinsäure
gemäß dem anhängenden
Patentanspruch 19 erreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des dritten Aspekts der Erfindung ist der Primer an einem festen
Träger
befestigt.
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In
einer zusätzlichen
bevorzugten Ausführungsform
des zweiten Aspekts der Erfindung ist die Markierung ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des zweiten Aspekts der Erfindung ist die Markierung an dem verlängerbaren
Nukleotid über
einen spaltbaren Linker befestigt.
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Diese
und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, Abbildungen
und anhängenden
Patentansprüche
besser verständlich
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine schematische Darstellung einer Zielnukleinsäure.
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2A-C
zeigen einen ersten Aspekt des Verfahrens der Erfindung, wobei ein
verlängerbares Nukleotid
markiert wird und die Markierung nachfolgend zu jedem diskreten
Erhöhungsschritt
der Primerverlängerung
nicht-nachweisbar gemacht wird.
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3A-B
zeigen einen zweiten Aspekt des Verfahrens der Erfindung, wobei
ein Nukleotidterminator markiert wird.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Jetzt
wird im Detail auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Bezug genommen, wobei Beispiele für diese in den angefügten Zeichnungen
dargestellt sind. Während
die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführüngsformen
beschrieben werden wird, wird es selbstverständlich sein, dass sie nicht
dazu dienen sollen, die Erfindung auf jene Ausführungsformen zu begrenzen.
Im Gegenteil, die Erfindung ist dazu vorgesehen, Alternativen, Modifikationen
und Entsprechungen abzudecken, die innerhalb der Erfindung, wie
sie durch die anhängenden
Patentansprüche
definiert ist, eingeschlossen sein könnten.
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I. DEFINITIONEN
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Sofern
nicht anders angegeben, sollen die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wie
sie hierin verwendet werden, die folgenden Bedeutungen haben:
„Nukleosid" bezieht sich auf
eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidinnukleosidbase,
z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin
und ähnlichem
besteht, und die an der 1'-Position
mit einer Pentose einschließlich
2'-Deoxy- und 2'-Hydroxylformen verbunden
ist (Siryer). Der Begriff „Nukleotid", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids, z.B.
einen Triphosphatester, wobei die häufigste Stelle der Veresterung
die Hydroxylgruppe darstellt, die an der C-5-Position der Pentose
gebunden ist. An vielen Stellen in der vorliegenden Offenbarung
soll der Begriff Nukleosid sowohl Nukleoside als auch Nukleotide
einschließen. Die
Begriffe Nukleotid und Nukleosid, wie sie hierin verwendet werden,
sollen synthetische Analoga mit modifizierten Nukleosidbasenresten,
mit modifizierten Zuckerresten und/oder modifizierten Phosphatesterresten,
z.B. wie an anderer Stelle beschrieben (Scheit; Eckstein), umfassen.
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„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" beziehen sich auf
lineare Polymere aus Nukleotidmonomeren, einschließlich einzel-,
doppel- und dreisträngige
Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, deren α-anomere Formen und ähnliches. Üblicherweise sind
die Nukleosidmonomere über
Phosphodiesterverknüpfungen
verbunden, wobei sich der Begriff „Phosphodiesterverknüpfung" wie er hierin verwendet
wird, auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, die deren
Phosphatanaloga einschließen,
wobei das Phosphoratom in der Oxidationsstufe +5 vorliegt und eines
oder mehrere der Sauerstoffatome durch einen Nicht-Sauerstoffrest
ersetzt ist. Beispielhafte Phosphatanaloga umfassen Phosphorthioat,
Phosphordithioat, Phosphorselenat, Phosphordiselenat, Phosphoranilothioat,
Phosphoranilidat, Phosphoramidat, Borphosphate und ähnliche
einschließlich
zugehöriger
Gegenionen, z.B. H, NH4, Na und ähnliche,
wenn solche Gegenionen vorhanden sind. Alternativ können Polynukleotide
Polymere aus nicht-nukleotidischen Monomeren, die über Phosphodiesterverknüpfungen
oder andere Verknüpfungen
verbunden sind, umfassen, die dazu in der Lage sind, sequenzspezifische
Hybride mit einer Zielnukleinsäure
auszubilden, z.B. Peptidnukleinsäure-
(PNA)-Polymere. Polynukleotide reichen typischerweise in ihrer Größe von wenigen
monomeren Einheiten, z.B. 8-40, bis zu einigen Tausend monomeren
Einheiten. Jedes Mal, wenn ein Polynukleotid durch eine Sequenz
aus Buchstaben wie „ATGCCTG" dargestellt wird,
versteht es sich, dass die Nukleotide in 5'→3'-Reihenfolge von
links nach rechts angeordnet sind und dass „A" Desoxyadenosin bezeichnet, „C" Desoxycytidin bezeichnet, „G" Desoxyguanosin bezeichnet
und „T" Thymidin bezeichnet, sofern
nichts anderes angegeben ist.
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„Verlängerbares
Nukleotid" bezeichnet
jedes Nukleotid, das, wenn es in ein Primerverlängerungsprodukt während einer
Primerverlängerungsreaktion eingebaut
wird, die weitere Verlängerung
eines solchen Primerverlängerungsprodukts
erlaubt. Beispielhafte verlängerbare
Nukleotide umfassen 2'-Desoxynukleotidtriphosphate,
z.B. 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxy-7-deazadesoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat und
2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat. Optional
enthalten eines oder mehrere der verlängerbaren Nukleotide eine Markierung.
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„Nukleotidterminator" bezeichnet jedes
Nukleotid, das, wenn es in ein Primerverlängerungsprodukt eingebaut wird,
die weitere Verlängerung
eines solchen Primerverlängerungsprodukts
verhindert. Eine Voraussetzung für
einen Nukleotidterminator ist es, dass, wenn der Nukleotidterminator
einen Ribofuranose-Zuckerteil enthält, die 3'-Position keine Hydroxygruppe aufweisen
darf, die dazu geeignet ist, nachfolgend von einer Polymerase dazu
verwendet zu werden, zusätzliche
Nukleotide einzubauen. Alternativ könnte ein Ribofuranose-Analogon
wie Arabinose verwendet werden. Beispielhafte Nukleotidterminatoren
umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofu ranosyl, β-D-Arabinofuranosyl,
3'-Desoxy-β-D-arabinofuranosyl,
3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosyl und
2',3'-Didesoxy-3'-fluoro-β-D-ribofuranosyl
(Chidgeavadze). Nukleotidterminatoren schließen auch reversible Nukleotidterminatoren
ein (Metzker).
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„Polymerase" bezeichnet ein Enzym
oder einen anderen Katalysator, der geeignet ist, eine Reaktion
zu katalysieren, die zu einem Zielsequenz-abhängigen Einbau eines Nukleotids
an ein 3'-Ende eines
Primers oder eines Primerverlängerungsprodukts
führt,
wenn solch ein Primer oder Primerverlängerungsprodukt an eine Zielnukleinsäure angelagert ist.
Beispielhafte Polymerasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Pfu DNA-Polymerase, E. coli-Polymerase I, T-7-Polymerase, reverse
Transkriptase, Taq DNA-Polymerase und ähnliche (Kornberg und Baker).
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„Markierung" bezeichnet jeden
Rest, der, wenn er an einem Nukleotid oder Polynukleotid der Erfindung
befestigt ist, solch ein Nukleotid oder Polynukleotid detektierbar
macht, wenn man bekannte Detektionsmittel verwendet. Markierungen
können direkte
Markierungen, die selbst detektierbar sind, oder indirekte Markierungen
sein, die in Kombination mit anderen Agenzien detektierbar sind.
Beispielhafte direkte Markierungen umfassen, aber sind nicht beschränkt auf
Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, Spin-Markierungen, chemilumineszierende Markierungen
und ähnliche.
Beispielhafte indirekte Markierungen schließen Enzyme ein, die ein Signal-erzeugendes
Ereignis katalysieren, und Liganden, wie ein Antigen oder Biotin,
die spezifisch mit hoher Affinität
an einen detektierbaren Anti-Liganden wie einem markierten Antikörper oder
Avidin binden können.
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„Primerverlängerungsreaktion" bezeichnet eine
Reaktion zwischen einem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid und einem
Nukleotid, die zu der Hinzufügung
des Nukleotids an ein 3'-Ende
des Primers führt,
so dass das hinzugefügte
Nukleotid komplementär
zum entsprechenden Nukleotid der Zielnukleinsäure ist.
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„Primärverlängerungsreagens" bezeichnet ein Reagens,
das Komponenten enthält,
die notwendig sind, um eine Primerverlängerungsreaktion zu bewirken.
Primerverlängerungsreagentien
enthalten typischerweise (i) ein Polymerase-Enzym; (ii) einen Puffer
und (iii) ein oder mehrere verlängerbare
Nukleotide.
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„Spezifisch
bindendes Paar" bezieht
sich auf ein Paar aus Molekülen,
die spezifisch aneinander binden, um einen Bindungskomplex auszubilden. Beispiele
für spezifi sche
Bindungspaare umfassen, aber sind nicht beschränkt auf Antikörper-Antigen-Paare (oder Antikörper-Hapten-Paare),
Ligand-Rezeptor-Paare, Enzym-Substrat-Paare, Biotin-Avidin-Paare, Polynukleotide
mit komplementären
Basenpaaren und ähnliche.
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„Primer" ist ein Polynukleotid,
das dazu geeignet ist, sich selektiv an eine vorgegebene Zielsequenz
anzulagern und danach als ein Initiationspunkt für eine Primerverlängerungsreaktion
zu dienen, wobei der Primer in einer 5'→3'-Richtung verlängert wird.
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II. IN DEM VERFAHREN DER
ERFINDUNG VERWENDETE MATERIALIEN
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A. Zielnukleinsäure
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Eine
Zielnukleinsäure
zur Verwendung mit der Erfindung kann aus jedem lebendigen oder
einstmals lebendigen Organismus stammen, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf Prokaryont, Eukaryont, Pflanze, Tier und Virus.
Die Zielnukleinsäure
kann aus einem Zellkern stammen, z.B. genomische DNA, oder sie kann
extranukleäre
Nukleinsäure
sein, z.B. Plasmid-, Mitochondriennukleinsäure und ähnliche.
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Viele
Verfahren zur Isolierung und Reinigung einer Zielnukleinsäure zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung stehen zur Verfügung. Das
bevorzugte Reinigungsverfahren sollte eine Zielnukleinsäure bereitstellen,
die ausreichend frei von Protein ist, um eine effiziente Primerverlängerung
und Nukleinsäurevervielfältigung
zu ermöglichen.
Bevorzugte Reinigungsverfahren umfassen (i) organische Extraktion
gefolgt von Ethanolfällung,
z.B. unter Verwendung eines organischen Phenol/Chloroform-Reagens
(Ausubel), vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Extraktors,
z.B. der von PE Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältliche DNA-Extraktor
Modell 341; (ii) Festphasenadsorptionsverfahren (Walsh, Boom); und
(iii) durch Salz ausgelöste
DNA-Fällungsverfahren
(Miller), wobei solche Verfahren üblicherweise als „Aussalz"-Verfahren bezeichnet
werden. Optimalerweise geht jedem der obigen Reinigungsverfahren
ein enzymatischer Verdauschritt voraus, um das Entfernen von Protein aus
der Probe zu unterstützen,
z.B. Verdau mit Proteinase K oder anderen ähnlichen Proteasen.
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Um
die Empfindlichkeit des Verfahrens der Erfindung zu erhöhen, wird
die Zielnukleinsäure
vorzugsweise unter Verwendung eines geeigneten Nukleinsäurevervielfäl tigungsverfahrens
vervielfältigt, bevor
das Verfahren durchgeführt
wird. Solch eine Vervielfältigung
kann linear oder exponentiell sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Vervielfältigung
der Zielnukleinsäure
unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Mullis) erreicht.
Im Allgemeinen besteht die PCR aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt,
der die Stränge
einer doppelsträngigen
Nukleinsäureprobe
trennt, gefolgt von der Wiederholung (i) eines Anlagerungsschritts, der
den Vervielfältigungsprimern
gestattet, sich spezifisch an Positionen anzulagern, die eine Zielsequenz
flankieren; (ii) eines Verlängerungsschritts,
der die Primer in einer 5'→3'-Richtung verlängert, wodurch
ein Nukleinsäurevervielfältigungsprodukt
gebildet wird, das zu der Zielsequenz komplementär ist, und (iii) eines Denaturierungsschritts,
der die Trennung des Verlängerungsprodukts
und der Zielsequenz bewirkt. Jeder der obigen Schritte kann bei
einer unterschiedlichen Temperatur durchgeführt werden, wobei die Temperaturänderungen
unter Verwendung eines Thermocyclers (PE Applied Biosystems, Foster
City, CA) bewirkt werden können.
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Die
verallgemeinerte Struktur einer Zielnukleinsäure zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung ist in 1 gezeigt, wobei die Zielnukleinsäure 5 einen
5'-flankierenden
Teil 10 einschließlich
eines zum Primer komplementären
Teils 15, einen 3'-flankierenden
Teil 25 und einen repetitiven Bereich 20, der
sich zwischen dem 5'-flankierenden
Teil und dem 3'-flankierenden
Teil befindet, umfasst. Der repetitive Bereich 20 der Zielnukleinsäure umfasst
mehrere repetitive Einheiten (R)n 21,
wobei R eine repetitive Einheit bezeichnet und n die Anzahl repetitiver
Einheiten bezeichnet, die den repetitiven Bereich bilden. Die repetitive
Einheit R kann jeder Typ eines repetitiven Motivs sein, zum Beispiel,
aber nicht beschränkt
auf eine Milcrosatelliten-Wiederholung (Webber und May; Smeets;
Williamson), eine Minisatelliten-Wiederholung
(Jeffreys, Caskey) oder eine α-Satelliten-Wiederholung
(Jabs).
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Der
repetitive Bereich kann aus mehreren Typen repetitiver Einheiten
oder aus repetitiven Einheiten bestehen, die selbst polymorph sind.
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B. Primer
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Primer
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind dafür vorgesehen,
ein Gleichgewicht zwischen der Spezifität der Primeranlagerung, d.h. der
Frequenz, mit der eine unerwünschte
Zielsequenz an einer Primerverlängerungsreaktion
teilnimmt, und der Effizienz der Primerverlängerung, d.h. dem Ausmaß, mit dem
eine erwünschte
Zielsequenz an der Primerverlängerungsreaktion
teilnimmt, zu erhalten.
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Die
Spezifität
der Primeranlagerung wird im Allgemeinen durch die Länge des
Primers und die Temperatur der Anlagerungsreaktion gesteuert. Polynukleotide
zwischen ungefähr 18 und 24 Basen
sind bevorzugt, weil solche Polynukleotide dazu tendieren, sehr
sequenzspezifisch zu sein, wenn die Anlagerungstemperatur wenige
Grade um eine Primerschmelztemperatur herum eingestellt wird (Dieffenbach).
Um Primerverlängerung
zu ermöglichen,
enthält
ein 3'-Ende des
Primers eine -OH-Gruppe
oder einen anderen Rest, der den Einbau eines Nukleotids an dem
3'-Ende des Primers
gestattet. Es gibt eine Anzahl von Computerprogrammen, um die Primerwahl
in unterschiedlichen Zusammenhängen
zu ermöglichen
(Osborne; Montpetit).
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Die
Sequenz des Primers wird so gewählt, dass
sich der Primer an den zum Primer komplementären Teil des 3'-flankierenden Teils
der Zielnukleinsäure
anlagert. Vorzugsweise lagert sich der Primer so an, dass ein 3'-Ende des Primers
zu einem 3'-Ende eines repetitiven
Bereichs einer Zielnukleinsäure benachbart
ist. Der Primer kann sich jedoch auch an ein Segment des repetitiven
Bereichs der Zielnukleinsäure
anlagern, solange er wenigstens zum Teil an dem 3'-flankierenden Teil
des Ziels verankert ist.
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Vorzugsweise
werden die Primer der Erfindung auf herkömmliche Weise auf einem automatisierten
DNA-Synthesizer, z.B. DNA/RNA-Synthesizer Modell 392 oder 394 von
PE Applied Biosystems (Foster City, CA) unter Verwendung chemischer Standardreaktionen,
z.B. Phosphoramidit-Chemie (Beaucage) synthetisiert. In einem alternativen
Verfahren können
Primer aus einer biologischen Quelle isoliert werden.
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C. Festphasenträger
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung wird ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
während
eines Trennschritts an einem Festphasenträger befestigt. Solch eine Befestigung
kann entweder durch die Zielnukleinsäure oder durch das Primerpolynukleotid
erfolgen.
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Festphasenträger zur
Verwendung mit der Erfindung können
eine große
Formenvielfalt aufweisen, einschließlich Mikropartikel, Beads,
Membranen, Objektträger, Platten,
im Mikromaßstab
bearbeitete Chips und ähnliche.
Außerdem
können
die Festphasenträger
der Erfindung eine große
Vielfalt an Zusammensetzungen umfassen, einschließlich Glas, Kunststoff,
Silizium, Alkanthiolat-derivatisiertes Gold, Cellulose, niedrigvernetztes
und hochvernetztes Polystyrol, Silicagel, Polyamid und ähnliche.
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Wenn
die Befestigung des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den
Primer erfolgt, können die
Primer mit einem Festphasenträger
verwendet werden, auf dem sie synthetisiert wurden, oder sie können separat
synthetisiert werden und an einem Festphasenträger zur Verwendung während oder
vor dem Trennschritt des Verfahrens befestigt werden.
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Wenn
Primer mit demselben Festphasenträger verwendet werden, auf dem
sie synthetisiert werden, kann ein solcher Träger eine Vielzahl an Formen umfassen
und eine Vielfalt an Verknüpfungsgruppen enthalten.
Solche Träger
können
Mikropartikel oder planare Anordnungen oder Matrizen aus Bereichen umfassen,
die im Wesentlichen gleichförmige
Primerpopulationen aufweisen. Eine große Vielfalt an Mikropartikelsyntheseträgern kann
mit der Erfindung verwendet werden, einschließlich Mikropartikel, die aus „controlled
pore glass" (CPG),
hochvernetztem Polystyrol, Acrylcopolymeren, Cellulose, Nylon, Dextran, Latex,
Polyacrolein und ähnlichen
hergestellt sind. Mikropartikelträger enthalten zusätzlich handelsübliche Nukleosid-derivatisierte
CPG- und Polystyrol-Beads (erhältlich
z.B. von Applied Biosystems, Foster City, CA); derivatisierte magnetische
Beads; mit Polyethylenglykol gepfropftes Polystyrol (z.B. TentaGel, Rapp
Polymere, Tübingen,
Deutschland); und ähnliche.
Die Auswahl der Trägereigenschaften
wie Material, Porosität,
Größe, Form
und ähnliches
und der Art der verwendeten Verknüpfungsgruppe hängt von
den Bedingungen ab, unter denen die Primer verwendet werden. Zum
Beispiel sind in der vorliegenden Erfindung Träger und Linker bevorzugt, die
die sterische Hinderung der Polymeraseenzyme minimieren und die
den Zugang zum Nukleotidsubstrat ermöglichen. Andere wichtige Faktoren,
die beim Auswählen
des geeignetsten Mikropartikelträgers
berücksichtigt
werden müssen,
umfassen Gleichförmigkeit
der Größe, Effizienz
als ein Syntheseträger,
Ausmaß,
zu dem der Oberflächeninhalt
bekannt ist, und optische Eigenschaften, z.B. stellen durchsichtige
glatte Beads Vorteile bei der Instrumentierung bereit, wenn man große Zahlen
von Beads auf einer Oberfläche
verwendet.
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Wie
oben erwähnt,
können
Primer auch auf einem einzelnen (oder einigen wenigen) Festphasenträger synthetisiert
werden, um eine Anordnung aus gleichförmig mit Primern beschichteten
Bereichen zu bilden. Das heißt
innerhalb jedes Bereichs in solch einer Anordnung wird der gleiche
Primer synthetisiert. Verfahren zum Synthetisieren solcher Anordnungen sind
an anderer Stelle offenbart (Pease; Southern).
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Wenn
Primer separat synthetisiert werden und nachfolgend zur Verwendung
an einem Festphasenträger
befestigt werden, kann der Primer an dem Träger über eine kovalente Verknüpfung oder eine
nicht-kovalente Verknüpfung
befestigt werden. Wenn der Primer an dem festen Träger über eine nicht-kovalente
Verknüpfung
befestigt ist, enthält
der Primer einen Teil eines spezifischen Bindungspaars, z.B. Biotin,
und der andere Teil des Paars ist an dem festen Träger befestigt,
z.B. Avidin. Mehrere Verfahren zur kovalenten Anbindung von Polynukleotiden an
feste Träger
stehen zur Verfügung,
z.B. über
die Reaktion eines 5'-Amino-Polynukleotids
mit einem Isothiocyanat-funktionalisiertem Glasträger (Guo). Ein
weiter Bereich an beispielhaften Verknüpfungsgruppen zum entweder
kovalenten oder nicht-kovalenten Befestigen von Primern an festen
Trägern
ist an anderer Stelle offenbart. (Pon; Webb; Barany; Damha; Beattie;
Maskos und Southern).
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Wenn
die Befestigung des Primer-Matrizen-Hybrids über die Matrizennukleinsäure erfolgt und
die Matrizennukleinsäure
ein PCR-Vervielfältigungsprodukt
darstellt, können
die Mittel zur kovalenten oder nicht-kovalenten Befestigung in einen PCR-Primer eingebaut
werden, der verwendet wird, um die PCR auszuführen. Folglich kann der PCR-Primer
einen Teil eines spezifischen Bindungspaars, z.B. Biotin, oder eine
reaktive Gruppe enthalten, die mit einem funktionalisierten festen
Träger
reagieren kann, um eine kovalente Verknüpfung zu bilden, z.B. eine
5'-Aminogruppe,
die mit einem Isothiocyanat-funktionalisiertem Glasträger reagiert.
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D. Markierte Nukleotide
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In
den Verfahren der vorliegenden Erfindung enthalten eines oder mehrere
verlängerbare
Nukleotide und/oder Nukleotidterminatoren eine Markierung. Die Markierung
ist an dem Nukleotid auf solch eine Art und Weise befestigt, dass
die Markierung den Polymerase-vermittelten Einbau des markierten Nukleotids
in einer Primerverlängerungsreaktion nicht
wesentlich beeinträchtigt.
Viele alternative Verfahren zum Markieren von Nukleotiden in einer
zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeigneten Art und
Weise stehen zur Verfügung
(Kricka). Bei einer bevor zugten Art von Markierungsverfahren wird
eine Nukleosidbase des Nukleotids modifiziert, eine Markierung zu
enthalten, d.h. die N-6-Position einer Purinbase oder die C-5-Position
einer Pyrimidinbase. Eine besonders bevorzugte Art markierter Nukleotide
sind die Propargylethoxyaminonukleotide (Khan).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist ein markiertes, verlängerbares Nukleotid dazu geeignet,
nicht-nachweisbar gemacht zu werden, z.B. durch Behandlung mit einem
geeigneten Reagens oder elektromagnetischer Strahlung. In dieser
Ausführungsform
kann das markierte, verlängerbare
Nukleotid entweder durch Entfernen der Markierung von dem Nukleotid
oder durch Zerstören der
Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung nicht-nachweisbar
gemacht werden.
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Mehrere
Verfahren zum Befestigen einer Markierung an einem verlängerbaren
Nukleotid, so dass die Markierung leicht entfernt werden kann, stehen
zur Verfügung.
Beispielhafte abspaltbare Linker zum Verbinden einer Markierung
mit einem Nukleotid umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio]propionamid
(APDP), (Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxyl)ethyl]sulfon (BSOCOES),
Disuccinimidyltartrat (DST) und Ethylenglycobis[succinimidylsuccinat]
(EGS) und ähnliche
(Pierce-Katalog).
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Bevorzugte
Markierungen, deren Signal-erzeugende Eigenschaften bei Behandlung
mit einem geeigneten Reagens oder mit elektromagnetischer Strahlung
zerstört
werden können,
umfassen fluoreszierende Markierungen, deren fluoreszierende Eigenschaften
mittels Fotozerstörung
durch Exposition gegen Licht von hoher Intensität oder mittels chemischem Abbau
durch Behandlung mit oxidierenden Chemikalien, z.B. Sauerstoff,
Natriumhypochlorit, Permanganat und ähnlichen, zerstört werden
können.
Alternative bevorzugte Arten von Markierungen umfassen Enzyme, die
durch Reaktion mit einem irreversiblen Enzyminhibitor oder durch
Denaturierung nicht-nachweisbar gemacht werden können, und chemilumineszierende
Markierungen, die nur eine einzelne Licht-erzeugende Umwandlung
durchlaufen können
und somit selbst-zerstörend
sind.
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E. Erste und zweite Primerverlängerungsreagentien
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Die
vorliegende Erfindung umfasst erste und zweite Primerverlängerungsreagentien,
die, wenn sie gemäß den Verfahren
der Erfindung verwendet werden, die Verlänge rung eines Primers in diskreten Schrittweiten
einzelner repetitiver Einheiten voranschreiten lassen, d.h. der
Primer wird nur um eine repetitive Einheit pro diskretem Primerverlängerungsreaktionszyklus
verlängert.
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Das
erste Primerverlängerungsreagens
der Erfindung umfasst einen Satz verlängerbarer Nukleotide, die es
einer Primerverlängerungsreaktion
erlauben, nur so weit voranzuschreiten, dass ein Primer um einen
Betrag verlängert
wird, der kleiner als eine gesamte repetitive Einheit ist. Folglich
kann in Abhängigkeit
von der speziellen Sequenz der repetitiven Einheit das erste Primerverlängerungsreagens eine
Vielfalt möglicher
Kombinationen verlängerbarer Nukleotide
umfassen. Wenn die Sequenz der repetitiven Einheit AGCT lautet,
könnte
z.B. das erste Primerverlängerungsreagens
verlängerbare
Nukleotide T (komplementär
zu A), T und C (komplementär
zu A und G) oder T und C und G (komplementär zu A und G und C) enthalten.
Um jedoch eine ungesteuerte fortlaufende Primerverlängerung
zu verhindern, darf das erste Primerverlängerungsreagens nicht alle
verlängerbaren
Nukleotide T und C und G und A enthalten.
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In
bestimmten Situationen ist es erwünscht, das erste Primerverlängerungsreagens
in separate Unterreagentien zu unterteilen, so dass jedes Unterreagens
verlängerbare
Nukleotide enthält,
die dafür ausreichend
sind, die Verlängerung
eines Primers nur so weit zu erlauben, dass ein Unterabschnitt der repetitiven
Sequenz gebildet wird. Wenn die repetitive Einheit ATGCCGT lautet,
könnte
z.B. ein Unterreagens des ersten Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren
Nukleotide T, A und C enthalten, während ein anderes Unterreagens
des ersten Primerverlängerungsreagens
die verlängerbaren
Nukleotide G und C enthält.
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Das
zweite Primerverlängerungsreagens
der Erfindung umfasst einen Satz verlängerbarer Nukleotide, die es
einem Primerverlängerungsreagens
erlauben, nur so weit voranzuschreiten, dass der Teil einer repetitiven
Einheit synthetisiert wird, der nicht durch das erste Primerverlängerungsreagens
synthetisiert wurde. Somit kann in Abhängigkeit von der speziellen
Sequenz der repetitiven Einheit und der Zusammensetzung des ersten
Primerreagens das zweite Primerverlängerungsreagens eine Vielfalt möglicher
Nukleotidkombinationen umfassen. Das oben diskutierte Beispiel fortführend könnte das zweite
Primerverlängerungsreagens
die verlängerbaren
Nukleotide G und A enthalten, wenn die Sequenz der repetitiven Einheit
AGCT lautet und das erste Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren
Nukleotide T und C enthält.
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F. Primerterminationsreagens
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Primerterminationsreagens, um
die Termination der Primerverlängerung
zu bewirken, so dass keine weitere Primerverlängerung erzielt werden kann,
sobald ein Primerverlängerungsprodukt
mit dem Primerterminationsreagens reagiert hat.
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Das
Primerterminationsreagens der Erfindung umfasst einen oder mehrere
Nulcleotidterminatoren und optional einen Satz verlängerbarer
Nukleotide, die eine Primerverlängerungsreaktion
nur so weit voranschreiten lassen, dass ein Primer um einen Betrag
verlängert
wird, der kleiner als eine gesamte repetitive Einheit in einer Primerverlängerungsreaktion
ist. Somit kann in Abhängigkeit
von der speziellen Sequenz der repetitiven Einheit, der Sequenz
des 3'-flankierenden
Teils der Zielnukleinsäure
und der Zusammensetzung der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien
das Primerverlängerungsreagens
eine Vielfalt möglicher
Kombinationen an verlängerbaren
Nukleotiden und Nukleotidterminatoren enthalten. Wenn die Sequenz
der repetitiven Einheit z.B. AGCT lautet und das erste Nukleotid
des 3'-flankierenden Teils
G ist und die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien die verlängerbaren
Nukleotide T, C, G und A enthalten, würde das Primerterminationsreagens
nur den Nukleotidterminator C enthalten, wobei dieser Nukleotidterminator komplementär zu dem
in dem 3'-flankierenden
Teil befindlichen G ist. Wenn die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien
nur die verlängerbaren Nukleotide
T und C enthalten, würde
das Primerverlängerungsreagens
alternativ die verlängerbaren
Nukleotide G und A und den Nukleotidterminator C enthalten.
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In
bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung umfasst das Primerverlängerungsreagens einen
markierten Nukleotidterminator. Das Markieren des Nukleotidterminators
wird im Wesentlichen wie oben in Abschnitt D beschrieben ausgeführt.
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III. DAS VERFAHREN
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
eines ersten Aspekts des Verfahrens der Erfindung ist schematisch
in 2A-C dargestellt. In der Figur wird das Verfahren
auf eine Zielnukleinsäure 5 mit
einem repetitiven Bereich 20, der aus zwei Kopien einer Zweibasenwiederholung
mit der Sequenz „AC" besteht, und mit
einem 5'-flan kierenden
Bereich 25 mit einem G-Nukleotid, das an den repetitiven
Bereich angrenzt, angewendet. In dieser bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts wird ein Primer 200 an einen zum Primer
komplementären
Teil 15 der Zielnukleinsäure 5 angelagert,
wodurch sich ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
bildet. Das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
wird dann mit einem ersten Primerverlängerungsreagens umgesetzt,
das ein markiertes, verlängerbares
Nukleotid T enthält,
was zum Einbau des markierten T-Nukleotids in das 3'-Ende eines Primerverlängerungsprodukts 210 führt. Nachfolgend
zur Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagens wird das erste
Primerverlängerungsreagens
von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt und das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid wird
mit einem zweiten Primerverlängerungsreagens umgesetzt,
das ein verlängerbares
G-Nukleotid enthält, was
zu der Hinzufügung
des G-Nukleotids in ein 3'-Ende
des Primerverlängerungsprodukts 215 führt. Als
nächstes
wird das nicht-reagierte zweite Primerverlängerungsreagens von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt, und eine Messung wird durchgeführt, um die Menge des in das
Primerverlängerungsprodukt
eingebauten, markierten, verlängerbaren
Nukleotids zu bestimmen. Wie durch das Säulendiagramm in der Figur angezeigt,
wird zu diesem Punkt in dem Verfahren ein großes Signal detektiert, was
das Vorhandensein des eingebauten, markierten T-Nukleotids anzeigt.
Schließlich
wird die an dem eingebauten, verlängerbaren Nukleotid befestigte
Markierung nicht-nachweisbar gemacht, um das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
für einen
nachfolgenden, diskreten Primerverlängerungsreaktionszyklus vorzubereiten.
In dem Beispiel werden die oben beschriebenen Verfahrensschritte,
wie in 2B und 2C gezeigt,
noch zweimal wiederholt. Bei dem in 2C gezeigten
dritten Zyklus ist die Intensität
des gemessenen Signals wesentlich reduziert im Vergleich zu den
Signalintensitäten,
die bei den ersten zwei Zyklen beobachtet wurden, weil das markierte, verlängerbare
Nukleotid T an diesem Punkt nicht in das Primerverlängerungsprodukt
eingebaut werden kann. Folglich zeigt diese in dem dritten Zyklus
beobachtete Verringerung im gemessenen Signal an, dass der repetitive
Bereich nur zwei Kopien der repetitiven AC-Einheit enthält.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
eines zweiten Aspekts des Verfahrens der Erfindung ist in 3A-B
gezeigt. Wie zuvor wird das Verfahren auf eine Zielnukleinsäure mit
einem repetitiven Bereich, der aus zwei Kopien einer Zweibasenwiederholung mit
der Sequenz „AC" besteht, und mit
einem 5'-flankierenden
Teil mit einem G-Nukleotid, das an die repetitive Region angrenzt,
angewendet. In dieser bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts wird
wie zuvor ein Primer 200 an einen zum Primer komplementären Teil 15 einer
Zielnukleinsäure 5 angelagert,
wodurch sich ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
bildet. Das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid wird dann
mit einem ersten Primerverlängerungsreagens
umgesetzt, das ein nicht-markiertes, verlängerbares Nukleotid T enthält, was
zum Einbau des nicht-markierten
T-Nukleotids in das 3'-Ende
eines Primerverlängerungsprodukts 310 führt. Nachfolgend
zur Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagens wird das erste
Primerverlängerungsreagens
von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt, und das Zielnkleinsäure-Primer-Hybrid
wird mit einen zweiten Primerverlängerungsreagens, das ein verlängerbares
G-Nukleotid enthält,
und mit einem Primerterminationsreagens, das einen markierten C-Nukleotidterminator
enthält,
umgesetzt, was zu der Hinzufügung
nur des verlängerbaren
G-Nukleotids in das 3'-Ende des Primerverlängerungsprodukts 315 führt. Als
nächstes
werden das nichtreagierte zweite Primerverlängerungsreagens und das Primerterminationsreagens
von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt, und eine Messung wird durchgeführt, um die Menge des in das
Primerverlängerungsprodukt
eingebauten, markierten Nukleotidterminators zu bestimmen. Wie in
der Figur angezeigt, wird an diesem Punkt des Verfahrens kein Signal
detektiert, was anzeigt, dass der markierte Nukleotidterminator
während
dieses Zyklus des Verfahrens nicht in das Primerverlängerungsprodukt
eingebaut wird. In 3B wird der oben beschriebene
Verfahrensschritt wiederholt. In diesem in 3B gezeigten zweiten
Zyklus ist die Intensität
des gemessenen Signals wesentlich erhöht im Vergleich zu der in dem ersten
Verfahrensschritt beobachteten, nominellen Nullsignalintensität, weil
während
des zweiten Schritts der markierte C-Nukleotidterminator in das Primerverlängerungsprodukt
eingebaut wird.
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Die
folgende Diskussion stellt eine detailliertere Beschreibung der
oben beschriebenen Verfahrensschritte des ersten und zweiten Aspekts
der Erfindung bereit.
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A. Primeranlagerung
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Die
Anlagerungsreaktion wird unter Bedingungen durchgeführt, die
stringent genug sind, um Sequenzspezifität sicherzustellen, aber ausreichend tolerant
sind, um die Bildung stabiler Hybride mit einer akzeptablen Geschwindigkeit
zuzulassen. Die für die
Primeranlagerung benötigte
Temperatur und Zeitdauer hängen
von mehreren Faktoren einschließlich der
Basenzusammensetzung, der Länge
und Konzentration des Primers und der Natur des verwendeten Lösungsmittels
ab, z.B. von der Konzentration der Kosolventien wie DMSO, Formamid
oder Glycerin und von Gegen ionen wie Magnesium. Üblicherweise wird die Hybridisierung
mit synthetischen Polynukleotiden bei einer Temperatur durchgeführt, die ungefähr 5 bis
10°C unter
der Schmelztemperatur des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids in dem Anlagerungslösungsmittel
liegt. Vorzugsweise liegt die Anlagerungstemperatur in dem Bereich
von 55 bis 75°C, und
die Primerkonzentration beträgt
ungefähr
0,2 μM.
Unter diesen bevorzugten Bedingungen wird die Anlagerungsreaktion
in nur wenigen Sekunden vollständig
sein.
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B. Primerverlängerungsreaktion
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Die
Zeit, die benötigt
wird, um eine Primerverlängerungsreaktion
auszuführen,
hängt von
der Länge
und der Konzentration der Zielsequenz und von der Reaktionstemperatur
ab. Schätzungen
für die
Geschwindigkeit des Nukleotideinbaus unter typischen Bedingungen
schwanken von 35 bis 100 Nukleotiden pro Sekunde in Abhängigkeit
von dem Puffer, dem pH-Wert, der Salzkonzentration, dem Polymerase-Enzym und der Natur
der DNA-Matrize.
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Um
eine Primerverlängerungsreaktion
zu erreichen, die gemäß dem Verfahren
der Erfindung in diskreten Schrittweiten aus einzelnen repetitiven
Einheiten voranschreitet, wird die Primerverlängerungsreaktion in zwei unabhängige Schritte
geteilt: eine erste Primerverlängerungsreaktion
und eine zweite Primerverlängerungsreaktion.
In der ersten Primerverlängerungsreaktion
wird der Primer um einen Betrag verlängert, der kleiner als die
Länge einer
einzelnen repetitiven Einheit ist, wobei die Steuerung des Ausmaßes der
Primerverlängerung
durch die Zusammensetzung eines ersten Primerverlängerungsreagens
bewirkt wird. In der zweiten Primerverlängerungsreaktion wird der Primer
so weit verlängert, dass
in Verbindung mit der ersten Primerverlängerungsreaktion der Primer
um einen Betrag verlängert wird,
der der Länge
einer einzelnen repetitiven Einheit entspricht.
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Gemäß dem ersten
Aspekt des Verfahrens der Erfindung enthält eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagentien
ein markiertes, verlängerbares
Nukleotid.
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Auch
gemäß dem ersten
Aspekt des Verfahrens der Erfindung enthält das zweite Primerverlängerungsreagens
in einer Variante der oben beschriebenen diskreten Zweischrittverlängerungsreaktion ein
Primerterminationsreagens. Wenn nach einer zweiten Primerverlängerungsreaktion
der Primer bis zum Ende des repetitiven Be reichs der Zielnukleinsäure verlängert worden
ist, wird somit ein Nukleotidterminator in das Primerverlängerungsprodukt
eingebaut, was folglich jede weitere Verlängerung jenes Primerverlängerungsprodukts
verhindert. Dies ist vorteilhaft, weil es die Möglichkeit beseitigen wird, dass
irgendeine störende
Primerverlängerung über den
repetitiven Bereich der Zielnukleinsäure hinaus stattfinden wird.
Diese Ausführungsform
der Erfindung ist dort besonders bevorzugt, wo zwei Allele einer
repetitiven Sequenz gleichzeitig untersucht werden.
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Gemäß dem zweiten
Aspekt der Erfindung ist in der zweiten Primerverlängerungsreaktion
ein Primerterminationsreagens enthalten, das einen markierten Nukleotidterminator
umfasst. Vorzugsweise wird der markierte Nukleotidterminator so
ausgewählt,
dass er komplementär
zu dem Nukleotid an dem 3'-Ende
des 3'-flankierenden
Bereichs der Zielnukleinsäure
ist, das an den repetitiven Bereich einer solchen Zielnukleinsäure angrenzt.
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C. Trennung von Primer
und Primerverlängerungsreagentien
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Zwischen
den ersten und zweiten Primerverlängerungsreaktionen wird ein
Trennschritt durchgeführt,
um ein Durchmischen des ersten und des zweiten Primerverlängerungsreagens
zu verhindern und um dadurch eine ungesteuerte Primerverlängerung zu
verhindern. Die zum Ausführen
des Trennschritts verwendeten Mittel können beliebige Mittel sein,
die dazu geeignet sind, das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid von dem ersten und/oder zweiten
Primerverlängerungsreagens
zu trennen. Beispielhafte Trennverfahren umfassen, aber sind nicht
beschränkt
auf HPLC, Elektrophorese, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion,
Adsorption und ähnliche.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
während
des Trennschritts so an einem festen Träger befestigt, dass die Primerverlängerungsreagentien
einfach durch Waschen des festen Trägers von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt werden können. Gemäß dieser
Ausführungsform
kann der Primer vor oder nach Durchführung der ersten Primerverlängerungsreaktion
an dem festen Träger
befestigt werden. Die Waschbedingungen sind derart, dass das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
nicht wesentlich beschädigt
wird, und eine unspezifische Adsorption der Primerverlängerungsreagentien
minimiert wird.
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D. Messen eines Signals
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Im
Anschluss an entweder die erste oder die zweite Primerverlängerungsreaktion
wird ein Detektionsschritt durchgeführt, bei dem die Menge an intakter
Markierung bestimmt wird, die in ein Primerverlängerungsprodukt eingebaut worden
ist. Jedes Nachweisverfahren kann verwendet werden, das für die Art
der verwendeten Markierung geeignet ist. Somit umfassen mögliche Nachweisverfahren
radioaktive Detektion, den Nachweis optischer Adsorption, z.B. Nachweis
von UV-VIS-Absorption, Nachweis optischer Emission, z.B. Fluoreszenz
oder Chemilumineszenz.
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Der
Messschritt kann in Abhängigkeit
von dem ausgeführten
Aspekt der Erfindung und der Zusammensetzung des ersten und zweiten
Primerverlängerungsreagens
an verschiedenen Punkten in dem Verfahren stattfinden. Beim ersten
Aspekt findet der Messschritt vorzugsweise statt, nachdem mit dem
Primerverlängerungsreagens,
das das markierte, verlängerbare
Nukleotid enthält,
umgesetzt worden ist und nachdem dieses von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid
abgetrennt wurde. Bei dem zweiten Aspekt findet der Messschritt
statt, nachdem mit dem Primerterminationsreagens, das den markierten
Nukleotidterminator enthält,
umgesetzt wurde und nachdem dieses von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt
wurde.
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E. Eine Markierung nicht-nachweisbar
machen
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Gemäß dem ersten
Aspekt des Verfahrens der Erfindung wird, sobald ein Signal von
einer Markierung nachgewiesen wird, die Markierung nicht-nachweisbar
gemacht, bevor ein nachfolgender Zyklus diskreter Primerverlängerung
durchgeführt wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Markierung nicht-nachweisbar gemacht, indem die Markierung
von dem in das Primerverlängerungsprodukt
eingebauten, markierten, verlängerbaren Nukleotid
abgespalten wird. Das zum Abspalten der Markierung von dem Nukleotid
verwendete Verfahren hängt
von der Art der spaltbaren Verknüpfung
ab, die verwendet wurde, um die Markierung und das Nukleotid zu
verbinden. Siehe oben. Beispielhafte Spaltungsreagentien umfassen
Thiol, Base, Periodat, Hydroxylamin und ähnliche. In einem bevorzugten
Verfahren wird die Markierung an einem Basenteil eines Uracilnukleotids
befestigt, und im Anschluss an die Detektion wird die Markierung
von dem markierten, verlänger baren
Nukleotid durch Behandlung mit dem Enzym Uracil-N-Glycosylase (UNG)
abgespalten.
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In
einer zweiten bevorzugten Ausführungsform
wird die Markierung durch Zerstören
der Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung selbst nicht-nachweisbar
gemacht. In Abhängigkeit von
der Art des verwendeten Labels gibt es mehrere Verfahren, die zum
Zerstören
der Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung verwendet werden
können.
Wenn die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist, kann die Markierung
z.B. durch Fotobleichung des Farbstoffs unter Verwendung einer intensiven
Lichtquelle in einer sauerstoffreichen Umgebung nicht-nachweisbar
gemacht werden. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann die Markierung
durch Umsetzen der Markierung mit einem irreversiblen Enzyminhibitor,
der das Enzym außer
Stande setzt, eine Signal-erzeugende Reaktion zu katalysieren, nichtnachweisbar
gemacht werden. Wenn die Markierung ein chemilumineszierendes Mittel
ist, das nur eine einzige Licht-erzeugende Umwandlung durchlaufen kann,
ist die Markierung selbst-zerstörend
und benötigt
folglich keine getrennte Reaktion, um die Markierung nicht-nachweisbar
zu machen (Bronstein).
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IV. KITS ZUM DURCHFÜHREN DES
VERFAHRENS
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Die
vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Kits zum Durchführen verschiedener Aspekte
und Ausführungsformen
der Verfahren der Erfindung. In einem ersten Aspekt umfassen Kits
der Erfindung einen Primer, ein erstes Primerverlängerungsreagens
und ein zweites Primerverlängerungsreagens,
wobei wenigstens eines von dem ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagens
ein verlängerbares
Nukleotid mit einer daran befestigten Markierung enthält. Vorzugsweise
kann die an dem verlängerbaren
Nukleotid befestigte Markierung in der Folge eines Behandlungsschritts,
der darin effektiv ist, die Markierung von einem Primerverlängerungsprodukt
abzuspalten und/oder die Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung
zu zerstören,
nicht-nachweisbar gemacht werden. Vorzugsweise ist der Primer an
einen festen Träger
gebunden oder er ist dazu befähigt, über ein
spezifisches Bindungspaar oder durch eine kovalente Verknüpfungsgruppe
an einen festen Träger
gebunden zu werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst dieser Aspekt der Erfindung einen Festphasenträger zur
Befestigung eines Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den
Primer oder über
die Zielnukleinsäure.
Optional enthalten die Kits des ersten Aspekts der Erfindung ein
Primerterminationsreagens.
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In
einem zweiten Aspekt umfassen die Kits der Erfindung einen Primer,
ein erstes Primerverlängerungsreagens,
ein zweites Primerverlängerungsreagens
und ein Primerterminationsreagens, wobei das Primerterminationsreagens
einen Nukleotidterminator mit einer daran befestigten Markierung
umfasst. Das zweite Primerverlängerungsreagens
und das Primerterminationsreagens können entweder getrennt oder
zusammen als eine Mischung abgepackt sein. Vorzugsweise ist der
Primer an einen festen Träger
gebunden, oder er ist dazu befähigt, über ein
spezifisches Bindungspaar oder über
eine kovalente Verknüpfungsgruppe
an einen festen Träger gebunden
zu werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst dieser Aspekt
der Erfindung einen Festphasenträger
zur Befestigung eines Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den
Primer oder über
die Zielnukleinsäure.
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Obwohl
oben nur wenige Ausführungsformen
im Detail beschrieben worden sind, werden gewöhnliche Fachleute in der Molekularbiologie
klar verstehen, dass in der bevorzugten Ausführungsform viele Modifikationen
möglich
sind, ohne von deren Lehren abzuweichen. Dementsprechend sollen
alle solchen Modifikationen im Umfang der nachfolgenden Patentansprüche eingeschlossen
sein.