DE4100279C2 - Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzermittlung - Google Patents
Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch FluoreszenzermittlungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unter
scheiden von Genen, insbesondere ein solches zum Unterschei
den von Genen durch Fluoreszenzmarkierungen.
Eine herkömmliche Gendiagnose ist das Verfahren des Restrik
tionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP = Restriction
Fragment Length Polymorphism). Eine genaue Beschreibung die
ser Diagnose ist z. B. in Bunseki (= Analyse) Nr. 7, 1986,
462-468 gegeben. Bei diesem Verfahren wird ein zu analysie
rendes Gen mit einem Enzym zerschnitten und mit Hilfe des
Agarosegels elektrophoretisch aufgetrennt. Dann wird sein
Muster auf einem Filter festgehalten. Das Filter wird in
eine Lösung mit einer DNA-Probe getaucht, die mit einem ra
dioaktiven Isotop markiert ist und eine besondere Sequenz
aufweist, so daß die Probe mit DNA-Fragmenten hybridisiert
werden kann, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu
derjenigen der Probe ist. Die DNA-Probe wird mit einem be
sonderen Band der DNA-Fragmente hybridisiert, die in einen
leiterähnlichen Zustand aufgetrennt wurden. Ein Film wird am
Filter angebracht, um das Muster des DNA-Bandes zu fixieren,
an das die DNA-Probe hybridisiert wird. Wenn ein besonderes
Enzym zum Zerschneiden der maßgeblichen DNA und einer beson
deren DNA-Probe verwendet wird, ist es möglich, ein Muster
(Fingerabdruck) zu erhalten, das für ein Individuum spezi
fisch ist. Außerdem ist es möglich, Information über eine
Erbkrankheit zu gewinnen. Für gewöhnlich wird dieses RFLP-
Verfahren ausgeführt, indem leiterähnliche Muster verwendet
werden, die durch eindimensionale Elektrophorese gewonnen
wurden. Es wurden jedoch auch Versuche ausgeführt, das In
formationsvolumen dadurch zu erhöhen, daß zweidimensionale
Elektrophorese eingesetzt wird. Dies ist im einzelnen von
A. G. Uitterlinden et al. in Proceedings of National Academy
of Science 86, 2742 (1989) beschrieben.
Statt Radioisotopen als Markierstoffen wurden auch Fluores
zenzstoffe beim RFLP-Verfahren verwendet, wie dies in Geno
mics 4, 129 (1989) im einzelnen beschrieben ist. Bei diesem
Versuch wird die Fluoreszenzmarkierungsfarbe mit dem Typ des
zum Schneiden verwendeten Restriktionsenzyms geändert. Die
DNA-Fragmente werden gleichzeitig auf einem Wanderungsstrei
fen voneinander getrennt und in Echtzeit gemessen.
Die Diagnosegenauigkeit mit dem RFLP-Verfahren hängt von der
Möglichkeit ab, inwieweit die Anzahl zu analysierender DNA-
Bänder erhöht werden kann. Eindimensionale Elektrophorese
hat den Nachteil, daß sie unzureichende Information liefert,
da beim Versuch, viele durch mehr als ein Enzym geschnittene
Fragmente zu erzeugen, um viele Bänder zu erhalten, es nicht
möglich ist, diese vielen Bänder voneinander zu trennen und
demgemäß nur verschmierte Muster erhalten werden. Dieselbe
Art von Problemen tritt auf, wenn Echtzeit-Fluoreszenzer
mittlung verwendet wird, wie in Genomics 4, 129 (1989) be
schrieben. Das bei diesem Verfahren verwendete Gerät ist da
zu in der Lage, DNA-Fragmente mit derselben DNA-Basensequenz
als Fragmente mit 400 Basen und 401 Basen voneinander zu un
terscheiden. Die DNA-Fragmente können jedoch nicht voneinan
der getrennt werden, wenn sich die Basensequenzen voneinan
der unterscheiden, da die Molekulargewichte derselben häufig
ziemlich voneinander verschieden sind. Darüber hinaus be
steht die Schwierigkeit, daß die Trennung um so schwieriger
wird, je länger eine Base ist, die ein Fragment aufweist, so
daß es nicht möglich ist, dieses Verfahren als RFLP-Verfah
ren einzusetzen, um Proben mit Fragmenten mit großer Basen
länge mit hoher Genauigkeit voneinander zu unterscheiden.
Andererseits erlaubt es die zweidimensionale Elektrophorese,
mehr Bänder zu analysieren, jedoch ist es bei diesem Verfah
ren erforderlich, ein Autoradiogramm für jede Probe zu un
tersuchen. Darüber hinaus ist es schwierig, Homologie und
Unterschiede festzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum
Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzermittlung anzuge
ben, mit dem es möglich ist, genaue Daten nach dem RFLP-Ver
fahren zu gewinnen, um die oben genannten Schwierigkeiten zu
überwinden.
Die Erfindung ist durch die Merkmale von Anspruch 1 gegeben.
Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegen
stand abhängiger Ansprüche.
Als unterschiedliche Gene, die mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluoreszenzer
mittlung voneinander unterschieden werden können, werden
z. B. Gene von unterschiedlichen Individuen verwendet, um
diese Individuen voneinander unterscheiden zu können, oder
Gene, von denen einige normal und andere so ausgebildet
sind, daß sie vermutlich eine genbedingte Krankheit verur
sachen, um dadurch Erbkrankheiten zu erforschen, oder Gene
von einem lndividuum.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Trennen von DNA-
Fragmenten ein- oder mehrdimensionale Gelelektrophorese ver
wenden.
Als Vorrichtung, die sich zum optischen Ermitteln von Diffe
renzen von Trennmustern von DNA-Fragmenten eignet, verwenden
Ausführungsbeispiele der Erfindung einen Echtzeit-Fluores
zenzdetektor, der einzelne Linien erkennt, oder einen ein-
oder zweidimensionalen Gelleser. Beim genannten optischen
Ermitteln von Unterschieden in Trennmustern werden die zu
untersuchenden DNA-Fragmente optisch so untersucht, wie sie
in einer Mischung vorliegen, wodurch von allen DNA-Fragmen
ten Fluoreszenz gleichzeitig an derselben Stelle abgestrahlt
wird. Das Fluoreszenzlicht wird dann durch Wellenlängenab
tastung ausgewertet, und dadurch erfolgt das Vergleichen der
Muster. Dieser Ablauf zeichnet sich durch hohe Genauigkeit
und einfache Ausführbarkeit aus.
Als Kombinationen eines Fluoreszenzstoffs und eines Anre
gungslasers, die beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar
sind, sind z. B. folgende Kombinationen möglich: FITC, des
sen Isomeres und ein 488-nm-Argonlaser; TRITC, Texasrot und
ein 515-nm-Argonlaser (oder ein 535-nm-YAG-Laser); der Phtha
locyanin-Al-Komplex (Al-Pc), dessen Isomeres und ein 633-nm-
He-Ne-Laser (oder ein 670-nm-Halbleiterlaser).
Dadurch, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren markierte DNA-
Fragmente von mehr als einem Gen, die spezifisch markiert
sind, in einer Mischung geschnitten, getrennt und dann op
tisch zum Auswerten von Unterschieden in Trennmustern unter
sucht werden, ist es möglich, Unterschiede in den Spektren
und zwischen zweidimensionalen Elektrophoresemustern genau
zu erfassen, die zu den genannten markierten DNA-Fragmenten
für mehr als ein Gen gehören. Dadurch können mit hohem Wir
kungsgrad und hoher Genauigkeit unterschiedliche Abschnitte
auf entsprechenden Genfragmenten festgestellt werden, selbst
wenn die Bänder in den Elektrophoresemustern der Gene der
Standardprobe oder der zu untersuchenden Gene nur unzurei
chend voneinander getrennt sind.
In den Figuren zeigt
Fig. 1 eine schematische Zeichnung zum Erläutern des Prin
zips des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Zusammenstellung
von Funktionsgruppen, wie sie bei erfindungsgemäßen Verfah
ren verwendet werden.
Anhand von Fig. 1 wird im folgenden prinzipiell ein erfin
dungsgemäßes Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch
Fluoreszenzermittlung beschrieben. Ein Standardprobengen 1
und ein zu untersuchendes Gen 2 (wobei es sich jeweils um
mehr als ein Gen handeln kann) werden mit einem geeigneten
Restriktionsenzym zerschnitten (üblicherweise ein Schneid
enzym wie NoT-I). Die aus dem Standardprobengen erhaltene
Gruppe von DNA-Fragmenten wird durch einen ersten Fluores
zenzstoff (F1) markiert. Genauer gesprochen wird ein mit F1
markiertes Oligonukleotid durch Ligation eingefügt, oder ein
mit F1 markiertes Desoxinukleotid wird durch Kettenerweite
rungsreaktion um die Schnittstellen in der oben genannten
DNA-Fragmentgruppe eingefügt. Darüber hinaus wird die Gruppe
der DNA-Fragemente von dem zu untersuchenden Gen mit einem
zweiten Fluoreszenzstoff (F2) auf dieselbe Weise wie vorste
hend angegeben markiert. Dabei werden die Längen der zwei
miteinander zu vergleichenden DNA-Fragmente mit einem Agens,
wie einem Linker, so eingestellt, daß ihre Nassen dieselben
sind. Dann werden die DNA-Fragmente der markierten Standard
probengene und die markierten zu untersuchenden Gene ge
mischt und anschließend mit einem Enzym (wie einem 4-Basen-
Schneidenzym), so wie sie in der Mischung 3 vorliegen, ge
schnitten. Schließlich werden sie einem Trennablauf durch
Elektrophorese unterworfen, wobei sie sich immer noch in der
Mischung befinden. Einige der DNA-Fragmente, die dieselbe
Folge aufweisen, erreichen den Ermittlungsabschnitt, indem
sie beinahe aufeinanderliegen. Es wird dann die Emission vom
ersten Fluoreszenzstoff in den DNA-Fragmenten 4 des Stan
dardprobengens und die Emission vom zweiten Fluoreszenzstoff
in den DNA-Fragmenten 5 vom zu untersuchenden Gen getrennt
voneinander empfangen, wobei der Verstärkungsfaktor des Ver
stärkers im Emissionsempfänger so eingestellt wird, daß die
Signale gleiche Intensität aufweisen. Ein Differenzsignal
entsteht demgemäß nur dann, wenn eines der DNA-Fragmente aus
dem Standardprobengen sich von einem Fragment aus dem zu un
tersuchenden Gen unterscheidet. Durch Ermitteln von Diffe
renzen zwischen den zwei Signalen ist es demgemäß mit gutem
Wirkungsgrad zuverlässig möglich, ein zu untersuchendes Gen
von einem Standardprobengen zu unterscheiden.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nun unter Bezug
nahme auf die Figuren genauer erläutert.
Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 wird als Standardpro
bengen 1 ein Gen einer gesunden Person verwendet. Als zu un
tersuchendes Gen 2 wird ein solches eines Patienten mit
einer Erbkrankheit verwendet. Diese Gene werden zunächst je
weils durch dasselbe Restriktionsenzym NoT-I zerschnitten,
um aus jedem Gen eine Gruppe von DNA-Fragmenten zu erhalten.
Dann wird die Fluoreszenz der Fragmente gemessen, und es er
folgt eine Einstellung in solcher Weise, daß sich die Fluo
reszenzintensitäten von den zu vergleichenden DNA-Fragment
gruppen wenig voneinander unterscheiden, so daß quasi die
Masse derselben in etwa zur Übereinstimmung gebracht wird.
Die DNA-Fragmentgruppe vom Standardprobengen wird mit dem
Fluoreszenzstoff 1 (F1) markiert, der eine Peakwellenlänge
von 680 nm von Al-Pc, d. h. vom Phthalocyanin-Aluminium-
Komplex aufweist. Getrennt davon wird die DNA-Fragmentgruppe
des zu untersuchenden Gens mit dem Fluoreszenzstoff 2 (F2)
markiert, der eine Peakwellenlänge von 710 nm eines Al-Pc-
Isomeren aufweist.
Die markierten DNA-Fragmente werden mit einer DNA-Kettener
weiterungsreaktion bearbeitet, was durch eine DNA-Polymerase
mit fluoreszenzstoffmarkierten Desoxinukleotiden oder durch
Einführen von mit den Fluoreszenzstoffen, Al-Pc markierten
Oligonukleotiden erfolgt, mit einer Ligationsreaktion in dem
durch das Enzym zerschnittenen Abschnitt.
Der Anteil der vorstehend genannten fluoreszenzstoffmarkier
ten Desoxinukleotide oder Oligonukleotide, der nicht rea
giert hat, wird dadurch entfernt, daß mit Ethanolausfällung
die sachdienliche Substanz ausgefällt wird und die Lösung
mit dem Teil, der nicht reagiert hat, verworfen wird. Eine
Meßprobe 3 wird dadurch erhalten, daß die markierte DNA-
Fragmentgruppe des Standardprobengens und diejenige des zu
untersuchenden Gens gemischt werden und dabei die Mengen der
beiden Probenlösungen so eingestellt werden, daß dann, wenn
die von den markierten DNA-Fragmenten emittierte Fluores
zenzstrahlung mit der jeweiligen Wellenlänge gemessen wird,
beide Fragmentgruppen im wesentlichen dieselbe Fluoreszenz
intensität liefern.
Während die genannte zu messende Probe 3 noch als Mischung
vorliegt, jedoch in den Zustand einer Basizität von 60 mM
versetzt, werden die DNA-Fragmente durch ein Restriktions
enzym Hae III, wie ein 4-Basen-Schneidenzym, in kleinere
Fragmente zerschnitten.
Mit Hilfe eines Elektrophoresegerätes für Ermittlung mehr
farbiger Fluoreszenz, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, wird
die Fluoreszenz für die Mischung aus der DNA-Fragmentgruppe
4 des Standardprobengens und der Gruppe 5 des zu untersu
chenden Gens gemessen, welche beiden Gruppen durch das oben
genannte Zerschneiden mit dem Enzym erhalten wurden. Diese
Mischung der DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens und
der Gruppe des zu untersuchenden Gens wird mit einem Dosie
rer 8 auf eine 0,3 mm dicke Trenn-Gelplatte 9 aus Polyacryl
amid an einer vorgegebenen Stelle aufgetropft, und sie wird
dann dem Einfluß von Elektrophorese unterworfen, damit die
mit F1 markierte DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens
und die mit F2 markierte Gruppe des zu untersuchenden Gens,
die beide in der genannten Mischung vorliegen, entsprechend
ihrer Molekulargewichte voneinander getrennt werden können.
Beim Ausführungsbeispiel wird die Fluoreszenz in Echtzeit
während der Trennung durch Elektrophorese gemessen. Konkret
wird hierzu ein Laserstrahl 12 verwendet, der von einem
He-Ne-Laser 10 mit 10 mW Leistung, hergestellt von Nippon
Denki Kabushiki-Kaisha, ausgestrahlt wird und durch einen
Spiegel 11 auf eine Stelle etwa 25 cm vom Startpunkt der
Elektrophorese entfernt auf eine Seite der oben genannten
Gelplatte gelenkt wird. Ein Fluoreszenzstrahl, wie er emit
tiert wird, wenn ein fluoreszenzstoffmarkiertes DNA-Fragment
den Laserstrahl kreuzt, wird durch ein Bildteilerprisma 13
und ein Bandpaßfilter 14 gelenkt und von einem Emissionsem
pfänger 15 empfangen, der als zweidimensionaler Detektor
oder als Sensor für zwei Fluoreszenzlinien wirkt. Ein Über
wachungsgerät 19 nimmt das Bild des Fluoreszenzstrahls mit
zwei Linien auf, wobei die eine Linie der Markierung F1 der
genannten DNA-Fragmentgruppe des Standardprobengens und die
andere der Markierung F2 des genannten DNA-Fragments vom zu
untersuchenden Gen entspricht. Das Bandpaßfilter 14 zum Aus
filtern von Licht unterschiedlicher Wellenlängen, wie es an
der Lichtaustrittsseite des Bildteilerprismas 13 angebracht
ist, erlaubt es, die Emissionen von den zwei genannten Fluo
reszenzstoffmarkierungen F1 und F2 getrennt zu erfassen. Das
Ergebnis dieser getrennten Erfassung wird über eine Anzeige
18 ausgegeben.
Wie in Fig. 1 dargestellt, liefern DNA-Fragmentgruppen vom
Standardprobengen und vom zu untersuchenden Gen, die sich
nicht voneinander unterscheiden, keine unterschiedlichen
Spektren. Andere Fragmente, die sich unterscheiden, führen
jedoch zu Differenzspektren, die durch positive oder nega
tive Signale repräsentiert sind. Auf diese Weise wird Infor
mation für den Unterschied zwischen den oben genannten bei
den Genen erhalten. Wenn es erforderlich ist, das Molekular
gewicht der Probe genau zu bestimmen, wird wie folgt vorge
gangen. Es wird eine Molekulargewichtsmarkier-DNA mit einem
Fluoreszenzstoff F3 markiert, der sich von F1 und F2 unter
scheidet. Das Bildteilerprisma wird so ausgebildet, daß es
drei Lichtaustrittsseiten aufweist. Das Fluoreszenzlicht von
F3 wird durch ein Bandpaßfilter geschickt, die Fluoreszenz
strahlung wird empfangen, und sie wird dazu verwendet, ein
Bezugssignal zum Auffinden des Molekulargewichts zu liefern.
Durch Erhöhen der Anzahl aufgespalteter Bilder ist es auch
möglich, gleichzeitig mehrere Proben zu untersuchen.
In Fig. 1 bezeichnet ein Bezugszeichen 6 das Spektrum einer
DNA-Fragmentgruppe von einem Standardprobengen, und ein Be
zugszeichen 7 bezeichnet das entsprechende Spektrum für eine
DNA-Fragmentgruppe eines zu untersuchenden Gens. In Fig. 2
bezeichnet ein Bezugszeichen 16 eine Steuerung und ein Be
zugszeichen 17 einen Computer.
Beim oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird ein Laser
strahl auf eine Seitenfläche der Gelanordnung in einem Meß
abschnitt gerichtet, und Fluoreszenz wird durch einen zwei
dimensionalen Detektor empfangen. Es kann jedoch auch ein
Laserstrahl auf die Front der Gelanordnung gerichtet werden
und so gesteuert werden, daß er die Einstrahlfläche abra
stert. Die Fluoreszenz wird durch mindestens zwei Photover
vielfacher empfangen, die mit einem Filter ausgestattet
sind.
Statt Echtzeitmessung ist es auch möglich, nach der Elektro
phorese einen Laserstrahl auf die Gelplatte zu richten, um
ein zweidimensionales Bild zum Erhalten von Daten aufzuneh
men, oder die Gelplatte mit einem Liniensensor abzurastern,
um Daten zu erhalten, oder eine Gelvorrichtung mit einer
Lampe zu bestrahlen, um Musterinformation zu gewinnen.
Da beim erfindungsgemäßen Verfahren mehrere miteinander zu
vergleichende DNA-Fragmente in einer Mischung durch ein En
zym zerschnitten werden und einer Fluoreszenzmessung unter
worfen werden, um Unterschiede in Mustern zwischen verschie
denen einander entsprechenden DNA-Fragmenten festzustellen,
ist es möglich, Störsignale zu eliminieren, wie sie beim
Messen durch Unterschiede beim Schneiden oder bei der Elek
trophorese des mehr als einen zu unterscheidenden Fragments
bedingt sind. Dadurch kann mit gutem Wirkungsgrad und hoher
Genauigkeit der Unterschied zwischen Genen unabhängig von
großer Ähnlichkeit zwischen ihren DNA-Basen-Folgen festge
stellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren weist daher
hohen Wirkungsgrad zum Vergleichen von DNA-Fragmenten aus
Genen von Patienten mit einer bestimmten Erbkrankheit von
Fragmenten aus Genen gesunder Personen auf, was es ermög
licht, den Abschnitt in einem Gen einzugrenzen, der die gen
bedingte Krankheit verursacht. Darüber hinaus ist es mit
diesem Verfahren auch möglich, eine DNA-Fragmentgruppe mit
bekannter Basenlänge als Standard zu verwenden und die Grup
pe zusammen mit einer DNA-Fragmentgruppe eines zu untersu
chenden Gens in einem Zustand, in dem beide gemischt sind,
wandern zu lassen und die Tatsache zu nutzen, daß DNA-Frag
mente mit derselben Basenlänge übereinander liegen. Dadurch
ist es möglich, die Basenlänge der DNA eines zu untersuchen
den Gens genau festzustellen.
Das Verfahren läßt sich nicht nur zum Unterscheiden zweier
Gene in unterschiedlichen Personen verwenden, sondern auch
zum Unterscheiden von mehr als zwei Genen, wozu es lediglich
erforderlich ist, mehr Stoffe zur Farbmarkierung zu verwen
den.
Claims (6)
1. Verfahren zum Unterscheiden von Genen durch Fluores
zenzermittlung, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- i) Zerschneiden mehrerer voneinander zu unterscheidender Gene (1, 2) mit demselben Enzym;
- ii) Markieren jedes der in Schritt (i) erhaltenen DNA- Fragmente mit einem Fluoreszenzstoff (F1, F2), der jeweils einem der mehreren Gene zugeordnet ist;
- iii) Herstellen einer Mischung (3) der in Schritt (ii) be arbeiteten DNA-Fragmente;
- iv) Zerschneiden der DNA-Fragmente, so wie sie in der Mi schung vorliegen, mit einem Enzym;
- v) Voneinandertrennen der DNA-Fragmente (4, 5), die in Schritt (iv) bearbeitet wurden und noch miteinander gemischt sind; und
- vi) optisches Feststellen von Unterschieden in den ge trennten Mustern (6, 7) der voneinander getrennten DNA-Frag mente, um voneinander die Gene zu unterscheiden, die aus den DNA-Fragmenten bestanden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die mehreren voneinander zu unterscheidenden Gene (1, 2) von
unterschiedlichen Personen herrühren.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Fragmente durch ein- oder mehr
dimensionale Gelelektrophorese voneinander getrennt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß das optische Ermitteln mit Hilfe eines
Echtzeit-Fluoreszenzdetektors ausgeführt wird, der Fluores
zenzlinien erfassen kann.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß zum optischen Ermitteln ein ein- oder
zweidimensionaler Gelleser verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das optische Ermitteln dadurch ausge
führt wird, daß Fluoreszenzlicht, das zur selben Zeit vom
selben Ort ausgestrahlt wird, nach der Wellenlänge ausge
wertet wird.
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