DE69720763T2

DE69720763T2 - Sätze von, mit fluoreszierenden energieübertragungsverbindungen, markierten primern und deren verwendung in mehrkomponentenanalyse

Info

Publication number: DE69720763T2
Application number: DE69720763T
Authority: DE
Inventors: Jingyue Ju
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: WO1998031834A1; DE69720763D1; US5814454A; CA2275139A1; ATE236996T1; US5952180A; EP0943019A1; US5804386A; AU5602298A; EP0943019B1; JP2001509271A

Description

Fachgebiet
Das Gebiet der Erfindung ist das fluoreszierender Markierungen, im Speziellen von fluoreszenzmarkierten Primern zur Verwendung in DNA-Sequenzierungsverfahren.
Hintergrund der Erfindung
Fluoreszierende Markierungen werden in einer Vielzahl von biologischen, chemischen, medizinischen und biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Ein Beispiel dafür ist das Sequenzieren von Polynucleotiden, insbesondere die automatisierte DNA-Sequenzierung, die für großtechnische DNA-Sequenzierungsprojekte, wie z. B. das "Human Genome Project", zunehmend von Bedeutung wird.
Bei Verfahren zur automatisierten DNA-Sequenzierung werden unterschiedlich große, markierte DNA-Fragmente, die nach jeder Base in der Sequenz enden, enzymatisch hergestellt, indem die zu sequenzierende DNA als Templat verwendet wird. Jede Gruppe von Fragmenten, die einer Termination an einer der vier markierten Basen entsprechen, sind mit derselben Markierung markiert. Somit werden die auf A endenden Fragmente mit einer ersten Markierung markiert, während die auf G, C und T endenden jeweils mit einer zweiten, dritten und vierten Markierung markiert werden. Die markierten Fragmente werden dann in einem Elektrophoresemedium größengetrennt, und es wird ein Elektropherogramm erstellt, aus dem die DNA-Sequenz bestimmt wird.
Nachdem die Verfahren zur automatisierten DNA-Sequenzierung immer fortschrittlicher geworden waren, gilt ein gesteigertes Interesse der Verwendung von Sätzen von Fluoreszenzmarkierungen, wobei alle Markierungen mit einer gemeinsamen Wellenlänge angeregt werden und dennoch eines von vier unterschiedlichen detektierbaren Signalen aussenden, eines für jede der vier unterschiedlichen Basen. Solche Markierungen bringen eine Reihe an Vorteilen mit sich, wie z. B. stark fluoreszierende Signale und die Fähigkeit, sämtliche markierte Fragmente elektrophoretisch in einer einzigen Spur eines Elektrophoresemediums zu trennen, wodurch Probleme im Zusammenhang mit Mobilitätsschwankungen zwischen verschiedenen Spuren vermieden werden.
Obwohl bereits solche Sätze von Markierungen zur Verwendung bei automatisierten DNA-Sequenzierungsverfahren entwickelt worden sind, sandten die unterschiedlich markierten Elemente solcher Sätze bislang jeweils eine unterschiedliche Wellenlänge aus. Herkömmliche automatisierte Detektionsvorrichtungen, die gegenwärtig in Verfahren eingesetzt werden, bei denen alle der enzymatisch hergestellten Fragmente oder Primerverlängerungsprodukte in derselben Spur aufgetrennt werden, müssen also vier unterschiedliche Wellenlängen von emittiertem Fluoreszenzlicht detektieren können. Diese Anforderung kann sich als unerwünschte Einschränkung erweisen. Genauer gesagt erhöht das gleichzeitige Sequenzieren einer großen Zahl unterschiedlicher DNA-Template die Anzahl an unterschiedlichen Fragmenten sowie an erforderlichen entsprechenden Markierungen. Ebenso bedarf es einer Verringerung der Komplexität der Detektionsvorrichtung, z. B. wird eine Vorrichtung, die unter Lichtdetektion bei lediglich zwei Wellenlängen betrieben werden kann, bevorzugt.
Aus diesem Grund wäre es wünschenswert, Sätze von fluoreszierenden Markierungen zu entwickeln, die vier unterschiedliche Signale bereitstellen können, bei denen die Anzahl der den vier unterschiedlichen Signalen zugeordneten Wellenlängen geringer ist, als die Anzahl der unterschiedlichen Markierungen; z. B. wenn vier unterschiedliche Markierungen Signale liefern, die emittiertes Licht mit ein bis zwei Wellenlängen umfassen. Mit solchen Sätzen könnte man entweder (1) die Komplexität von automatisierten Detektionsvorrichtungen verringern, oder (2) die Leistungsfähigkeit von Vorrichtungen, die vier unterschiedliche Wellenlängen detektieren können, erhöhen, wodurch ein gleichzeitiges Sequenzieren von zwei DNA-Templaten oder derselben zweisträngigen Template vom 5'- sowie vom 3'-Ende ermöglicht wird.
Relevante Literatur
DNA-Sequenzierung wird von Griffin & Griffin, Appl. Biochem. Biotechnol. 38, 147–159 (1993), besprochen. Fluoreszenzenergieübertragungs-Markierungen und ihre Verwendung in DNA-Sequenzierungsanwendungen werden von Ju et al., Nucleic Acids Res. 24, 1144–1148 (1996), Ju et al., Proc. Nat. Med. 2, 246–249 (1996), Ju et al., Anal. Biochem. 231, 131–140 (1995), Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4347–4351 (1995), beschrieben. Die Verwendung von Fluoreszenzenergieübertragungs-Markierungen in Mehrkomponentenanalyse-Anwendungen, die nicht der DNA-Sequenzierung dienen, werden von Wang et al., Anal. Chem. 67, 1197–1203 (1995), Ziegle et al., Genomics 14, 1026–1031 (1992), und Repp et al., Leukemia 9, 210–215 (1995), erläutert. Weitere Literaturverweise, in denen Mehrkomponentenanalyse-Anwendungen besprochen werden, umfassen Schena et al., Science 270, 467–469 (1995).
Andere Literaturverweise von Interesse sind die US-Patente 4.996.143 und 5.326.692 sowie Glazer and Streyer, Biophys. J. 43, 383–386 (1983), Huang et al., Anal. Chem. 64, 2149–2154 (1992), Proben et al., Science 336–341 (1987), Smith et al., Nature 321, 674–679 (1986), Lu et al., Chromat. A 680, 497–501 (1994) und Ansorge et al., Nucleic Acids Res. 15, 4593–4603 (1987).
In der JP-A-5-060698 wird ein Verfahren zur Didesoxysequenzierung mittels vierer Primen (z. B. einer für jede unterschiedliche Base) vorgesehen, bei dem auf jedem Primen dasselbe Paar von Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzenergieübertragungs-Markierungen verwendet wird, worin der Abstand zwischen den Markierungen bei jedem Primen unterschiedlich ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Sätze von fluoreszierenden Markierungen, im Besonderen markierte Primen, sowie Verfahren für ihre Verwendung in der Mehrkomponentenanalyse bereitgestellt.
Insbesondere sieht die Erfindung einen Satz aus vier fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidprimern vor, worin drei der Oligonucleotidprimer ein gemeinsames Donor-Fluorophor "A" und Akzeptor-Fluorophor "B" in Energieübertragungsbeziehung aufweisen und um unterschiedliche Abstände voneinander getrennt sind, so dass frei unterscheidbare Fluoreszenzsignale ausgesandt werden, und der vierte Primer zwei Donor-Fluorophore "A" aufweist, so dass ein Fluoreszenzsignal ausgesandt wird, das sich von den drei unterscheidbaren Fluoreszenzsignalen unterscheidet.
Die gemeinsamen Donor- und Akzeptor-Fluoreszenskomponenten in Energieübertragungsbeziehung sind durch unterschiedliche Abstände voneinander getrennt, so dass die Markierungen nach Anregung mit einer gemeinsamen Lichtwellenlänge unterscheidbare Fluoreszenzsignale aufweisen. Die Sätze von Markierungen finden in verschiedenen Anwendungen, für die mehrere unterscheidbare Fluoreszenzmarkierungen notwendig ist, Verwendung, speziell als Primen in enzymatischen Nucleinsäuresequenzierungsanwendungen. Primen mit den gleichen Markierungen, die unterscheidbare Emissionsmuster erzeugen, können hergestellt werden, da die Energieübertragung zwischen Akzeptor- und Donor-Fluorophoren eine Funktion des Abstands zwischen dem Akzeptor und dem Donor in der Markierung ist. Durch eine Veränderung des Abstands werden unterschiedliche Fluoreszenz-Emissionsmuster erzeugt.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt das allgemeine Markierungskonzept unter Verwendung vierer fluoreszierender Moleküle, um zumindest acht Fluoreszenzfarbstoff-markierte Primen mit unterscheidbaren Fluoreszenz-Emissionmustern zu erzeugen.
2 veranschaulicht die Struktur der vier Primen, die mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, und zwar 6-Carboxyfluorescein (FAM, F) als Donor und 6-Carboxyrhodamin (ROX, R) als Akzeptor. Die Zahl in der Primerbezeichnung gibt die dazwischenliegenden Nucleotide zwischen Donor und Akzeptor an.
3 zeigt, dass das Fluoreszenzsignal der vier fluoreszierenden Primen ausreichend unterschiedlich ist, um für vier Nucleotide T (F6R), G (F13R), A (F16R) und C (F16F) zu kodieren. Ebenso wird gezeigt, dass der Primen F16T, der 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA, T) als Ersatz für ROX (R) als Akzeptor enthält, nahezu die gleiche Fluoreszenzsignalintensität wie F (blau) und T (schwarz) aufweist. Die gezeigten Fluoreszenzsignale sind die Elektropherogramme der Einzelbasenverlängerungsgfragmente jedes Primers, die mittels ABI-Vierfarben-Fluoreszenz-377-DNA-Sequenzer, der über geeignete Filter zur Detektion von Fluoreszenzsignalen von FAM (F λ_em(max) = 525 nm), ROX (R λ_em(max) = 605 nm) und TAMRA (T λ_em(max) = 580 nm) besitzt, erhalten wurden.
4 veranschaulicht, dass die Fluoreszenzintensität der Einzelbasenverlängerungsfragmente von Primen F6R (T-Fragmente) und F13R (G-Fragmente) aufgrund der Energieübertragung von F zu R weitaus höher ist als die von Einzelbasenfragmenten mit Primen R15R (T-Fragmente) erzeugte, der zwei ROX-Farbstoffe enthält, aber dieselbe Sequenz wie F6R und F13R aufweist. Im Vergleich wurde dieselbe Konzentration des Primers sowie anderer Sequenzierungsreagenzien verwendet.
5 zeigt einen kleinen Abschnitt der Rohsequenzierungsdaten in Zweifarbendarstellung (FAM, F λ_em(max) = 525 nm, blau; ROX, R λ_em(max) = 605 nm, rot), die durch die Primen F6R (T), F13R (G), F16R (A), F16F (C) und einen cDNA-Klon mit einem Poly-A-Schwanz am 3'-Ende erzeugt wurden. Die Sequenzen können nach den Farbmustern jedes Peaks benannt werden.
6 zeigt einen großen Abschnitt der Rohsequenzierungsdaten (von Nukleotid 30 bis 130) in Zweifarbendarstellung (FAM, F λ_em(max) = 525 nm, blau; ROX, R λ_em(max) = 605 nm, rot), die durch die Primen F6R (T), F13R (G), F16R (A), F16F (C) und einen cDNA-Klon mit einem Poly-A-Schwanz am 3'-Ende erzeugt wurden. Die Sequenzen können nach den Farbmustern jedes Peaks benannt werden. Mittels des Thermo Sequenzee Kits (Amersham LIFE SCIENCE) wurden Proben hergestellt und diese dann in einem ABI-377-DNA-Sequenzen mit virtuellem Filter A laufen gelssen, der Fluoreszenzsignale von FAM und ROX detektiert.
7 ist eine schematische Darstellung des enzymatischen Sanger-DNA-Sequenzierungsverfahrens.
DEFINITIONEN
Der Begriff "fluoreszierende Markierung" oder "Fluoreszenzmarkierung" bezieht sich auf eine Verbindung, die zumindest ein an ein Polymer gebundenes Fluorophor enthält.
Der Begriff "Energieübertragungs-Fluoreszenzmarkierung" verweist auf eine Verbindung mit zumindest zwei Fluorophoren in Energieübertragungsbeziehung, wobei die Fluorophore an eine Spacerkomponente, z. B. eine Polymergruppierung, gebunden sind, die die zwei Fluorophore durch einen gewissen Abstand trennt.
Die Begriffe "enzymatische Sequenzierung", "Sanger-Verfahren", "Didesoxy-Verfahren" und "Kettenterminator-Verfahren" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Verfahren der DNA-Sequenzierung zu beschreiben, das nach seinem Hauptentwickler, F. Sangen, benannt ist. Das Verfahren benutzt ein einstrangiges DNA-Templat, einen kurzen DNA-Primer und ein Polymerase-Enzym, um einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Der Primen wird zuerst an das einstrangige Templat anneliert, und das Reaktionsgemisch wird dann in vier aliquote Teile geteilt und Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) plus ein Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) werden hinzugegeben, so dass jedes der Röhrchen ein unterschiedliches ddNTP aufweist. Die Polymerase inkorporiert ein ddNTP gegenüber seiner Komplementärbase in das Templat, wobei jedoch keine weiteren dNTPs hinzugefügt werden können, da das ddNTP keine 3'-Hydro xylgruppe besitzt. Das Verhältnis von ddNTP zu dNTP ist so gestaltet, dass die Polymerase die wachsende DNA-Kette an allen Positionen, an denen das ddNTP insertiert werden kann, terminiert und somit ein Satz aus Fragmenten (d. h. Primerverlängerungsprodukten) ausgebildet wird, die alle ein gemeinsames Ende, den Primen, aufweisen. Die Fragmente werden so markiert, dass, wenn die vier Reaktionsgemische Elektrophorese mittels eines Polyacrylamid-Gels unterzogen werden, eine) Gel-Bandenmuster oder -leiter ausgebildet wird, aus dem/der die DNA-Sequenz direkt abgelesen werden kann. Dieser Prozess ist in 7 schematisch dargestellt.
Der Begriff "enzymatisch hergestellt" bedeutet, dass ein Produkt zumindest teilweise als Resultat von Enzymeinwirkung entstanden ist, z. B. Nucleotidfragmente werden erzeugt, wenn ein Enzym eine Reaktion katalysiert, wobei die größeren Sequenzen in zwei oder mehrere Fragmente aufgespalten werden.
Der Begriff "Primen" soll eine Polymersequenz bezeichnen, die komplementär ist und an einen Teil einer Sequenzierung unterzogenen, einstrangigen Nucleotidsequenz hybridisieren kann, wobei der Primen dazu verwendet wird, in vitro DNA-Synthese zu initiieren.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Sätze aus Fluoreszenzmarkierungen, im Besonderen Sätze aus fluoreszenzmarkierten Primern, und Verfahren für ihre Verwendung in Mehrkomponentenanalyse-Anwendungen, insbesondere enzymatische Nucleinsäure-Sequenzierungsanwendungen, werden in Einklang mit den nachfolgenden Ansprüchen bereitgestellt. In der weiteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden zuerst die Sätze detaillierter dargestellt, und danach folgt eine Erläuterung der Verfahren für ihre Verwendung in Mehrkomponentenanalyse-Anwendungen.
Bevor die vorliegende Erfindung genauer beschrieben wird, ist zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf die unten dargestellten, speziellen Ausführungsformen der Erfindung beschränkt ist, da Abwandlungen der jeweiligen Ausführungsformen erfolgen können und diese immer noch in den Schutzumfang der nachfolgenden Ansprüche fallen. Es ist also zu verstehen, dass die verwendete Terminologie für die Beschreibung der jeweiligen Ausführungsformen herangezogen wurde, und nicht einschränkend aufzufassen ist. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird stattdessen in den nachfolgenden Ansprüchen dargestellt.
Es muss festgestellt werden, dass die Singularformen "ein/eine" sowie "der/die/das" auch den Plural umfassen, wenn im Kontext nicht eindeutig nur der Singular angesprochen sein kann. Falls nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe, dieselbe Bedeutung, wie sie im Allgemeinen von Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung verstanden wird.
Die vorliegenden Sätze aus fluoreszierenden Markierungen umfassen eine Vielzahl von unterschiedlichen Arten von Markierungen, worin jede Markierungsart in einem Satz ein von anderen Markierungsarten in andere Sätzen unterscheidbares Fluoreszenzsignal erzeugen kann. Die Markierungen in den unterschiedlichen Sätzen senden unterschiedliche Signale aus, vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, auf Anregung mit einer gemeinsamen Anregungswellenlänge. Für DNA-Segzuenzierungsanwendungen umfassen die Sätze, wie oben definiert, normalerweise vier Primen.
Die von den Primern erzeugten unterscheidbaren Signale umfassen zumindest die Intensität von ausgesandtem Licht mit ein oder zwei Wellenlängen. Vorzugsweise umfassen die erzeugten unterscheidbaren Signale unterscheidbare Fluoreszenzemissionsmuster, die durch Auftragen der Intensität von durch unterschiedlich große Fragmente emittiertem Licht mit zwei Wellenlängen im Zeitverlauf erstellt werden, da sich unterschiedlich markierte Fragmente relativ zu einem Detektor bewegen. Diese Muster sind in der Technik als Elektropherogramme bekannt. Bei Analysen, die nicht auf Elektrophorese beru hen, wie z. B. Analysen auf Mikroarray-Chip-Basis, können unterschiedliche Targets, die mit einer spezifischen Markierung gekennzeichnet sind, durch die einzigartigen Fluoreszenzmuster voneinander unterschieden werden. Bei einer Markierungsart eines Satzes kann beispielsweise die Intensität des emittierten Lichts mit einer ersten Wellenlänge zweimal so hoch sein wie die Intensität des emittierten Lichts mit einer zweiten Wellenlänge, und bei einer zweiten Markierung kann die Größenordnung der Lichtemissionsintensitäten der zwei Wellenlängen umgekehrt sein, oder Licht kann nur mit einer Wellenlänge ausgesandt werden. Die unterschiedlichen Muster entstehen durch den unterschiedlichen Abstand zwischen Donor und Akzeptor. Aus diesem Grund sind die von jeder dieser Markierungen ausgesandten Muster voneinander unterscheidbar.
Die vorliegenden Sätze umfassen üblicherweise ein Akzeptor-Fluorophor und zumindest ein Donor-Fluorophor in Energieübertragungsbeziehung, wobei solche Markierungen komplexere Konfigurationen, wie z. B. mehrere Donoren und/oder mehrere Akzeptoren, z. B. Donor 1, Akzeptor 1 und Akzeptor 2, aufweisen können. Entscheidend bei den Sätzen ist, dass drei der Markierungen der Sätze dieselben Donor- und Akzeptor-Fluorophore besitzen und der einzige Unterschied zwischen den Markierungen der Abstand zwischen diesen gemeinsamen Akzeptor- und Donor-Fluorophoren ist. Somit wird in Markierungssätzen, in welchen drei Markierungen einen einzigen Donor und einen einzigen Akzeptor umfassen, zumindest eine der Energieübertragungsmarkierungen ein Donor- und ein Akzeptor-Fluorophor in Energieübertragungsbeziehung besitzen, die durch einen Abstand x getrennt sind, und zumindest eine der Energieübertragungsmarkierungen dieselben Donor- und Akzeptor-Fluorophore in Energieübertragungsbeziehung besitzen, die durch einen unterschiedlichen Abstand y getrennt sind, worin die Abstände x und y unterschiedlich genug sind, um auf Anregung unterscheidbare Fluoreszenz-Emissionsmuster derselben Wellenlänge, wie oben beschrieben, auszusenden. Eine dritte Markierung wird dieselben Donor- und Akzeptor-Fluorophore wie die erste und die zweite Markierung aufweisen, und der Abstand z zwischen dem Donor- und Akzeptor-Fluorophor ist unterschiedlich genug von x und y, um sicherzustellen, dass die dritte Markierung ein von der ersten und der zweiten Markierung unterscheidbares Fluo reszenz-Emissionsmuster erzeugen kann. In einem spezifischem Markierungssatz kann somit eine Vielzahl von Markierungen mit denselben Donor- und Akzeptor-Fluorophoren gegeben sein, wobei sich die Markierungen lediglich durch die Abstände zwischen den Donor- und Akzeptor-Fluorophoren unterscheiden. Um sicherzustellen, dass unterschiedliche Arten von Markierungen eines Satzes mit gemeinsamen Donor- und Akzeptor-Fluorophoren unterscheidbare Fluoreszenz-Emissionsmuster hervorrufen, unterscheiden sich die Abstände zwischen Donor- und Akzeptor-Fluorophoren um zumindest etwa 5%, üblicherweise um zumindest etwa 10% und insbesondere um zumindest etwa 20%, und liegen im Allgemeinen in einem Bereich zwischen etwa 4 und etwa 200 Å, vorzugsweise zwischen etwa 12 und etwa 100 Å und im Besonderen zwischen etwa 15 und etwa 80 Å, wobei die minimalen Abstände auf Basis derzeit verfügbarer Detektionsvorrichtungen bestimmt wurden und verringert werden können, wenn empfindlichere Detektionstechnologie entwickelt wird und dadurch mehr unterschiedliche Markierungen erzeugt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst zumindest ein Teil, bis zu und einschließlich aller, der Markierungen eine Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponente in Energieübertragungsbeziehung, die kovalent an eine Spacerkomponente gebunden sind, d.h. Energieübertragungsmarkierungen. Somit kann ein Satz aus einer Vielzahl von Markierungen vorliegen, bei welchem drei der Markierungen obige Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten und der Rest der Markierungen eine einzige Fluoreszenzkomponente umfassen. Vorzugsweise umfassen jedoch alle Markierungen eine Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponente. Im Allgemeinen wird bei einem Ein-Donor- und Ein-Akzeptor-Energieübertragungssystem, wenn ein Satz n Arten von Energieübertragungsmarkierungen umfasst, die Anzahl an unterschiedlichen Akzeptor-Fluorophoren in den Energieübertragungsmarkierungen n-1 nicht überschreiten. Wenn also die Anzahl an unterschiedlichen Energieübertragungsmarkierungen im Satz vier ist, werden nicht mehr als drei, und im Allgemeinen nicht mehr als zwei, unterschiedliche Akzeptor-Fluorophore vorhanden sein.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind zusätzliche Kombinationen von Markierungen möglich. In einem Satz von Markierungen könnten zwei der Markierungen Energieübertragungsmarkierungen sein, die gemeinsame Donor- und Akzeptor-Fluorophore, getrennt durch unterschiedliche Abstände aufweisen, und die restlichen Markierungen könnten zusätzliche Energieübertragungsmarkierungen mit anderen Donor- und/ oder Akzeptor-Fluorophoren, Fluoreszenzmarkierungen, die keine Energie übertragen, und dergleichen sein.
Die Spacerkomponente der Energieübertragungsmarkierungen der Sätze, an die die Fluoreszenzkomponenten kovalent gebunden sind, ist üblicherweise eine Polymerkette oder eine andere chemische Gruppierung, die als Spacer für die Donor- und Akzeptor-Fluorophor-Komponenten dienen kann, wie z. B. eine starre chemische Gruppierung, worunter beispielsweise Chemikalien mit zyklischen Ringen oder Kettenstrukturen fallen, die den Donor und den Akzeptor trennen können und auch in eine aktive Gruppe eingebaut werden können, um diese an zu analysierenden Targets anbringen zu können, wobei die Spacerkomponente im Allgemeinen eine Polymerkette ist und die Fluoreszenzkomponenten kovalent über Linkergruppen an Monomereinheiten der Kette gebunden sind, wobei diese Monomereinheiten der Kette durch mehrere monomere Elemente, deren Anzahl ausreicht, um eine Energieübertragung von den Donor- zu den Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten zu ermöglichen, getrennt sind. Die Polymerketten sind im Allgemeinen entweder Polynucleotide, Analoge oder Mimetika davon, oder Peptide, Peptid-Analoge oder Mimetika davon, wie z. B. Peptoide. Bei Polynucleotiden, Polynucleotid-Analogen oder Mimetika davon, umfasst die Polymerkette im Allgemeinen Zuckerkomponenten, die an eine heterozyklische stickstoffhältige Base, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil etc., kovalent gebunden sein können oder auch nicht, und durch eine Linkergruppe gebunden sind. Die Zuckerkomponenten sind im Allgemeinen fünfgliedrige Ringe, z. B. Ribose, oder sechsgliedrige Ringe, z. B. Hexose, wobei fünfgliedrige Ringe, wie z. B. Ribose, bevorzugt sind. Eine Anzahl an unterschiedlichen Zuckerlinkergruppen kann verwendet werden, wie beispielsweise Phosphodiester, Thiophosphat, Methylen(methylimino) (MMI), Methophosphonat, Phosphoramadit, Guanidin und dergleichen (siehe Matteucci & Wagner, Nature Supp. 84, 20–22 (1996)). Peptide, Peptid-Analoge und Mimetika davon, die sich zur Verwendung als polymerer Spacer eignen, umfassen Peptoide, wie in der WO 91/19735 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, wobei die einzelnen monomeren Elemente, die durch Amid-Bindungen verbunden sind, an eine heterozyklische stickstoffhältige Base, z. B. Peptid-Nucleinsäure, gebunden sein können oder nicht (siehe Matteucci & Wagner oben). Im Allgemeinen bestehen die polymeren Spacerkomponenten der vorliegenden Markierungen aus Peptid-Nucleinsäure, Polyzuckerphosphat, wie in den in der PCT/US 96/13134 beschriebenen Energieübertragungskassetten, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, und Polynucleotiden wie in der PCT/US 95/01205 dargestellt, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Sowohl Donor- als auch Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten der vorliegenden Markierungen sind über eine Linkergruppe kovalent an die Spacerkomponente, z. B. die polymere Spacerkette, gebunden. Die Linkergruppe kann sehr unterschiedlich sein und ist für diese Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Die Linkergruppen können aliphatisch, alizyklisch, aromatisch oder heterzyklisch oder Kombinationen davon sein. Funktionalitäten oder Heteroatome, die in der Linkergruppe vorkommen können, umfassen Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder dergleichen, wobei die Heteroatom-Funktionalität oxy, oxo, thio, thiono, amino, amido und dergleichen sein kann. Jede beliebige einer Vielzahl von Linkergruppen, welche die Energieübertragung und Gel-Elektrophorese nicht stören, kann verwendet werden. Dazu gehören Purine oder Pyrimidine, im Besonderen Uridine, Thymidine und Cytosine, wobei die Substitution an einem Ringelement, insbesondere Kohlenstoff, oder einer Seitenkette, z. B. Methyl bei Thymidin, erfolgt. Die Donor- und/oder Fluoreszenzkomponente kann direkt an eine Base oder über eine Linkergruppe aus 1 bis 6, normalerweise 1 bis 3 Atomen, insbesondere Kohlenstoffatomen, gebunden sein. Die Linkergruppe kann gesättigt oder ungesättigt sein und besitzt im Allgemeinen nicht mehr als eine Stelle aliphatischer Unsättigung.
Obwohl nicht unbedingt notwendig ist bei DNA-Sequenzierungsanwendungen im Allgemeinen zumindest eine der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten mit einem Ende der polymeren Spacerkette verbunden, und die Akzeptor-Fluoreszenzkomponente ist an ein monomeres Element innerhalb der Kette gebunden. Bei Markierungen, bei denen die Polymerkette aus Polynucleotiden, Analogen oder Mimetika davon besteht, befindet sich die Donor-Fluoreszenzkomponente im Allgemeinen am 5'-Terminus der Polymerkette, und die Akzeptor-Fluoreszenzkomponente ist an einer Position 3' zum 5'-Terminus der Kette gebunden. Für andere Anwendungen wie z. B. FISH, ist eine Vielzahl von Markierungsansätzen möglich.
Die Donor-Fluoreszenzkomponenten sind im Allgemeinen Verbindungen, die im Bereich zwischen etwa 300 und 900 nm, insbesondere zwischen etwa 350 und 800 nm, absorbieren und Energie an die Akzeptor-Fluoreszenzkomponente übertragen können. Die Donor-Komponente weist einen starken molaren Absorptionskoeffizienten bei der gewünschten Anregungswellenlänge auf, vorzugsweise mehr als 10⁴, insbesondere mehr als 10⁵ cm^–1 M^–1. Das Molekulargewicht der Donor-Komponente liegt im Allgemeinen unter etwa 2,0 kD, vorzugsweise unter etwa 1,5 kD. Eine Vielzahl an Verbindungen kann als Donor-Fluoreszenzkomponente herangezogen werden. Dazu gehören Fluorescein, Phycoerythrin, BODIPY, DAPI, Indo-1, Cumarin, Dansyl, Cyaninfarbstoffe und dergleichen. Donor-Komponenten von Interesse umfassen Fluorescein, Rhodamin, Cyaninfarbstoffe und dergleichen.
Die Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten können ident sein, z. B. beide FAM. Wenn sie jedoch unterschiedlich sind, absorbiert die Akzeptorfluoreszenzkomponente im Allgemeinen Licht mit einer Wellenlänge, die zumindest 10 nm, vorzugsweise zumindest 20 nm oder mehr, über der maximalen Absorptionswellenlänge des Donors liegt, und weist ein Fluoreszenzemissionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 400 bis 900 nm auf. Wie die Donor-Komponente besitzt auch die Akzeptor-Fluoreszenzkomponente ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2,0 kD, vorzugsweise weniger als 1,5 kD. Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten können Rhodamine, Fluorescein derivate, BODIPY und Cyaninfarbstoffe und dergleichen sein. Spezifische Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten umfassen FAM, JOE, TAM, ROX, BODIPY und Cyaninfarbstoffe.
Der Abstand zwischen Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten wird so gewählt, dass eine Energieübertragung von der Donor- zur Akzeptor-Fluoreszenzkomponente ermöglicht wird, wobei die Effizienz der Energieübertragung zwischen 20 und 100 liegt. Je nach Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten beträgt der Abstand zwischen den beiden zwischen 4 und 200 Å, vorzugsweise zwischen 12 und 100 Å und insbesondere zwischen 15 und 80 Å, wie oben beschrieben.
Die Markierungen der vorliegenden Sätze werden größtenteils durch untenstehende Formel angegeben:
worin:
D die Donor-Fluoreszenzkomponente ist, die aus mehr als zwei durch einen Spacer getrennten Donoren bestehen kann;
N die Spacerkomponente ist, die eine Polymerkette oder eine starre chemische Gruppierung sei kann, wobei, wenn N ein Polymerspacer ist, der Nucleotide, Analoge oder Mimetika davon umfasst, die Anzahl der monomeren Elemente in N im Allgemeinen zwischen etwa 1 und 50, vorzugsweise zwischen etwa 4 und 20 und insbesondere zwischen etwa 4 und 16, liegt;
A die Akzeptor-Fluoreszenzkomponente ist, die sich aus mehr als zwei unterschiedlichen durch einen Spacer getrennten Akzeptoren zusammensetzen kann; und
X optional und im Allgemeinen vorhanden ist, wenn die Markierungen in Oligonucleotidprimer eingeschlossen werden, wobei X eine Funktionalität, z. B. eine aktivierte Phosphatgruppe, zur Bindung an ein Mono- oder Polynucleotid, Analog oder Mimeti kum davon, ist, insbesondere an ein Desoxyribonucleotid aus im Allgemeinen 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 25, Nucleotiden.
Damit die Sätze zur enzymatischen Nucleinsäuresequenzierung eingesetzt werden können, bei der die Markierungen als Primen verwendet werden, umfassen die Markierungen der vorliegenden Sätze entweder Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten, die direkt an eine hybridisierende Polymerhauptkette, z. B. ein Polynucleotid, eine Peptidnucleinsäure und dergleichen, gebunden sind, oder die Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten sind in einer Energieübertragungskassette enthalten, die an eine hybridisierbare Komponente gebunden ist, wobei die Energieübertragungskassette die Fluoreszenzkomponenten gebunden an eine nichthybridisierende Polymerhauptkette, z. B. einen Universalspacer, enthält (siehe PCT/US96/13134 sowie Ju et al., Nat. Med. (1996), s. o., deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind). Die hybridisierbare Komponente setzt sich typischerweise aus etwa 8 bis 40, üblicherweise etwa 8 bis 25 Nucleotiden zusammen, wobei die hybridisierbare Komponente im Allgemeinen komplementär zu verschiedenen im Handel erhältlichen Vektorsequenzen ist, bei denen es im Zuge ihrer Verwendung zu einer Synthese vom Vektor zur geklonten Sequenz kommt. Die Vektoren können einstrangige Vektoren filamentöser Bakteriophagen, Bakteriophagen-Lambda-Vektoren, pUC-Vektoren, pGEM-Vektoren oder dergleichen umfassen. Der Primen kann einfach aus einem Iniversalprimer, wie z. B. pUC/M13, λgt10, λgt11 und dergleichen, abgeleitet werden (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Kapitel 13 (1989), CSHL), wobei der Universalprimer wie oben beschrieben modifiziert wurde, z. B. durch direktes Binden der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten an Basen des Primers oder durch Binden einer Energieübertragungskassette mit den Fluoreszenzkomponenten an den Primen.
Sätze von bevorzugten Energieübertragungsmarkierungen, bei denen Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten kovalent an eine Polynucleotid-Hauptkette in obigem D-N-A-Format gebunden sind, umfassen: (1) F6R, F13R, F16R und F16F; wobei unter schiedliche Formate verwendet werden können, solange die vier Primen ein unterschiedliches Fluoreszenz-Emissionsmuster erzeugen.
Die fluoreszierenden Markierungen der vorliegenden Sätze können gemäß bekannten Verfahren einfach synthetisiert werden, wobei die vorliegenden Markierungen im Allgemeinen durch Oligomerisieren monomerer Elemente der Polymerkette der Markierung synthetisiert werden, wobei gewisse monomere Elemente kovalent an eine Fluoreszenzkomponente gebunden sind.
Die vorliegenden Sätze fluoreszierender Markierungen können für Anwendungen eingesetzt werden, bei denen zumindest zwei Komponenten einer Probe oder eines Gemischs aus Komponenten unterscheidbar detektiert werden müssen. Bei solchen Anwendungen wird der Satz mit der Probe, die die zu detektierenden Komponenten enthält, unter Bedingungen vereinigt, bei denen zumindest zwei der Komponenten der Probe, sofern vorhanden, mit einem ersten und einem zweiten Satz an Markierungen markiert werden, wobei die erste und zweite Markierung des Satzes dieselben, durch unterschiedliche Distanzen getrennten Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten enthält. Somit ist eine erste Komponente der Probe mit einer ersten Markierung des Satzes gekennzeichnet, der durch einen ersten Abstand X getrennte Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten enthält. Eine zweite Komponente der Probe ist mit einer zweiten Markierung gekennzeichnet, die dieselben durch einen Abstand Y getrennten Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten umfasst, wobei X und Y wie oben beschrieben gewählt sind. Die markierten ersten und zweiten Komponenten, die von den restlichen Komponenten der Probe getrennt wurden oder nicht, werden mit Licht bestrahlt, das eine Wellenlänge hat, die eine Absorption durch die Donor-Fluoreszenzkomponenten ermöglicht und vorzugsweise zu einer maximalen Absorption durch die Donor-Fluoreszenzkomponenten führt. Die Bestrahlung der markierten Komponenten führt zur Erzeugung unterscheidbarer Fluoreszenz-Emissionsmuster durch die markierten Komponenten, wobei ein erstes Fluoreszenz-Emissionsmuster von der ersten Markierung und ein zweites Fluoreszenz-Emissionsmuster von der zweiten Markierung erzeugt wird. Die un terscheidbaren Fluoreszenz-Emissionsmuster werden dann detektiert. Anwendungen, für die die vorliegenden Markierungen eingesetzt werden können, umfassen eine Vielzahl von Mehrkomponentenanalyse-Anwendungen, die fluoreszierende Markierungen verwenden, einschließlich FISH, Analysen auf Mikroarray-Chip-Basis, bei welchen die Markierungen als Sonden fungieren können, die sich besonders an Target-Komponenten binden, und DNA-Sequenzierung, wo die Markierungen als Primen vorliegen können, etc.
Die vorliegenden Sätze von Markierungen finden insbesondere in enzymatischen Polynucleotidsequenzierungs-Anwendungen Einsatz, bei denen vier unterschiedlich große Polynucleotidfragmente, die an unterschiedlichen Basen enden, erzeugt werden (Elemente jedes Satzes enden an derselben Base), und eine Unterscheidung der Fragmentsätze voneinander durchgeführt werden soll. Bei solchen Anwendungen umfassen die Sätze im Allgemeinen vier unterschiedliche Markierungen, die als Primen für die enzymatische Verlängerung herangezogen werden können, wobei zumindest zwei der Markierungen Energieübertragungsmarkierungen sind, die unterschiedlich beabstandete Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzkomponenten umfassen, die durch Anregung mit einer gemeinsamen Lichtwellenlänge unterscheidbare Fluoreszenzemissionsmuster erzeugen können. Mittels in der Technik bekannter Verfahren wird durch die Verwendung einer ersten Markierung des Satzes als Primer ein erster Satz an Primerverlängerungsprodukten hergestellt, die alle in A enden. Ein zweiter, dritter und vierter Satz an Primerverlängerungsprodukten mit den Endungen G, C und T werden ebenso enzymtisch erzeugt. Die vier unterschiedlichen Sätze an Primerverlängerungsprodukten werden dann kombiniert und normalerweise in einem elektrophoretischem Medium nach Größe getrennt. Die aufgetrennten Fragmente werden nun relativ zum Detektor bewegt (wobei üblicherweise entweder die Fragmente oder der Detektor stationär sind). Die Intensität des von jedem markierten Fragment während der Bewegung relativ zum Detektor ausgesandten Lichts wird als Funktion der Zeit aufgetragen, d. h. ein Elektropherogramm wird erstellt. Da die Markierungen der vorliegenden Sätze im Allgemeinen Licht mit lediglich zwei Wellenlängen aussenden, umfasst das aufgetragene Elektropherogramm mit zwei Wel lenlängen ausgestrahltes Licht. Jeder Peak im Elektropherogramm entspricht einer bestimmten Art von Primerverlängerungsprodukt (d. h. A, G, C oder T), wobei jeder Peak eines der vier unterschiedlichen Fluoreszenz-Emissionsmuster umfasst. Um die DNA-Sequenz zu bestimmen, wird das Elektropherogramm so gelesen, dass sich jedes unterschiedliche Fluoreszenz-Emissionsmuster auf eine der vier Basen der DNA-Kette bezieht.
Falls gewünscht können zwei Sätze von Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei die von. den Markierungen im ersten Satz erzeugten unterscheidbaren Fluoreszenz-Emissionsmuster Emissionen mit einer ersten und einer zweiten Wellenlänge und die vom zweiten Markierungssatz erzeugten Muster Emissionen mit einer dritten und einer vierten Wellenlänge umfassen. Durch gemeinsame Verwendung zweier Sätze kann man im Wesentlichen gleichzeitig die Primerverlängerungsprodukte zweier unterschiedlicher Templat-DNA-Stränge in einem herkömmlichen Vierfarben-Detektor detektieren und dadurch die Leistung des Detektors verdoppeln.
Die vorliegenden Sätze von Markierungen kann in Sets verkauft werden, die zusätzliche Reagenzien oder Komponenten, die für den jeweiligen Einsatz des Markierungssatzes notwendig sind, umfassen können oder auch nicht. Für Sequenzierungsanwendungen können die Sätze in einem Set verkauft werden, das darüber hinaus ein oder mehrere erforderliche Sequenzierungsreagenzien wie Polymerase, Nucleotide, Didesoxynucleotide und dergleichen enthält.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration und sind nicht einschränkend zu verstehen. Sie werden angegeben, um Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu geben, wie die Sätze aus fluoreszierenden Markierungen herzustellen und zu verwenden sind.
EXPERIMENTELLER TEIL
A. Aufbau und Synthese der fluoreszierenden Primer
Ein Beispiel für ein allgemeines Markierungsverfahren, basierend auf dem Konzept der Energieübertragung, zur Herstellung von zumindest acht fluoreszierenden Primern aus vier fluoreszierenden Farbstoffen wird in 1 beschrieben. Um die Anwendbarkeit des Markierungsansatzes zu zeigen, sind zwei fluoreszierende Farbstoffe, 6-Carboxyfluorescein (FAM, F λ_em(max) = 525 nm) als Donor und 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX, R λ_em(max) 605 nm, rot) als Akzeptor, ausgewählt worden, um vier fluoreszierende Oligonucleotidprimer herzustellen, die in der Folge zur DNA-Sequenzierung eines cDNA-Klons herangezogen werden. Die Strukturen der fluoreszierenden Primer sind in 2 angegeben.
Oligodesoxynucleotide (mit einer Länge von 25 Basen) mit der Sequenz 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAC-3' (Seq.-ID Nr. 01) wurden mit durch unterschiedliche Abstände getrennte Donor-Akzeptor-Fluorophor-Paaren synthetisiert. Das 25-Mer enthält eine modifizierte Base, die durch die Verwendung von 5'-[N-(Trifluoracetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-desoxyuridin, 3'-[(2-Cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit (Amido-Modifier C6 dT, Glen Research, Sterling, VA, USA) eingeführt wurde und einen geschützten Primäramin-Linkerarm enthält. Der Donor-Farbstoff wurde an das 5'-Ende des Oligomers gebunden, und der Akzeptor-Farbstoff an die primäre Amingruppe der modifizierten Base. Die Primen werden gemäß dem von Ju, J., Ruan, C., Fuller, C. W., Glazer, A. N. und Mathies, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4347–4351 (1995), veröffentlichten Verfahren synthetisiert und gereinigt. Die Energieübertragungsprimer werden mittels der Abkürzung D-N-A benannt, wobei D der Donor, A der Akzeptor und N die Anzahl an zwischen D und A liegenden Nucleotiden ist. Bei allen zubereiteten Primern ist 6-Carboxyfluorescein (FAM, F, mit einem Fluoreszenz-Emissionsmaximum bei 525 nm) als gemeinsamer Donor und 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX, R, mit einem Fluoreszenz-Emissionsmaximum bei 605 nm) als ein Akzeptor ausgewählt, ausgenommen ein Bei spiel bei dem N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA, T, mit einem Fluoreszenz-Emissionsmaximum bei 580 nm), wie in 3 gezeigt, als Akzeptor fungiert.
In 3 sind fünf Fluoreszenzprimer mit ihren einzigartigen Fluoreszenzsignalmustern dargestellt. Beim Primen F6R liegt die Energieübertragungseffizienz vom Donor F zu R bei über 90%, wodurch nur die dominante rote Farbe von Akzeptor R angezeigt wird. Der Primen F13R besitzt eine geringere Energieübertragungseffizienz als F6R und weist deshalb nicht nur ein starkes Rotsignal von Akzeptor R, sondern auch ein Blausignal von F mit einer ungefähren Intensität von 40% des Rotsignals auf. Beim Primer F16R ist die Energieübertragungseffizienz noch geringer als bei F13R, was zu einer ungefähr gleichen Signalintensität von R (rot) und F (blau) führt. Das Fluoreszenzsignal des Primers F16F, der zwei FAM-Moleküle besitzt, wird von der Farbe blau dominiert. Beim Primen F16T, der TAMRA (T) als Akzeptor verwendet, ist das Fluoreszenzsignal von F (blau) nahezu gleich intensiv wie von T (schwarz). Aus diesen Beispielen wird deutlich, dass mit lediglich 3 Farbstoffen mindestens fünf verschiedene fluoreszierende Markierungen erzeugt werden. Mit zwei Farbstoffen FAM und ROX werden vier fluoreszierende Primen geschaffen, die hinreichend unterschiedliche Fluoreszenzsignale aufweisen, um für die DNA-Sequenzierungsfragmente, die mit den Nucleotiden T (F6R), G (F13R), A (F16R) und C (F16F) enden, zu kodieren. Diese vier Primen werden dann für die Evaluierung mittels DNA-Sequenzierung herangezogen, bei der ein cDNA-Klon mit einem PolyA-Schwanz, der von den gebildeten Primern geprimt werden kann, eingesetzt wird.
B. DNA-Sequenzierungsverfahren
Die Sequenzierung wurde mittels eines cDNA-Klons, bezeichnet als Incyte-Klon 1 wie unten angeführt, und dem Thermo-Sequenaee-Sequenzierungsset (Amersham Life Science) auf einem ABI-377-Sequenzer durchgeführt.
INCYTE-KLON 1 (Die kursiv geschriebene Sequenz ist die in Fig. 6 dargestellte Sequenz.)
Es wurden vier Reaktionen, eine für jede Farbstoff/ddNTP-Kombination, mit 0,2 pMol des zugehörigen Primers durchgeführt. Die Reaktionen mit ddCTP wurden mit dem F16F-Primer, mit ddATP mit dem F16R-Primer, mit ddGTP mit dem F13R-Primer und mit ddTTP mit dem F6R-Primer ausgeführt. Das Sequenzierungsreaktionsgemisch wurde fünfzehn Zyklen von 94°C für 20 Sekunden, 47°C für 40 Sekunden und 68°C für 60 Sekunden unterzogen und dann auf 4°C abgekühlt. Die vier Reaktionsgemische jeder Sequenz wurden in eine Phiole gefüllt und 50 μl 100%iges Ethanol zugegeben, um die DNA-Fragmente zu fällen. Die DNA wurde mittels Zentrifugation bei 4°C für 30 Minuten gefällt und anschließend einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen. Die gefällte DNA wurde vakuumgetrocknet und in 4 μl entionisiertem Formamid, das 8,3 mM EDTA enthielt, resuspendiert und für 2 Minuten auf 95°C erhitzt. Die denaturierte DNA wurde auf ein 4%iges Denaturierungsgel mit 7 M Harnstoff, das in die Vorrichtung gefüllt war, geladen. 3,5 Stunden lang wurde Elektrophorese mittels einem 1-X-Trisborat-EDTA-Puffer durchgeführt.
C. DNA-Sequenzierungsergebnisse unter Verwendung der vier fluoreszierenden Primer
4 zeigt, dass die Fluoreszenzintensität der Einzelbasenverlängerungsfragmente der Primen F6R (T-Fragmente) und F13R (G-Fragmente) aufgrund der Energieübertragung von F zu R deutlich höher ist, als die von den Einzelbasenfragmenten des Primers R15R (T-Fragmente) erzeugte, der zwei ROX-Farbstoffe mit derselben Sequenz wie F6R und F13R enthält. In der Vergleichsprobe wurde dieselbe Konzentration des Primers und anderer Sequenzierungsreagenzien verwendet. Ein kleiner Teil der DNA-Sequenzierungsrohdaten in einer Zweifarbendarstellung, die von FAM und ROX unter Verwendung der Primen F6R, F13R, F25R und F16F auf einem ABI-377-DNA-Sequenzer gewonnen wurden, sind in 5 dargestellt. Aus diesen Rohdaten können durch das Farbverhältnis in den Peaks der Elektropherogramme Sequenzen bestimmt werden. 6 zeigt einen Großteil der Sequenzierungsrohdaten (von Nucleotid 30 bis 130) in Zweifarbendarstellung, die durch die Primen F6R (T), F13R (G), F16R (A), F16F (C) und einen cDNA-Klon mit einem PolyA-Schwanz am 3'-Ende erzeugt wurden. Sequenzen können nach den Farbmustern jedes Peaks benannt werden, ohne dass eine Mobilitätsverschiebungs-Korrektur an den Rohdaten vorgenommen werden muss. Wenn z. B. Blau- und Rotsignale in einem Peak beinahe dieselbe Intensität aufweisen, wurde der Peak als A bezeichnet; ist lediglich ein dominantes Blausignal im Peak ersichtlich, wurde er als C bezeichnet, bei einem leicht stärkeren Rot- als Blausignal als G und bei einem deutlich stärkeren Rot- als Blausignal als T.
Aus den Versuchsdaten geht klar hervor, dass mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen und unter Verwendung des Energieübertragungskonzepts, durch das stärkere Fluoreszenzsignale geschaffen werden, vier fluoreszierende Primer mit hinreichend unterschiedlichen Fluoreszenzsignalmustern für eine erfolgreichen DNA-Sequenzierung erzeugt werden können. Mit zwei zusätzlichen unterschiedlichen fluoreszierenden Molekülen können durch Anwendung desselben vorliegenden Prinzips weitere vier fluoreszierende Primen hergestellt werden. Somit können mit einem DNA-Sequenzer, der mit passenden Vierfarbenfiltern ausgestattet ist, zwei Sätze an DNA-Sequenzierungsproben gleichzeitig analysiert und die Sequenzierungsleistung verdoppelt werden. Diese mittels den vorliegenden Konzepten erzeugten Sätze aus einzigartigen fluoreszierenden Markierungen werden in anderen Mehrkomponentenanalyse-Projekten weitreichende Anwendungsmöglichkeiten finden.
Aus den obigen Ergebnissen und Ausführungen ist eindeutig ersichtlich, dass die Sätze von Markierungen der vorliegenden Erfindung eine Reihe von Vorteilen bieten. Werden die Markierungssätze beispielsweise in der DNA-Sequenzierung eingesetzt, kann ein Detektor, der lediglich zwei deutlich getrennte Wellenlängen detektieren kann, eingesetzt werden. Der Detektor kann einen Großteil der Fluoreszenzsignale messen, wodurch eine höhere Detektionsempfindlichkeit sowie eine zunehmende abgelesene Sequenzlänge bereitgestellt wird. Mit einem herkömmlichen Detektor, der Detektoren mit vier unterschiedlichen Wellenlänge umfasst, kann durch die Sequenzierung zweier unterschiedlicher Stränge mit zwei Sätzen an Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung weiters die Leistung effektiv verdoppelt werden. Die vorliegenden Sätze von Markierungen stellen also einen wichtigen Beitrag zur Technik dar.

Claims

Satz aus vier fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidprimern, worin drei der Oligonucleotidprimer ein gemeinsames Donor-Fluorophor "A" und Akzeptor-Fluorophor "B" in Energieübertragungsbeziehung aufweisen und um unterschiedliche Abstände voneinander getrennt sind, so dass drei unterscheidbare Fluoreszenzsignale ausgesandt werden, und der vierte Primen zwei Donor-Fluorophore "A" aufweist, so dass ein Fluoreszenzsignal ausgesandt wird, das sich von den drei unterscheidbaren Fluoreszenzsignalen unterscheidet.
Satz nach Anspruch 1, worin das Akzeptor-Fluorophor aus der aus TAM, JOE, FAM, ROX, BODIPY und Cyaninfarbstoffen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Satz nach Anspruch 1 oder 2, worin das Donor-Fluorophor FAM ist.
Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Akzeptor-Fluorophor ROX ist.
Satz aus 8 fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidprimern, worin der Satz eine erste Gruppe aus vier Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen zweite Gruppe aus vier Oligonucleotidprimern umfasst, worin drei der Oligonucleotidprimer der zweiten Gruppe ein gemeinsames Donor-Fluorophor "C" und Akzeptor-Fluorophor "D" in Energieübertragungsbeziehung aufweisen und um unterschiedliche Abstände voneinander getrennt sind, so dass drei unterscheidbare Fluoreszenzsignale ausgesandt werden, und der vierte Primen zwei Donor-Fluorophore "C" aufweist, so dass ein Fluoreszenzsignal ausgesandt wird, das sich von den drei unterscheidbaren Fluoreszenzsignalen unterscheidet; wobei sich die Fluorophore "C" und "D" von den Fluorophoren der ersten Gruppe "A" und "B" so unterscheiden, dass die Fluorophore der zweiten Gruppe vier Fluoreszenzsignale aussenden, die sich von den Fluoreszenzsignalen der Fluorophore der ersten Gruppe unterscheiden.
Verfahren zum Sequenzieren eines DNA-Moleküls, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines Satzes von Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 4; das Durchführen einer Didesoxysequenzierungsreaktion mit den Primern, worin jeder Primen in einer Primerverlängerungsreaktion mit einem anderen ddNTP eingesetzt wird; das Trennen der Primerverlängerungsprodukte; das Detektieren der größengetrennten Primerverlängerungsprodukte; und das Bestimmen der Sequenz anhand der detektierten größengetrennten Primerverlängerungsprodukte.
Verfahren nach Anspruch 6, worin zwei DNA-Moleküle unter Einsatz eines Satzes von Primern nach Anspruch 5 sequenziert werden.
Set zur Verwendung bei der DNA-Sequenzierung, wobei das Set Folgendes umfasst: einen Satz aus vier fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidprimern nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen Satz aus acht fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidprimern nach Anspruch 5.