DE3886051T2 - Auswahl von zellen mit verbesserten zelladhäsionseigenschaften. - Google Patents
Auswahl von zellen mit verbesserten zelladhäsionseigenschaften.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Zelladhäsionssysteme und insbesondere Zellen mit gesteigerten Zelladhäsionseigenschaften.
- Die Adhäsion von Zellen an extrazelluläre Matrixkomponenten scheint in bezug auf das Verhalten von Zellen wie Zellteilung, Zelldifferenzierung und embryonale Zellmigration und -sortierung grundlegend zu sein (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, 1985, 5766-5770). Darüber hinaus können bestimmte abnorme Zellverhalten, wie Tumorinvasion und Metastasierung aus Veränderungen im Mechanismus der Adhäsion von Zellen an die extrazelluläre Matrix resultieren.
- Die Zelladhäsion scheint in großem Umfang durch Zelloberflächenrezeptoren vermittelt zu werden, welche die Zelladhäsions fördernden Moleküle oder Liganden in der extrazellulären Matrix erkennt und spezifisch an diese binden. Eine Reihe dieser, die Adhäsion fördernden Moleküle einschließlich Fibronektin, Vitronektin, Laminin und die Kollagene sind identifiziert worden. Die Zellanheftungsstelle von Fibronektin wurde beispielsweise mit monoklonalen Antikörpern und proteolytischen Fragmenten des Moleküls lokalisiert. Es wurde davon ausgegangen, daß das aus Pepsinspaltungen des chymotryptischen Fragments von 120 Kd isolierte Peptid von 15 Kd die Zellanheftungsstelle von Fibronektin repräsentiert (Cell, Band 26, 1981, 259-267). Man hat nunmehr erkannt, daß vielfältige dieser die Adhäsion fördernden Moleküle die gemeinsame Aminosauresequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (Arg-Gly-Asp oder RGD) aufweisen, welche als Zellbindungsdomäne wirkt und für die Fähigkeit von Zellen beim Erkennen und Binden dieser Moleküle verantwortlich ist. Die Anheftung von Zellen an beispielsweise Fibronektin und Vitronektin wird von Peptiden gehemmt, welche die RGD-Sequenz enthalten (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, 1985, 5766-5770).
- Adhäsive Zellen verfügen auf ihren Oberflächen über eine Reihe von verschiedenen Typen von Rezeptoren, die auf RGD gerichtet sind und deren Verhältnis für den Zelltyp spezifisch ist. Obgleich sämtliche dieser Rezeptoren an die RGD enthaltende Domäne ihrer Liganden binden, besitzen sie nichtsdestoweniger eine Spezifität für ihr besonderes, die Zelladhäsion förderndes Molekül. Synthetische Peptide, welche die RGD-Sequenz enthalten, können im Falle der Beschichtung eines Substrats zur Förderung der Zelladhäsion oder im Falle des Vorliegens in löslicher Form zur Hemmung der Zellanheftung Verwendung finden.
- Da die Fähigkeit zur Bindung an extrazelluläre Matrixkomponenten auf die Zelloberflächenrezeptoren zurückzuführen ist, sollte das Ausmaß der Zelladhäsion durch quantitative Veränderungen in der Anzahl der auf der Oberfläche der Zellen vorhandenen Rezeptoren beeinflußt werden. Ein Verfahren zur Bereitstellung von Zelllinien mit erhöhter Anzahl von Rezeptoren wäre gut geeignet für die Bereitstellung von Zellen, die eine gesteigerte Bindungsfähigkeit aufweisen und eine besonders geeignete Quelle an Zelloberflächenrezeptoren liefern würden. Darüber hinaus kann ein derartiges Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von Rezeptoren in abnormen Zellinien, deren Pathologie auf eine verringerte Anzahl von Rezeptoren zurückzuführen ist, oder bei normalen Zellinien, welche sich aufgrund einer verringerten Anzahl von Rezeptoren dedifferenziert haben, geeignet sein. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und realisiert zugleich damit einhergehende Vorteile.
- Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Auswahl von Zellen mit gesteigerten Adhäsionseigenschaften bereitgestellt, indem Zellen aus einer Mutterzellinie in einem Medium kultiviert werden, welches einen Adhäsionsliganden in Lösung in einer derartigen Konzentration enthält, daß weniger als alle Adhäsions-Oberflächenrezeptoren auf den Zellen gebunden werden, und diejenigen Zellen ausgewählt werden, die in der Lage sind, in derartigen Medien zu wachsen, um sie in Medien, welche erhöhte Konzentrationen des Adhäsionsliganden in Lösung enthalten, sukzessive zu rekultivieren. Der Adhäsionsligand in Lösung kann beispielsweise ein Peptid sein, wie eines, welches eine RGD- Bindungsstelle enthält, oder ein Antikörper, um die Adhäsionsfunktion des Adhäsionsrezeptors zu inhibieren. Darüber hinaus wird mit der Erfindung ein analoges Verfahren zur Förderung der Differenzierung von Zellen bereitgestellt. Ferner werden mittels derartiger Verfahren hergestellte Zellinien zur Verfügung gestellt.
- Gemäß einem weiteren Aspekt wird mit der Erfindung ein weiteres Verfahren zur Förderung der Differenzierung von Zellen in einer Zellinie bereitgestellt, indem solche Zellen, welche hohe Mengen an Zelladhäsionsrezeptoren auf ihren Oberflächen aufweisen, ausgewählt und rekultiviert werden. Beispielsweise werden die Zellen einem für den Zelladhäsionsrezeptor spezifischen Liganden ausgesetzt, um auf diese Weise eine Bindung zwischen dem Liganden und den Zellen auszuschließen. Der Ligand kann entweder ein Bindungspartner des Adhäsionsrezeptors oder ein Antikörper sein, welcher an den Rezeptor bindet, wenngleich nicht notwenigerweise in der Form, daß die Bindungsfunktion des Rezeptors gehemmt wird. Diejenigen Zellen, die daran den größten Teil des Liganden gebunden haben, werden identifiziert und zur Rekultur in Gegenwart des Liganden ausgewählt. Die Stufen der Kultivierung in Gegenwart des Liganden sowie die Identifizierung derjenigen Zellen, die große Menge des gebundenen Liganden aufweisen werden wiederholt, bis die gewünschte Konzentration an Oberflächenrezeptoren und der Differenzierungsgrad etabliert sind. Ein Verfahren zur Identifizierung derartiger Zellen erfolgt mittels Bindung an einen fluoreszenzmarkierten Liganden und Trennung der Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellsortiergerätes auf der Grundlage der an ihren Oberflächen auftretenden Fluoreszenzmenge, obgleich andere, im Stand der Technik bekannte Verfahren alternativ eingesetzt werden können.
- Figur 1. Von Antikörpern erkannte Immunpräzipitate von MG-63- und PRV-Zelloberflächenantigenen. Die Oberflächen von MG-63- und PRV-Zellen (etwa 10&sup5;) wurden mit 1 mCi ¹²&sup5;I markiert, lysiert und die Antigene werden wie in Beispiel VI beschrieben immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE unter nichtreduzierenden (A) oder reduzierenden (B und C) Bedingungen analysiert. (A und B) Spuren 1-2, Immunpräzipitation mit Antifibronektin-Rezeptor-Antikörper; Spur 4, Immunpräzipitation mit Anti- Vitronektin-Rezeptor-Antikörper; Spuren 1 und 4, MG-63-Zellen (subkonfluente Kultur); Spuren 2 und 5, PRV-Zellen (konfluente Kultur); Spuren 3 und 6 PRV-Zellen (subkonfluente Kultur). (C) Immunpräzipitation von subkonfluenten Kulturen von MG-63- (Spur 1) und PRV- (Spur 2) Zellen mit Anti-HLA-Antikörper.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von Zellinien mit gesteigerten Adhäsionseigenschaften und erhöhtem Differenzierungsgrad durch Auswahl von Zellen, die in der Lage sind, in Gegenwart von Adhäsionsliganden in Lösung zu wachsen. RGD ist die Bindungsdomäne für eine Reihe von extrazellulären, die Adhäsion fördernden Komponenten wie Fibronektin und Vitronektin. Die Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen binden selektiv an derartige, die Adhäsion fördernden Moleküle.
- Normale Zellen müssen an einem Substrat haften, um zu proliferieren. Wenn in dem Kulturmedium ein Peptid vorhanden ist, welches RGD enthält, versagen die meisten Zellen bei der Anheftung oder lösen sich von einem Substrat, welches RGD enthält. Da sich die meisten Zellen in Kultur über einen RGD-abhängigen Mechanismus, in ausreichenden Konzentrationen, im allgemeinen etwa 1 mMol, anheften, hemmt RGD die Zellproliferation in Kultur. Dieses Phänomen ist intensiv untersucht worden, vgl. beispielsweise Hayman et al., J. Cell Biol., 100:1948, worauf Bezug genommen wird. Mittels eines analogen Mechanismus kann die Zellanheftung durch andere Adhäsionsliganden oder durch Antikörper inhibiert werden, welche spezifisch an die fraglichen Adhäsionsrezeptoren binden und mit der Bindungsfunktion des Rezeptors interferieren.
- Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Auswahl von Zellen bereitgestellt, welche gesteigerte Adhäsionseigenschaften aufweisen, indem Zellinien sukzessiv ansteigenden Konzentrationen an Adhäsionsliganden in Lösung, beispielsweise einem RGD-Peptid, ausgesetzt werden, und diejenigen Zellen ausgewählt und rekultiviert werden, welche in der Lage sind, sich bei derartigen Konzentrationen des Adhäsionsliganden anzuheften und zu proliferieren. Derartige Zellen weisen auf ihren Oberflächen eine erhöhte Anzahl von Adhäsionsrezeptoren auf. Obgleich das Peptid GRGDSP als RGD enthaltendes Peptid eingesetzt worden ist, da man weiß, daß es von einer Reihe von Rezeptoren erkannt wird, können andere RGD enthaltende Peptide verwendet werden. Diejenigen, von denen man weiß, daß sie eine besondere Affinität zu bestimmten Rezeptoren aufweisen, können einen selektiven Druck zur Steigerung derartiger besonderer Rezeptoren ausüben.
- Viele Zellen einschließlich derjenigen der MG-63-Zellinie sind bekannt dafür, daß sie sich an Substrate in Kultur durch Ausscheidung von Vibronektin oder einer Vibronektin-ähnlichen Substanz an das Substrat anheften. Das RGD enthaltende Peptid in Lösung konkurriert essentiell mit dem ausgeschiedenen Fibronektin um die Bindung an Rezeptoren, was zu dem beschriebenen selektiven Druck auf die Zellen zu gesteigerten adhäsiven Eigenschaften durch beispielsweise Expression einer erhöhten Anzahl von Fibronektinrezeptoren führt. Eine analoge selektive Einrichtung kann etabliert werden durch Bereitstellung von Antifibronektinrezeptor-Antikörpern in Lösung, welche ebenfalls mit dem ausgeschiedenen Fibronektin um die Bindung an die Fibronektinrezeptoren konkurriert und die Adhäsionsfunktion der Rezeptoren inhibiert.
- Selektive Anordnungen zur Steigerung der Adhäsionseigenschaften, die auf andere RGD-spezifische Zelloberflächenrezeptoren oder auf nicht-RGD-spezifische Zelloberflächenrezeptoren zurückgehen, können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise kann das Kultursubstrat mit einem Adhäsionsliganden wie Vitronektin oder einem Derivat davon beschichtet sein und Vitronektin oder ein für den Vitronektinrezeptor-spezifischer Ligand oder ein für den Vitronektinrezeptor-spezifischer Antikörper liegen in Lösung in einer solchen Konzentration vor, daß einige, aber nicht alle der Vitronektionrezeptoren gebunden werden. Alternativ kann die Oberfläche selbst mit einem für den Vitronektinrezeptor spezifischen Antikörper beschichtet sein. Um sicherzustellen, daß sich die Zellen nicht durch einen alternativen Fibronektin-vermittelten Mechanismus an das Substrat anheften, können im wesentlichen alle Fibronektinrezeptoren dadurch blockiert werden, daß sie ebenfalls für den Fibronektinrezeptor spezifische Liganden oder Antikörper in Lösung anbieten. Das Kultivieren in sukzessiv ansteigenden Konzentrationen des für den Fibronektinrezeptor spezifischen Liganden oder Antikörpers führt zu gesteigerten Adhäsionseigenschaften der Zellen, die mit den Vitronektin spezifischen Zelloberflächenrezeptoren zusammenhängen.
- Alternativ kann das Substrat mit einem nicht-RGD-spezifischen Liganden oder einem Antikörper gegen einen nicht-RGD-spezifischen Rezeptor und einem in der Kultur bereitgestellten, entsprechenden Liganden oder Antikörper beschichtet werden. Die inhärenten Mechanismen für die Zellanheftung wie derjenige, welcher durch die Ausscheidung von Fibronektin vermittelt wird, können durch Gegenwart geeigneter Mengen eines geeigneten Liganden oder eines zur Bindung alternativer Adhäsionsrezeptoren wie den Fibronektinrezeptoren geeigneten Antikörpers blockiert werden.
- Bestimmte Zellen sind bekannt zur Ausscheidung von die Adhäsion fördernden Liganden, welche von Fibronektin verschieden sind und bei der Vermittlung der Anheftung von in Kultur gewachsenen Zellen geeignet sind. In derartigen Zellinien können gesteigerte Adhäsionseigenschaften, welche auf diese Liganden und Rezeptoren zurückgehen, durch Kultivieren in sukzessiven Konzentrationen des ausgeschiedenen Liganden, einem zu dem Liganden analogen Peptid oder einem Antikörper, welcher für den Rezeptor des fraglichen Liganden spezifisch ist, gefördert werden.
- Zur Förderung der Differenzierung von Zellen können analoge Verfahren angewendet werden. Obgleich man nicht an derartige Erklärungen gebunden sein möchte, können abnorme, relativ undifferenzierte maligne Zellen eine verminderte Anzahl von Adhäsionsrezeptoren an ihren Oberflächen aufweisen. Wenn man aus derartig abnormen Populationen diejenigen Zellen auswählt, welche gesteigerte adhäsive Eigenschaften aufweisen, wird die Zelldifferenzierung gefördert. Daher können geeignete Zellinien mit gesteigerten Adhäsionseigenschaften abgeleitet werden und derartige Zellinien können differenziertere Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus können normale, undifferenzierte Stammzellen dadurch zur Differenzierung gezwungen werden, daß sie solch einem selektiven Vorgehen ausgesetzt werden. Alternativ können Zellinien, die sich in Zellkultur wahrscheinlich differenzieren, in einem differenzierten Zustand gehalten werden, indem sie Adhäsionsliganden in Lösung wie RGD enthaltenden Peptiden ausgesetzt werden.
- Das Verfahren kann ferner für eine therapeutische in vivo-Anwendung angepaßt werden, um die Anzahl der Adhäsionszelloberflächenrezeptoren auf, oder den Differenzierungsgrad von abnormen Zellen zu steigern. Beispielsweise kann ein Adhäsionsligand in Lösung an einen geeigneten Ort im Körper eingeführt werden, so daß er mit den Zielzellen in Kontakt tritt. Durch die Bindung an die Adhäsionszelloberflächenrezeptoren können die Liganden zu einer Disassoziation der Zielzellen führen, oder sie können alternativ die Proliferation von Zellen, welche eine gesteigerte normale phenotypische Expression von Adhäsionsrezeptoren und einen normalen Differenzierungsgrad aufweisen, selektiv fördern.
- Die stufenweise Auswahl von Zellen wie beispielsweise menschlichen MG-63-Osteosarkom-Zellen zur Anheftung und zum Wachstum in Gegenwart von die Zellanheftung inhibierenden Konzentrationen eines Adhäsionsliganden in Lösung, wie einem RGD enthaltenden Peptid, beispielsweise GRGDSP, führt zur Auswahl von Zellen, die in der Lage sind, in Gegenwart des Adhäsionsliganden in Lösung zu wachsen (derartige Zellen werden nachfolgend allgemein als Peptid-resistente Variantzellen oder PRV-Zellen bezeichnet). Diese PRV-Zellen weisen im Vergleich zu den Mutterzellen eine Überproduktion an Zelloberflächenrezeptoren wie demjenigen für Fibronektin auf. Im Falle einer aus MG-63-Zellen abgeleiteten Zellinie mit der Bezeichnung MG-63.3A ist diese Überproduktion auf einen Anstieg in der Menge an für diesen Rezeptor kodierender mRNA zurückzuführen. Dieser Anstieg liegt jedoch nicht an der Amplifizierung des Gens für den Fibronektinrezeptor.
- Die PRV-Zellen haben die Überproduktion des Fibronektinrezeptors, die Resistenz gegenüber der Ablösung aus mit Fibronektin beschichteten Oberflächen durch das GRGDSP-Peptid sowie die veränderte Morphologie für eine Zeitdauer von ungefähr 6 Monaten beibehalten, wobei sie während der letzten 3 Monate in Abwesenheit des GRGDSP-Peptids kultiviert wurden.
- Der in der Beschreibung verwendete Begriff "Adhäsionsligand" bezieht sich auf irgendein Molekül, welches an einen Rezeptor bindet, dessen Funktion es ist, die Zelladhäsion zu vermitteln. "Adhäsionsligand" kann natürlich auftretende, die Adhäsion fördernde chemische Einheiten, Derivate davon, für Adhäsionszelloberflächenrezeptoren spezifische Antikörper oder irgendeine andere chemische Einheit, welche in der Lage ist, an Adhäsionsvermittelten Zelloberflächenrezeptoren zu binden, einschließen, ist aber nicht auf diese beschränkt.
- Durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Förderung der Zelldifferenzierung in Kultur ermöglicht die Erfindung den Erhalt und das Aufrechterhalten von Kulturen, die in der Lage sind, ihre differenzierten Funktionen auszuüben. Eine derartige funktionelle Fähigkeit ist beispielsweise in den Fällen wichtig, wo Zellen mit rekombinierten Genomen zum Erhalt ausgeschiedener Produkte kultiviert werden. Ferner sind vollständig differenzierte funktionelle Zellen notwendig für bestimmte Transplantationsanwendungen, wie epitheliale Zellen für Hauttransplantate, endotheliale Zellen für Gefäßtransplantate, sekretorische Zellen wie Insulin-sekretierende Pankreaszellen zur Transplantation in Diabetiker und Knochen-produzierende Zellen für einen Knochenersatz in Kultur. Das Verfahren stellt Zellen mit gesteigerten Adhäsionseigenschaften bereit, welche insbesondere geeignet sind für bestimmte Transplantationen und welche eine schnelle Quelle für Rezeptoren bereitstellen können.
- Das Hexapeptid GRGDSP wurde unter Anwendung eines automatisierten Peptidsynthezisers und den von Hersteller bereitgestellten Chemikalien synthetisiert (Modell 430A; Applied Biosystems, Foster City, CA). Dieses Peptid ist bekannt dafür, daß es durch seine RGD-Stelle an eine Vielzahl von Rezeptoren bindet.
- Die hier verwendeten Abkürzungen bedeuten:
- D -- Asparaginsäure
- E -- Glutaminsäure
- G -- Glycin
- P -- Prolin
- R -- Arginin
- S -- Serin.
- Menschliche Osteosarkom-MG-63-Zellen wurden aus der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden in Dulbecco's verändertem Eagle's-Medium (DME) kultiviert, welchem 10 % Hitze-aktiviertes fötales Rinderserum (FBS) (Tissue Culture Biologicals, Tulare, CA), Glutamin (2 mM), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 ug/ml) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zugesetzt waren. Für das routinemaßige Subkultivieren wurden Einzellschichten mit phosphatgepufferter Saline (PBS) (150 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,3) gewaschen und mit EDTA (1 mM in PBS) abgelöst.
- MG-63-Zellen wurden in Gegenwart von GRGDSP kultiviert. Das Peptid wurde in DME gelöst und der pH-Wert wurde mit Natriumbicarbonat (7,5 %) auf 7,0 eingestellt. Die Lösungen wurden anschließend vor der Verwendung filtersterilisiert.
- Unter Zugabe des Hexapeptids GRGDSP zu den Einzellschichtkulturen von MG-63-Zellen in einer Konzentration von 0,85 mM wurden die Zellen von dem Substrat gelöst. Die nicht angehefteten Zellen (> 99 %) wurden entfernt und frisches, das Peptid enthaltendes (0,85 mM) Medium wurde den verbleibenden Zellen zugegeben, von denen sich einige ebenfalls von dem Substrat ablösten. Diese verbleibenden wenigen Zellen wurden in Gegenwart des Peptids inkubiert und es wurden ein paar Zellen gefunden, die sich anhefteten und wuchsen. Die Zellen erhielten einen Zusatz frischen Mediums, welches das Peptid enthielt, und zeigten sich in der Lage, sich unter diesen Bedingungen anzuheften und zu wachsen. Sobald die Zellen konfluent vorlagen, wurden sie mit EDTA abgelöst und in Gegenwart des Peptids subkultiviert. Die Konzentration des Hexapeptids wurde nachfolgend von 0,85 auf 5,0 mM über einen Zeitraum von jeweils 5 Monaten in Schritten von jeweils 0,58 mM zur Auswahl angehefteter Zellen gesteigert.
- Zur Klärung der Frage der Stabilität des Peptids für lange Kulturdauern wurde das verbrauchte Medium von Zellen, die mehrere Tage in Gegenwart des Peptids gewachsen waren, zu MG-63-Zellen gegeben, die dem Peptid zuvor nicht ausgesetzt waren. Diese Zellen lösten sich sofort von ihren Kultursubstraten, was darauf hinweist, daß das Peptid nach mehreren Tagen in Kultur immer noch aktiv war.
- Eine aus MG-63 abgeleitete PRV-Zellinie, welche in der Lage ist, sich in Gegenwart von 5,0 mM des GRGDSP-Peptids anzuheften und zu wachsen, wurde mit MG-63.3A bezeichnet.
- Antikörper, die für den Fibronektin-Rezeptor spezifisch und in der Lage sind, die Adhäsionsfunktion des Rezeptors zu inhibieren, wurden durch das Verfahren gemäß Beispiel V hergestellt und ferner einem Screening zugeführt um nachzuweisen, daß sie die Adhäsionsfunktion ihrer entsprechenden Rezeptoren inhibieren können. Alternativ können monoklonale Antikörper mit ähnlichen Eigenschaften durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Verfahrensweise des sukzessiven Kultivieren von Zellen gemäß Beispiel I wird wiederholt unter Substitution des für den Fibronektion-Rezeptor spezifischen Antikörpers durch das RGD enthaltende Peptid in Lösung. Die anfängliche Konzentration wird so ausgewählt, daß die Bindung der Antikörper an weniger als alle der Antikörper-spezifischen Rezeptoren gefördert wird. Die Zellen, welche in der Lage sind, sich anzuheften und bei ausreichenden Konzentrationen des Antikörpers zur Ablösung und Abtötung der Zellen der Mutterlinie überleben, zeigen gesteigerte Adhäsionseigenschaften.
- Geeignete Zellen werden zur Kultivierung ausgewählt. Wenn die Zellen nicht in der Lage sind, einen nicht-Fibronektinadhäsions-fördernden Liganden, durch den sich die Zellen an das Substrat anheften können, auszuscheiden, werden die Kulturbehälter mit einem geeigneten Adhäsionsliganden beschichtet. Alternativ kann das Substrat mit einem Antikörper beschichtet werden, welcher mit dem interessierenden Rezeptor reagieren kann. Wenn die Zellen in der Lage sind, spontan einen dem interessierenden Rezeptor entsprechenden Liganden auszuscheiden, ist eine derartige Beschichtung nicht erforderlich, kann aber trotzdem erfolgen.
- Die Zellen werden kultiviert in einem anfänglichen Medium, welches einen mit dem interessierenden Rezeptor korrespondierenden Adhäsionsliganden in Lösung in einer Konzentration enthält, welche so ausgewählt ist, daß eine Bindung an weniger als alle der interessierenden Rezeptoren erfolgt. Diejenigen Zellen, die in der Lage sind, sich in diesem Medium anzuheften und zu proliferieren werden ausgewählt zur Rekultivierung in einem Medium, welches sukzessiv ansteigende Konzentrationen des interessierenden Liganden enthält. Alternativ können Antikörper gegen den interessierenden Rezeptor in Lösung bereitgestellt werden. Zusätzlich kann ein Adhäsionsligand (oder ein mit dem Adhäsionsrezeptor korrespondierender Antikörper) in Lösung bereitgestellt werden, um eine Zellanheftung an das Substrat durch direkt von den Zellen ausgeschiedene Adhäsionsliganden zu verhindern.
- Replikakulturen wurden in Gegenwart von ähnlichen Konzentrationen eines varianten Hexapeptids GRGESP kultiviert, wobei E Glutaminsäure bedeutet, bei dem man zuvor festgestellt hatte, daß es als die Zellanheftung förderndes Mittel inaktiv ist und bei der Ablösung von Zellen von ihren Kultursubstraten unwirksam ist (Hayman et al., 1985, J. Cell Biol. 100:1948). Dieses GRGESP- Peptid hatte keinerlei Effekt auf die MG-63-Zellen, welche normal wuchsen und von MG-63-Zellen, die in Abwesenheit dieses Peptids kultiviert wurden, nicht unterscheidbar waren.
- Die Fibronektion- und Vitronektinrezeptoren auf den Zellen wurden unter Anwendung Affinitäts-gereinigter polyklonaler Antikörper, welche mit diesen beiden Rezeptoren reagieren, analysiert. Die hauptsächlich verwendeten Antikörper waren Affinitats-gereinigte polyklonale anti-MG-63-Vitronektinrezeptor- und anti-MG- 63-Fibronektionrezeptor-Antikörper des Kaninchens, anti-Mausepidermaler Wachstumsfaktorrezeptor-Antiserum des Kaninchens und anti-HLS-Antikörper. Die Fibronektionrezeptoren und Vitronektinrezeptoren wurden durch die Verfahren von Pytela et al., (1985), Cell, 40:191, und Pytela et al., (1985), PNAS, 82:5766, auf die hier Bezug genommen wird, isoliert. Die Antikörper wurden hergestellt, indem Kaninchen ein geeignetes Immunogen unter Anwendung von Standardverfahren injiziert wurde. Die Absorption des resultierenden Antiserums gegen normale menschliche Proteine führte zur Isolierung von Antikörpern, die entweder für den Fibronektinrezeptor oder für den Vitronektionrezeptor spezifisch waren.
- Der zweite verwendete Antikörper war FITC-konjugiertes anti- Kaninchen-IgG der Ziege, welcher hergestellt wurde, indem Ziegen mittels standardisierter Verfahren Kaninchen-IgG injiziert wurde und die Antikörper mit FITC gemäß standardisierter Verfahren konjugiert wurden. Die FITC-Fluoreszenz wurde als grüne Fluoreszenz nachgewiesen. Zur Markierung nicht lebensfähiger Zellen wurde Propidiumjodid eingesetzt und als rote Fluoreszenz nachgewiesen.
- Die Zellen wurden mit 1 mM EDTA geernted und in einer Konzentration von 2,5 x 10&sup5; - 1 x 10&sup6; Zellen/ml in PBS enthaltend 5 % fötales Kälberserum (FCS) und 0,1 % Natriumazid resuspendiert. Nach dem Waschen der Zellen mit dem obigen Puffer wurden 2 Volumen (in bezug auf das Zellpellet) des entsprechenden Antikörpers oder Antiserums zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 4ºC wurden die Zellen mehrfach mit dem obigen Puffer gewaschen und FITC-konjugiertes anti-Kaninchen-IgG der Ziege wurde zu der Zellsuspension zugegeben und 30 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Nach intensivem Waschen wurden die Zellen unter Anwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsorters (Ortho Cytofluorograf 50H) analysiert. Die Zellpräparationen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz gefärbt und unter Anwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsorters (Cytofluorograf 50H mit 2150 Computersystem; Ortho Diagnostic Systems, Inc. Westwood, MA) analysiert.
- Die flußcytometrischen Analysen der beiden Zellinien zeigten, daß die PRV-Zellen im Vergleich zu den MG-63-Zellen einen signifikanten Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität aufwiesen, wenn der Fibronektinrezeptor mittels indirekter Immunfluoreszenz "geprobt" wurde, wohingegen ein Unterschied in der Färbungsintensität der Vitronektionrezeptor im Vergleich zu den MG- 63-Zellen nicht beobachtet wurde.
- Für Vergleichszwecke wurde eine ähnliche Analyse wie oben beschrieben durchgeführt unter Verwendung von anti-Human-Leukozytenantigen (HLA) und anti-epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor- Antikörpern, welche keine signifikanten Unterschiede in der Menge dieser auf den Oberflächen dieser beiden Zellinien vorhandenen Antigene zeigte. Eine Bestimmung der Zellgrößen durch vorwärts und rechtwinklig gerichtetes Lichtgitter zeigten, daß die Zellen in Suspension ähnliche Größen aufwiesen, was darauf hinweist, daß die gesteigerte Färbung mit anti-Fibronektinrezeptor-Antikörpern tatsächlich die Gegenwart erhöhter Mengen des Rezeptors auf den PRV-Zellen reflektierte.
- Die Erhöhung der Anzahl von Fibronektionrezeptoren auf den PRV- Zellen wurde durch quantitative Immunpräzipitation von mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markierten Zellen und nachfolgender SDS-PAGE und Autoradiographie gezeigt.
- MG-63- und Peptid-resistente Variantzellen wurden aus der Kultur mit EDTA (1 mM) herausgelöst und mit PBS enthaltend CaCl&sub2; (1 mM) und MgCl&sub2; (1 mM) resuspendiert. Die Zellen (etwa 2 x 10&sup6;) wurden mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markiert, wie von Pytela et al., (1985), Cell, 40:191, beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird, und in PBS enthaltend SDS (0,1 %), Triton X-100 (0,5 %) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Natriumdesoxycholat (0,5 %) und Phenylmethylsulfonyl-fluorid (PMSF) (1 mM) 15 Minuten lang bei 4ºC lysiert. Die in Lösung gebrachten Zellen wurden mittels Zentrifugation von Zelltrümmern befreit und Zellextrakte, die gleiche Menge an ¹²&sup5;I-Radioaktivität aufwiesen, wurden mit den passenden Antikörpern durch Kopräzipitation mit Protein A-Sepharose immunpräzipitiert. Der Antigen/Antikörper-Komplex wurde dissoziiert durch Kochen in einem Probenpuffer (200 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8, enthaltend 3 % SDS, 10 % Glycerin und 0,001 % Bromphenolblau). Die Proben wurden mittels Elektrophorese unter reduzierenden (5 % 2-Mercaptoethanol) oder nicht-reduzierenden Bedingungen in 7,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgelen und nachfolgender Autoradiographie gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970), Nature, 227:680, analysiert.
- Die Molekulargewichte der durch die entsprechenden Antikörper immunpräzipitierten Proteine entsprachen den Molekulargewichten von gereinigtem Fibronektin und Vitronektin und zeigten die charakteristischen Migrationsmuster auf SDS-Polyacrylamidgelen, wenn sie einer Elektrophorese unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen zugeführt wurden, wie von Pytela et al. (1986), Science, 231:1559, beschrieben. Der Anstieg in der Anzahl der Fibronektionrezeptoren auf PRV-Zellen wurde durch densitometrisches Scannen der Autoradiographien quantifiziert, und die Menge einer jeden Untereinheit erwies sich als ungefähr 6-fach höher als es auf der Mutterlinie der MG-63-Zellen der Fall war. Eine ähnliche Analyse von PRV-Zellen, die in Abwesenheit von GRGDSP-Peptid gewachsen waren, zeigte, daß diese Zellen diesen Anstieg der Anzahl an Fibronektionrezeptoren beibehielten. Die Anzahl der Vitronektionrezeptoren auf den PRV-Zellen scheint ähnlich derjenigen der MG-63-Zellen zu sein, was mit der flußcytometrischen Analyse gemäß Beispiel III übereinstimmt.
- Für Vergleichszwecke wird darauf hingewiesen, daß eine Immunpräzipitation von Klasse 1 HLA-Antigen mit anti-HLS-Antikörpern keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl dieses Moleküls im Vergleich der beiden Zellinien zeigte; diese Daten stimmten bei fünf getrennten Experimenten überein.
- Die gesamte zelluläre RNA wurde aufbereitet durch das Guanidinium/Cäsiumchlorid-Verfahren von Ullrich et al., wie es von Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, auf das hier Bezug genommen wird, beschrieben wurde. Die RNA-Lösung wurde auf 20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, in 50 % Formamid (7 % (Vol./Vol.) Formaldehyd eingestellt und 15 Minuten lang bei 6500 inkubiert, um die RNA zu denaturieren. Anschließend erfolgten Verdünnungen mit 11 x SSC (1 x SSC ist 0,15M NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat) enthaltend 37 % Formaldehyd, und die RNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, welche mit 20 x SSC abgespült worden waren. Nach zweistündigem Backen bei 80ºC in einem Vakuumofen wurden die Filter mit [³²P]cDNAs als Sonde hybridisiert, wie nachfolgend für die Southern-Blot-Analyse beschrieben.
- Eine DNA Dot-Blot-Analyse der gesamten RNA aus PRV- und MG-63- Zellen unter Verwendung von mit ³²P-markierter cDNA für die α- Untereinheit des Fibronektinrezeptors zeigte, daß die Überproduktion des Fibronektinrezeptors in den PRV-Zellen im Vergleich zu den MG-63-Zellen mit einem höheren Gehalt an für den Fibronektinrezeptor spezifischen mRNA korrelierte.
- Eine SDS-PAGE von mit [³H]Leucin und ¹²&sup5;I Oberflächen-markierten MG-63- und PRV-Zellen zeigte keine weiteren hauptsächlichen Unterschiede in den Proteinprofilen der beiden Zellinien. Zusammengenommen legen die obigen Daten den Schluß nahe, daß die PRV-Zellen mehr Fibronektinrezeptoren als die MG-63-Mutterzellen exprimieren, wobei dieser Unterschied auf einen Unterschied in der Menge an mRNA für den Fibronektinrezeptor in den beiden Zellen zurückzugehen scheint.
- Um nachzuweisen, ob der Grund für die Überproduktion von Fibronektinrezeptoren in der Amplifizierung des Gens lag, wurde hochmolekulare DNA aus MG-63- und PRV-Zellen mit Restriktionsendonukleasen verdaut und mittels Southern-Blot-Analyse analysiert. Für die Restriktionsenzymanalyse wurden die hochmolekularen DNAs aus den Zellen nach den Verfahren von Blin und Stafford (1976), Nucleic Acids Res., 3:2303 isoliert. Die Restriktionsendonukleasen wurden von Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, bezogen und wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt. Nach vollständigem Verdau wurde eine Minigelanalyse durchgeführt. Die gespaltenen DNAs wurden einer Elektrophorese in 0,8 %-igen Agarosegelen in Tris/Borat/EDTA-Puffer unterzogen.
- Nach alkalischer Denaturierung und Neutralisierung wurde die DNA auf Nitrocellulosepapier überführt. Nach dem Backen der Filter für 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen wurden die Filter bei 42ºC in einer 50 % Formamid, 5x Denhardt's Reagens, 5x SSPE (1x SSPE ist 150 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA), 0,1 % SDS und 150 ug/ml gescherte und hitzedenaturierte Lachssperma-DNA enthaltenden Lösung prähybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte 16 Stunden lang bei 42ºC in der oben genannten Lösung enthaltend eine mit ³²P Oligo-markierte cDNA der α-Untereinheit des Fibronektionrezeptors, welche aus einem BamHI-Fragment von XP7 (Argraves et al. (1986), J. Biol. Chem., 261:12922) mit einer Größe von 675 Bp bestand, oder enthaltend eine mit ³²P Oligo-markierte cDNA der α-Untereinheit des Vitronektinrezeptors, welche aus einem 1283 Bp großen Fragment von XVNR10 (Suzuki et al. (1986), EMBJO., 4:2519) bestand.
- Nach der Hybridisierung wurden die Filter in 2x SSC, 1,5 mM Natriumcitrat, 0,1 % SDS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und anschließend 1 Stunde lang bei 65ºC mit 1x SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und eine Autoradiographie erfolgte bei -70ºC unter Verwendung eines Kodak XAR-5 Films und einer Verstärkerfolie (Cronex Lightning Plus, E.I. DuPont de Nemours, Newton, CN).
- Das Hybridisierungssignal für repräsentative Restriktionsenzymspaltungen der aus beiden Zellinie isolierten DNA wies eine gleiche Intensität auf, wenn sie mit den für die α-Untereinheiten des Fibronektinrezeptors oder des Vitronektinrezeptors kodierenden cDNAs als Sonden analysiert wurden. Dieselben Ergebnisse wurden in getrennten Versuchen unter Einsatz anderer Restriktionsenzyme erhalten. Die gesteigerte Expression des Fibronektionrezeptors in den PRV-Zellen scheint daher nicht an einer Genamplifizierung zu liegen, sondern liegt vermutlich entweder an der gesteigerten Transkriptionsrate des Gens für den Fibronektionrezeptor oder an der erhöhten Stabilität der mRNA für den Rezeptor.
- Wenn es zu keiner qualitativen Veränderung der Rezeptoren gekommen ist, sollten mehr Peptide zur Hemmung der Anheftung von PRV- Zellen an Fibronektin erforderlich sein, als es bei MG-63-Zellen der Fall ist, wohingegen ähnliche Konzentrationen an Peptiden erforderlich wären, um die Anheftung von beiden Zelltypen an Vitronektin zu inhibieren. Es wurden Analysen durchgeführt unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen nach dem Verfahren von Ruoslahti et al. (1982), Meth. Enz., 82:803, worauf Bezug genommen wird. 2 ug Fibronektin und 3 ug Vitronektin wurden zur Beschichtung einer jeden Vertiefung verwendet, wobei 10 000 Zellen pro Vertiefung eingesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt: TABELLE I Erforderliche Peptidkonzentration für eine 50 %-ige hemmung der maximalen Zellanheftung Substrat Fibronektin Vitronenktin
- Maximale Zellanheftung in Abwesenheit von Peptiden: 60 % für Fibronektin und 80 % für Vitronektin.
- Im Vergleich zu den MG-63-Zellen waren ungefähr 25 mal mehr Peptide erforderlich, um eine 50 %-ige Hemmung der maximalen Anheftung von PRV-Zellen an Fibronektin zu erreichen. Es waren jedoch nahezu identische Konzentrationen an Peptiden wirksam bei der Hemmung der Anheftung beider Zellinien an Vitronektin. Diese Daten zeigen, daß das Verfahren zur Auswahl der Peptide zu Zellen geführt hat, welche fester als die Mutterzellinie an Fibronektin haften, und sie legen nahe, daß die PRV-Zellen in Gegenwart des Peptids in Kultur vorwiegend den Fibronektinrezeptor benutzen, da die in dem Selektionsmedium anwesende Peptidmenge die Anheftung an Vitronektin deutlich inhibiert, jedoch nicht in der Lage ist, die Anheftung an Fibronektin zu hemmen.
- Die PRV-Zellen zeigten bestimmte, von der MG-63-Zellinie abweichende phenotypische Eigenschaften einschließlich einer veränderten Morphologie, einer langsameren Proliferationsrate, der Fähigkeit zur Bildung einer calcifizierten Matrix in vitro, einer gesteigerten Synthese von Typ I Kollagen sowie einem 50- 100 fachen Anstieg der Synthese von Prostaglandin E und einem Anstieg in der Produktion von Chondroitinsulfatproteoglycan. Diese Eigenschaften zeigen, daß die Zellen der PRV-Linie im Vergleich zu denen der MG-63-Linie in höherem Maße differenzierte Zelltypen waren. Diese Zellinie resultierte daher aus der durch den Auswahlmodus gemäß Beispiel I herbeigeführten Differenzierung einer Tumorzellinie.
- Die PRV-Zellen unterschieden sich in bemerkenswerter Weise von den MG-63-Mutterzellen und wiesen eine sternförmige Morphologie mit vielfältigen Fortsätzen auf, von denen einige um ein vielfaches länger waren als die Zellkörper. Diese morphologischen Eigenschaften sind denen von Osteozyten nicht unähnlich. Auf der anderen Seite sind die MG-63-Zellen im wesentlichen flache, polygonale Zellen, welche an Fibroblasten erinnern. Die PRV- Zellen schienen miteinander verwoben zu sein und die Zellfortsätze bildenden häufig Verbindungen miteinander. Zusätzlich schienen die PRV-Zellen stärker sekretorisch zu sein, wie anhand der granulären Natur des Cytoplasmas und der Fortsätze dieser Zellen geschlossen wurde. PRV-Zellen, die in Abwesenheit von GRGDSP-Peptid gewachsen waren, haben diese Morphologie für einen Zeitraum von mindestens 3 Monaten beibehalten, was darauf hinweist, daß diese morphologische Veränderung stabil ist. Es wurde eine Karyotyp-Analyse der beiden Zellinien durchgeführt, um sicherzustellen, daß sie miteinander verwandt sind, und um ferner festzustellen, ob es bei den PRV-Zellen im Vergleich zu den MG-63-Zellen zu irgendeiner größeren chromosomalen Änderung gekommen war. Die Chromosomen aus 5 MG-63- und 16 PRV-Zellen wurden analysiert. Diese Analysen zeigten, daß sämtliche der aus den beiden Zellinien untersuchten Zellen neun unterscheidbare Chromosomenmarker sowie Trisomien mehrerer Chromosomen und die Abwesenheit des normalen Chromosoms 9 gemeinsam hatten. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß die PRV-Zellen sich tatsächlich aus den MG-63-Zellen ableiteten. Keine auf die Genamplifizierung hinweisenden offensichtlichen chromosomalen Veränderungen wurden in den PRV-Zellen beobachtet.
- Die PRV-Zellen besitzen Wachstumseigenschaften, die von denen der MG-63-Zellen abweichen und proliferieren in einem sehr viel kürzeren Zyklus. Bei einer Ausplattierung in derselben anfänglichen Dichte erfordern sie 15 Tage bis zur Konfluenz im Vergleich zu 4 Tagen, die die MG-63-Zellen erforderten.
- Eine Analyse des Einbaus von mit Tritium markiertem Thymidin wurde durchgeführt. PRV- und MG-63-Zellen wurden bei gleicher Zelldichte auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von 1 uCi Methyl[³H]-Thymidin (2,0 Ci/mMol) ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37ºC über eine Reihe von Zeiträumen wurden die Zellen mit 10 mM EDTA abgelöst und mit einem Zellerntegerät auf Glasfibercellulosescheiben geerntet. Man ließ die Scheiben trocknen und die Radioaktivität wurde mittels flüssiger Scintillationszählung bestimmt. Während die MG-63-Zellen 82 397 ± 13 000 cpm/10&sup5; Zellen pro 24 Stunden eingebaut hatten, wiesen die PRV-Zellen lediglich einen Einbau von 8 330 ± 420 cpm/10&sup5; Zellen pro 24 Stunden auf. (Ergebnisse aus zwei getrennten Versuchen, wobei jeder Versuch Mittelwerte aus drei Messungen repräsentiert)
- Einzellschichten wurden mit PBS gewaschen und mit Alizarin Rot S im Hinblick auf Calciumeinlagerungen gefärbt, wie von McGee-Russell, (1955), Nature, 175:301, beschrieben. Kurz ausgedrückt, werden die Zellen 15 Minuten lang in einer 1:1-Mischung aus Formaldehyd (37 %) und absolutem Ethanol fixiert. Die Einzellschichten wurden in 50 % Ethanol überführt und anschließend schnell mit destilliertem Wasser abgespült. Die Einzellschichten wurden mit einer 2 %-igen Lösung von Alizarin Rot S, PH-Wert 4,2, beschichtet. Nach 5 Minuten wurden die Einzellschichten intensiv mit PBS gewaschen, um überschüssiges Färbemittel zu entfernen und den Hintergrund zu reduzieren. Die Stellen der Calciumablagerungen konnten als orange-rot gefärbte Präzipitate beobachtet werden. Die Menge an mit den Zellen assoziiertem Farbstoff wurde quantifiziert durch Lösung der Zellen in 0,1 % SDS und Messung der Absorption bei 465 nm in einem Spektrophotometer. Die Einzellschichten wurden ebenfalls zum Nachweis von Calcium durch den von Kossa-Silbertest gefärbt.
- Bei konfluentem Wachstum bilden die PRV-Zellen viele weiße Erhebungen auf der Oberfläche der Kulturplatten aus Kunststoff, welche mit dem bloßen Auge deutlich sichtbar sind. Diese Erhebungen färbten sich im Falle von Alizarin Rot S, einem Farbstoff, welcher Calciumablagerungen färbt, positiv. Die MG-63- Zellen wuchsen andererseits in Form flacher Einzellschichten, bildeten nicht diese Erhebungen bei konfluentem Wachstum und wurden mit Alizarin Rot S nicht angefärbt.
- Bei Beobachtung unter einem invertierten Phasenkontratmikroskop erschienen die Erhebungen auf den PRV-Zellen als ausgefranstes Material, welches mit Alizarin Rot S intensiv gefärbt wurde. Das intensive Färben der Erhebungen mit Alizarin Rot S liegt nicht nur einfach an dem Einfangen des Farbstoffes, da auch weniger konfluent wachsende Kulturen von PRV im Vergleich zu MG-63-Zellen ebenfalls mit Alizarin Rot S positiv gefärbt wurden. Die Menge an mit den PRV-Zellen assoziiertem Farbstoff, wie sie spektroskopisch bestimmt wurde, steigerte sich mit der Zelldichte, während der für die PRV-Zellen erhaltene Wert im wesentlichen auf dem Niveau des Hintergrunds lag. Ähnliche Kulturen wurden ferner auf Calciumablagerungen durch die Silberfärbung von von Ross gefärbt. Die Färbung mit diesem Verfahren war lediglich im Falle der PRV-Zellen positiv, wobei das Verteilungsmuster dasselbe war, wie das mittels Färbung mit Alizarin Rot S erhaltene. Durch Färbung der Kulturen mit dem Vitalfarbstoff Trypanblau wurde nachgewiesen, daß die intensiv mit diesen beiden Farbstoffen gefärbten Bereiche nicht auf die Gegenwart toter Zellen zurückzuführen war. Die meisten der in den mit Alizarin Rot S und den Farbstoffen von von Kossa gefärbten Bereichen vorhandenen Zellen schloßen das Trypanblau aus, was darauf hinweist, daß sie lebensfähig waren.
- Die Gegenwart von Calciumphosphat in den von den PRV-Zellen gebildeten Erhebungen wurde ferner aufgezeigt durch eine Energiedispersionsröntgenanalyse nach dem Verfahren von Russ, (1971), Amer. Soc. for Testing and Materials, Special Public. 45. Die durch dieses Verfahren erhaltenen Daten zeigten deutlich, daß diese Erhebungen der PRV-Zellen eine signifikant größere Menge an Calciumphosphat enthielten als Proben ähnlicher Größe von MG-63-Zellen. Das Verhältnis von Calcium zu Magnesium beträgt ungefähr 10 für die PRV-Zellen, wohingegen es bei den MG-63-Zellen bei nahe 1,0 liegt. In ähnlicher Weise beträgt das Verhältnis von Phosphor zu Schwefel ungefähr 11 für die PRV-Zellen und lediglich 2 für die MG-63-Zellen. Jedoch sind die Verhältnisse anderer Elemente wie das von Natrium zu Aluminium bei beiden Zellinien ähnlich (1,25 für PRV-Zellen und 1,4 für MG-63- Zellen). Diese Daten zeigen zusammen mit den Untersuchungen zur Aufnahme von &sup4;&sup5;Ca, aus denen sich ergeben hatte, daß die PRV- Zellen während eines 48-stündigen Zeitraums ungefähr 20-mal mehr Calcium als die MG-63-Zellen einbauten, die selektive Konzentration von Calciumphosphat in den Erhebungen der PRV-Zellen.
- Es wurden die hauptsächlichen Kollagentypen analysiert, die von MG-63- und PRV-Zellen synthetisiert worden waren. Kurz gesagt, wurden die Zellen 24 Stunden lang markiert mit 50 uCi/ml 5-[³H]- Prolin (9,3 Ci/mM) in DME enthaltend 10 % FCS und 100 ug/ml von sowohl Ascorbinsäure als auch β-Aminopropionitratfumarat. Das Medium wurde im Hinblick auf Essigsäure auf 0,5 M eingestellt und die Zellen wurden in dem Medium enthaltend 25 mM EDTA und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) dispergiert. Die Zellsuspension wurde 30 Sekunden lang bei 60 Hz mit Ultraschall behandelt und der unlösliche Rest mittels Zentrifugation entfernt. Gleiche Proteininengen aus MG-63- bzw. PRV-Zellen enthaltenden Aliquots wurden 3 Stunden lang mit 100 ug/ml Pepsin bei 4ºC behandelt. Die Spaltprodukte durch Pepsin wurden mit NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht und die durch die beiden Zellinien synthetisierten Kollagentypen wurden mittels SDS-PAGE auf 7,5 %-igen Polyacrylamidgelen wie oben beschrieben analysiert.
- Die Fluorogramme zeigten übereinstimmend zwei Hauptbanden, die mit den von beiden Zellinien synthetisierten α1(I)- und α2(I)- Kollagenketten komigrierten, aber die PRV-Zellen synthetisieren ungefähr 5-fach mehr Kollagentyp I. Daher scheint es so, daß, obgleich die hauptsächlich von den MG-63-Osteosarkomzellen synthetisierte Rollagenform das Typ I-Kollagen ist, die PRV-Zellen die Synthese dieses Kollagenstyps unreguliert haben, was mit ihrem differenzierteren Osteoblasten-ähnlichen Phenotyp und der calcifizierten Matrixbildung zusammenhängt.
- Da Prostaglandine, wie insbesondere PGE&sub2;, beim Knochenmetabolismus eine Rolle spielen, wurden die Mengen an PGE&sub2;, die von den MG-63-Osteosarkomzellen und den PRV-Zellen synthetisiert und ausgeschieden wurden, anhand des spezifischen Radioimmunoassayverfahrens von Mitchell und Flint, (1978), J. Endocrin., 76:111, auf das Bezug genommen wird quantifiziert.
- Radioaktivmarkierte Produkte des Metabolismus der ¹&sup4;C-Arachidonsäure und unveränderte Substrate wurden mittels Umtkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Cl8-&sup5;&sup4;u Bondapak-Säule (Waters, Milford, MA) getrennt, wie zuvor nach dem Verfahren von Mitchell et al. (1987), Prostaglandins, Leukotrines and Medicine, 27:197, beschrieben.
- Wie in Tabelle 2 dargestellt, ist die von den MG-63-Zellen ausgeschiedene Menge an PGE&sub2; ungefähr 50-fach höher als die aus den PRV-Zellen in Gegenwart von 10 % fötalem Kälberserum ausgeschiedene Menge. Der Unterschied ist sogar größer, wenn die Zellen unter Serum-freien Bedingungen kultiviert werden. Der ¹&sup4;C-Arachidonsäuremetabolismus der beiden Zellinien zeigte auch, daß die MG-63-Zellen im Vergleich zu PRV-Zellen einen signifikant höheren Prozentgehalt der Arachidonsäure in Prostaglandine umwandelten (Tabelle 3). Reine der Zellinien metabolisierte die Arachidonsäure auf dem Lipoxygenaseweg in nachweisbarem Ausmaß. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß es in den PRV-Zellen eine Drosselung des Phospholipidmetabolismus gibt und unterstützen eher die Rolle hoher Mengen an PEG&sub2; als Vermittler der Knochenresorption als der der Rnochenbildung. TABELLE 2 Von MG-63 bzw. PRV ins Kulturmedium freigesetztes Prostaglandin, PGE&sub2;-verwandt PGE&sub2; (pg/10&sup6; Zellen) Mit Serum (10 %) Ohne Serum *
- Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei getrennten Versuchen. Man ließ die Zellen auf eine ungefähr gleiche Zelldichte wachsen und entfernte dann das Rulturmedium und bestimmte den Gehalt an PGE&sub2; mittels spezifischem Radioimmunoassay wie beschrieben. Die Zellen wurden aus der Kultur mit 1 mM EDTA entfernt und die Zellzahl unter Anwendung eines Artek-Zellzählers ermittelt.
- * Die Zellen wurden in definiertem Medium kultiviert, welches aus Dulbecco's Minimum Essential Medium, F12 Nutrient Medium (Gibco) und einem Transferrin/Insulin/Selen-Mix (Collaborative Research Inc., Bedford, MA) bestand. Tabelle 3 Der Metabolismus von ¹&sup4;C-Arachidonsäure in Prostaglandine von MG-63- und PRV-Zellen Konzentration an ¹&sup4;C-Prostaglandin (cpm/mg Protein) % der gesamten, in Prostaglandine umgewandelten Marker
- Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei getrennten Versuchen. Die Zellen wurden 2 Tage lang in 2 % fötalem Kälberserum in Gegenwart von ¹&sup4;C-Arachidonsäure (5 x 10&sup5; cpm) kultiviert. Die Produkte des Metabolismus der ¹&sup4;C-Arachidonsäure wurden wie beschrieben gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt durch das Verfahren von Lowry et al.
- Eine der einmaligen Eigenschaften der PRV-Zellen besteht darin, daß sie Cluster bilden, welche wachsen und fransenförmiges Material ausbilden, in welches die Zellen eingebettet werden. Dieses Material ist reich an Calciumphosphat. Das lichtmikroskopische Erscheinungsbild der von den PRV-Zellen gebildeten calcifizierten Erhebungen ähnelt sehr stark dem von primären Osteoblastenkulturen aus fötaler Rattencalvarie sowie in Osteoblastenkulturen aus der Calvarie neugeborener Mäuse beobachteten. Die PRV- Zellen sind jedoch in der Lage zur Durchführung dieser Mineralisierung in Abwesenheit von exogenem β-Glycerophosphat, was ein wesentliches Erfordernis für die Matrixmineralisierung bei einigen primären Osteoblastenkulturen ist, was darauf hinweist, daß die PRV-Zellen über aktivierte biochemische Stoffwechselwege verfügen, die es ermöglicht, die basale Konzentration an Phosphat im Kulturmedium zu nutzen. Darüber hinaus sind die PRV- Zellen nicht bösartig. Im Falle der Injektion in nackte Mäuse sind sie im Gegensatz zu den MG-63-Mutterzellen, welche bei Injektion Tumore bilden, nicht zur Bildung von Tumoren in der Lage.
- Zwei zusätzliche Zellinien wurden dem selektiven Modus gemäß Beispiel I ausgesetzt: SKNSH, ein Neuroblastom, und HOS, ein Osteosarkom, wobei beide bei der American Type Culture Collection hinterlegt sind. Nach Wachstum in Medien enthaltend 2 mg/ml GRGDSP wurde bei den HOS-Zellinien eine Überproduktion an Rezeptoren festgestellt. Die SRSNH-Linie zeigte morphologische Veränderungen nach Wachstum in Medien, welche 1,5 mg/ml des RGD enthaltenden Peptids enthielten. Diese Ergebnisse stimmen überein mit den vergleichbaren Abweichungen hinsichtlich der gesteigerten Adhäsion und der größeren Differenzierung der MG-63-Zellinien zu einer vergleichbaren Zeit des selektiven Modus.
- Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, wird hervorgehoben, daß Veränderungen durchgeführt werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen, welcher lediglich durch die anhängenden Ansprüche beschränkt wird.
Claims (33)
1. Verfahren zur Auswahl von Zellen, die gesteigerte, aus der
erhöhten Anzahl funktioneller Rezeptoren resultierende
Adhäsionseigenschaften aufweisen, aus einer Mutterzellinie,
umfassend die Schritte:
a. Bereitstellen einer Probe von Zellen aus der
Mutterzellinie,
b. Kultivieren der Mutterzellen in Kulturmedien, die eine
anfängliche Konzentration eines Adhäsionsliganden in Lösung
enthalten, welcher in der Lage ist, an Rezeptoren auf der
Oberfläche der Mutterzellen in der Weise zu binden, daß die
adhäsive Funktion der Rezeptoren inhibiert wird, wobei die
anfängliche Konzentration so ausgewählt wird, daß weniger
als alle der Rezeptoren, die auf der Oberfläche der Zellen
mit einer erhöhten Anzahl von funktionellen Rezeptoren
vorhanden sind, gebunden werden, während eine ausreichende
Anzahl funktioneller Rezeptoren auf Zellen mit einer
normalen Anzahl funktioneller Rezeptoren gebunden werden, um die
Zellproliferation zu hemmen,
c. Auswählen derjenigen Zellen, die über ausreichend
funktionelle Rezeptoren verfügen, um in Gegenwart der
anfänglichen Konzentration des Adhäsionsliganden in Lösung zu
proliferieren,
d. sukzessives Rekultivieren der ausgewählten Zellen in
Kulturmedien, die sukzessiv ansteigende Konzentrationen des
Adhäsionsliganden in Lösung enthalten,
e. Auswählen derjenigen Zellen, die ausreichend
funktionelle Rezeptoren aufweisen, um in Konzentrationen des
Adhäsionsliganden in Lösung zu proliferieren, die normalerweise
die Zellproliferation hemmen, und
f. Etablieren von Zellinien aus den ausgewählten Zellen,
die somit gesteigerte, aus der erhöhten Anzahl an Rezeptoren
resultierende Adhäsionseigenschaften aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Adhäsionsligand in
Lösung ein Peptid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Peptid die
Aminosäuresequenz RGD als Adhäsionsbindungsstelle enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Peptid GRGDSP ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Adhäsionsligand in
Lösung ein Antikörper ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt der
Beschichtung von Behältern, in denen die Mutterzellen
kultiviert werden, mit einem die Adhäsion fördernden Material,
welches an dieselben Zelloberflächenrezeptoren bindet wie
der Adhäsionsligand in Lösung.
7. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den zusätzlichen
Schritt des Bereitstellens eines den Rezeptor in Kultur
blockierenden Liganden, welcher an Zelloberflächenrezeptoren
bindet, die nicht mit dem Adhäsionsliganden in Lösung
korrespondieren.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der den Rezeptor
blockierende Ligand in ausreichender Konzentration bereitgestellt
wird, um an im wesentlichen alle seiner entsprechenden
Zelloberflächenrezeptoren zu binden.
9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der den Rezeptor
blockierende Ligand an die Fibronektinrezeptoren bindet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mutterlinie eine
Tumor-Zellinie ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mutterzellinie eine
Osteosarkom-Zellinie ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mutterzellinie MG-63
ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mutterzellen
nichtmaligne Zellen sind, welche in der Lage sind, in Kultur zu
wachsen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mutterzellinien
nicht-maligne Zellen sind, welche eine Verminderung der
Adhäsionszelloberflächenrezeptoren aufweisen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Verminderung der
Adhäsionszelloberflächenrezeptoren ein Ergebnis des
Wachstums der Mutterzellen in Kultur ist.
16. Isolierte Zellinien mit einer Menge an funktionellen, den
Adhäsionsliganden bindenden Rezeptoren, die größer ist als
die Anzahl der funktionellen, den Adhäsionsliganden
bindenden Rezeptoren normaler Zellinien desselben Zelltyps.
17. Verfahren zur Förderung der Differenzierung von Zellen aus
Mutterzellinien aufgrund einer erhöhten Anzahl an
Rezeptoren, umfassend die Schritte:
a. Bereitstellen einer Probe von Zellen aus der
Mutterzellinie,
b. Kultivieren der Mutterzellen in Kulturmedien, die eine
anfängliche Konzentration eines Adhäsionsliganden in Lösung
enthalten, welcher in der Lage ist, an Rezeptoren auf der
Oberfläche der Mutterzellen in der Weise zu binden, daß die
adhäsive Funktion der Rezeptoren inhibiert wird, wobei die
anfängliche Konzentration so ausgewählt wird, daß weniger
als alle der Rezeptoren, die auf der Oberfläche der Zellen
mit einer erhöhten Anzahl von funktionellen Rezeptoren
vorhanden sind, gebunden werden, während eine ausreichende
Anzahl funktioneller Rezeptoren auf Zellen mit einer
normalen
Anzahl funktioneller Rezeptoren gebunden werden, um die
Zellproliferation zu hemmen,
c. Auswählen derjenigen Zellen, die ausreichend
funktionelle Rezeptoren aufweisen, um in Gegenwart der anfänglichen
Konzentration des Adhäsionsliganden in Lösung zu
proliferieren,
d. sukzessives Rekultivieren der ausgewählten Zellen in
Kulturmedien, die sukzessiv ansteigende Konzentrationen des
Adhäsionsliganden in Lösung enthalten,
e. Auswählen derjenigen Zellen, die ausreichend
funktionelle Rezeptoren aufweisen, um in Konzentrationen des
Adhäsionsliganden in Lösung zu proliferieren, die normalerweise
die Zellproliferation hemmen, und
f. Etablieren von Zellinien aus den ausgewählten Zellen,
die im Vergleich zu den Mutterzellen aufgrund der erhöhten
Anzahl an Rezeptoren eine gesteigerte Differenzierung
aufweisen.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Adhäsionsligand in
Lösung ein Peptid ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Peptid die
Aminosäuresequenz RGD als Adhäsionsbindungsstelle enthält.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Peptid GRDGSP ist.
21. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Adhäsionsligand in
Lösung ein Antikörper ist.
22. Verfahren nach Anspruch 17, ferner umfassend den Schritt des
Beschichtens des Substrates der Behälter, in denen die
Mutterzellen kultiviert werden, mit einem die Adhäsion
fördernden Material, welches an dieselben Zelloberflächenrezeptoren
bindet wie der Adhäsionsligand in Lösung.
23. Verfahren nach Anspruch 17, ferner umfassend den
zusätzlichen Schritt des Bereitstellens eines den Rezeptor in Kultur
blockierenden Moleküls, welches an Zelloberflächenrezeptoren
bindet, die nicht mit dem Adhäsionsliganden in Lösung
korrespondieren.
24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das den Rezeptor
blokkierende Molekül in einer ausreichenden Konzentration
bereitgestellt wird, um an im wesentlichen alle seiner
entsprechenden Zelloberflächenrezeptoren zu binden.
25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das den Rezeptor
blokkierende Molekül an die Fibronektinrezeptoren bindet.
26. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Mutterzellinie eine
Tumor-Zellinie ist.
27. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Mutterzellinie eine
Osteosarkom-Zellinie ist.
28. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Mutterzellinie MG-63
ist.
29. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Mutterzellen
nichtmaligne Zellen sind, welche in der Lage sind, in Kultur zu
wachsen.
30. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Mutterzellinien
nicht-maligne Zellen sind, welche einen verminderten
Differenzierungsgrad aufweisen.
31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Verminderung des
Differenzierungsgrads ein Ergebnis des Wachstums der
Mutterzellen in Kultur ist.
32. Verfahren zur Steigerung der Differenzierung von Zellen aus
einer Zellinie, umfassend das Auswählen von Zellen mit einer
erhöhten Anzahl von Zelladhäsionsrezeptoren.
33. Verfahren zur Förderung einer Differenzierung von Zellen aus
einer Zellinie, umfassend die Schritte:
a. Bereitstellen eines Liganden, welcher in der Lage ist,
an einen Zelloberflächenrezeptor, der von Zellen der
Zellinie exprimiert wird, selektiv zu binden,
b. Reagierenlassen des Liganden mit Zellen der Zellinie,
c. Identifizieren derjenigen Zellen, an die hohe
Konzentrationen des Liganden gebunden sind,
d. Rekultivieren der identifizierten Zellen in Gegenwart
des Liganden, und
e. Wiederholen der Schritte b bis e, bis die Zellen den
gewünschten Differenzierungsgrad aufweisen.
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Family Cites Families (9)
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US5049659A (en) * | 1988-02-09 | 1991-09-17 | Dana Farber Cancer Institute | Proteins which induce immunological effector cell activation and chemattraction |
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