JP6955251B2 - 細胞解離剤、細胞解離方法および細胞シートの製造方法 - Google Patents
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Description
細胞外マトリックスを構成するタンパク質(例えば、フィブロネクチンなど)が、細胞の表面上に存在する受容体(例えば、インテグリンなど)に結合することで、細胞と細胞外マトリックスとの間で接着が生じる。このとき、上記細胞外マトリックスを構成するタンパク質の部分配列としてRGD(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸)配列が存在し、当該RGD配列に対して上記受容体が結合することが知られている。
本発明の一実施形態にかかる細胞解離剤は、「細胞が接着している基材から当該細胞を解離させるための薬剤」を意図する。また、「細胞を細胞培養用基材の表面(培養液と接触する面)から解離する効果」を、以下「細胞解離効果」と称する。
本実施形態の一態様に係る細胞解離方法は、基材に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程(以下、接触工程1と称する)を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる1種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものである。
本発明の細胞シートの製造方法は、基材にシート状に接着している細胞(換言すれば、細胞と細胞との間の接着が形成されている細胞)と、細胞解離剤とを接触させる工程(以下、接触工程2と称する)を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる1種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものである。
以下の実験を行うために、予め細胞を培養した。本実施例においては、ヒト胎児腎細胞HEK293、ラット副腎褐色細胞腫PC−12、マウス胎児線維芽細胞NIH/3T3を用いた。
アミノ酸またはアミノ酸の誘導体が有する細胞解離効果を検証した。
HEK293、PC−12またはNIH/3T3と、細胞解離剤とを接触させて、細胞解離効果を検証した。
細胞解離後の細胞の生存率を算出するべく、細胞解離剤を用いてディッシュ表面から細胞を解離させ、当該細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液に対して、410gにて5分間遠心分離処理を行った。遠心分離処理の後、該懸濁液から上清を除去し、沈殿している細胞に対して培地を1mL加えて、細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液のうち、20μLを同量のトリパンブルー染色液(SIGMA社 T6146−5Gを終濃度0.5%になるようPBSで希釈したもの)と混合した後、室温下で1分間静置した。血球計算版を用いて、顕微鏡下にて全細胞の数と、染色された細胞(死細胞)の数とをそれぞれ計数し、得られた値より生存率を算出した。
細胞解離後の細胞の接着性を確認するべく、細胞解離剤を用いてディッシュ表面から細胞を解離させ、当該細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液に対して、410gにて5分間遠心分離処理を行った。遠心分離処理の後、該懸濁液から上清を除き、沈殿している細胞に対して培地4mLを加えて、細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液のうち、2mLを新しいディッシュに添加し、37℃にて10分間インキュベートした。ディッシュから培地を除去し、PBSにてディッシュを一回洗浄した後、ディッシュ上に残存している細胞数を計数した。
本実施例において用いられた細胞解離剤により、基材の表面から解離されたPC−12が、解離後正常に分化(具体的には、神経突起の成長)するかを調べた。上述の培地へ、神経成長因子であるNerve Growth Factor (NGF)を終濃度50ng/mLとなるように添加した。該培地中にてPC−12を3日間培養した後、顕微鏡を用いて細胞の形状を確認した。
100%コンフルエントの状態に培養したNIH/3T3細胞の培養ディッシュに、100mMのD−アルギニンまたはL−アルギニンを含有するHEPES緩衝液を添加し、37℃下にて5分間インキュベートした。
Claims (4)
- 細胞が接着している基材から当該細胞を解離させるための細胞解離剤であって、
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる1種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞解離剤。 - 上記誘導体は、アグマチン、カダベリン、ヒスタミン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、メタナミン、エタナミン、イソブチルアミン、イソアミルアミン、2−メチルブチルアミン、エタノールアミン、1−アミノ−2−プロパノール、シスタミン、3−メチルチオプロピルアミン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノブチルアミド、ピロリジン、フェネチルアミン、トリプタミン、または、チラミンであることを特徴とする、請求項1に記載の細胞解離剤。
- 基材に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程を有し、
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる1種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞解離方法。 - 基材にシート状に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程を有し、
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる1種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞シートの製造方法。
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