JPH03500244A - 細胞接着性が増大した細胞の選別 - Google Patents
細胞接着性が増大した細胞の選別Info
- Publication number
- JPH03500244A JPH03500244A JP63508675A JP50867588A JPH03500244A JP H03500244 A JPH03500244 A JP H03500244A JP 63508675 A JP63508675 A JP 63508675A JP 50867588 A JP50867588 A JP 50867588A JP H03500244 A JPH03500244 A JP H03500244A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- adhesion
- cell line
- ligand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞接着性が増大した細胞の選別
発明の背景
本発明は細胞接着システムに関し、さらに詳しくは細胞接着性が増大した細胞に
関する。
細胞外マトリックヌ成分に対する細胞の接着は、細胞***、細胞分化、ならびに
胚子円細胞移動および細胞選別のような細胞挙動パターンの基本であるように忘
われる。さらに、腫瘍の侵襲および転移のようなある種の異常な細胞の挙動は、
細胞外マトリックスへの細胞の接着機構の変化によって住じるものと考えられる
。
細胞接着は大部分、細胞外マトリックス中の細胞接着促進分子またはリガンドを
認識し、それに結合する細胞表面受容体によって仲介されると思われる。多数の
このような接着促進分子、たとえばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニ
ンおよびコラーゲンがこれまで同定されてきた。現在では、これらの各種の付着
促進分子はアミノ酸配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(Arg −
Gly −AspまたはRGD )を共有し、これが細胞結合ドメイン1として
機能し、細胞がこれらの分子を認識して結合する能力を説明するものと考えられ
ている。
接着性細胞にはその表面にRGDに向けられた多数の種類の異なる受容体が並ん
でいて、それらの比率が細胞種に特異的である。これらの受容体はすべて、それ
らのリガンドのRGD含有ドメインに!合するが、それでもなおそれらの特定の
細胞接着促進分子に特異性を示す。RGD配列を含む合成ペプチドで基板を4覆
すると細胞接着の促進に使用することができるし、それを溶解型で与えると細胞
の付着を阻害することができる。
細胞外マトリックス成分への結合能は細胞表面受容体にあるので、細胞接着の程
度は細胞の表面上に存在する受容体数の定量的な変化によって影響されるはずで
ある。受容体のレベルを増大させた細胞系を得る方法があれば、結合能が増大し
、細胞表面受容体のとくに有用な供給源を与える細胞を提供するのにきわめて役
に立つものである。さらに、このような方法は、その病因が受容体数の低下にあ
る異常細胞系または受容体数の低下の結果として分化した正常細胞系における受
容体数を増加させるのに使用することができる。本発明は、これらの要求を満た
し、同時ICそれに関連した利点を提供するものである。
発明の要約
本発明は、母体細胞系からの細胞を、細胞上の接着表面受容体のすべてに結合す
るには至らなVa度で溶解させた接着リガンドを含む培地中で培養し、溶液中の
接着リガンド濃度を増加させた培地中で継続的に再培養してこのような培地中で
生育できる細胞を選択することにより、接着性が増大した細胞を選別する方法を
提供する。溶解させた接着リガンドとしては、たとえば、RGD結合部位を含有
するペプチY、または接着受容体の接着機能を阻害するような抗体を使用するこ
とができる。さらに、本発明は、細胞の分化を促進するための類似の方法を提供
する。このような方法で生成された細胞系も提供される。
本発明は他の態様としてさらに、高レベルの細胞接着受容体を表面に発現する細
胞を選択し再培養することによる細胞系の細胞分化の促進方法を提供する。たと
えば、細胞を、細胞接着受容体に特異的なリガンドに曝露して、リガンrと細胞
間の結合を行わせる。リガンVは接着受容体の結合パートナ−でもまた受容体に
結合する抗体でもよく、結合は必ずしも受容体の結合能を阻害するものでなくて
もよい。最高の比率のリガンドが結合した細胞を同定し、選別して、リガンドの
存在下に再培養する。リガンドの存在下におけ゛る培養、リガンドの高レベルの
結合を示す細胞の同定およびこれらの細胞の再培養の工程は、所望の細胞表面受
容体濃度および分化レベルが達成されるまで反復される。このような細胞を同定
する一方法としては、螢光標識リガンドに結合させ、細胞表面に発現した螢光の
レベルに基づbて自動m胞選別装fKより細胞を分離する方法があるが、別法と
して本技術分野で知られる他の方法を使用することもできる。
図面の簡単な説明
第1図:抗体によって認識されるMG−63およびPRV細胞表面抗原の免疫沈
降。MG−63およびPRV細胞(約105個)を1 mciの1251で表面
標識し、溶解し、抗原を例)りに記載するようにして免疫沈降させた。免疫沈降
は、非還元条件(A)または還元条件(BおよびC)下にSDS −FAGΣで
分析した。(AおよびB)レーン1−2、抗フィブロネクチン受容体抗体による
免疫沈降;レーン4、抗ビトロネクチン受容体抗体による免疫沈降;レーン1お
よび4、MG−6363細胞(亜集密的培養);レーン2および5、PRV細胞
(集密的培養);レーン3および6、PRV )[胞(亜集密的培養)。(C)
MG−63(レーア1 )およびPRV (レーン2)細胞の亜集密的培養の抗
−HLa抗体による免疫沈降。
発明の詳細な説明
本発明は、溶解した接着リガンドの存在下に生育できる細胞を選択することによ
る、接着性が増大し、分化の増進状態にある細胞系の提供方法に関する。RGD
はフィブロネクチンやビトロネクチンのような多数の接着促進m胞外成分に対す
る結合ドメインである。細胞表面上の受容体は、このような接着促進分子に選択
的に結合する。
増殖するためには、正常な細胞は基板に付着しなければならなり、培養培地中に
RGD含有ペプチドが存在すると、大部分の細胞はRGD含有基析に付着するこ
とができず、またそれから脱着してしまう。すなわち、大部分の細胞は培養中に
はRGD依存性機構を介して付着するので、十分な@度、一般的には約1鮨の濃
度で、RGDは培養中の細胞の増殖を阻害する。この視象は詳細に検討されてき
た(たとえばHaymanら:J。
Ca’ll Bioユ、、100:1948参照。この文献は参考として本明細
書に導入する)。類似の機構によって細胞の付着は、他の接着リガンドにより、
または問題の接着受容体に特異的に結合して受容体の結合機能と干渉する抗体に
より、阻害される。
本発明は、細胞系を、溶解した接着リガンドたとえばRGDペゾチドに濃度を継
続的に増大させて曝露し、このような濃度の接着リガンドに付着できて増殖でき
る細胞を選択し再培養することにより、接着性が増大した細胞を選別する方法を
提供する。このような細胞ではその表面に発現する接着受容体の数が増加する。
多くの受容体によって認識されることが知られているペプチドGRGD8PをR
GD含有ペプチドとして使用してきたが、他のRGD含有ペゾチドを用いること
もできる。
ある種の受容体に特定の親和性を有することが知られているペプチドは、それら
の特定の受容体を増加させる選択的圧を発揮する。
MG−63細胞系の細胞を含めた多くの細胞が、7ィブロネクチンまたはフィブ
ロネクチン様物質を分泌し、それを介して基板に付着することにより、培養中に
基板に付着することが知られている。溶解した只GD含有ペプチドは、フィブロ
ネクチン受容体に結合するために分泌されたフィブロネクチンと主として競合し
、細胞に、たとえばフィブロネクチン受容体の発現の増加を介して接着性を増大
させる上述の選択圧を生じさせる。類似の選択状態は、フィブロネクチン受容体
と結合するために分泌されるフィブロネクチンと同様に競合し、受容体の接着機
能を阻害する抗−フィブロネクチン受容体抗体を溶液中に与えることによっても
確立させることができる。
他のRGD特異的紺胞表面受容体または非RGD %異的細胞表面受容体が関連
する接着性増大のための選択状態も利用できる。たとえば、培養基板を接着リガ
ンドたとえばビト;ネクチ/もしくはその誘導体で被覆し、さらにビトロネクチ
ンもしくはビトロネクチン受容体特異的リガンドまたはビトロネクチン受容体特
異的抗体を、ビトロネクチン受容体のすべてではない一部に結合するような濃度
で溶液中に提供することができる。
別法として、表面自体をビトロネクチン受容体特異的抗体で被覆することもでき
る。細胞が代わりのフィブロネクチン仲介機構を介して基板に付着しないことを
保証するためには、フィブロネクチン受容体特異的リガンドまたは抗体も溶液中
に存在させて実質的にすぺてのフィブロネクチン受容体を遮断する。ビトロネク
チン受容体特異的リガンドまたは抗体の濃度を継続的に増加させて培養を行うと
、ビクロネクチン特異的細胞表面受容体に関連した細胞の接着性が増大する。
別法として、基板を非1’tGD特異的リガンYまたは非RGD特異的受容体に
対する抗体で被覆し、相当するリガンドまたは抗体を培養液中に存在させること
ができる。細胞付着の固有の機構、たとえばフィブロネクチンの分泌によって仲
介される機構は、適当なりがンドまたは別の接着受容体たとえばフィブロネクチ
ン受容体に結合する適当な抗体な適轟量存在させることによって遮断できる。
ある種の細胞は、培養液中で生育する細胞の付着を仲介するのに有用なフィブロ
ネクチン以外の接着促進リガンドを分泌することが知られている。この!うな細
胞系では、これらのリガンドおよび受容体に関連した接着性の増大は、分泌され
るリガンド、リガンドに類似のペプチド、または問題のリガンドに相当する受容
体に特異的な抗体の継続的濃度で培養することによって促進することができる。
類似の方法を細胞分化の促進に使用することもできる。このような説明によって
限定を意図するものではないが、異常な比較的未分化の悪性細胞は、その表面上
の接着受容体数の減少を示すことがある。このような異常細胞集団から接着性が
増大した細胞を選択することによって、細胞分化が促進される。このようにして
接着性が増大した有用な細胞系が誘導され、このような細胞系では分化特性が高
められる。さらに、正常な未分化幹細胞は、このような選択状態に曝露すること
により分化を強制することができる。また、細胞培養時に脱分化しやすい細胞系
は、溶解させた接着リガンドたとえばRGD含有リガンドに曝露することによっ
て分化状態に維持させることができる。
この方法はまた、in v:LvOでの治療用に、たとえば異常細胞の接着細胞
表面受容体数または分化レベルを増大させるために適用できる。・たとえば溶解
させた接着リガンドを生体内の適当な部位に導入して標的細胞に接触させること
ができる。接着細胞表面受容体に結合させることによって、リガンドは標的細胞
の解離を生じさせるか、または接着受容体の正常な表現型の発現が増加し、正常
な分化状態の細胞の増殖が選択的に促進される。
たとえばMG−63ヒト骨肉腫細胞のような細胞を、溶解した接着リガンドたと
えばGRGDSFのようなRGD含有ペプチドの細胞付着阻止濃度での存在下に
おける付着および生育によって段階的に選択すると、溶解した接着リガンドの存
在下に生育できる細胞が選択される(このような細胞を以下、一般的にペプチド
抵抗性変異細胞またはPRV細胞と呼ぶ〕。これらのPRV細胞では、母体細胞
に比べて、細胞表面受容体たとえばフィブロネクチンに対する受容体を過剰に産
生ずる。
MG−63細胞から誘導される、MG−63,3Aと呼ばれる細胞系の場合には
、この過剰産生は、受容体をコードするmRNAレベルの増加によるものである
。
しかしながら、この増加はフィブロネクチン受容体遺伝子の増幅によるものでは
なり0
PRv細胞は、フィブロネクチン受容体の過乗産生、GRGDEiPペプチドに
よるフィブロネクチン被覆表面からの脱着に対する抵抗性および形態学的変化を
ほぼ6カ月維持し、その最後の3力月には、それらはGRGDSPペプチドの不
存在下にも生育した。
本明細書で用いられる「接着リガンド」の語は、細胞接着を仲介する機能をもつ
受容体に結合する任意の分子を意味する。「接着リガンド」には、天然の接着促
進性化学体、それらの誘導体、接着細胞表面受容体に対して特異的な抗体、また
は接着関連細胞表面受容体に結合できる他の任意の化学的が包含されるが、これ
らに限定されるものではない。
工業的利用性
培養細胞の分化を促進する方法を提供することにより、本発明は、分化機能を果
たすことができる培養体を獲得し、維持することを可能にする。このような機能
性能力は、たとえば、分泌生成物を得るため組換えrツムを有する細胞を培養す
る場合に重要である。さらに、完全に分化した機能性細胞は、ある種の移植に使
用するために必要である。たとえば、皮膚移植体用の上皮細胞、血管移植片用の
内皮細胞、糖尿病患者に移植するだめのインスリン分泌膵臓細胞のような分泌細
胞、および培養前置換のだめの骨生成細胞等がある。
本発明の方法は、接着性の増大したM胞を与え、これらはある種の移植操作にと
くに適していて、直ちに使用できる受容体の原材料を提供する。
例 I
RGD含有ペゾチドによる脱着に抵抗性を示す細胞の選別
ヘキサペプチドGRGDSPは、自動ペプチド合成装置を用い、製造業者によっ
て指示された化学操作に従って合成した(430A型; Applied Bi
osystems。
Po5ter C1ty、 CA )。このペプチドはそのRGD部位を介して
様々な受容体に結合することが知られている。
本明細書で用いる略号は次のとおりである。
D□アスパラギン酸
E□グルタミン酸
ヒト骨肉腫MG−63細胞はThe American TypeCultur
e Co:Llection (Rockvi’lls、 M:D )から入手
した。この細胞は、10%熱活性化ウシ胎仔血清(PBS)(Ti5sue c
ulture Biological、 Tulare、CA )、グルタミン
(2mM )、ペニシリン(100U/mJ)およびストレプトマイシン(10
C1,!!9/1m)(工rvineSciehtific、 5anta A
na、 CA )を補充したダルベツコ改良イーグル培地(DME )中で培養
した。定常的継代培養では、細胞単層をリン酸緩衝食塩溶液(PBS )(15
QmMNaC1,i QmMリン酸ナトvsyb、p)17.3)で洗浄し、E
DTA (PBS中i mM )で分離させた。
MG−63細胞はGRGDSPの存在下に培養した。このペプチドはDME中に
溶解し、炭酸水素ナトリウム(7,5%)で−を7.0に調整した。この溶液は
ついで使用前に滅菌−a過した。
単層培養MO−453細胞にヘキサペプチドGRGDSPを0.85 mMの濃
度で加えると、細胞は基板から脱着プチド(0,85mM )を含む新鮮な培地
を残った細胞に加えると、また一部の細胞が基板から脱着した。これらの残った
わずかな細胞をペプチドの存在下に培養すると、最終的に数個の細胞が付着して
、増殖することが認められた。集密状態に遅したならば、細胞をEDTAで脱着
させ、ペプチドの存在下に継代培養した。
ヘキサペプチドの濃度を次に0.85 mMから5.[l mMへ、0−85m
Mずつ5力月間を要して上昇させ、各回、付着した細胞を選択した。
長期間にわたる培着に際してのペプチドの安定性に関する問題を調べるために、
ペプチドの存在下、数日間細胞の生育に使用された培地を、以前にペプチドに曝
露されたことがないMG−63細胞に適用した。これらの細胞は培養基板から直
ちに脱着し、ペプチドが培養液中で数日後にもなお活性であることを示した。
5、QmMのGRGI)SPの存在下に付着できて増殖できるNG−63由来の
PRV細胞ハM G−63,3j’−ト命名された。
例 1
細胞接着受容体に特異的な抗体による脱着に抵抗性を示す細胞の選別
フィブロネクチン受容体IC%異釣で、この受容体の接着機能を阻害できる抗体
は、例■の方法で産生させ、相当する受容体の接着機能を阻害するかどうかを調
べてさらにスクリーニングした。別法として、類似の性質を有するモノクローナ
ル抗体を本技術分野でよ(知られた方法によって生成させることもできる。例1
の継代細胞培養の方法を反復し、溶液中のRGD含有ペプチドをフィブロネクチ
ン受容体特異的抗体に置換する。
初期濃度は、抗体特異的受容体のすべてへの抗体結合を促進しないように選択さ
れる。母系の細胞を脱着させて殺滅するのに十分な抗体濃度で付着し生存できる
細胞は、接着性の増大を示す。
例 ■
非フィブロネクチン接着ペプチドによる脱着に抵抗性を示す細胞の選別
適当な細胞を選択して培養する。細胞が基板への付着性を与える非フィブロネク
チン接着促進リガンドを分泌できない場合には、培養容器を適当な接着リガンド
で被覆する。別法として、基板を問題の受容体と反応性の抗体で被覆してもよい
。細胞が問題の受容体に相当するリガンドな自発的に分泌できる場合には、この
ような被覆は必要ではないが、被しても差支えない。
細胞は、問題の受容体に相当する接着リガンドを、問題の受容体のすべてには結
合しないように選択した濃度で溶解して含有する初期培地中で生育させる。この
培地中で付着、増殖できる細胞を選択し、問題のリガンドの濃度を順次増加させ
た培地中で再培養する。
別法として、I’、’5題の受容体に対する抗体を溶液中に加えてもよい。さら
に、接着リガンドが細胞によって直接分泌される場合でも、接着リガンド(また
は接着受容体に相当する抗体)を、細胞の付着を防止するために溶液中に加°え
ることができる。
例 ■
非RGDペゾチド変異体中での同型培養同型培養を、以前に細胞付着促進剤とし
て不活性で培養基板からの細胞の脱着には無効であることが明らかにされている
( Haymanら: 1985、J、 Ce11Biol 100 : 19
48 )へキサペプチド変異体GRaEsP (Eはグルタミン酸である)の同
濃度の存在下に実施した。このGRGESPペプチドはMO−65細胞には何の
影響も与えず、NG−(53細胞は正常に生育して、このペプチドの不存在下に
生育させたMG−63と鎗別できなかった。
例 V
フィブロネクチンおよびビトロネクチン受容体の流動細胞計測分析による定量
細胞上のフィブロネクチンおよびビトロネクチン受容体は、アフィニティーで精
製した、これらの2種の受容体と反応するポリクローナル抗体を用いて分析した
。使用した一次抗体は、アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗−MG−6
3ビトロネクチン受容体および抗−MG−63フィブロネクチン受容体抗体、ウ
サギ抗−マウス上皮成長因子受容体抗血清、ならびに抗−HLEi抗体であった
。フィブロネクチン受容体およびビトロネクチン受容体はPyt elaらの方
法(Cell。
40:191.1985およびPNAS、 82:5766.1985;これら
の記載は参考として本明細に導入する〕によって単離した。抗体は、標準操作を
用い、ウサギに逼蟲な免疫原を注射して製造した。正常ヒトタンパク質に対して
生成した抗血清を吸着させるとフィブロネクチン受容体またはビトロネクチン受
容体のいずれかに特異的な抗体が単離された。
二次抗体としては、ヤギに標準プロトコールでウサイエgGを注射し、抗体を標
準プロトコールでF工TCに接合させて製造したアエTC接合ヤギ抗−ウサギ1
gGを使用した。F工TCの螢光は緑色の螢光として検知された。生育不能細胞
の標識にはヨウ化プロビジウムを使用し、赤色の螢光として検知した。
細胞はi mM EDTAで収穫し、5%ウシ胎血清清(EC8)および0.1
%ナトリウムアジドを含有するPBS中に2.5X105〜I Xl 06個/
1rLlの濃度に再懸濁した。細胞を上述の緩衝液で洗浄したのち、それぞれの
抗体または抗血清2容量(細胞ベレツトに対して)を加えた。1時間4℃でイン
キュベートシタのち、細胞を上記緩衝液中で数回洗浄し、細胞懸濁液にF工TC
接合ヤギ抗−ウサギエgGを添加して30分間4℃でインキュベートした。完全
に洗浄したのち、螢光活性化細胞ソータ=(0rthOCytofluorog
raf 50 B )を用いて細胞を分析した。細胞プレバレージョンは間接免
疫螢光によって染色し、螢光活性化細胞ソーター(Cytofluorogra
f 5 Q Hと2150:7ンビューターシステム; 0rtho Diag
nostic +9ystem、工ne、。
Westwood、 MA )を用因て分析した。
2種の細胞系の流動細胞計測分析の結果は、フィブロネクチン受容体を間接免疫
螢光で調べた場合PRV細胞はMO−63細胞に比べて螢光の平均強度が有意に
増加していたが、ビトロネクチン受容体の染色量にはMG−63細胞に比べて差
が認めらな−ことを示した。
比較のために、抗−ヒト白血球抗原(HLA )および抗−上皮成長因子受容体
抗体を用して上記のように同様の分析を行ったが、これらの2種の細胞系の表面
に存在するこれらの抗原の量には有意差はみられなかった。前方および直角光散
乱による細胞サイズの測定では細胞は懸濁液中で同じサイズを有することが明ら
かにされ、抗−フィブロネクチン受容体抗体での染色の増加は実際に、PRV細
胞上の受容体量の増加を反映するものであることが示された。
例 ■
免疫沈降によるフィブロネクチン受容体の定量PRV細胞上のフィブロネクチン
受容体数の増加は、125ニ一表面標識細胞からの定量的免疫沈降、っ−でSD
S −PAGEおよびオートラジオグラフィーによって測定された。
MG−63およびペプチド抵抗性変異体細胞を培養液からEDTA (i mM
)で脱着させ、CaC12(1mM )およびMgCl2 (1mM )を含
有するPBSに再懸濁した。
細胞(約2X’IO’個)をP7tel&ら(celz、 40 :191.1
985;これは参考として本BAm書に導入する)に記載されたように1251
で表面標識し、5DS(0,1%)、TritOn X −i D O(D−5
%) (SigmaChemical Co、、 St、 Louis、 MO
) 、デオキシコール酸ナトリウム(0,5%〕およびフェニルメチルスルホニ
ルフルオリド・(PMSF)(’1mM)を含有するPBS中、4℃に15分分
間−て溶解した。溶解した細胞から遠心分離で細胞層を除去し、当量のユ25工
放射能を含む細胞抽出液をプロティンA 5epharoseとの共沈殿により
適当な抗体と免疫沈降させた。抗j−抗体複合体をサンプル緩衝液(3%SDS
、10%グリセロールおよヒo、o o i%ジブロモェノールブルーを含有す
る2 Q Q mM Tris−EC:L、p)] 6.8 )中で煮沸して解
離させた。サンプルを還元(5%2−メルカプトエタノール)または非還元条件
下7.5%5DS−ポリアクリルアミドゲル中電気泳動ついでオートラジオグラ
フィーにより、Laemm’liの方法(Nature、 227 : 680
.1970)に従って分析した。
各抗体によって免疫沈降されたタンパク質の分子量は1rNHフイブロネクチン
およびビトロネクチンの分子量に相蟲し、Pyte:Laら(5cience、
231 : 1559.1986、この記載は参考として本明細書に導入する)
の記載のようにして非還元および還元条件下に電気泳動に付すと19’DSポリ
アクリルアミドデル上でその移動特性パターンを示した。PRV細胞上のフィブ
ロネクチン受容体数の増加はオートラジオグラフィーをデンシトメーターで走査
して定量し、各サブユニットの量はMG−63細胞の母系の場合の約6倍に増加
していることが明らかにされた。GR()DSPペプチドの不存在下に生育させ
たPRV細胞の同様の分析から、これらの細胞はフィブロネクチン受容体数の増
加を維持していることが明らかにされた。PRV細胞のビトロネクチン受容体数
はMG−63細胞の場合と同様であることがわかり、これ、は例mの流動細胞計
測分析の場合と一致する。 、
比較のだめのクラス1:、HL、A尻重の抗−HLS抗体による菟疫沈降では、
2種の細胞系のこの分子の量に有意な差は認められず、これらのデータは5つの
別個の実験で一致した。
例 11゜
IAドツトプロント分析
全細胞性RNAはUl:Lr1chらのグアニジウム/塩化セシウム法により、
Maniatisらの記載(MolecularClOning、A La’b
orator’y Manu&1. C011Fl Spring IEarb
orLal)o、ratory、C01(L Spring、Harb’or、
NY+ 1 9 8 2 ; この記載は参考として本明細書に導入する)に従
って製造した。RNA溶液は、50%ホルムアミド(7%CV/V)ホ・ルムア
ルデヒド中20二Mリン酸ナトリウム、PH6,8に調整し、65°Cで15分
間インキュベートしてRNAを変性させた。ついで3・7%ホルムアルデヒドヲ
含有−r−・るj、i XlSiC,、(i X、、、SSC,はQ、i 5
M NaC1,1,5mMクエン酸ナトリウム)で希釈し、RNAを、予め20
×SSC中に浸したニトロセルロース濾紙に適用した。真空オープン中8.0℃
で2時間ペイキングしたのち、濾紙を以下に記載するように1.[32p″)c
DNAで、サザンブロント分、析により検査した。・
PRVおよびM IG −,6’、、3細胞からの全RNAを、フィブロネクチ
ン受容体α−サブユニットの32p標識c DNAを用いてMAドツトプロット
分析に付すと、PRV細胞におけるフィブロネクチン受容体の過剰産生がMG−
63細胞に比べてフィブロネクチン受容体mRNAのレベルが高いことに相関す
ることを示した。
〔3H〕ロイシン−およびユ25工表面標識MG−63およびPRV細胞の5D
S−PAGEでは、この2種の細胞系のタンパク質像に他のどのような大きな差
も見出すことはできなかった。これを上述のデータと合わせて考えると、ppv
細胞は母体MG−63細胞に比べて多量のフィブロネクチン受容体を発現し、こ
の差はこの2種の細胞におけるフィブロネクチン受容体のmRIJA量の差によ
ると思われる。
遺伝子増幅がフィブロネクチン過剰産生の原因かどうかを決定するために、MO
−63およびPRV細胞からの高分子量DNAを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、サデンプロット法によって分析した。制限酵素分析では、細胞からB11.
nと5taffordの操作(1Jucl、Ac’1dsRed、、3 : 2
303.1976)によって高分子量DNAを単離した。制限エンドヌクレアー
ゼはBethesdaResearchLaboratories (Beth
esda、 MD )から購入し、製造業者の指示に従って使用した。消化に続
いて最後にミニ−デル分析を行った。消化されたDNAをTria /ホウ酸塩
/ ICDTA緩衝液中0.8%アガロースデル上電気泳動に付した。アルカリ
変性および中和後、DN4をニトロセルロース濾紙に移した。真空オープン中8
0℃で2時間ペイキングしたのち、濾紙を、50%ホルムアミド・、5×デンハ
ル) EJL 5 x 5spz(,1xSSPEは15’ Q鮨、lNaC1
、j、 [] mM NaE2PO4。
i mMEDTA )、0.1%SDSおよび1o o μg/mt;の剪断、
熱変性サク***DNAを含有する溶液中429Cでプレハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーションは、X7Pか゛らの6・75− bp Ba
mHI 7 ニア /” 、I 7トからなるS2pオリゴ標識フイブロネクチ
ン受容体α−サブユニットCDNA (Argravesら: J、 Biol
Chew。
261 : 12922.198..6・)またはXVNR10からの1.28
3−’bpフラグメントからなる32F−オリが標識ビトロネクチン受容体α−
サブユニットc DINA(5uzukiら: xMgo、r 4 : 251
9.1986)を含有する上記溶液中、42℃で16時間実施した。
ハイブリダイゼーション後、濾紙を2xs(’11.5mMクエン酸ナトリウム
、Q、i、sDs中室温で1時間、つめで1 x ssc、 0.1%SDS中
65℃で1時間洗浄した。m紙を風乾させ、オートラジオグラフィーはKoaa
k XAR−5フィルムおよび増感スクリーン(Cronex Lightni
ng Plus、 E、工、 DuPont d・Nemours 。
Newton、 CN )を用い一70℃で行った。
両細胞系から単離されたDIIAの代表的制限酵素消化物のハイブリ、ダイゼー
ションシグナルは、フィブロネクチン受容体またはビトロネクチン受容体のα−
サブユニットをコードするDiをプローブとした場合、閂等の強度を示した。他
の制限酵素を用いた別の実験でも同様の結果が得られた。したがって、PRv細
胞におけるフィブロネクチン受容体の発現の増加は遺伝子増幅によるものではな
く、多分、フィブロネクチン受容体遺伝子の転写速度の上昇またはその受容体m
RNAの安定性の増大のめずれかによったものと思われる。
例 11
GRGDSPの存在下におけるフィブロネクチンおよびビトロネクチンへの付着
受容体に質的変化が起こらなかったとすると、PRV細胞のフィブロネクチンへ
の付着を阻害するためには、MG−65細胞の場合よりも、多量のペプチドが要
求されるはずであり、一方、ビトロネクチンへの両細胞の付着を阻害するには同
濃度のペプチドが必要であろう。検定は96−ウェルマイクロタイタープレート
を用い、Ruoslahtiらの方法(Mezh、 Enz、 82 : 80
3.1982;この記載は参考として本明細書に導入する)に従って行った。各
ウェル・の被覆にはフィブロネクチン2μgおよびビトロネクチン3μgを用い
、細胞は各ウェルあたりi o、o o o個を添加した。
結果は第1表に示す。
第 1 表
MG−65pRv
!IIM mM
フィブロネクチン 0.21 5.30ビトロネクチン 0.06 0.07
フイブロネクチンに対するPRV細胞の最大付着の50%阻害には、MG−63
細胞の場合に比べて約25倍ものペプチドを要した。しかしながら、ビトロネク
チンへの付着の阻害にはいずれての細胞系の場合も実際に同濃度のペプチドで有
効であった。これらのデータは、細胞選択過程におりて母細胞系よりもフィブロ
ネクチンに強固に接着する細胞を生じたことを示し、また、選択培地中に存在す
るペプチド量はビトロネクチンへの付着を明らかに阻害するがフィブロネクチン
への付着は阻害できないことから、培養液中にペプチドが存在するときPRV細
胞は主としてフィブロネクチン受容体を使用することが示唆された。
例 ■
PRvm胞の特性
pRv細胞は、形態学的変化、増殖速度の遅延、1nWitrOにおける石灰化
マトリックスの形成能、■型コラーデンの合成増加、プロスタグランジンE合成
の50〜100倍低下およびコンドロイチン硫酸プofオグリカン産庄の低下を
含めて、MG−63細胞系とは、きわめて異なる表視型特性を示した。これらの
特性はPRY系の細胞がMG−(53系の場合に比べて著しく高度に分化された
細胞型であることを示している。
すなわち、この細胞系は、例1の選択条件によってもたらされた腫瘍細胞系の分
化から生じたものである。
PRV細胞は、多くの場合細胞不休よりも長い多数の突起を有する星状の形態を
示し、母体のMG−63細胞とは著しく異なっていた。これらの形態学的特性は
骨細胞の場合と似ていなめことはない。一方、MG−63細胞はほぼ平担な多角
形細胞で、線維芽細胞に類似する。ppv細胞は編み合わされたような外観を呈
し、細胞突起はしばしば細胞を相互に連結させて因るようにみえた。さらに、’
PRV細胞は、細胞質の顆粒性およびこれらの細胞の突起から判断して分泌性
に冨むように思われた。GRGDSF−”Eプテドの不存在下に生育させてもP
RV細胞はこの形態を少なくとも3力月は維持し、この形態学的変化は安定なも
のであることを示してめる。この2種の細胞系について、両者の関係を確認し、
またPRV細胞にはMG−6”)細胞に比べて何らかの全体的な染色体変化が起
こったのかどうかを調べるために、核型分析を行った。5個のMG−63および
16個のPR’V細胞からの染色体を分析した。これらの分析の結果は、この2
種の細胞系からの詞ぺた細胞はすべて、9個の識別可能な染色体マーカー、なら
びに数個の染色体のトリソミーおよび正常染色体9の不存在の点で共通している
ことを示した。これらの観察は、PRV細胞が実際にMO−63細胞から誘導さ
れることを示している。遺伝子増偏を示すような明らかな染色体変化は、PR?
細胞には認められなかった。
b、成長特性 ・
PRv細胞はMG−63細胞とは異なる成長特性を有し、はるかに遅い増殖速度
を示す。同じ初期密度で平板培養した場合、集密状態に違するまで:ve−63
細胞では4日を要するのに対し、PRv細胞はほぼ15日を要した。
トリチウム化チミジンの取り込み試験を実施した。
PRYおよびMG−63細胞を、96−ウェルマイクロタイタープレート中、1
μC1チミジンメチル〔3ヨ〕(2−OC1/mmol )の存在下、等しい細
胞密度で平板培養した。37℃で様々な時間インキュベートしたのち、細胞を1
0 mM EDTAで脱着させ、細胞ハーベスタ−を用いてガラス淑維セルロー
スディスク上に収穫した。ディスクを乾燥させ、放射能を液体シンチレーション
カウンターで測定した。MG−t53細胞は82.397±13.D 00 c
p2II/ 105個細胞/24時間を取り込んだのに対し、PRV細胞の取り
込みはわずかに8,330±420 cpm/ 105個細胞/24時間であっ
た(2回の別個の実験の結果であり、各実験は細胞単層をPBI9で洗浄し、カ
ルシウム沈着を調べるためMcGee−RuSsell(Nature、、 1
75: 301 、’ 1.9’55 )の記載に従ってアリプリンレッドSで
染色した。略述すると種細胞をホルムアルデiド(37%)と無水エタノール1
:1混合物中に15分間固定した。細胞単層を50%エタノールに移し、ついで
速やかに蒸留水ですすいだ。単層をアリザリンレッドSの2%溶液、pH4,2
で覆った。5分後に細胞単層をPBSで完全に洗浄して過剰の染料を除去し、バ
ックグランドを低下させた。カルシウムの沈着部位は橙赤色の複屈折沈殿として
観察できた。細胞と会合した染料の量は、細胞を0.1%SDS中で溶解し、分
光光度計で465 nmの吸収を測定することにより定量した。細胞単層は、カ
ルシウムのvon Koasa銀試験によっても染色した。
集密状態に違すると、PRV細胞は、プラスチック培養皿の表面上に、肉眼でも
明瞭に観察できる多くの白色の小結節を生じる。これらの不結節は、カルシウム
沈着を染色する染料であるアリゾリンレッドSに対して染色された。一方、MO
−63細胞は、平担な単層として成長し、集密状態に達してもこれらの小結節は
形成せず、アリザリンレッドSで染色されなかった。
逆位相差顕微鏡で観察すると、PRV細胞の小結節は、アリゾリンレッドSで強
力に染色された屈折性物質として認められた。小結節のアリザリンレッドSによ
る強力な染色は、集密度の低いPRV培養体でもM O−63細胞に比べて陽性
に染色されたことから、単に染料の捕捉によるものではない。PRV細胞と会合
した染料の量を分光光度法で測定すると綿服密度とともに増大したが、PRV細
胞について得られた値はほぼバンクグランドレベルであった。同じ培養体のカル
シウム沈着ヲvon Kose 録染色によっても染色した。この方法による染
色ではPRV細胞についてのみが陽性で、分布パターンはアリゾリンレッドS染
色の場合と同一であった。
これらの2種の染料によって強度に染色された領域が死細胞の存在によるもので
なかったことは、培養体の生死判定染料、トリパンブルーで染色した。アリザリ
ンレッドSおよびvon Kosga染色で染色された領域に存在する大部分の
細胞はトリバンプルーを排除し、それらが生存していることを示した。
PRV細胞によって形成された小結節中におけるカルシウムの存在はさらに、R
usεの方法(Am13r、 SOc。
for Testing and Materials、5pecial Pu
blic、45.1971 )に従りエネルゼー分散X線解析によって明らかに
された。この方法で得られたデータは、これらのPRV細胞小結節が同じブイズ
のMG−63細胞サンプルに比べて有意に多量のリン酸カルシウムを含むことを
明らかに示した。カルシウムとマグネシウムの比はPRV細胞については約10
であるが、MG−63細胞では1.0に近い。同様に、リンと′fM黄の比はP
RV細胞では約11であるが、MG−63細胞ではわずか2である。しかしなが
ら、他の元素の比、たとえばナトリウムとアルミニウムの比は、両細胞系で同じ
である( PRV細胞で1.25、Ma、−63細胞テ1.4.)。コレらのデ
ータを、PRV細胞がMG−63細胞の約20倍ものカルシウムを48時間で取
り込むことを示す45Caの取り込み研究の結果と考え合わせると、PRV細胞
の小結節中のリン酸カルシウム濃度が特殊なことを示しMG−63およびPRV
細胞によって合成される主なコラーゲン製を分析した。略述すると、細胞を、1
0%FC8ならびに各100μEl/ml!のアスコルビン酸およびβ−アミノ
プロビオニトレートフマレートを含有するDME中50 #C17mzの5−
(”E)プロリン(9,3c 1/rnM)で24時間標識した。培地を酢酸で
0.5Mとし、細胞ヲ25 mM EDTA ト1 mM フェニルメメチルス
ルホニルフルオリド(PMSF )含有培地中に分散した。細胞懸濁液を60H
2で30秒間超音波処理し、不溶性残留物を遠心分離で除去した。MG763お
よびPRV Ifa胞のタンパク質の轟量を含有するサンプルを10μ9/ml
のベゾシンにより4℃で3時間処理した。ペプンン消化物をNaOHでPI″1
8.0とし、2種の細胞系によって合成されたコラーゲンの種類を上述のように
7.5%ポリアクリルアミドデル上5DS−PAGEによって分析した。
フルオログラムでは常に、標準α1(1)およびα2(I)コラーデン鎖と共移
動する2つの主要バンドが両細胞系によって合成されることを示したが1. P
RV細胞はコラーゲンI型を約5倍合成する。したがって、MG−63骨肉謄細
胞によって合成される主なコラーゲン製はI型コラーデンであるが、PRv細胞
ではこの型のコラーゲンの合成は調節されておらず、同時に分化された骨芽細胞
様表現型と石灰化マトリックスの増加を示すように思われる。
プロスタグランジンとくにPGE2は骨代謝に関与しているので、MO−63骨
肉腫細胞およびPRVによって合成され分泌されるPGE2の量をMitche
ll & F]、intの特異的イムノアッセイ操作(J、 Eコdocrin
、 76 :111.1978;この記載は参考として本明細書に導入する)に
よって定量した。
140−アラキドン酸代謝の放射標識生成物と未変化基質を、C18’4 、!
! Bondapakカラム(waters+Milford、 MA )を使
用した逆相)l:PLCにより、Mitchellらが以前に報告したように(
prcstaglandins。
Leukotrianes ana Meaicine 2 7 : 1 9
7、1987、この記載は参考として本明細書に導入する)分離した。
第2表に示すように、10%ウシ胎仔血清の存在下、MG−63細胞によって分
泌されるPGE2の量はPFtV細胞の場合より約5D倍多かった。この差は血
清を含まない条件下に細胞?培養した場合にはさらに太きい。
2種の細胞系によるユ40−アラキドン酸代i1モ、Mf)−66細胞では1’
RV細胞に比べ有意に高い百分率のアラキドン酸をプラスタグランジンに代謝す
ることが明らかにされた(第3表)。どちらの細胞系もリポキシデナーゼ経路で
はアラキドン酸を検出できる程度には代謝しなかった。これらの結果は、PRV
細胞ではリン脂質代謝の下方調整があることを示唆し、また、骨形成よりもむし
ろ骨吸収のメディエータ−としての高レベルのPGE2の役割を支持するもので
あろう。
第 2 表
MO−63およびPRVによる培養培地中への関連プラスタグランジン、PGE
2分泌
P分泌E2 (PVl D 6個′m胞)血清あり(10%) 血清なし“
M O−634653±510 2495 + 800MG−63,3A 11
8+ 60 24+ 15値は3回の別個の実験からの平均である。細胞ははぼ
等しb細胞濃度まで生育させ、この時点で培養培地を取り出し、上述の特異的ラ
ジオイムノアン七イでPGE20レベルを測定した。細胞は1mM EDTAで
培養液から除去し、Mi胞数をArtek a胞計数器を用すで計数した。
”細胞はダルベツコ最小必須培地、F12栄養培地(Gibco )およびトラ
ンフェリン/インスリン/セレン混合物(Co11aborative Re5
earchよりc、、 Bedforcl。
MA )からなる一定の培地中で生育させた。
第3表
MG−63およびPRV細胞による14C−アラキドン酸のプロスタグランジン
への代謝
14c′−プロスタグラ ブロスタグ2ンンジン濃度(cp坊 ジンに代謝され
タンパク質) だ総標識%
MG−6387,ODD±1.700 18.0%MG−63.3A 4.65
3±800 0.9%値は3回の別個の実験の平均である。細胞は14c−アラ
キドン酸(5X I Q5cpm )の存在下に2%ウシ胎血清溝中で2日間培
養した。140m7キツドン醗代謝の生成物は上述のようにして測定した。タン
パク質濃度はLowryらの方法によって測定した。
f、その他の特徴
PRV細胞の独特な特徴のひとつは、細胞を包埋する屈折性物質を成長させ同化
する集菌体を形成することである。この物質はリン酸カルシウムに富んで因る。
PRv細胞によって形成される石灰化小結節の明かるい原微鏡的外観は、ラット
血清頭蓋冠からの一次骨芽細胞培養体、マウス新生仔頭蓋冠からの骨芽細胞培養
体中に認められるものときわめて類似している。しかしながら、PRV細胞は、
一部の一次骨芽細胞培養体でのマ) IJラックス灰化に必須な外因性β−グリ
セロホスファターゼの不存在下にも石灰化を行うことができて、これはPRV細
胞が培養培地中のリン酸の基礎濃度を利用できる活性な生化学経路をもっことを
示している。
しかもPRV細胞は悪性ではない。ヌードマウに注射しても、腫瘍を生成する母
体MG−63細胞と異なり、腫瘍を生成しなり0
例 X
同型細胞系
さらに2種の細胞系を例Iの選択基準に曝露した。
すなわち、神経芽細胞5KNSコおよび骨肉腫細胞HO5で、いずれもAmer
ican Type Cu1ture Colユaction K ’IjF託
されている。?+9/rdのGRGDSPを含有する培地中で生育させると、H
oS細胞系は受容体を過剰産生ずることが明らかにされた。5KNSH系はRG
D含有ペプチド1.5■/−を含有する培地中で生育させると形態学的変化を生
じた。これらの結果は、MG−631fB胞系を選択条件に相邑する時間曝露し
た場合に生じた接着性の増加および分化の促進方向の相轟する変化に一致する。
本発明を以上、現時点での好ましい態様を参照しながらR明したが、本発明は添
付の請求の範囲によってのみ限定されるものであって、本発明の範囲から逸脱す
ることなく変化が可能なことを理解すべきである。
補正書の翻訳文提出書 (#猪法制84 条+718 )1、特許比願の表示
PCT/US8B1033423、特許出願人
氏名(名称) ラ ジヨウ キャンサー リサーチ ファウンデーション5、m
′:Etの提8年月8 1990 年 1 月 7ε 日浄書(内容に変更なし
)
請求の範囲(34条補正)
(1)母細胞系から機能性受容体数の増加の結果として接着性の増大した細胞を
選別する方法において、に、上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、b、
上記母細胞の表面上の受容体に結合できる接着リガンドを溶液として、機能性受
容体数の増加した細が正常数の機能性受容体を有する細胞上の機能性受容体とは
細胞増殖を阻害するのに十分な数と結合するように選択された初期濃度で含有す
る培養培地中、上記受容体の接着機能を阻害するような方法で培養し、C0溶解
した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖するのに十分な機能性受容
体を有する細胞を選択し、
d、この選ばれた細胞を、落屑した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含
有させた培養培地中で継萩的に再培養し、
e、溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖する
のに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、ついで、
f、この選択された細胞から、受容体数の増加の結果として接着性が増大した細
胞系を衝立する各工程からなる方法。
(2)溶解した接着リガンドはペプチドである請求項(1)記載の方法。
(3) ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸已列RGDを含有する請求項(
2)記載の方法。
(4)ペプチドはGRGDSPである請求項(3)記載の方法。
(6) 溶解した接着リガンドは抗体である請求項(1)記載の方法。
(6) さらに、母細胞を培養する容器を、溶解した接着リガンドと同じ細胞表
面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加する請求項tll記載の
方法。
(71さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受
容体遮断リガンドを培養液に加える付加工程からなる請求項(1)記載の方法。
(8) 受容体遮断リガンドはその相当する細胞表面受容体のすべてに結合する
のに十分な濃度を加える請求項(7)記載の方法。
(9)受容体遮断リガンドはフィブロネクチン受容体に結合する請求項(7)記
載の方法。
■ 母細胞系は腫瘍細胞系である請求項(1)記載の方法。
0υ 母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項(1)記載の方法。
C21母細胞系はMG−63である請求項(1)記載の方法。
(131母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項(1)記載の
方法。
(14) 母細胞系は接着細胞表面受容体が減少している非悪性細胞である請求
項(1)記載の方法。
051 接着細胞表面受容体の減少は母細胞の培養液中での生育の結果である請
求項Cl41記載の方法。
aω 同−細胞型の正常細胞系の機能性接着結合リガンド受容体の数よりも多く
の機能性接着結合リガンド受容体を有する単離された細胞系。
0′r)母細胞系からの細胞の分化を受容体数の増加の結果として促進する方法
において、
a、上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、℃、上記母細胞の表面上の受
容体に結合できる接着リガンドを溶液として、機能性受容体数の増加した細胞の
表面上に存在するすべての受容体には結合したbが正常数の機能性受容体を有す
る細胞上の機能性受容体とは細胞増殖を阻害するのに十分な数と結合するように
選択された初期濃度で含有する培養培地中、上記受容体の接着機能を阻害するよ
うな方法で培養し、C0溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増
殖するのに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、
d、この選ばれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含
有させた培養液中で継続的に再培養し、
e、溶解した上記接着リガン−の、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖する
のに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、ついで、
f、この選択された細胞から、受容体数の増加の結果として接着性が増大した細
胞系を樹立する各工程からなる方法。
i 溶解した接着リガンドはペプチドである請求項αD記戦の方法。
C3ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列RGDを含有する請求項081
記載の方法。
C!ω ペプチドはGRG、DSPである請求項09記載の方法。
(2Ll 溶解した接着リガンドは抗体である請求項0力記載の方法。
(2z さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接= IJガントと
同じ細胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加する請求項0
7)記載の方法。
の さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受容
体遮断分子を培養液に加える付加工程からなる請求項αη記載の方法。
U 受容体遮断分子はその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するのに十分
な濃度を加える請求項の記載の方法。
斡 受容体遮断分子はフィブロネクチン受容体に結合する請求項−記載の方法。
(251母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項αつ記載の方法。
■ 母細胞系は骨肉1細胞系である請求項αn記載の3 母細胞系はMG−63
である請求項0D記載の方法。。
凶 母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項(17+記載の方
法。
(至) 母細胞系は分化のレベルが低下した非悪性細胞である請求項On記載の
方法。
Gll 分化のレベルの低下は母細胞の培養液中での主育の結果である請求項回
記載の方法。
6つ 削除。
蕊 細胞接着受容体のレベルが増加した細胞を選択することからなる細胞系の細
胞の分化を増大させる方法。
ば 細胞系の細胞の分化を促進させる方法にお込て、a、上記細胞系の細胞によ
って発現される細胞表面受容体に選択的に結合できるリガンドを準備し、b、上
記リガンドを上記細胞系の細胞と反応させ、C8上記リガンドが高濃度に結合し
た細胞を同定し、d、同定された細胞を上記リガンドの存在下に再培養し、つい
で
e、細胞が所望の分化レベルを示すようになるまで工程すからeまでを反復する
各工程からなる方法。
手続補正書(自発)
平成 2年 5月10日
゛ 特許庁長官殿
1、事件の表示
PCT / US88 / 033122、発明の名称
細胞接着性が増大した細胞の選別
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名 称 ラ ジョラ キャンサー リサーチファウンデーション
4、代理人
居 所 〒100東京都千代田区大手町二丁目2番1号新大手町とルヂング33
1
5、補正の対象
手続補正書(自発)
平成2年6月10日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)母細胞系から接着性の増大した細胞を選別する方法において、 a.上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、b.上記母細胞の表面上の受 容体に結合できる接着リガンドを溶液として、上記母細胞の表面上に存在する上 記受容体のすべてには結合しないように選択された初期濃度で含有する培養培地 中、上記受容体の接着機能を阻害するような方法で培養し、 c.溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖する細胞を選択し 、 d.この選はれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有させた培養培地中で継続的に再培養し、 e.溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害Rる濃度で増殖でき る細胞を選択し、ついでf.この選択された細胞から接着性の増大した細胞系を 樹立かる各工程からなる方法。 (2)溶解した接着リガンドはペプチドである請求項(1)記載の方法。 (3)ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列RGDを含有する請求項(2 )記載の方法。 (4)ペプチドはGRGDSPである請求項(3)記載の方法。 (5)溶解した接着リガンドは抗体である請求項(1)記載の方法。 (6)さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接着リガンドと同じ細 胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加した請求項(1)記 載の方法。 (7)さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受 容体遮断リガンドを培養液に加える付加工程からなる請求項(1)記載の方法。 (8)受容体遮断リガンドはその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するの に十分な濃度を加える請求項(7)記載の方法。 (9)受容体遮断リガンドはフィブロネクチン受容体に結合する請求項(7)記 載の方法。 (10)母細胞系は腫瘍細胞系である請求項(1)記載の方法。 (11)母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項(1)記載の方法。 (12)母細胞系はMG−63である請求項(1)記載の方法。 (13)母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項(1)記載の 方法。 (14)母細胞系は接着細胞表面受容体が減少している非悪性細胞である請求項 (1)記載の方法。 (15)接着細胞表面受容体の減少は母細胞の培養液中での生育の結果である請 求項(14)記載の方法。 (16)請求項(1)記載の方法によって産生された細胞系(17)母細胞系か らの細胞の分化を促進する方法において、 a.上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、b.上記母細胞の表面上の受 容体に結合できる接着リガンドを溶液として、上記母細胞の表面上に存在する上 記受容体のすべてには結合しないように選択された初期濃度で含有する培養培地 中、上記受容体の接着機能を阻害するように培養し、 c.溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖する細胞を選択し 、 d.この選ばれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有する培養培地中で継続的に再培養し、 e.溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖でき る細胞を選択し、ついでf.この選択された細胞から上記母細胞よりも分化が促 進された細胞系を樹立する各工程からなる方法。 (18)溶解した接着リガンドはペプチドである請求項(17)記載の方法。 (19)ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列RGDを含有する請求項( 18)記載の方法。 (20)ペプチドはGRDGSPである請求項(19)記載の方法。 (21)溶解した接着リガンドは抗体である請求項(17)記載の方法。 (22)さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接着リガンドと同じ 細胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加した請求項(17 )記載の方法。 (23)さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する 受容体遮断分子を培養液に加える付加工程からなる請求項(17)記載の方法。 (24)受容体遮断分子はその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するのに 十分な濃度を加える請求項(23)記載の方法。 (25)受容体遮断分子はフィブロネクチン受容体に結合する請求項(23)記 載の方法。 (26)母細胞系は腫瘍細胞系である請求項(17)記載の方法。 (27)母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項(17)記載の方法。 (28)母細胞系はMG−63である請求項(17)記載の方法。 (29)母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項(17)記載 の方法。 (30)母細胞系は分化レベルの低下した非悪性細胞である請求項(17)記載 の方法。 (31)分化レベルの低下は母細胞の培養液中での生育の結果である請求項(3 0)記載の方法。 (32)請求項(17)記載の方法によって産生された細胞系。 (33)細胞接着受容体のレベルが増加した細胞を選択ナることからなる細胞系 の細胞の分化を増大させる方法。 (34)細胞系の細胞の分化を促進させる方法において、a.上記細胞系の細胞 によって発現される細胞表面受容体に選択的に結合できるリガンドを準備し、b .上記リガンドを上記細胞系の細胞と反応させ、c.上記リガンドが高濃度に結 合した細胞を同定し、d.同定された細胞を上記リガンドの存在下に再培養し、 ついで e.細胞が所望の分化レベルを示すようになるまで工程bからeまでを反復する 各工程からなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10202187A | 1987-09-28 | 1987-09-28 | |
US102,021 | 1987-09-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03500244A true JPH03500244A (ja) | 1991-01-24 |
Family
ID=22287695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63508675A Pending JPH03500244A (ja) | 1987-09-28 | 1988-09-26 | 細胞接着性が増大した細胞の選別 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5700681A (ja) |
EP (1) | EP0391928B1 (ja) |
JP (1) | JPH03500244A (ja) |
AU (1) | AU626815B2 (ja) |
CA (1) | CA1314250C (ja) |
DE (1) | DE3886051T2 (ja) |
WO (1) | WO1989002914A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019024422A (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-21 | 国立大学法人広島大学 | 細胞解離剤、細胞解離方法および細胞シートの製造方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0391928B1 (en) * | 1987-09-28 | 1993-12-01 | La Jolla Cancer Research Foundation | Selection for cells having increased cell adhesion properties |
US5016644A (en) * | 1989-01-10 | 1991-05-21 | La Mina Ltd. | Urine testing module and method of collecting urine antigen |
US5022411A (en) * | 1989-09-18 | 1991-06-11 | La Mina Ltd. | Modular fluid testing device |
US5188959A (en) * | 1989-09-28 | 1993-02-23 | Trustees Of Tufts College | Extracellular matrix protein adherent t cells |
ES2317657T3 (es) * | 1996-09-19 | 2009-04-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Polimeros que contienen polisacaridos tales como alginatos o alginatos modificados. |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4565789A (en) * | 1983-04-04 | 1986-01-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cell matrix receptor system and use in cancer diagnosis and management |
US4988621A (en) * | 1985-05-24 | 1991-01-29 | La Jolla Cancer Research Foundation | Peptides in cell detachment and aggregation |
US4879237A (en) * | 1985-05-24 | 1989-11-07 | La Jolla Cancer Research Foundation | Use of peptides in control of cell attachment and detachment |
EP0391928B1 (en) * | 1987-09-28 | 1993-12-01 | La Jolla Cancer Research Foundation | Selection for cells having increased cell adhesion properties |
US5238839A (en) * | 1988-02-09 | 1993-08-24 | Dana Farber Cancer Institute | Nucleic Acids Encoding proteins which induce immunological effector cell activation and chemattraction, vectors, and recombinant cells |
US5049659A (en) * | 1988-02-09 | 1991-09-17 | Dana Farber Cancer Institute | Proteins which induce immunological effector cell activation and chemattraction |
US5192746A (en) * | 1990-07-09 | 1993-03-09 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Cyclic cell adhesion modulation compounds |
US5260277A (en) * | 1990-09-10 | 1993-11-09 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Guanidinyl and related cell adhesion modulation compounds |
JP2745351B2 (ja) * | 1991-02-14 | 1998-04-28 | 富士写真フイルム株式会社 | ペプチド誘導体及びその用途 |
-
1988
- 1988-09-26 EP EP88909408A patent/EP0391928B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-26 JP JP63508675A patent/JPH03500244A/ja active Pending
- 1988-09-26 WO PCT/US1988/003312 patent/WO1989002914A1/en active IP Right Grant
- 1988-09-26 AU AU26077/88A patent/AU626815B2/en not_active Ceased
- 1988-09-26 DE DE88909408T patent/DE3886051T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-28 CA CA000578650A patent/CA1314250C/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-12-20 US US08/359,956 patent/US5700681A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-20 US US08/915,315 patent/US5952224A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019024422A (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-21 | 国立大学法人広島大学 | 細胞解離剤、細胞解離方法および細胞シートの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2607788A (en) | 1989-04-18 |
US5952224A (en) | 1999-09-14 |
EP0391928B1 (en) | 1993-12-01 |
CA1314250C (en) | 1993-03-09 |
DE3886051D1 (de) | 1994-01-13 |
WO1989002914A1 (en) | 1989-04-06 |
AU626815B2 (en) | 1992-08-13 |
US5700681A (en) | 1997-12-23 |
EP0391928A1 (en) | 1990-10-17 |
EP0391928A4 (en) | 1991-12-11 |
DE3886051T2 (de) | 1994-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pruss et al. | Mitogens for glial cells: a comparison of the response of cultured astrocytes, oligodendrocytes and Schwann cells | |
CN104678106B (zh) | 单克隆抗体stro-4 | |
Simmons et al. | CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow | |
Castro-Malaspina et al. | Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny | |
Rezania et al. | Integrin subunits responsible for adhesion of human osteoblast‐like cells to biomimetic peptide surfaces | |
Sadahira et al. | Very late activation antigen 4-vascular cell adhesion molecule 1 interaction is involved in the formation of erythroblastic islands. | |
Watson et al. | Effect of IL-7 on the growth of fetal thymocytes in culture. | |
Geppert et al. | Activation of human T4 cells by cross-linking class I MHC molecules. | |
JP4922548B2 (ja) | 体性幹細胞の同定および単離ならびにその使用 | |
Modzelewski et al. | Isolation and identification of fresh tumor-derived endothelial cells from a murine RIF-1 fibrosarcoma | |
Kennedy et al. | Antigenic expression by cells derived from human gliomas does not correlate with morphological classification | |
Lacoste-Eleaume et al. | Biochemical and functional characterization of an avian homolog of the integrin GPIIb-IIIa present on chicken thrombocytes | |
Reyes-Botella et al. | Antigenic phenotype of cultured human osteoblast-like cells | |
TW202336229A (zh) | 表現趨化因子受體及細胞接著分子之cd3陰性細胞之集團、及其用途及其製造方法 | |
Simonson et al. | Rat mesangial cell-matrix interactions in culture | |
JPH03500244A (ja) | 細胞接着性が増大した細胞の選別 | |
Varani et al. | Tumor type‐specific differences in cell‐substrate adhesion among human tumor cell lines | |
Zarcone et al. | Human leukemia-derived cell lines and clones as models for mechanistic analysis of natural killer cell-mediated cytotoxicity | |
Farach et al. | Developmental expression of a cell-surface protein involved in calcium uptake and skeleton formation in sea urchin embryos | |
Hunt et al. | Isolation of phenotypically distinct trophoblast cell lines from normal rat chorioallantoic placentas | |
Randle et al. | A lymphostromal molecule, thymic shared Ag-1, regulates early thymocyte development in fetal thymus organ culture. | |
Lindsay et al. | Intracerebral transplantation of cultured neurons after reaggregation in a plasma clot | |
JPH05509318A (ja) | インターロイキン―4とインターロイキン―1βが共働してVCAM―1を誘導する | |
Richtsmeier et al. | Dendritic Cell Identification in Head and Neck Lymphoid Tissue: Newly Recognized Cells Control T-Lymphocyte Functions | |
Stein et al. | Cell-to-cell communication competence in simian virus 40-transfected rat ovarian cells is reduced following tumor selection |