JPH03500244A - 細胞接着性が増大した細胞の選別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞接着性が増大した細胞の選別 発明の背景 本発明は細胞接着システムに関し、さらに詳しくは細胞接着性が増大した細胞に 関する。

細胞外マトリックヌ成分に対する細胞の接着は、細胞***、細胞分化、ならびに 胚子円細胞移動および細胞選別のような細胞挙動パターンの基本であるように忘 われる。さらに、腫瘍の侵襲および転移のようなある種の異常な細胞の挙動は、 細胞外マトリックスへの細胞の接着機構の変化によって住じるものと考えられる 。

細胞接着は大部分、細胞外マトリックス中の細胞接着促進分子またはリガンドを 認識し、それに結合する細胞表面受容体によって仲介されると思われる。多数の このような接着促進分子、たとえばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニ ンおよびコラーゲンがこれまで同定されてきた。現在では、これらの各種の付着 促進分子はアミノ酸配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ　− Ｇｌｙ　−ＡｓｐまたはＲＧＤ　）を共有し、これが細胞結合ドメイン１として 機能し、細胞がこれらの分子を認識して結合する能力を説明するものと考えられ ている。

接着性細胞にはその表面にＲＧＤに向けられた多数の種類の異なる受容体が並ん でいて、それらの比率が細胞種に特異的である。これらの受容体はすべて、それ らのリガンドのＲＧＤ含有ドメインに！合するが、それでもなおそれらの特定の 細胞接着促進分子に特異性を示す。ＲＧＤ配列を含む合成ペプチドで基板を４覆 すると細胞接着の促進に使用することができるし、それを溶解型で与えると細胞 の付着を阻害することができる。

細胞外マトリックス成分への結合能は細胞表面受容体にあるので、細胞接着の程 度は細胞の表面上に存在する受容体数の定量的な変化によって影響されるはずで ある。受容体のレベルを増大させた細胞系を得る方法があれば、結合能が増大し 、細胞表面受容体のとくに有用な供給源を与える細胞を提供するのにきわめて役 に立つものである。さらに、このような方法は、その病因が受容体数の低下にあ る異常細胞系または受容体数の低下の結果として分化した正常細胞系における受 容体数を増加させるのに使用することができる。本発明は、これらの要求を満た し、同時ＩＣそれに関連した利点を提供するものである。

発明の要約 本発明は、母体細胞系からの細胞を、細胞上の接着表面受容体のすべてに結合す るには至らなＶａ度で溶解させた接着リガンドを含む培地中で培養し、溶液中の 接着リガンド濃度を増加させた培地中で継続的に再培養してこのような培地中で 生育できる細胞を選択することにより、接着性が増大した細胞を選別する方法を 提供する。溶解させた接着リガンドとしては、たとえば、ＲＧＤ結合部位を含有 するペプチＹ、または接着受容体の接着機能を阻害するような抗体を使用するこ とができる。さらに、本発明は、細胞の分化を促進するための類似の方法を提供 する。このような方法で生成された細胞系も提供される。

本発明は他の態様としてさらに、高レベルの細胞接着受容体を表面に発現する細 胞を選択し再培養することによる細胞系の細胞分化の促進方法を提供する。たと えば、細胞を、細胞接着受容体に特異的なリガンドに曝露して、リガンｒと細胞 間の結合を行わせる。リガンＶは接着受容体の結合パートナ−でもまた受容体に 結合する抗体でもよく、結合は必ずしも受容体の結合能を阻害するものでなくて もよい。最高の比率のリガンドが結合した細胞を同定し、選別して、リガンドの 存在下に再培養する。リガンドの存在下におけ゛る培養、リガンドの高レベルの 結合を示す細胞の同定およびこれらの細胞の再培養の工程は、所望の細胞表面受 容体濃度および分化レベルが達成されるまで反復される。このような細胞を同定 する一方法としては、螢光標識リガンドに結合させ、細胞表面に発現した螢光の レベルに基づｂて自動ｍ胞選別装ｆＫより細胞を分離する方法があるが、別法と して本技術分野で知られる他の方法を使用することもできる。

図面の簡単な説明 第１図：抗体によって認識されるＭＧ−６３およびＰＲＶ細胞表面抗原の免疫沈 降。ＭＧ−６３およびＰＲＶ細胞（約１０５個）を１　ｍｃｉの１２５１で表面 標識し、溶解し、抗原を例）りに記載するようにして免疫沈降させた。免疫沈降 は、非還元条件（Ａ）または還元条件（ＢおよびＣ）下にＳＤＳ　−ＦＡＧΣで 分析した。（ＡおよびＢ）レーン１−２、抗フィブロネクチン受容体抗体による 免疫沈降；レーン４、抗ビトロネクチン受容体抗体による免疫沈降；レーン１お よび４、ＭＧ−６３６３細胞（亜集密的培養）；レーン２および５、ＰＲＶ細胞 （集密的培養）；レーン３および６、ＰＲＶ　）［胞（亜集密的培養）。（Ｃ） ＭＧ−６３（レーア１　）およびＰＲＶ　（レーン２）細胞の亜集密的培養の抗 −ＨＬａ抗体による免疫沈降。

発明の詳細な説明 本発明は、溶解した接着リガンドの存在下に生育できる細胞を選択することによ る、接着性が増大し、分化の増進状態にある細胞系の提供方法に関する。ＲＧＤ はフィブロネクチンやビトロネクチンのような多数の接着促進ｍ胞外成分に対す る結合ドメインである。細胞表面上の受容体は、このような接着促進分子に選択 的に結合する。

増殖するためには、正常な細胞は基板に付着しなければならなり、培養培地中に ＲＧＤ含有ペプチドが存在すると、大部分の細胞はＲＧＤ含有基析に付着するこ とができず、またそれから脱着してしまう。すなわち、大部分の細胞は培養中に はＲＧＤ依存性機構を介して付着するので、十分な＠度、一般的には約１鮨の濃 度で、ＲＧＤは培養中の細胞の増殖を阻害する。この視象は詳細に検討されてき た（たとえばＨａｙｍａｎら：Ｊ。

Ｃａ’ｌｌ　Ｂｉｏユ、、１００：１９４８参照。この文献は参考として本明細 書に導入する）。類似の機構によって細胞の付着は、他の接着リガンドにより、 または問題の接着受容体に特異的に結合して受容体の結合機能と干渉する抗体に より、阻害される。

本発明は、細胞系を、溶解した接着リガンドたとえばＲＧＤペゾチドに濃度を継 続的に増大させて曝露し、このような濃度の接着リガンドに付着できて増殖でき る細胞を選択し再培養することにより、接着性が増大した細胞を選別する方法を 提供する。このような細胞ではその表面に発現する接着受容体の数が増加する。

多くの受容体によって認識されることが知られているペプチドＧＲＧＤ８ＰをＲ ＧＤ含有ペプチドとして使用してきたが、他のＲＧＤ含有ペゾチドを用いること もできる。

ある種の受容体に特定の親和性を有することが知られているペプチドは、それら の特定の受容体を増加させる選択的圧を発揮する。

ＭＧ−６３細胞系の細胞を含めた多くの細胞が、７ィブロネクチンまたはフィブ ロネクチン様物質を分泌し、それを介して基板に付着することにより、培養中に 基板に付着することが知られている。溶解した只ＧＤ含有ペプチドは、フィブロ ネクチン受容体に結合するために分泌されたフィブロネクチンと主として競合し 、細胞に、たとえばフィブロネクチン受容体の発現の増加を介して接着性を増大 させる上述の選択圧を生じさせる。類似の選択状態は、フィブロネクチン受容体 と結合するために分泌されるフィブロネクチンと同様に競合し、受容体の接着機 能を阻害する抗−フィブロネクチン受容体抗体を溶液中に与えることによっても 確立させることができる。

他のＲＧＤ特異的紺胞表面受容体または非ＲＧＤ　％異的細胞表面受容体が関連 する接着性増大のための選択状態も利用できる。たとえば、培養基板を接着リガ ンドたとえばビト；ネクチ／もしくはその誘導体で被覆し、さらにビトロネクチ ンもしくはビトロネクチン受容体特異的リガンドまたはビトロネクチン受容体特 異的抗体を、ビトロネクチン受容体のすべてではない一部に結合するような濃度 で溶液中に提供することができる。

別法として、表面自体をビトロネクチン受容体特異的抗体で被覆することもでき る。細胞が代わりのフィブロネクチン仲介機構を介して基板に付着しないことを 保証するためには、フィブロネクチン受容体特異的リガンドまたは抗体も溶液中 に存在させて実質的にすぺてのフィブロネクチン受容体を遮断する。ビトロネク チン受容体特異的リガンドまたは抗体の濃度を継続的に増加させて培養を行うと 、ビクロネクチン特異的細胞表面受容体に関連した細胞の接着性が増大する。

別法として、基板を非１’ｔＧＤ特異的リガンＹまたは非ＲＧＤ特異的受容体に 対する抗体で被覆し、相当するリガンドまたは抗体を培養液中に存在させること ができる。細胞付着の固有の機構、たとえばフィブロネクチンの分泌によって仲 介される機構は、適当なりがンドまたは別の接着受容体たとえばフィブロネクチ ン受容体に結合する適当な抗体な適轟量存在させることによって遮断できる。

ある種の細胞は、培養液中で生育する細胞の付着を仲介するのに有用なフィブロ ネクチン以外の接着促進リガンドを分泌することが知られている。この！うな細 胞系では、これらのリガンドおよび受容体に関連した接着性の増大は、分泌され るリガンド、リガンドに類似のペプチド、または問題のリガンドに相当する受容 体に特異的な抗体の継続的濃度で培養することによって促進することができる。

類似の方法を細胞分化の促進に使用することもできる。このような説明によって 限定を意図するものではないが、異常な比較的未分化の悪性細胞は、その表面上 の接着受容体数の減少を示すことがある。このような異常細胞集団から接着性が 増大した細胞を選択することによって、細胞分化が促進される。このようにして 接着性が増大した有用な細胞系が誘導され、このような細胞系では分化特性が高 められる。さらに、正常な未分化幹細胞は、このような選択状態に曝露すること により分化を強制することができる。また、細胞培養時に脱分化しやすい細胞系 は、溶解させた接着リガンドたとえばＲＧＤ含有リガンドに曝露することによっ て分化状態に維持させることができる。

この方法はまた、ｉｎ　ｖ：ＬｖＯでの治療用に、たとえば異常細胞の接着細胞 表面受容体数または分化レベルを増大させるために適用できる。・たとえば溶解 させた接着リガンドを生体内の適当な部位に導入して標的細胞に接触させること ができる。接着細胞表面受容体に結合させることによって、リガンドは標的細胞 の解離を生じさせるか、または接着受容体の正常な表現型の発現が増加し、正常 な分化状態の細胞の増殖が選択的に促進される。

たとえばＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞のような細胞を、溶解した接着リガンドたと えばＧＲＧＤＳＦのようなＲＧＤ含有ペプチドの細胞付着阻止濃度での存在下に おける付着および生育によって段階的に選択すると、溶解した接着リガンドの存 在下に生育できる細胞が選択される（このような細胞を以下、一般的にペプチド 抵抗性変異細胞またはＰＲＶ細胞と呼ぶ〕。これらのＰＲＶ細胞では、母体細胞 に比べて、細胞表面受容体たとえばフィブロネクチンに対する受容体を過剰に産 生ずる。

ＭＧ−６３細胞から誘導される、ＭＧ−６３，３Ａと呼ばれる細胞系の場合には 、この過剰産生は、受容体をコードするｍＲＮＡレベルの増加によるものである 。

しかしながら、この増加はフィブロネクチン受容体遺伝子の増幅によるものでは なり０ ＰＲｖ細胞は、フィブロネクチン受容体の過乗産生、ＧＲＧＤＥｉＰペプチドに よるフィブロネクチン被覆表面からの脱着に対する抵抗性および形態学的変化を ほぼ６カ月維持し、その最後の３力月には、それらはＧＲＧＤＳＰペプチドの不 存在下にも生育した。

本明細書で用いられる「接着リガンド」の語は、細胞接着を仲介する機能をもつ 受容体に結合する任意の分子を意味する。「接着リガンド」には、天然の接着促 進性化学体、それらの誘導体、接着細胞表面受容体に対して特異的な抗体、また は接着関連細胞表面受容体に結合できる他の任意の化学的が包含されるが、これ らに限定されるものではない。

工業的利用性 培養細胞の分化を促進する方法を提供することにより、本発明は、分化機能を果 たすことができる培養体を獲得し、維持することを可能にする。このような機能 性能力は、たとえば、分泌生成物を得るため組換えｒツムを有する細胞を培養す る場合に重要である。さらに、完全に分化した機能性細胞は、ある種の移植に使 用するために必要である。たとえば、皮膚移植体用の上皮細胞、血管移植片用の 内皮細胞、糖尿病患者に移植するだめのインスリン分泌膵臓細胞のような分泌細 胞、および培養前置換のだめの骨生成細胞等がある。

本発明の方法は、接着性の増大したＭ胞を与え、これらはある種の移植操作にと くに適していて、直ちに使用できる受容体の原材料を提供する。

例　Ｉ ＲＧＤ含有ペゾチドによる脱着に抵抗性を示す細胞の選別 ヘキサペプチドＧＲＧＤＳＰは、自動ペプチド合成装置を用い、製造業者によっ て指示された化学操作に従って合成した（４３０Ａ型；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｐｏ５ｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　）。このペプチドはそのＲＧＤ部位を介して 様々な受容体に結合することが知られている。

本明細書で用いる略号は次のとおりである。

Ｄ□アスパラギン酸 Ｅ□グルタミン酸 ヒト骨肉腫ＭＧ−６３細胞はＴｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ ｅ　Ｃｏ：Ｌｌｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉ’ｌｌｓ、　Ｍ：Ｄ　）から入手 した。この細胞は、１０％熱活性化ウシ胎仔血清（ＰＢＳ）（Ｔｉ５ｓｕｅ　ｃ ｕｌｔｕｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、　Ｔｕｌａｒｅ、ＣＡ　）、グルタミン （２ｍＭ　）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＪ）およびストレプトマイシン（１０ Ｃ１，！！９／１ｍ）（工ｒｖｉｎｅＳｃｉｅｈｔｉｆｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａ ｎａ、　ＣＡ　）を補充したダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ　）中で培養 した。定常的継代培養では、細胞単層をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　）（１５ ＱｍＭＮａＣ１，ｉ　ＱｍＭリン酸ナトｖｓｙｂ、ｐ）１７．３）で洗浄し、Ｅ ＤＴＡ　（ＰＢＳ中ｉ　ｍＭ　）で分離させた。

ＭＧ−６３細胞はＧＲＧＤＳＰの存在下に培養した。このペプチドはＤＭＥ中に 溶解し、炭酸水素ナトリウム（７，５％）で−を７．０に調整した。この溶液は ついで使用前に滅菌−ａ過した。

単層培養ＭＯ−４５３細胞にヘキサペプチドＧＲＧＤＳＰを０．８５　ｍＭの濃 度で加えると、細胞は基板から脱着プチド（０，８５ｍＭ　）を含む新鮮な培地 を残った細胞に加えると、また一部の細胞が基板から脱着した。これらの残った わずかな細胞をペプチドの存在下に培養すると、最終的に数個の細胞が付着して 、増殖することが認められた。集密状態に遅したならば、細胞をＥＤＴＡで脱着 させ、ペプチドの存在下に継代培養した。

ヘキサペプチドの濃度を次に０．８５　ｍＭから５．［ｌ　ｍＭへ、０−８５ｍ Ｍずつ５力月間を要して上昇させ、各回、付着した細胞を選択した。

長期間にわたる培着に際してのペプチドの安定性に関する問題を調べるために、 ペプチドの存在下、数日間細胞の生育に使用された培地を、以前にペプチドに曝 露されたことがないＭＧ−６３細胞に適用した。これらの細胞は培養基板から直 ちに脱着し、ペプチドが培養液中で数日後にもなお活性であることを示した。

５、ＱｍＭのＧＲＧＩ）ＳＰの存在下に付着できて増殖できるＮＧ−６３由来の ＰＲＶ細胞ハＭ　Ｇ−６３，３ｊ’−ト命名された。

例　１ 細胞接着受容体に特異的な抗体による脱着に抵抗性を示す細胞の選別 フィブロネクチン受容体ＩＣ％異釣で、この受容体の接着機能を阻害できる抗体 は、例■の方法で産生させ、相当する受容体の接着機能を阻害するかどうかを調 べてさらにスクリーニングした。別法として、類似の性質を有するモノクローナ ル抗体を本技術分野でよ（知られた方法によって生成させることもできる。例１ の継代細胞培養の方法を反復し、溶液中のＲＧＤ含有ペプチドをフィブロネクチ ン受容体特異的抗体に置換する。

初期濃度は、抗体特異的受容体のすべてへの抗体結合を促進しないように選択さ れる。母系の細胞を脱着させて殺滅するのに十分な抗体濃度で付着し生存できる 細胞は、接着性の増大を示す。

例　■ 非フィブロネクチン接着ペプチドによる脱着に抵抗性を示す細胞の選別 適当な細胞を選択して培養する。細胞が基板への付着性を与える非フィブロネク チン接着促進リガンドを分泌できない場合には、培養容器を適当な接着リガンド で被覆する。別法として、基板を問題の受容体と反応性の抗体で被覆してもよい 。細胞が問題の受容体に相当するリガンドな自発的に分泌できる場合には、この ような被覆は必要ではないが、被しても差支えない。

細胞は、問題の受容体に相当する接着リガンドを、問題の受容体のすべてには結 合しないように選択した濃度で溶解して含有する初期培地中で生育させる。この 培地中で付着、増殖できる細胞を選択し、問題のリガンドの濃度を順次増加させ た培地中で再培養する。

別法として、Ｉ’、’５題の受容体に対する抗体を溶液中に加えてもよい。さら に、接着リガンドが細胞によって直接分泌される場合でも、接着リガンド（また は接着受容体に相当する抗体）を、細胞の付着を防止するために溶液中に加°え ることができる。

例　■ 非ＲＧＤペゾチド変異体中での同型培養同型培養を、以前に細胞付着促進剤とし て不活性で培養基板からの細胞の脱着には無効であることが明らかにされている （　Ｈａｙｍａｎら：　１９８５、Ｊ、　Ｃｅ１１Ｂｉｏｌ　１００　：　１９ ４８　）へキサペプチド変異体ＧＲａＥｓＰ　（Ｅはグルタミン酸である）の同 濃度の存在下に実施した。このＧＲＧＥＳＰペプチドはＭＯ−６５細胞には何の 影響も与えず、ＮＧ−（５３細胞は正常に生育して、このペプチドの不存在下に 生育させたＭＧ−６３と鎗別できなかった。

例　Ｖ フィブロネクチンおよびビトロネクチン受容体の流動細胞計測分析による定量 細胞上のフィブロネクチンおよびビトロネクチン受容体は、アフィニティーで精 製した、これらの２種の受容体と反応するポリクローナル抗体を用いて分析した 。使用した一次抗体は、アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗−ＭＧ−６ ３ビトロネクチン受容体および抗−ＭＧ−６３フィブロネクチン受容体抗体、ウ サギ抗−マウス上皮成長因子受容体抗血清、ならびに抗−ＨＬＥｉ抗体であった 。フィブロネクチン受容体およびビトロネクチン受容体はＰｙｔ　ｅｌａらの方 法（Ｃｅｌｌ。

４０：１９１．１９８５およびＰＮＡＳ、　８２：５７６６．１９８５；これら の記載は参考として本明細に導入する〕によって単離した。抗体は、標準操作を 用い、ウサギに逼蟲な免疫原を注射して製造した。正常ヒトタンパク質に対して 生成した抗血清を吸着させるとフィブロネクチン受容体またはビトロネクチン受 容体のいずれかに特異的な抗体が単離された。

二次抗体としては、ヤギに標準プロトコールでウサイエｇＧを注射し、抗体を標 準プロトコールでＦ工ＴＣに接合させて製造したアエＴＣ接合ヤギ抗−ウサギ１ ｇＧを使用した。Ｆ工ＴＣの螢光は緑色の螢光として検知された。生育不能細胞 の標識にはヨウ化プロビジウムを使用し、赤色の螢光として検知した。

細胞はｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡで収穫し、５％ウシ胎血清清（ＥＣ８）および０．１ ％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ中に２．５Ｘ１０５〜Ｉ　Ｘｌ　０６個／ １ｒＬｌの濃度に再懸濁した。細胞を上述の緩衝液で洗浄したのち、それぞれの 抗体または抗血清２容量（細胞ベレツトに対して）を加えた。１時間４℃でイン キュベートシタのち、細胞を上記緩衝液中で数回洗浄し、細胞懸濁液にＦ工ＴＣ 接合ヤギ抗−ウサギエｇＧを添加して３０分間４℃でインキュベートした。完全 に洗浄したのち、螢光活性化細胞ソータ＝（０ｒｔｈＯＣｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇ ｒａｆ　５０　Ｂ　）を用いて細胞を分析した。細胞プレバレージョンは間接免 疫螢光によって染色し、螢光活性化細胞ソーター（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａ ｆ　５　Ｑ　Ｈと２１５０：７ンビューターシステム；　０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃ　＋９ｙｓｔｅｍ、工ｎｅ、。

Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、　ＭＡ　）を用因て分析した。

２種の細胞系の流動細胞計測分析の結果は、フィブロネクチン受容体を間接免疫 螢光で調べた場合ＰＲＶ細胞はＭＯ−６３細胞に比べて螢光の平均強度が有意に 増加していたが、ビトロネクチン受容体の染色量にはＭＧ−６３細胞に比べて差 が認めらな−ことを示した。

比較のために、抗−ヒト白血球抗原（ＨＬＡ　）および抗−上皮成長因子受容体 抗体を用して上記のように同様の分析を行ったが、これらの２種の細胞系の表面 に存在するこれらの抗原の量には有意差はみられなかった。前方および直角光散 乱による細胞サイズの測定では細胞は懸濁液中で同じサイズを有することが明ら かにされ、抗−フィブロネクチン受容体抗体での染色の増加は実際に、ＰＲＶ細 胞上の受容体量の増加を反映するものであることが示された。

例　■ 免疫沈降によるフィブロネクチン受容体の定量ＰＲＶ細胞上のフィブロネクチン 受容体数の増加は、１２５ニ一表面標識細胞からの定量的免疫沈降、っ−でＳＤ Ｓ　−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって測定された。

ＭＧ−６３およびペプチド抵抗性変異体細胞を培養液からＥＤＴＡ　（ｉ　ｍＭ 　）で脱着させ、ＣａＣ１２（１ｍＭ　）およびＭｇＣｌ２　（１ｍＭ　）を含 有するＰＢＳに再懸濁した。

細胞（約２Ｘ’ＩＯ’個）をＰ７ｔｅｌ＆ら（ｃｅｌｚ、　４０　：１９１．１ ９８５；これは参考として本ＢＡｍ書に導入する）に記載されたように１２５１ で表面標識し、５ＤＳ（０，１％）、ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ　−ｉ　Ｄ　Ｏ（Ｄ−５ ％）　（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ ）　、デオキシコール酸ナトリウム（０，５％〕およびフェニルメチルスルホニ ルフルオリド・（ＰＭＳＦ）（’１ｍＭ）を含有するＰＢＳ中、４℃に１５分分 間−て溶解した。溶解した細胞から遠心分離で細胞層を除去し、当量のユ２５工 放射能を含む細胞抽出液をプロティンＡ　５ｅｐｈａｒｏｓｅとの共沈殿により 適当な抗体と免疫沈降させた。抗ｊ−抗体複合体をサンプル緩衝液（３％ＳＤＳ 、１０％グリセロールおよヒｏ、ｏ　ｏ　ｉ％ジブロモェノールブルーを含有す る２　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＥＣ：Ｌ、ｐ）］　６．８　）中で煮沸して解 離させた。サンプルを還元（５％２−メルカプトエタノール）または非還元条件 下７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中電気泳動ついでオートラジオグラ フィーにより、Ｌａｅｍｍ’ｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　：　６８０ ．１９７０）に従って分析した。

各抗体によって免疫沈降されたタンパク質の分子量は１ｒＮＨフイブロネクチン およびビトロネクチンの分子量に相蟲し、Ｐｙｔｅ：Ｌａら（５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３１　：　１５５９．１９８６、この記載は参考として本明細書に導入する） の記載のようにして非還元および還元条件下に電気泳動に付すと１９’ＤＳポリ アクリルアミドデル上でその移動特性パターンを示した。ＰＲＶ細胞上のフィブ ロネクチン受容体数の増加はオートラジオグラフィーをデンシトメーターで走査 して定量し、各サブユニットの量はＭＧ−６３細胞の母系の場合の約６倍に増加 していることが明らかにされた。ＧＲ（）ＤＳＰペプチドの不存在下に生育させ たＰＲＶ細胞の同様の分析から、これらの細胞はフィブロネクチン受容体数の増 加を維持していることが明らかにされた。ＰＲＶ細胞のビトロネクチン受容体数 はＭＧ−６３細胞の場合と同様であることがわかり、これ、は例ｍの流動細胞計 測分析の場合と一致する。　、 比較のだめのクラス１：、ＨＬ、Ａ尻重の抗−ＨＬＳ抗体による菟疫沈降では、 ２種の細胞系のこの分子の量に有意な差は認められず、これらのデータは５つの 別個の実験で一致した。

例　１１゜ ＩＡドツトプロント分析 全細胞性ＲＮＡはＵｌ：Ｌｒ１ｃｈらのグアニジウム／塩化セシウム法により、 Ｍａｎｉａｔｉｓらの記載（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌＯｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａ’ｂ ｏｒａｔｏｒ’ｙ　Ｍａｎｕ＆１．　Ｃ０１１Ｆｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＩＥａｒｂ ｏｒＬａｌ）ｏ、ｒａｔｏｒｙ、Ｃ０１（Ｌ　Ｓｐｒｉｎｇ、Ｈａｒｂ’ｏｒ、 ＮＹ＋　１　９　８　２　；　この記載は参考として本明細書に導入する）に従 って製造した。ＲＮＡ溶液は、５０％ホルムアミド（７％ＣＶ／Ｖ）ホ・ルムア ルデヒド中２０二Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ６，８に調整し、６５°Ｃで１５分 間インキュベートしてＲＮＡを変性させた。ついで３・７％ホルムアルデヒドヲ 含有−ｒ−・るｊ、ｉ　ＸｌＳｉＣ，、（ｉ　Ｘ、、、ＳＳＣ，はＱ、ｉ　５　 Ｍ　ＮａＣ１，１，５ｍＭクエン酸ナトリウム）で希釈し、ＲＮＡを、予め２０ ×ＳＳＣ中に浸したニトロセルロース濾紙に適用した。真空オープン中８．０℃ で２時間ペイキングしたのち、濾紙を以下に記載するように１．［３２ｐ″）ｃ ＤＮＡで、サザンブロント分、析により検査した。・ ＰＲＶおよびＭ　ＩＧ　−，６’、、３細胞からの全ＲＮＡを、フィブロネクチ ン受容体α−サブユニットの３２ｐ標識ｃ　ＤＮＡを用いてＭＡドツトプロット 分析に付すと、ＰＲＶ細胞におけるフィブロネクチン受容体の過剰産生がＭＧ− ６３細胞に比べてフィブロネクチン受容体ｍＲＮＡのレベルが高いことに相関す ることを示した。

〔３Ｈ〕ロイシン−およびユ２５工表面標識ＭＧ−６３およびＰＲＶ細胞の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥでは、この２種の細胞系のタンパク質像に他のどのような大きな差 も見出すことはできなかった。これを上述のデータと合わせて考えると、ｐｐｖ 細胞は母体ＭＧ−６３細胞に比べて多量のフィブロネクチン受容体を発現し、こ の差はこの２種の細胞におけるフィブロネクチン受容体のｍＲＩＪＡ量の差によ ると思われる。

遺伝子増幅がフィブロネクチン過剰産生の原因かどうかを決定するために、ＭＯ −６３およびＰＲＶ細胞からの高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化 し、サデンプロット法によって分析した。制限酵素分析では、細胞からＢ１１． ｎと５ｔａｆｆｏｒｄの操作（１Ｊｕｃｌ、Ａｃ’１ｄｓＲｅｄ、、３　：　２ ３０３．１９７６）によって高分子量ＤＮＡを単離した。制限エンドヌクレアー ゼはＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ、　ＭＤ　）から購入し、製造業者の指示に従って使用した。消化に続 いて最後にミニ−デル分析を行った。消化されたＤＮＡをＴｒｉａ　／ホウ酸塩 ／　ＩＣＤＴＡ緩衝液中０．８％アガロースデル上電気泳動に付した。アルカリ 変性および中和後、ＤＮ４をニトロセルロース濾紙に移した。真空オープン中８ ０℃で２時間ペイキングしたのち、濾紙を、５０％ホルムアミド・、５×デンハ ル）　ＥＪＬ　５　ｘ　５ｓｐｚ（，１ｘＳＳＰＥは１５’　Ｑ鮨、ｌＮａＣ１ 、ｊ、　［］　ｍＭ　ＮａＥ２ＰＯ４。

ｉ　ｍＭＥＤＴＡ　）、０．１％ＳＤＳおよび１ｏ　ｏ　μｇ／ｍｔ；の剪断、 熱変性サク***ＤＮＡを含有する溶液中４２９Ｃでプレハイブリダイゼーション を行った。ハイブリダイゼーションは、Ｘ７Ｐか゛らの６・７５−　ｂｐ　Ｂａ ｍＨＩ　７　ニア　／”　、Ｉ　７トからなるＳ２ｐオリゴ標識フイブロネクチ ン受容体α−サブユニットＣＤＮＡ　（Ａｒｇｒａｖｅｓら：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 　Ｃｈｅｗ。

２６１　：　１２９２２．１９８．．６・）またはＸＶＮＲ１０からの１．２８ ３−’ｂｐフラグメントからなる３２Ｆ−オリが標識ビトロネクチン受容体α− サブユニットｃ　ＤＩＮＡ（５ｕｚｕｋｉら：　ｘＭｇｏ、ｒ　４　：　２５１ ９．１９８６）を含有する上記溶液中、４２℃で１６時間実施した。

ハイブリダイゼーション後、濾紙を２ｘｓ（’１１．５ｍＭクエン酸ナトリウム 、Ｑ、ｉ、ｓＤｓ中室温で１時間、つめで１　ｘ　ｓｓｃ、　０．１％ＳＤＳ中 ６５℃で１時間洗浄した。ｍ紙を風乾させ、オートラジオグラフィーはＫｏａａ ｋ　ＸＡＲ−５フィルムおよび増感スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉ ｎｇ　Ｐｌｕｓ、　Ｅ、工、　ＤｕＰｏｎｔ　ｄ・Ｎｅｍｏｕｒｓ　。

Ｎｅｗｔｏｎ、　ＣＮ　）を用い一７０℃で行った。

両細胞系から単離されたＤＩＩＡの代表的制限酵素消化物のハイブリ、ダイゼー ションシグナルは、フィブロネクチン受容体またはビトロネクチン受容体のα− サブユニットをコードするＤｉをプローブとした場合、閂等の強度を示した。他 の制限酵素を用いた別の実験でも同様の結果が得られた。したがって、ＰＲｖ細 胞におけるフィブロネクチン受容体の発現の増加は遺伝子増幅によるものではな く、多分、フィブロネクチン受容体遺伝子の転写速度の上昇またはその受容体ｍ ＲＮＡの安定性の増大のめずれかによったものと思われる。

例　１１ ＧＲＧＤＳＰの存在下におけるフィブロネクチンおよびビトロネクチンへの付着 受容体に質的変化が起こらなかったとすると、ＰＲＶ細胞のフィブロネクチンへ の付着を阻害するためには、ＭＧ−６５細胞の場合よりも、多量のペプチドが要 求されるはずであり、一方、ビトロネクチンへの両細胞の付着を阻害するには同 濃度のペプチドが必要であろう。検定は９６−ウェルマイクロタイタープレート を用い、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉらの方法（Ｍｅｚｈ、　Ｅｎｚ、　８２　：　８０ ３．１９８２；この記載は参考として本明細書に導入する）に従って行った。各 ウェル・の被覆にはフィブロネクチン２μｇおよびビトロネクチン３μｇを用い 、細胞は各ウェルあたりｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ個を添加した。

結果は第１表に示す。

第　１　表 ＭＧ−６５ｐＲｖ ！ＩＩＭ　ｍＭ フィブロネクチン　０．２１　５．３０ビトロネクチン　０．０６　０．０７ フイブロネクチンに対するＰＲＶ細胞の最大付着の５０％阻害には、ＭＧ−６３ 細胞の場合に比べて約２５倍ものペプチドを要した。しかしながら、ビトロネク チンへの付着の阻害にはいずれての細胞系の場合も実際に同濃度のペプチドで有 効であった。これらのデータは、細胞選択過程におりて母細胞系よりもフィブロ ネクチンに強固に接着する細胞を生じたことを示し、また、選択培地中に存在す るペプチド量はビトロネクチンへの付着を明らかに阻害するがフィブロネクチン への付着は阻害できないことから、培養液中にペプチドが存在するときＰＲＶ細 胞は主としてフィブロネクチン受容体を使用することが示唆された。

例　■ ＰＲｖｍ胞の特性 ｐＲｖ細胞は、形態学的変化、増殖速度の遅延、１ｎＷｉｔｒＯにおける石灰化 マトリックスの形成能、■型コラーデンの合成増加、プロスタグランジンＥ合成 の５０〜１００倍低下およびコンドロイチン硫酸プｏｆオグリカン産庄の低下を 含めて、ＭＧ−６３細胞系とは、きわめて異なる表視型特性を示した。これらの 特性はＰＲＹ系の細胞がＭＧ−（５３系の場合に比べて著しく高度に分化された 細胞型であることを示している。

すなわち、この細胞系は、例１の選択条件によってもたらされた腫瘍細胞系の分 化から生じたものである。

ＰＲＶ細胞は、多くの場合細胞不休よりも長い多数の突起を有する星状の形態を 示し、母体のＭＧ−６３細胞とは著しく異なっていた。これらの形態学的特性は 骨細胞の場合と似ていなめことはない。一方、ＭＧ−６３細胞はほぼ平担な多角 形細胞で、線維芽細胞に類似する。ｐｐｖ細胞は編み合わされたような外観を呈 し、細胞突起はしばしば細胞を相互に連結させて因るようにみえた。さらに、’ 　ＰＲＶ細胞は、細胞質の顆粒性およびこれらの細胞の突起から判断して分泌性 に冨むように思われた。ＧＲＧＤＳＦ−”Ｅプテドの不存在下に生育させてもＰ ＲＶ細胞はこの形態を少なくとも３力月は維持し、この形態学的変化は安定なも のであることを示してめる。この２種の細胞系について、両者の関係を確認し、 またＰＲＶ細胞にはＭＧ−６”）細胞に比べて何らかの全体的な染色体変化が起 こったのかどうかを調べるために、核型分析を行った。５個のＭＧ−６３および １６個のＰＲ’Ｖ細胞からの染色体を分析した。これらの分析の結果は、この２ 種の細胞系からの詞ぺた細胞はすべて、９個の識別可能な染色体マーカー、なら びに数個の染色体のトリソミーおよび正常染色体９の不存在の点で共通している ことを示した。これらの観察は、ＰＲＶ細胞が実際にＭＯ−６３細胞から誘導さ れることを示している。遺伝子増偏を示すような明らかな染色体変化は、ＰＲ？ 細胞には認められなかった。

ｂ、成長特性　・ ＰＲｖ細胞はＭＧ−６３細胞とは異なる成長特性を有し、はるかに遅い増殖速度 を示す。同じ初期密度で平板培養した場合、集密状態に違するまで：ｖｅ−６３ 細胞では４日を要するのに対し、ＰＲｖ細胞はほぼ１５日を要した。

トリチウム化チミジンの取り込み試験を実施した。

ＰＲＹおよびＭＧ−６３細胞を、９６−ウェルマイクロタイタープレート中、１ μＣ１チミジンメチル〔３ヨ〕（２−ＯＣ１／ｍｍｏｌ　）の存在下、等しい細 胞密度で平板培養した。３７℃で様々な時間インキュベートしたのち、細胞を１ ０　ｍＭ　ＥＤＴＡで脱着させ、細胞ハーベスタ−を用いてガラス淑維セルロー スディスク上に収穫した。ディスクを乾燥させ、放射能を液体シンチレーション カウンターで測定した。ＭＧ−ｔ５３細胞は８２．３９７±１３．Ｄ　００　ｃ ｐ２ＩＩ／　１０５個細胞／２４時間を取り込んだのに対し、ＰＲＶ細胞の取り 込みはわずかに８，３３０±４２０　ｃｐｍ／　１０５個細胞／２４時間であっ た（２回の別個の実験の結果であり、各実験は細胞単層をＰＢＩ９で洗浄し、カ ルシウム沈着を調べるためＭｃＧｅｅ−ＲｕＳｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ、、　１ ７５：　３０１　、’　１．９’５５　）の記載に従ってアリプリンレッドＳで 染色した。略述すると種細胞をホルムアルデｉド（３７％）と無水エタノール１ ：１混合物中に１５分間固定した。細胞単層を５０％エタノールに移し、ついで 速やかに蒸留水ですすいだ。単層をアリザリンレッドＳの２％溶液、ｐＨ４，２ で覆った。５分後に細胞単層をＰＢＳで完全に洗浄して過剰の染料を除去し、バ ックグランドを低下させた。カルシウムの沈着部位は橙赤色の複屈折沈殿として 観察できた。細胞と会合した染料の量は、細胞を０．１％ＳＤＳ中で溶解し、分 光光度計で４６５　ｎｍの吸収を測定することにより定量した。細胞単層は、カ ルシウムのｖｏｎ　Ｋｏａｓａ銀試験によっても染色した。

集密状態に違すると、ＰＲＶ細胞は、プラスチック培養皿の表面上に、肉眼でも 明瞭に観察できる多くの白色の小結節を生じる。これらの不結節は、カルシウム 沈着を染色する染料であるアリゾリンレッドＳに対して染色された。一方、ＭＯ −６３細胞は、平担な単層として成長し、集密状態に達してもこれらの小結節は 形成せず、アリザリンレッドＳで染色されなかった。

逆位相差顕微鏡で観察すると、ＰＲＶ細胞の小結節は、アリゾリンレッドＳで強 力に染色された屈折性物質として認められた。小結節のアリザリンレッドＳによ る強力な染色は、集密度の低いＰＲＶ培養体でもＭ　Ｏ−６３細胞に比べて陽性 に染色されたことから、単に染料の捕捉によるものではない。ＰＲＶ細胞と会合 した染料の量を分光光度法で測定すると綿服密度とともに増大したが、ＰＲＶ細 胞について得られた値はほぼバンクグランドレベルであった。同じ培養体のカル シウム沈着ヲｖｏｎ　Ｋｏｓｅ　録染色によっても染色した。この方法による染 色ではＰＲＶ細胞についてのみが陽性で、分布パターンはアリゾリンレッドＳ染 色の場合と同一であった。

これらの２種の染料によって強度に染色された領域が死細胞の存在によるもので なかったことは、培養体の生死判定染料、トリパンブルーで染色した。アリザリ ンレッドＳおよびｖｏｎ　Ｋｏｓｇａ染色で染色された領域に存在する大部分の 細胞はトリバンプルーを排除し、それらが生存していることを示した。

ＰＲＶ細胞によって形成された小結節中におけるカルシウムの存在はさらに、Ｒ ｕｓεの方法（Ａｍ１３ｒ、　ＳＯｃ。

ｆｏｒ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、５ｐｅｃｉａｌ　Ｐｕ ｂｌｉｃ、４５．１９７１　）に従りエネルゼー分散Ｘ線解析によって明らかに された。この方法で得られたデータは、これらのＰＲＶ細胞小結節が同じブイズ のＭＧ−６３細胞サンプルに比べて有意に多量のリン酸カルシウムを含むことを 明らかに示した。カルシウムとマグネシウムの比はＰＲＶ細胞については約１０ であるが、ＭＧ−６３細胞では１．０に近い。同様に、リンと′ｆＭ黄の比はＰ ＲＶ細胞では約１１であるが、ＭＧ−６３細胞ではわずか２である。しかしなが ら、他の元素の比、たとえばナトリウムとアルミニウムの比は、両細胞系で同じ である（　ＰＲＶ細胞で１．２５、Ｍａ、−６３細胞テ１．４．）。コレらのデ ータを、ＰＲＶ細胞がＭＧ−６３細胞の約２０倍ものカルシウムを４８時間で取 り込むことを示す４５Ｃａの取り込み研究の結果と考え合わせると、ＰＲＶ細胞 の小結節中のリン酸カルシウム濃度が特殊なことを示しＭＧ−６３およびＰＲＶ 細胞によって合成される主なコラーゲン製を分析した。略述すると、細胞を、１ ０％ＦＣ８ならびに各１００μＥｌ／ｍｌ！のアスコルビン酸およびβ−アミノ プロビオニトレートフマレートを含有するＤＭＥ中５０　＃Ｃ１７ｍｚの５−　 （”Ｅ）プロリン（９，３ｃ　１／ｒｎＭ）で２４時間標識した。培地を酢酸で ０．５Ｍとし、細胞ヲ２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ト１　ｍＭ　フェニルメメチルス ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ　）含有培地中に分散した。細胞懸濁液を６０Ｈ ２で３０秒間超音波処理し、不溶性残留物を遠心分離で除去した。ＭＧ７６３お よびＰＲＶ　Ｉｆａ胞のタンパク質の轟量を含有するサンプルを１０μ９／ｍｌ のベゾシンにより４℃で３時間処理した。ペプンン消化物をＮａＯＨでＰＩ″１ ８．０とし、２種の細胞系によって合成されたコラーゲンの種類を上述のように ７．５％ポリアクリルアミドデル上５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

フルオログラムでは常に、標準α１（１）およびα２（Ｉ）コラーデン鎖と共移 動する２つの主要バンドが両細胞系によって合成されることを示したが１．　Ｐ ＲＶ細胞はコラーゲンＩ型を約５倍合成する。したがって、ＭＧ−６３骨肉謄細 胞によって合成される主なコラーゲン製はＩ型コラーデンであるが、ＰＲｖ細胞 ではこの型のコラーゲンの合成は調節されておらず、同時に分化された骨芽細胞 様表現型と石灰化マトリックスの増加を示すように思われる。

プロスタグランジンとくにＰＧＥ２は骨代謝に関与しているので、ＭＯ−６３骨 肉腫細胞およびＰＲＶによって合成され分泌されるＰＧＥ２の量をＭｉｔｃｈｅ ｌｌ　＆　Ｆ］、ｉｎｔの特異的イムノアッセイ操作（Ｊ、　Ｅコｄｏｃｒｉｎ 、　７６　：１１１．１９７８；この記載は参考として本明細書に導入する）に よって定量した。

１４０−アラキドン酸代謝の放射標識生成物と未変化基質を、Ｃ１８’４　、！ ！　Ｂｏｎｄａｐａｋカラム（ｗａｔｅｒｓ＋Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ　）を使 用した逆相）ｌ：ＰＬＣにより、Ｍｉｔｃｈｅｌｌらが以前に報告したように（ ｐｒｃｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ。

Ｌｅｕｋｏｔｒｉａｎｅｓ　ａｎａ　Ｍｅａｉｃｉｎｅ　２　７　：　１　９　 ７、１９８７、この記載は参考として本明細書に導入する）分離した。

第２表に示すように、１０％ウシ胎仔血清の存在下、ＭＧ−６３細胞によって分 泌されるＰＧＥ２の量はＰＦｔＶ細胞の場合より約５Ｄ倍多かった。この差は血 清を含まない条件下に細胞？培養した場合にはさらに太きい。

２種の細胞系によるユ４０−アラキドン酸代ｉ１モ、Ｍｆ）−６６細胞では１’ ＲＶ細胞に比べ有意に高い百分率のアラキドン酸をプラスタグランジンに代謝す ることが明らかにされた（第３表）。どちらの細胞系もリポキシデナーゼ経路で はアラキドン酸を検出できる程度には代謝しなかった。これらの結果は、ＰＲＶ 細胞ではリン脂質代謝の下方調整があることを示唆し、また、骨形成よりもむし ろ骨吸収のメディエータ−としての高レベルのＰＧＥ２の役割を支持するもので あろう。

第　２　表 ＭＯ−６３およびＰＲＶによる培養培地中への関連プラスタグランジン、ＰＧＥ ２分泌 Ｐ分泌Ｅ２　（ＰＶｌ　Ｄ　６個′ｍ胞）血清あり（１０％）　血清なし“ Ｍ　Ｏ−６３４６５３±５１０　２４９５　＋　８００ＭＧ−６３，３Ａ　１１ ８＋　６０　２４＋　１５値は３回の別個の実験からの平均である。細胞ははぼ 等しｂ細胞濃度まで生育させ、この時点で培養培地を取り出し、上述の特異的ラ ジオイムノアン七イでＰＧＥ２０レベルを測定した。細胞は１ｍＭ　ＥＤＴＡで 培養液から除去し、Ｍｉ胞数をＡｒｔｅｋ　ａ胞計数器を用すで計数した。

”細胞はダルベツコ最小必須培地、Ｆ１２栄養培地（Ｇｉｂｃｏ　）およびトラ ンフェリン／インスリン／セレン混合物（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈよりｃ、、　Ｂｅｄｆｏｒｃｌ。

ＭＡ　）からなる一定の培地中で生育させた。

第３表 ＭＧ−６３およびＰＲＶ細胞による１４Ｃ−アラキドン酸のプロスタグランジン への代謝 １４ｃ′−プロスタグラ　ブロスタグ２ンンジン濃度（ｃｐ坊　ジンに代謝され タンパク質）　だ総標識％ ＭＧ−６３８７，ＯＤＤ±１．７００　１８．０％ＭＧ−６３．３Ａ　４．６５ ３±８００　０．９％値は３回の別個の実験の平均である。細胞は１４ｃ−アラ キドン酸（５Ｘ　Ｉ　Ｑ５ｃｐｍ　）の存在下に２％ウシ胎血清溝中で２日間培 養した。１４０ｍ７キツドン醗代謝の生成物は上述のようにして測定した。タン パク質濃度はＬｏｗｒｙらの方法によって測定した。

ｆ、その他の特徴 ＰＲＶ細胞の独特な特徴のひとつは、細胞を包埋する屈折性物質を成長させ同化 する集菌体を形成することである。この物質はリン酸カルシウムに富んで因る。

ＰＲｖ細胞によって形成される石灰化小結節の明かるい原微鏡的外観は、ラット 血清頭蓋冠からの一次骨芽細胞培養体、マウス新生仔頭蓋冠からの骨芽細胞培養 体中に認められるものときわめて類似している。しかしながら、ＰＲＶ細胞は、 一部の一次骨芽細胞培養体でのマ）　ＩＪラックス灰化に必須な外因性β−グリ セロホスファターゼの不存在下にも石灰化を行うことができて、これはＰＲＶ細 胞が培養培地中のリン酸の基礎濃度を利用できる活性な生化学経路をもっことを 示している。

しかもＰＲＶ細胞は悪性ではない。ヌードマウに注射しても、腫瘍を生成する母 体ＭＧ−６３細胞と異なり、腫瘍を生成しなり０ 例　Ｘ 同型細胞系 さらに２種の細胞系を例Ｉの選択基準に曝露した。

すなわち、神経芽細胞５ＫＮＳコおよび骨肉腫細胞ＨＯ５で、いずれもＡｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌユａｃｔｉｏｎ　Ｋ　’ＩｊＦ託 されている。？＋９／ｒｄのＧＲＧＤＳＰを含有する培地中で生育させると、Ｈ ｏＳ細胞系は受容体を過剰産生ずることが明らかにされた。５ＫＮＳＨ系はＲＧ Ｄ含有ペプチド１．５■／−を含有する培地中で生育させると形態学的変化を生 じた。これらの結果は、ＭＧ−６３１ｆＢ胞系を選択条件に相邑する時間曝露し た場合に生じた接着性の増加および分化の促進方向の相轟する変化に一致する。

本発明を以上、現時点での好ましい態様を参照しながらＲ明したが、本発明は添 付の請求の範囲によってのみ限定されるものであって、本発明の範囲から逸脱す ることなく変化が可能なことを理解すべきである。

補正書の翻訳文提出書　（＃猪法制８４　条＋７１８　）１、特許比願の表示　 ＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１０３３４２３、特許出願人 氏名（名称）　ラ　ジヨウ　キャンサー　リサーチ　ファウンデーション５、ｍ ′：Ｅｔの提８年月８　１９９０　年　１　月　７ε　日浄書（内容に変更なし ） 請求の範囲（３４条補正） （１）母細胞系から機能性受容体数の増加の結果として接着性の増大した細胞を 選別する方法において、に、上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、ｂ、 上記母細胞の表面上の受容体に結合できる接着リガンドを溶液として、機能性受 容体数の増加した細が正常数の機能性受容体を有する細胞上の機能性受容体とは 細胞増殖を阻害するのに十分な数と結合するように選択された初期濃度で含有す る培養培地中、上記受容体の接着機能を阻害するような方法で培養し、Ｃ０溶解 した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖するのに十分な機能性受容 体を有する細胞を選択し、 ｄ、この選ばれた細胞を、落屑した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有させた培養培地中で継萩的に再培養し、 ｅ、溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖する のに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、ついで、 ｆ、この選択された細胞から、受容体数の増加の結果として接着性が増大した細 胞系を衝立する各工程からなる方法。

（２）溶解した接着リガンドはペプチドである請求項（１）記載の方法。

（３）　ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸已列ＲＧＤを含有する請求項（ ２）記載の方法。

（４）ペプチドはＧＲＧＤＳＰである請求項（３）記載の方法。

（６）　溶解した接着リガンドは抗体である請求項（１）記載の方法。

（６）　さらに、母細胞を培養する容器を、溶解した接着リガンドと同じ細胞表 面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加する請求項ｔｌｌ記載の 方法。

（７１さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受 容体遮断リガンドを培養液に加える付加工程からなる請求項（１）記載の方法。

（８）　受容体遮断リガンドはその相当する細胞表面受容体のすべてに結合する のに十分な濃度を加える請求項（７）記載の方法。

（９）受容体遮断リガンドはフィブロネクチン受容体に結合する請求項（７）記 載の方法。

■　母細胞系は腫瘍細胞系である請求項（１）記載の方法。

０υ　母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項（１）記載の方法。

Ｃ２１母細胞系はＭＧ−６３である請求項（１）記載の方法。

（１３１母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項（１）記載の 方法。

（１４）　母細胞系は接着細胞表面受容体が減少している非悪性細胞である請求 項（１）記載の方法。

０５１　接着細胞表面受容体の減少は母細胞の培養液中での生育の結果である請 求項Ｃｌ４１記載の方法。

ａω　同−細胞型の正常細胞系の機能性接着結合リガンド受容体の数よりも多く の機能性接着結合リガンド受容体を有する単離された細胞系。

０′ｒ）母細胞系からの細胞の分化を受容体数の増加の結果として促進する方法 において、 ａ、上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、℃、上記母細胞の表面上の受 容体に結合できる接着リガンドを溶液として、機能性受容体数の増加した細胞の 表面上に存在するすべての受容体には結合したｂが正常数の機能性受容体を有す る細胞上の機能性受容体とは細胞増殖を阻害するのに十分な数と結合するように 選択された初期濃度で含有する培養培地中、上記受容体の接着機能を阻害するよ うな方法で培養し、Ｃ０溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増 殖するのに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、 ｄ、この選ばれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有させた培養液中で継続的に再培養し、 ｅ、溶解した上記接着リガン−の、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖する のに十分な機能性受容体を有する細胞を選択し、ついで、 ｆ、この選択された細胞から、受容体数の増加の結果として接着性が増大した細 胞系を樹立する各工程からなる方法。

ｉ　溶解した接着リガンドはペプチドである請求項αＤ記戦の方法。

Ｃ３ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列ＲＧＤを含有する請求項０８１ 記載の方法。

Ｃ！ω　ペプチドはＧＲＧ、ＤＳＰである請求項０９記載の方法。

（２Ｌｌ　溶解した接着リガンドは抗体である請求項０力記載の方法。

（２ｚ　さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接＝　ＩＪガントと 同じ細胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加する請求項０ ７）記載の方法。

の　さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受容 体遮断分子を培養液に加える付加工程からなる請求項αη記載の方法。

Ｕ　受容体遮断分子はその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するのに十分 な濃度を加える請求項の記載の方法。

斡　受容体遮断分子はフィブロネクチン受容体に結合する請求項−記載の方法。

（２５１母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項αつ記載の方法。

■　母細胞系は骨肉１細胞系である請求項αｎ記載の３　母細胞系はＭＧ−６３ である請求項０Ｄ記載の方法。。

凶　母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項（１７＋記載の方 法。

（至）　母細胞系は分化のレベルが低下した非悪性細胞である請求項Ｏｎ記載の 方法。

Ｇｌｌ　分化のレベルの低下は母細胞の培養液中での主育の結果である請求項回 記載の方法。

６つ　削除。

蕊　細胞接着受容体のレベルが増加した細胞を選択することからなる細胞系の細 胞の分化を増大させる方法。

ば　細胞系の細胞の分化を促進させる方法にお込て、ａ、上記細胞系の細胞によ って発現される細胞表面受容体に選択的に結合できるリガンドを準備し、ｂ、上 記リガンドを上記細胞系の細胞と反応させ、Ｃ８上記リガンドが高濃度に結合し た細胞を同定し、ｄ、同定された細胞を上記リガンドの存在下に再培養し、つい で ｅ、細胞が所望の分化レベルを示すようになるまで工程すからｅまでを反復する 各工程からなる方法。

手続補正書（自発） 平成　２年　５月１０日 ゛　特許庁長官殿 １、事件の表示 ＰＣＴ　／　ＵＳ８８　／　０３３１２２、発明の名称 細胞接着性が増大した細胞の選別 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ラ　ジョラ　キャンサー　リサーチファウンデーション ４、代理人 居　所　〒１００東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町とルヂング３３ １ ５、補正の対象 手続補正書（自発） 平成２年６月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）母細胞系から接着性の増大した細胞を選別する方法において、 ａ．上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、ｂ．上記母細胞の表面上の受 容体に結合できる接着リガンドを溶液として、上記母細胞の表面上に存在する上 記受容体のすべてには結合しないように選択された初期濃度で含有する培養培地 中、上記受容体の接着機能を阻害するような方法で培養し、 ｃ．溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖する細胞を選択し 、 ｄ．この選はれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有させた培養培地中で継続的に再培養し、 ｅ．溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害Ｒる濃度で増殖でき る細胞を選択し、ついでｆ．この選択された細胞から接着性の増大した細胞系を 樹立かる各工程からなる方法。 （２）溶解した接着リガンドはペプチドである請求項（１）記載の方法。 （３）ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列ＲＧＤを含有する請求項（２ ）記載の方法。 （４）ペプチドはＧＲＧＤＳＰである請求項（３）記載の方法。 （５）溶解した接着リガンドは抗体である請求項（１）記載の方法。 （６）さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接着リガンドと同じ細 胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加した請求項（１）記 載の方法。 （７）さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する受 容体遮断リガンドを培養液に加える付加工程からなる請求項（１）記載の方法。 （８）受容体遮断リガンドはその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するの に十分な濃度を加える請求項（７）記載の方法。 （９）受容体遮断リガンドはフィブロネクチン受容体に結合する請求項（７）記 載の方法。 （１０）母細胞系は腫瘍細胞系である請求項（１）記載の方法。 （１１）母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項（１）記載の方法。 （１２）母細胞系はＭＧ−６３である請求項（１）記載の方法。 （１３）母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項（１）記載の 方法。 （１４）母細胞系は接着細胞表面受容体が減少している非悪性細胞である請求項 （１）記載の方法。 （１５）接着細胞表面受容体の減少は母細胞の培養液中での生育の結果である請 求項（１４）記載の方法。 （１６）請求項（１）記載の方法によって産生された細胞系（１７）母細胞系か らの細胞の分化を促進する方法において、 ａ．上記母細胞系からの細胞のサンプルを準備し、ｂ．上記母細胞の表面上の受 容体に結合できる接着リガンドを溶液として、上記母細胞の表面上に存在する上 記受容体のすべてには結合しないように選択された初期濃度で含有する培養培地 中、上記受容体の接着機能を阻害するように培養し、 ｃ．溶解した上記初期濃度の上記接着リガンドの存在下に増殖する細胞を選択し 、 ｄ．この選ばれた細胞を、溶解した上記接着リガンドの濃度を順次増加させて含 有する培養培地中で継続的に再培養し、 ｅ．溶解した上記接着リガンドの、通常は細胞の増殖を阻害する濃度で増殖でき る細胞を選択し、ついでｆ．この選択された細胞から上記母細胞よりも分化が促 進された細胞系を樹立する各工程からなる方法。 （１８）溶解した接着リガンドはペプチドである請求項（１７）記載の方法。 （１９）ペプチドは接着結合部位としてアミノ酸配列ＲＧＤを含有する請求項（ １８）記載の方法。 （２０）ペプチドはＧＲＤＧＳＰである請求項（１９）記載の方法。 （２１）溶解した接着リガンドは抗体である請求項（１７）記載の方法。 （２２）さらに、母細胞を培養する容器の基板を、溶解した接着リガンドと同じ 細胞表面受容体と結合する接着促進物質で被覆する工程を付加した請求項（１７ ）記載の方法。 （２３）さらに、溶解した接着リガンドに相当しない細胞表面受容体に結合する 受容体遮断分子を培養液に加える付加工程からなる請求項（１７）記載の方法。 （２４）受容体遮断分子はその相当する細胞表面受容体のすべてに結合するのに 十分な濃度を加える請求項（２３）記載の方法。 （２５）受容体遮断分子はフィブロネクチン受容体に結合する請求項（２３）記 載の方法。 （２６）母細胞系は腫瘍細胞系である請求項（１７）記載の方法。 （２７）母細胞系は骨肉腫細胞系である請求項（１７）記載の方法。 （２８）母細胞系はＭＧ−６３である請求項（１７）記載の方法。 （２９）母細胞系は培養液中で生育可能な非悪性細胞である請求項（１７）記載 の方法。 （３０）母細胞系は分化レベルの低下した非悪性細胞である請求項（１７）記載 の方法。 （３１）分化レベルの低下は母細胞の培養液中での生育の結果である請求項（３ ０）記載の方法。 （３２）請求項（１７）記載の方法によって産生された細胞系。 （３３）細胞接着受容体のレベルが増加した細胞を選択ナることからなる細胞系 の細胞の分化を増大させる方法。 （３４）細胞系の細胞の分化を促進させる方法において、ａ．上記細胞系の細胞 によって発現される細胞表面受容体に選択的に結合できるリガンドを準備し、ｂ ．上記リガンドを上記細胞系の細胞と反応させ、ｃ．上記リガンドが高濃度に結 合した細胞を同定し、ｄ．同定された細胞を上記リガンドの存在下に再培養し、 ついで ｅ．細胞が所望の分化レベルを示すようになるまで工程ｂからｅまでを反復する 各工程からなる方法。