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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Amplifikation hämatopoetischer Stammzellen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Amplifikation
humaner Knochenmarksstammzellen durch Kultivieren der Zellen mit
Endothelzellen in Gegenwart von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen.
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Die Erfindung umfaßt keine
humanen Embryozellen.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Hämatopoese,
die Bildung reifer Blutzellen, beinhaltet ein komplexes Differenzierungsschema
in viele Linien (Metcalf, Nature 339: 27–30, 1989). Hämatopoese
erfolgt hauptsächlich
im Knochenmark, wo hämatopoetische
Stammzellen (pluripotente Stammzellen) proliferieren und zu Progenitorzellen
differenzieren, die sich dann zu den verschiedenen Typen reifer
Blutzellen entwickeln (Gordon et al., Bone Marrow Transplant 4: 335,
1989; Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio. 3: 423, 1987). Die hämatopoetische
Stammzelle ist funktionell durch ihre ausgiebige und lang anhaltende
Selbsterneuerungskapazität
sowie ihre Fähigkeit
charakterisiert, zu differenzieren und dadurch zu Zellen aller lymphohämatopoetischen
Reihen zu führen
(Sprangrude et al., Science 241–58,
1988; Terstappen et al., Blood 77: 1218, 1991; Civin et al., Exp.
Hematol. 15: 10, 1987; Civin et al., J. Immunol. 133: 157, 1984;
Strauss et al., Exp. Hematol. 14: 878, 1986). Phänotypisch ist der augenblicklich
einzige gut definierte humane hämatopoetische
Stammzellmarker das hämatopoetische
Zelloberflächenantigen
CD34 (Civin et al., J. Immunol. 133: 157, 1984; Strauss et al.,
Exp. Hematol. 14: 878, 1986). Dieses Zelloberflächenantigen ist ein hochglykosyliertes
integrales 115 kd-Membranprotein vom Typ I mit unbekannter Funktion
(Civin, Exp. Hematol. 18: 461, 1990).
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Die Sequenz der cDNA für humanes
CD34 läßt vermuten,
daß es
mehrere O-verknüpfte
Glykosylierungsstellen gibt (Simmons et al., J. Immunol. 148: 267,
1992) und daß das
Anhängen
linienspezifischer Glykane an das CD34-Grundgerüst die Bindung an Lectine an
Knochenmarksstromazellen oder der extrazellulären Matrix erlaubt. Das CD34-Antigen
wird von etwa 1–5%
der Zellpopulation des humanen Knochenmarks exprimiert (Civin et
al., Exp. Hematol. 15: 10, 1987; Civin et al., J. Immunol. 133:
157, 1984; Strauss et al., Exp. Hematol. 14: 878, 1986) und schließt pluripotente
Zellen sowie Vorläuferzellen
für jede
der hämatopoetischen Zellinien
ein (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Berstein et al.,
Blood 77: 2316, 1991). Ferner wird das CD34-Antigen auf humanen
vaskulären
Endothelzellen exprimiert (Fina et al., Blood 75: 2417, 1990), was eine
mögliche
Rolle für
das Antigen bei Adhäsion
oder zellulären
Wechselwirkungen vermuten läßt. Gereinigte CD34+-Zellen können in vivo Hämatopoese
rekonstituieren (Berenson et al., J. Clin. Invest. 81: 951, 1988;
Berenson et al., Blood 77: 1717, 1991) und unterstützen die
Myelopoese zusammen mit Stromazellen in Langzeit-Knochenmarkskulturen über mehrere
Monate (Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984; Andrews et al., J.
Exp. Med. 172: 355, 1990; Sutherland et al., Blood 74: 1563, 1989;
Gordon et al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987; Gordon et al., Br.
J. Haematol. 60: 129, 1985; Verfaillie et al., J. Exp. Med. 172:
509, 1990). Weitere Untersuchungen zeigten, daß die pluripotente hämatopoetische
Stammzelle durch weitere phänotypische
Marker, einzeln und in Kombination, identifiziert werden kann. Die
primitivsten pluripotenten humanen hämatopoetischen Knochenmarksstammzellen
sind kleine (geringe Vorwärts-Lichtstreuung
und Seitwärtsstreuung) CD34+, Thy1+/–,
c-Kit+, HLA-DR–,
CD38–,
CD15–,
Rhodamin-123-schwache und 4-Hydroperoxycyclophosphamid-resistente
Zellen, sind aber hämatopoetischer
Linienmarker-negativ (Lin.–) (Baum et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 2804, 1992; Briddle et al., Blood 79: 3159,
1992; Craig et al., J. Exp. Med. 177: 1331, 1993). Ähnlich zeigten
jüngere
Reinigungsversuche, daß die
primitivsten murinen hämatopoetischen
Stammzellen über zahlreiche
phänotypischer
Marker isoliert wurden, wie Thy-1, c-Kit, Weizenkeimagglutinin (WGA)
und Stammzellantigen (Okada et al., Blood 78: 1706, 1991; Ikuta
und Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1502, 1992), aber Lin– sind
(Sprangrude et al., Science 241: 58, 1988).
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Das Knochenmark dient in vivo als
die notwendige Mikroumgebung, in der konstitutive Hämatopoese, Stammzelldifferenzierung
und Selbsterneuerung der Stammzellen erfolgen (Gordon et al., Bone
Marrow Transplant 4: 335, 1989; Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio.
3: 423, 1987; Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984). Diese
Mikroumgebung besitzt zwei Hauptkomponenten – die lymphohämatopoetischen
Elemente und das Knochenmarksstroma. Das Knochenmarksstroma, das
aus Fibroblasten, Endothelzellen, Adipozyten und Makrophagen/ Monozyten
besteht, liefert ein heterogenes adhärentes Zelllayer. Es wurde
gezeigt, daß nur
diese heterogenen adhärenten
Zelllayer bei der Unterstützung
von Langzeit-Stammzellproliferation
und -differenzierung in vitro wirksam sind (Dorshkind, Annu. Rev.
Immunol. 8: 111, 1990; Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335,
1977; Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984). Innerhalb des
Knochenmarksstromas durchlaufen hämatopoetische Progenitorzellen
Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung (Andrews et
al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Sutherland et al., Blood 74: 1563,
1989; Gordon et al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987; Gordon et
al., Br. J. Haematol. 60: 129, 1985). Man nimmt an, daß an der
Proliferation und Differenzierung von Stammzellen in Stroma-abhängigen Kulturen
Zell-Zell-Wechselwirkungen (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355,
1990; verfaillie et al., J. Exp. Med. 172: 509, 1990; Gordon et
al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987), aus Stroma stammende Zytokine
(Berstein et al., Blood 77: 2316, 1991; Dorshkind, Annu. Rev. Immunol.
8: 111, 1990; Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335, 1977; Clark
et al., Science 236: 1229, 1987) und extrazelluläre Matrixproteine (Campbell
et al., J. Clin. Invest. 75: 2085, 1985; Campbell et al., Nature
329: 744, 1987; Tsai et al., Blood 69: 1587, 1987; Liesveld et al.,
Blood 73: 1794, 1989) beteiligt sind. Es bestand großes Interesse und
viel Arbeit wurde investiert, um ein in vitro-Kultursystem für hämatopoetische
Zellen zu etablieren (Edgington et al., Bio/Technology 10: 1099,
1992). In vitro kultivierte hämatopoetische
Zellen könnten
in der Humantherapie verwendet werden. Beispielsweise könnten solche
Zellen bei Knochenmarkstransplantationen (BMT) eingesetzt werden.
Die meisten BMT-Protokolle versuchen, die Hämatopoesefunktion nach Exposition
mit myeloablativen Mitteln zu restaurieren. BMT ist daher ein wichtiger
Bestandteil der therapeutischen Behandlung von fortgeschrittener
Malignitäten
(sowohl hämatologischen
als auch nicht-hämatologischen),
intrinsischen Knochenmarksdefekten und Knochenmarksverletzung durch
extrinsische Mittel (beispielsweise Strahlung oder Toxine). Ferner
ist zu erwarten, daß BMT
zusammen mit den sich entwickelnden genetischen Therapiemethoden
eine zunehmend größere Rolle
bei der Behandlung zahlreicher Erkrankungen spielt. Zur allgemeinen Übersicht
siehe Negrin et al. (Marrow Transplantation Reviews 2: 23, 1992)
und Antman (Marrow Transplantation Reviews 2: 27, 1992).
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Hämatopoetische
Kultursysteme können
grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, Flüssigkultursysteme und Stroma-Cokultur-Systeme. Flüssigkultursysteme
züchten
hämatopoetische
Zellen suspendiert in flüssigen
Medien mit zusätzlichen
Wachstumsfaktoren und Zytokinen (Haylock et al., Blood 80: 1405,
1992; Brugger et al., Blood 81: 2579, 1993). Obwohl Flüssigkulturen
leicht zu erhalten und technisch für eine umfangreiche Expansion
hämatopoetischer
Zellen zur therapeutischen Verwendung gut geeignet sind, gelang
es mit keiner von ihnen, CD34+-Stammzellen
in größerer Zahl
zu erzeugen, wie sie zur langfristigen Ansiedelung (Engraftment)
notwendig sind Dies spiegelt sich auch in der Tatsache wider, daß es schwierig
ist, diese Kulturen über
einen längeren
Zeitraum (Monate) zu erhalten, da die pluripotenten Stammzellen
alle schnell zu reiferen Zellen differenzieren. Das Unvermögen, einen
Pool undifferenzierter pluripotenter Stammzellen zu erhalten und
zu expandieren, ist vermutlich auf das Fehlen einer durch die Stromaelemente
des Knochenmarks gebildeten geeigneten Mikroumgebung zurückzuführen. Um
dieses Problem zu lösen,
züchten
Stroma-Cokultur-Systeme hämatopoetische
Zellen mit oder ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen
auf oder in einem adhärenten
Layer von Knochenmarksstroma (einer heterogenen Population von Endothelzellen,
Adipozyten, Fibroblasten und Makrophagen).
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Eines der ersten Langzeitsysteme
für Knochenmarkskulturen
(Long-Term Bone Marrow Culture Systems, LTBMCS) wurde von Dexter
et al. beschrieben (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio. 3: 423, 1987).
Die LTBMCS von Dexter et al. zeigten, daß sich unter in vitro-Kulturbedingungen
verlängertes
Zellwachstum und verlängerte
Entwicklung erreichen läßt. In diesem
System scheint ein adhärentes
Layer von Knochenmarksstroma die Wachstumsfaktoren und die zelluläre Umgebung
zu liefern, die für
die Proliferation hämatopoetischer
Stammzellen und ihre Differenzierung zu einer Vielzahl determinierter
Progenitorzellen notwendig sind (Andrews et al., J. Exp. Med. 172:
355, 1990; Gordon et al., Br. J. Haematol. 60: 129, 1985). Die Einflüsse der Mikroumgebung
und die Regulierung der Hämatopoese
in diesem Kultursystem sind jedoch aufgrund der Heterogenität der Zelltypen,
die das Knochenmarksstroma bilden, schwer zu analysieren. Diese
Komplexität
der Mikroumgebung verhindert auch großenteils Versuche, Elemente
zu definieren, die für
spezifische Stadien der hämatopoetischer
Zellentwicklung verantwortlich sind.
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Trotz der Fähigkeit der LTBMCS, über einen
längeren
Zeitraum einen länger
anhaltenden Ausstoß von Zellen
zu generieren (was den Erhalt eines Pools pluripotenter Stammzellen
anzeigt), sind diese Systeme zur Zeit schwer für therapeutische Zwecke einsetzbar.
Erstens gibt es die obengenannte Komplexität der heterogenen zellulären Mikroumgebung,
die eine sorgfältige
Analyse der ablaufenden biologischen Mechanismen unmöglich macht
und eine deutliche Verbesserung des Kultursystems verhindert. Zweitens
erfordern LTBMCS vor dem Ansäen
hämatopoetischer
Zellen in der Kultur die Etablierung eines Layers von Knochenmarksstroma.
Etablierung des Stromalayers dauert häufig Wochen, eine signifikante Verzögerung.
Dies verhindert auch LTBMCS im Großmaßstab, die für eine therapeutische
Anwendung erforderlich sind. Schließlich gibt es keinen raschen
und signifikanten Ausstoß von
hämatopoetischen
Zellen aus diesen Kultursystemen, was ihren Nutzen für therapeutische
Zwecke wiederum limitiert.
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In einem Versuch, die Komplexität und die
Limitierungen der Dexter-LTBMCS zu vermeiden, wurden Perfusionsbioreaktorsysteme
entwickelt, in denen hämatopoetische
Zellen kultiviert werden konnten. Perfusionsbioreaktoren helfen,
eine definierte Kulturumgebung zu erhalten und physikalische Störungen zu
reduzieren. Siehe beispielsweise Schwartz et al. (PNAS USA 88: 6760,
1991), Roller et al. (Bio/Technology 11: 358, 1993), Koller et al.
(Blood 82: 378, 1993) und Palsson et al. (Bio/Technology 11: 368,
1993). Die meisten dieser Perfusionsbioreaktorsysteme sind jedoch
modifizierte Flüssigkultursysteme
und leiden in ihrer Unfähigkeit, den
pluripotenten hämatopoetischen
Stammzellpool, Zellen, die zum langzeitigen/permanenten Engraftment und
zur Rekonstitution des hämatopoetischen
Systems wesentlich sind, zu expandieren, an vielen der gleichen
Mängel.
Dies schränkt
den Nutzen dieser Kultursysteme für Knochenmarkstransplantation
und Gentherapie von hämatopoetischen
Stammzellen ein.
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Daher besteht weiterhin Bedarf an
in vitro-Kultursystemen, die zur klinisch brauchbaren Amplifikation von
humanen hämatopoetischen
CD34+-Stammzellen sowie von anderen hämatopoetischen
Elementen in der Lage sind. Es wird ein System benötigt, das
zur Produktion großer
Mengen bestimmter Knochenmarkselemente in der Lage ist, um für ausreichende
Mengen dieser Elemente bei der Humantherapie zu sorgen, beispielsweise
für Knochenmarkstransplantationen,
transfundierbare Blutkomponenten oder zur Gentherapie.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Dementsprechend besteht eine Aufgabe
der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur in vitro-Amplifikation
von humanen hämatopoetischen
Knochenmarksstammzellen bereitzustellen, das ausreichende Mengen
von Stammzellen zur humantherapeutischen Verwendung liefert. Dieses
einzigartige Kultursystem gibt dem Fachmann die Möglichkeit,
die Vorgänge,
die die Stammzellproliferation, die Selbsterneuerung und die Determinierung
steuern, in einer Umgebung zu untersuchen, die die in vivo-Situation
nachbildet. Diese Technologie zur Expansion hämatopoetischer Stammzellen
kann dazu verwendet werden, rasch eine genügende Anzahl von Progenitor-
und Postprogenitorzellen zur klinischen Applikation bei Knochenmarkstransplantationen
und für
die Gentherapie zu erzeugen. Ferner kann die Beeinflussung bestimmter
Elemente der Kulturbedingungen (z. B. der eingesetzten Zytokine
usw.) zur Determinierung der Linien der Stammzellennachkommen führen, so
daß sie
zu spezifischen Knochenmarkselementen differenzieren. Die Möglichkeit, Knochenmarksprogenitorzellen
zu reifen funktionellen Blutzellen wie Granulozyten oder Thrombozyten
zu entwickeln, böte
eine leistungsfähige
therapeutische Anwendung. Ferner sorgt die Fähigkeit dieses Systems, primitive
hämatopoetische
Stammzellen rasch und signifikant zu expandieren, für ein attraktives
System zur Transduktion/ Transfektion primitiver pluripotenter hämatopoetischer
Stammzellen für
die Gentherapie.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, um
die optimalen Kulturbedingungen, Wachstumsfaktorkombinationen, Fütterungsschemata
und Bioreaktorkonfigurationen für
eine maximale Proliferation nichtadhärenter Zellen, CD34+-Stammzellenexpansion und Aktivität multipotenter
Kolonie-bildender Zellen (Colony Forming Cells) (z. B. LT-IC, CFU-BLAST,
CFU-MIX und CFU-GM) unter Verwendung von ungetrennten mononukleären Zellen,
Lin–-Zellen
und gereinigten CD34+-Zellen aus kranken
und normalen Knochenmarksaspiraten, peripherem Blut und Nabelschnurblut
zu bestimmen.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht ferner darin, ein Kultursystem bereitzustellen, um primitive hämatopoetische
Stammzellen selektiv zu expandieren und das Kurzzeit- und Langzeitpotential
dieser mit verschiedenen Stammzellexpansions- und -transfusionsmethoden
erzeugten Zellen zur hämatopoetischen
Rekonstitution in hämatopoetischen
Tiermodellen (Nager und Primaten), die eine strahlungsinduzierte oder
chemisch induzierte Myelosuppression nachbilden, zu testen. Insbesondere
kann man die Restitutionskinetik von Progenitorzellen des peripheren
Bluts, von Knochenmarksvorläuferzellen
und von ihren reifen Zellnachkommen testen. Ferner kann das langzeitige
in vivo-Repopulationspotential
gebildeter Zellen (LT-IC) in Mäusen
mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) und auch durch chirurgische
in utero-Implantation dieser Zellen in fetale Schafe getestet werden,
wobei der hämatopoetische
Besiedelungsgrad in verschiedenen zeitlichen Intervallen der Gestation
festgestellt wird.
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Eine Aufgabe der Erfindung besteht
ferner darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, um normale hämatopoetische
Stammzellen, die von den leukämischen
Zellen von Leukämiepatienten
vor Chemotherapie und autologer Knochenmarkstransplantation abgetrennt
wurden, selektiv zu expandieren.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das
die Proliferation und Expansion hämatopoetischer Stammzellen
erlaubt und ihre Transduktion oder Transfektion mit Genkonstrukten
bei der Gentherapie und verwandten Methoden zuläßt.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Bioreaktor-Zellkultursystem im Großmaßstab für klinische
Versuche der Phase I bereitzustellen (Stammzellexpansion und autologe
BMT nach Knochenmarksablation). Diese Methode für den Großmaßstab kann durchgeführt werden,
um die Morbidität, die
Mortalität,
die Kosten, den Krankenhausaufenthalt und das mit der Standardtherapie
verbundene Patientenmanagement zu reduzieren, aber auch um aggressivere
Therapieprotokolle und komprimierte Therapieschemata zu untersuchen,
so daß ein
größerer Teil
der Patienten den Krebs überlebt.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das
eine bessere Charakterisierung der molekularen Mechanismen und zellulären Wechselwirkungen
erlaubt, die bei der Regulierung der Selbsterneuerung hämatopoetischer
Stammzellen und bei der Determinierung der Differenzierung der davon
abstammenden Populationen eine Rolle spielen.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Kultursystem bereitzustellen, das eine
bessere Evaluation der Rolle des direkten Kontakts mit Stromazellen
oder mit akzessorischen Zellen und/oder davon abstammenden Faktoren
bei der Modulation der Proliferation und Differenzierung verschiedener
Untergruppen hämatopoetischer
Vorläuferzellen
erlaubt.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht ferner darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das
eine Amplifikation und Isolierung von spezifischen, in ihrer Entwicklung
definierten Untergruppen hämatopoetischer
Zellen ermöglicht,
um eine Analyse und Manipulation genetischer oder anderer molekularer
Elemente, die an der Selbsterneuerung und Differenzierung hämatopoetischer
Stammzellen beteiligt sind, zu erleichtern.
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Weitere Aufgaben und Vorteile der
Erfindung werden teils in der nachfolgenden Beschreibung erläutert und
teils sind sie aus der Beschreibung offensichtlich oder ergeben
sich bei der Durchführung
der Erfindung. Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung lassen sich
mittels der in den anhängenden
Ansprüchen
besonders hervorgehobenen Elemente und Kombinationen erkennen und
erreichen.
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Zur Lösung der Aufgaben und gemäß dem Zweck
der Erfindung, wie sie hier verkörpert
und ausführlich
beschrieben wird, umfaßt
die Erfindung in einer Ausführungsform
ein Verfahren zur in vitro-Amplifikation humaner Knochenmarksstammzellen.
Das Verfahren umfaßt
die Isolierung von Stammzellen aus humanem Knochenmark; das In-Kontakt-Bringen
der isolierten Stammzellen mit Endothelzellen; und das Kultivieren
der in Kontakt gebrachten Stamm- und Endothelzellen in Gegenwart
wenigstens eines Zytokins in einer Menge, die ausreicht, um die
Expansion der Stammzellen zu unterstützen.
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In einer weiteren Ausführungsform
umfaßt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ansiedeln von Stammzellen
in einem Patienten. Bei diesem Verfahren werden zuerst Stammzellen
aus humanem Knochenmark isoliert. Dann werden die Stammzellen mit
Endothelzellen in Kontakt gebracht und die Kombination wird in Gegenwart
von wenigstens einem Zytokin in einer Menge, die ausreicht, um die
Expansion der Stammzellen zu unterstützen, kultiviert. Nach Amplifikation
werden die Stammzellen aus der Kultur isoliert und in den Patienten
infundiert.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
umfaßt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ansiedeln höher differenzierter
hämatopoetischer
Zellen in einem Patienten, um die schnelle, kurzfristige Rekonstitution
reifer Blutzellen im Blutkreislauf zu ermöglichen. Bei diesem Verfahren
werden zuerst CD34+-Stammzellen aus humanem Knochenmark
isoliert. Dann werden die CD34+-Zellen mit
Endothelzellen in Kontakt gebracht und die Kombination wird in Gegenwart
von wenigstens einem Zytokin in einer Menge, die ausreicht, um die
Expansion und Differenzierung der CD34+-Zellen
zu unterstützen,
kultiviert. Nach der Expansion wird die gesamte Population der CD34+-Stammzellen
sowie der höher
differenzierten Zellen in den Patienten infundiert.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Ein vollständigeres Verständnis der
Erfindung läßt sich
ohne weiteres durch die nachfolgende Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
und die begleitenden Zeichnungen erreichen, wobei gleiche Bezugszeichen
in den verschiedenen Figuren gleiche Strukturen oder Elemente bedeuten.
Die Darstellungen in jeder der Figuren sind schematisch, ohne den
Versuch zu unternehmen, einen tatsächlichen Maßstab oder genaue Verhältnisse
anzugeben. Proportionalitätsbeziehungen
sind als Näherungen
angegeben.
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1 zeigt
die Effekte optimaler Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem
Faktor (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF)
+ Stammzellfaktor (SCF), Interleukin-3 (IL-3) + SCF + Interleukin-6
(IL-6) und GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 auf die Produktion nichtadhärenter Zellen
in Flüssigsuspensionskulturen
(n = 6), Nonkontaktkulturen von porcinen mikrovaskulären Hirnendothelzellen
(PMVEC) (n = 6) und PMVEC-Kontaktkulturen (n = 12). Jede Säule stellt
die durchschnittliche Anzahl der gesamten vitalen nichtadhärenten Zellen ±1 SD dar,
die nach 7 Tagen Kultur pro 1 × 105 humanen CD34+-Knochenmarkszellen,
die anfänglich
kultiviert wurden, geerntet wurden. Es sind die Ergebnisse von fünf verschiedenen
Versuchen dargestellt.
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2 zeigt
die Expansion von humanen CD34+-Zellen nach
7 Tagen Kultur in PMVEC, die mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelt
worden waren.
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3 zeigt
die Expansion von CD34+-Knochenmarkszellen
auf Zytokin-behandelten PMVEC-Monolayern. PMVEC-Monolayer wurden
mit 5 × 105
gereinigten humanen CD34+-Knochenmarkszellen
initiiert und 7 Tage in Gegenwart von GM-CSF (2 ng/ml) + IL-3 (100
ng/ml) + IL-6 (10 ng/ml) kultiviert. Nach 7 Tagen Kultur wurden
nichtadhärente
hämatopoetische
Zellen aus den PMVEC-Monolayern
geerntet und mit monoklonalen APC-konjugierten anti-CD34- und FITC-konjugierten
anti-CD38-Antikörpern
gefärbt.
(3A) Isotypenkontrolle
von Zellen geernteter nichtadhärenter
Zellen, die unspezifische FITC- (x-Achse) und APC-Fluoreszenz (y-Achse)
zeigen. (3B) Log Fluoreszenzverteilung
von CD34+-Zellen entlang der y-Achse und von CD38+-Zellen entlang der x-Achse von kultivierten
nichtadhärenten
hämatopoetischen
Knochenmarkszellen an Tag 7.
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4 zeigt
die Anzahl von humanen nichtadhärenten
Zellen und von CD34+-Zellen im PMVEC-Kultursystem
in verschiedenen. Stadien der Kultur.
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5 zeigt
die Anzahl von humanen Colony Forming Cells (CFC) in den PMVEC-Kulturen
in verschiedenen Stadien der Kultur.
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6 zeigt
die Anzahl von humanen Colony Forming Cells (CFC) in den PMVEC-Kulturen
in verschiedenen Stadien der Kultur.
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7 zeigt Änderungen
in der Anzahl muriner CFU-GM pro Mausfemur. Mäuse wurden einer Bestrahlung
von 10,0 Gy ausgesetzt und es wurden ihnen entweder 5 × 104 MNC-Knochenmarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen
an Tag 7, die mit GM-CSF + IL-3 (∎)
behandelt worden waren, verabreicht oder 5 × 104 gepoolte
Blastzellen von Blastzellkolonien von Tag 7, die auf PMVEC-Monolayern
in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 (•)
gezüchtet
worden waren. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE von 8 Mäusen aus
zwei getrennten Versuchen dar.
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8 zeigt Änderungen
in der Anzahl muriner CFU-GM pro Mäusemilz. Mäuse wurden einer Bestrahlung
von 10,0 Gy ausgesetzt und es wurden ihnen
entweder 5 × 104 MNC-Knochenmarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen
von Tag 7, die mit GM-CSF + IL-3 (∎) behandelt worden waren,
verabreicht oder 5 × 104 gepoolte Blastzellkolonien, die in Gegenwart
von GM-CSF + IL-3 auf PMVEC-Monolayern gezüchtet worden waren (•). Jeder
Punkt stellt den Mittelwert ± SE
von 8 Mäusen
aus zwei getrennten Versuchen dar.
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9 zeigt
die Restitution von weißen
Blutzellen, roten Blutzellen und der Thrombozytenzahlen aus murinem
peripherem Blut. Mäuse
wurden einer Bestrahlung von 10,0 Gy ausgesetzt und es wurden ihnen
entweder 5 × 104 MNC-Knochenniarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen,
die mit GM-CSF + IL-3 behandelt worden waren (∎), verabreicht
oder 5 × 104 gepoolte Blastzellen von Blastzellkolonien
von Tag 7, die in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 auf PMVEC-Monolayern
gezüchtet
worden waren (•).
Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE von 8 Mäusen aus
zwei getrennten Versuchen dar.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein in. vitro-Kultursystem,
das die Proliferation und Expansion sowohl von primitiven hämatopoetischen
Knochenmarkszellen als auch von Blutstammzellen (CD34+ CD38–)
und von Vorläuferzellen
für alle
hämatopoetischen
Zellinien unterstützt.
Unter Verwendung von Zytokin-behandelten Endothelzellen wurde ein
Kultursystem entwickelt, das die Expansion von primitiven hämatopoetischen Stammzellen
unterstützt.
In diesem Kultursystem werden isolierte Stammzellen in Kontakt mit
Endothelzellen in Gegenwart von Zytokin(en) kultiviert, um die Expansion
und Amplifikation der Stammzellen zu fördern.
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Die pluripotente hämatopoetischen
Stammzelle kann sowohl funktionell als auch phänotypisch definiert werden.
Funktionell sind Stammzellen solche hämatopoetischen Zellen, die
die Fähigkeit
zu längerer Selbsterneuerung
sowie die Fähigkeit
zur Differenzierung zu allen lymphohämatopoetischen Zellinien besitzen.
Pluripotente hämatopoetische
Stammzellen, wenn sie sich in der geeigneten Mikroumgebung befinden, können daher
die hämatopoetischen
und lymphoiden Kompartimente vollständig und dauerhaft rekonstituieren.
Stammzellen können
auch phänotypisch
durch Zelloberflächenmarker
identifiziert werden. Es wurden eine Reihe phänotypischer Marker allein und
in Kombination beschrieben, um die pluripotente hämatopoetische
Stammzelle zu identifizieren. Humane Stammzellen wurden als kleine
Zellen charakterisiert, die CD34+, CD38–,
HLA-DR–,
Thy1+/–,
CD15–,
Lin–,
c-Kit+, 4-Hydroperoxycyclophosphamid-resistent
und Rhodamin 123-schwach sind. Äquivalente
murine Stammzellen wurden als Lin–,
Sca+ und Thy1.1+ charakterisiert.
Vorzugsweise sind die humanen Stammzellen, die für das vorliegende Kultursystem
verwendet werden, CD34+ CD38–.
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Die Stammzellen, die bei dem vorliegenden
Kulturverfahren verwendet werden, können mit allgemein bekannten
Methoden aus Knochenmark, peripherem Blut oder Nabelschnurblut isoliert
werden. Da sich das vorliegende Kulturverfahren zur Amplifikation
von Stammzellen aus verschiedenen Spezien eignet, können die Stammzellen
beispielsweise aus Menschen, nichthumanen Primaten oder Mäusen isoliert
sin. Die Stammzellen, die für
das vorliegende Verfahren verwendet werden, sind vorzugsweise stark
angereichert, d. h. arm an reifen lymphoiden und myeloiden Zellen.
Vorzugsweise sind die Stammzellen zu wenigstens 85%, besonders bevorzugt
zu wenigstens 95% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 99%
angereichert. Verschiedene Methoden, mit denen Stammzellen isoliert
und mittels positiver Immunselektion bis auf einen hohen Reinheitsgrad
angereichert werden können,
wurden von Berenson et al. (Journal of Immunoloaical Methods, 91:
11–19, 1986),
Thomas et al. (Prog. Clin. Biol. Res. 377: 537–44, 1992), Okarma et al. (Prog.
Clin. Biol. Res. 377: 487–502,
1992) und Kessler (US-Patentanmeldung Seriennr._, eingereicht am_)
beschrieben.
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In dem vorliegenden Kultursystem
werden die angereicherten Stammzellen in direkten Kontakt mit Endothelzellen
gebracht. Bevorzugte Endothelzellen sind mikrovaskuläre Hirnendothelzellen,
insbesondere porcine mikrovaskuläre
Hirnendothelzellen (PMVEC). Beispiele für andere Endothelzellen, die
sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, humane Endothelzellen, mikrovaskuläre Endothelzellen, Hirnendothelzellen,
porcine Endothelzellen und verschiedene Typen immortalisierter Endothelzellen.
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Um die Expansion zu maximieren ist
es wichtig, daß die
Stammzellen in Kontakt mit den Endothelzellen stehen. Beispielsweise
können
die Stammzellen auf einem 70–100%igen semikonfluenten
Monolayer aus PMVECs angesät
werden. Die in vitro-Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen
nimmt innerhalb von 7 Tagen signifikant zu, wenn die Stammzellen
direkt auf Endothelzellen kultiviert werden. Dies steht im Gegensatz
zu den Ergebnissen, die man erhält,
wenn Stammzellen mit Endothelzellen in Diffusionskammern kultiviert
werden, die Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Endothelzellen
verhindern.
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Die Verwendung von PMVECs besitzt
mehrere Vorteile gegenüber
anderen hämatopoetischen
Kultursystemen. Beispielsweise sind PMVECs im Vergleich mit Monolayern
aus Knochenmarksstromazellen, einer heterogenen Zellpopulation,
die Endothelzellen, Fibroblasten, Adipozyten, Makrophagen und Osteoklasten enthält, eine
homogene Zellinie. Diese heterogenen primären Monolayer aus Knochenmarksstromazellen
wurden üblicherweise
bei früheren
hämatopoetischen
Kultursystemen eingesetzt. Die Analyse der an der Hämatopoese
beteiligten Mechanismen ist daher bei dem homogenen PMVEC-Kultursystem
sehr viel leichter als bei dem heterogenen Kultursystem mit Knochenmarksstroma.
Ferner wächst
die PMVEC-Zellinie mit einer Verdoppelungsrate von 48 Stunden rasch,
kann bis zu 6 Monate (oder 54 Passagierungen) passagiert werden, besitzt
minimale Wachstumsanforderungen und kann leicht unter Kulturbedingungen
mit niedrigem Serumgehalt (1% FCS) gehalten werden. Im Gegensatz
dazu haben Stromazellen eine limitierte Passagierfähigkeit.
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Ferner ist das PMVEC-Zellkultursystem
in der Lage, eine signifikante Stammzellexpansion zu unterstützen. Beispielsweise
zeigt dieses Kultursystem zwischen den Tagen 7 und 14 einer Kultur
eine signifikante Stammzellenexpansion. An Tag 7 wurde eine etwa
10fache Expansion von CD34+-Zellen gemessen
und eine mehr als 95fache Expansion von CD34+-Zellen
wurde an Tag 14 der Kultur gemessen. Im Vergleich dazu liefern Flüssigkultur-
und Stromazellen-Cokultur-Systeme üblicherweise eine ≤ 3fache Expansion
an Tag 7 und der Prozentsatz an CD34+-Zellen
nimmt bis zu Tag 14 der Kultur rasch ab. Die Fähigkeit des vorliegenden Verfahrens,
die Zahl von CD34+ CD38–-Stammzellen,
von CFU-GM und von nichtadhärenten
Zellen nach 7 Tagen Kultur signifikant zu expandieren, macht das
Kultursystem zu einer attraktiven Alternative zu anderen Kurzzeit- und
Langzeit-Kultursystemen.
Das PMVEC-Zellkultursystem hat ferner den Vorteil, daß es die
Proliferation hämatopoetischer
Progenitorzellen von Menschen, nicht-humanen Primaten und Mäusen unterstützt. Dies
macht es möglich,
Hämatopoese
sowohl bei Menschen als auch in Tiermodellen zu untersuchen. Ferner
können
sowohl bestrahlte als auch Formalin-fixierte PMVEC-Monolayer die Expansion
hämatopoetischer
Progenitorzellen unterstützen.
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Die Stammzellen werden in dem vorliegenden
Verfahren mit Endothelzellen cokultiviert und mit Zytokinen behandelt.
Um die Expansion der Stammzellen zu fördern, werden der Kultur aus
CD34+-Zellen und Endothelzellen Zytokine
zugegeben, die zu den eingesetzten Stammzellenspezien passen. Obwohl
die Verwendung wenigstens eines Zytokins für die Expansion von CD34+-Zellen erforderlich ist, können auch
Kombinationen von Zytokinen eingesetzt werden und sind sogar bevorzugt.
Beispiele für
geeignete Zytokinkombinationen zur Verwendung bei der Expansion
von humanen CD34+-Zellen umfassen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, GM-CSF allein; GM-CSF + SCF; IL-3 + SCF + IL-6 und GM-CSF
+ IL-3 + SCF + IL-6. Vorzugsweise wird die Kultur aus Stammzellen
und Endothelzellen mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelt. Die
Menge von jedem eingesetzten Zytokin und der Kombination ausgewählter Zytokine
schwankt abhängig
von verschiedenen Variablen, läßt sich
aber leicht vom Fachmann feststellen. Beispielsweise können Stammzellen-Endothelzellen
mit 0,1–20,0
ng/ml GM-CSF, 1,0–200,0
ng/ml IL-3, 5,0–500,0
ng/ml SCF und/oder 10–100,0
ng/ml IL-6 kultiviert werden. Vorzugsweise werden 2 ng/ml GM-SCF
+ 10 ng/ml IL-3 + 100 ng/ml SCF + 10 ng/ml IL-6 eingesetzt.
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Wenn hochgereinigte Stammzellen kurzzeitig
(7 Tage) mit Kombinationen aus entweder GM-CSF + SCF, Il-3 + SCF
+ IL-6 oder GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 in Flüssigsuspension kultiviert wurden,
wurde keine Expansion oder keine Erhaltung der Zahl primitiver Stammzellen
beobachtet, obwohl die Gesamtzahl an nichtadhärenten Zellen und von CFC in
mit GM-CSF + IL3 + SCF + IL-6 behandelten Kulturen 10,2- bzw. 2,9fach zunahm.
Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß Zytokine allein für die in
vitro-Expansion von Stammzellen auf endothelialen Monolayern nicht
ausreichen und daß Wechselwirkungen
zwischen Stammzellen und PMVECs, andere lösliche Wachstumsfaktoren, membrangebundene
Wachstumsfaktoren, Zelladhäsionsmoleküle oder
extrazelluläre
Matrixproteine, die von Zytokin-aktivierten Endothelzellen produziert
werden, eine Rolle spielen können.
Ferner kann die von Endothelzellen stammende extrazelluläre Matrix
diese Wachstumsfaktoren binden und der Stammzelle diese Moleküle in aktiver
Form präsentieren.
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Der Mechanismus, über den das vorliegende Kultursystem
die Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen
unterstützt,
ist nicht klar. Es ist jedoch möglich,
daß die
mit Zytokin behandelten PMVEC ein oder mehr potentielle neue hämatopoetische
Wachstumsfaktoren produzieren, die die Expansion primitiver Stammzellen
unterstützen.
Der Mechanismus, über
den die PMVEC-Monolayer die Expansion primitiver hämatopoetischer
Stammzellen in Reaktion auf eine Kombination exogener Wachstumsfaktoren
unterstützen,
wird zur Zeit untersucht.
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Es wurde gezeigt, daß gereinigte
Stammzellen aus humanem Knochenmark zur langzeitigen hämatopoetischen
Rekonstitution und zur hämatopoetischen
Rekonstitution aller Linien in der Lage sind. Bei Knochenmarkstransplantationen
sind determinierte Progenitorzellen, beispielsweise die CFU-GM,
zusammen mit pluripotenten Stammzellen erforderlich, damit der Empfänger eine
frühe Aplasie übersteht
und zur vollständigen
hämatopoetischen
Rekonstitution gelangt. Ein wichtiger Durchbruch bei der klinischen
Knochenmarkstransplantation ist die Anwendbarkeit des vorliegenden
Kultursystems auf einen Großbioreaktor
unter Verwendung dieses Kultursystems, das die Expansion primitiver
hämatopoetischer
Stammzellen unterstützt, die
Progenitorzellen enthalten, die zur Selbsterneuerung, Differenzierung
zu allen Linien und zur langfristigen Hämatopoese in der Lage sind.
Insbesondere können
innerhalb von 14 Tagen Kultur 1,5 × 107 CFU-GM-Progenitorzellen
aus nur 1–2 × 106 CD34+-Stammzellen gebildet werden. Dies ist die
Zahl der CFU-GM, die für
ein Engraftment beim Menschen nach autologer Knochenmarkstransplantation
erforderlich ist. Diese Menge von Stammzellen kann in einer Arztpraxis
routinemäßig aus
einem 15 ml-Knochenmarksaspirat erhalten werden. Die Expansion von
Stammzellen in dem vorliegenden Kultursystem reduziert ferner das
Volumen des zu erntenden Knochenmarks, senkt die Wahrscheinlichkeit
für eine
generelle Anästhesie,
fördert
eine frühe
Hämatopoeserestitution,
verbessert schwere Zytopenie und begünstigt kürzere Krankenhausaufenthalte
und eine höhere Überlebensdauer
bei Personal, das myelotoxischen Agenzien und/oder Strahlung ausgesetzt
ist. Das vorliegende Kulturverfahren beeinflußt daher nicht nur deutlich
und bedeutsam die Therapie von onkologischen Erkrankungen durch
Knochenmarkstransplantationen, sondern auch die Behandlung von Syndromen des
Knochenmarksversagens und, potentiell, den Einsatz von Gentransfermethoden
bei der somatischen Gentherapie.
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Dementsprechend betrifft die vorliegende
Erfindung auch ein Verfahren zum Ansiedeln von Stammzellen in einem
Patienten. Dieses Verfahren beinhaltet die Isolierung von Stammzellen
und die Cokultivierung der isolierten Stammzellen mit Endothelzellen
in Gegenwart von Zytokinen wie oben ausgeführt. Das Verfahren erfordert
ferner die Isolierung der amplifizierten Stammzellen aus der Kultur.
(Das vorliegende Verfahren kann auch mit ungetrenntem Knochenmark
anstelle von gereinigten CD34+-Zellen angewandt
werden.)
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner ein Verfahren zum Ansiedeln reiferer hämatopoetischer Zellen in einem
Patienten zur kurzfristigen hämatopoetischen
Unterstützung.
Dieses Verfahren beinhaltet die im vorhergehenden Absatz dargelegte
Isolierung und Expansion von CD34+-Zellen.
Dieses Verfahren erfordert keine weitere Isolierung von CD34+-Zellen, da die gesamte expandierte Population
von CD34+-Zellen und von höher differenzierten
hämatopoetischen
Zellen wie oben ausgeführt
in den Patienten infundiert wird. Dies kann mit allgemein bekannten
Methoden erfolgen. Schließlich
werden die isolierten amplifizierten Zellen mit allgemein bekannten
Methoden in den Patienten infundiert.
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In dieser Kultur proliferierende
CD34+-Stammzellen (sowie reifere Elemente)
können
auch mit Methoden der Geninsertion/Gentherapie manipuliert werden,
bevor sie wieder im Patienten angesiedelt werden. Das vorliegende
Kultursystem könnte
daher die Gentherapie von Stammzellen revolutionieren und eine Heilungsmöglichkeit
für beispielsweise
Sichelzellanämie
bieten.
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Die vorliegende Methode kann auch
zusammen mit Methoden zur "Knochenmarksreinigung" verwendet werden,
um unerwünschte
Zellen (z. B. Tumorzellen, T-Lymphozyten) vor Reinfusion in den
Patienten zu entfernen. Die Kulturbedingungen können auch so manipuliert werden,
daß ein
spezifischer Blutzellentyp (wie Thrombozyten oder rote Blutzellen)
produziert wird, der in die Patienten reinfundiert/rücktransfundiert
werden kann. Beispielsweise ist eine autologe Transfusion sehr nützlich bei
Krebspatienten oder in Situationen, wo der Donorpool durch ein infektiöses Agens
kontaminiert sein kann.
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Die Verwendung dieses Kultursystems
im Großmaßstab könnte bei
der in vitro-Amplifikation primitiver hämatopoetischer Stammzellen
und determinierter Progenitorzellen von Nutzen sein, indem es die
Infusion autologer Zellen oder allogener Zellen in Menschen erlaubt,
beispielsweise bei medikamenteninduzierter Neutropenie oder nach
Knochenmarktransplantationen, sowie bei der Gentherapie hämatopoetischer
Stammzellen. Es könnte
möglich
sein, das vorliegende Kultursystem in bekannten Bioreaktoren einzusetzen,
um große Mengen
Stammzellen zu erzeugen.
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Nachdem die Erfindung beschrieben
wurde, sollen die folgenden Beispiele spezielle Anwendungsmöglichkeiten
der Erfindung veranschaulichen, einschließlich der augenblicklich besten
bekannten Ausführungsform
der Erfindung. Diese speziellen Beispiele sollen den Umfang der
in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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CD34+-KNOCHENMARKSZELLEN
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Humanes Knochenmark aus Wirbelkörpern wurde
aus Leichengewonnen. Das zur Gewinnung des Knochenmarks eingesetzte
Verfahren wird in der Veröffentlichung
No. 90–62
des Naval Medical Research Institute beschrieben (("The Procuring and
Processing of Human Cadaveric Bone Marrow", T. R. Faloon), erhältlich vom Defense Technical
Information Center, AD# A226 538). Kurz gesagt wurde Mark mittels
Sterilverfahren aus der Knochenmatrix erhalten und in sterile Erhaltungsnährmedien
gegeben. Mononukleäre
Zellen mit niedriger Dichte wurden bei 22°C 30 min bei 400 g über Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten
(relative Dichte 1,077 g/ml; Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway,
NJ) abgetrennt. Zellen niedriger Dichte an den Grenzflächen wurden
geerntet, zweimal durch Zentrifugation gewaschen (10 min bei 400
g) und in Iscove's
Modified Dulbecco's
Medium (IMDM, MA Bioproducts, Walkersville, MD), das mit 10% hitzeinaktiviertem
FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 mg/ml L-Glutamin (Gibco, Grand Island,
NY) und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY)
supplementiert war, resuspendiert. Falls nicht anders angegeben,
wird dieses Kulturmedium als komplettes Kulturmedium bezeichnet.
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CD34+-Knochenmarksprogenitorzellen
wurden durch positive immunmagnetische Selektion mit einem für das CD34-Antigen spezifischen
monoklonalen Antikörper
(K6.1) wie in der oben diskutierten Patentanmeldung von Kessler
beschrieben weiter gereinigt. Der monoklonale Antikörper K6.1
wurde durch Fusion von SP-2/0-AG14-Plasmazytomazellen (American
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) mit Splenozyten aus
einer BALB/cByJ-Maus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), die mit
vitalen KG-1a-Zellen (ATCC, Rockville, MD) hyperimmunisiert worden
war, hergestellt. Injektionen mit 10 bis 20 Millionen mit Kochsalzlösung gewaschenen
KG-1a-Zellen erfolgten etwa monatlich über eine Dauer von 6 Monaten;
die erste und letzte Immunisierung waren intravenös und die
anderen Immunisierungen waren intraperitoneal. Die letzte Injektion
erfolgte 3 Tage vor der Fusion. Zellhybridisierung und Selektion
in HAT-Medium wurden entsprechend den Methoden von Köhler und
Milstein (Nature 256: 495, 1975) mit den Modifikationen von Fazekas
de St. Groth und Scheldegger (J. Immunol. Methods 35: 1, 1980) und
Lane et al. (J. Immunol. Methods 72: 71, 1984) durchgeführt.
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Die etwa 2 Wochen nach der Fusion
gesammelten Kulturüberstände wurden
durch Immunoblotanalyse ("Western
blot") in KG-1a-Zellysaten
auf Antikörperaktivität gegen
MY-10/CD34-Antigen
gescreent. Anfänglich
wurden Pools von etwa 10 wachstumspositiven Hybridoma-Vertiefungen
gescreent und dann wurden einzelne Vertiefungen antikörperpositiver
Pools gescreent. Antikörperpositive
Vertiefungen wurden durch limitierende Verdünnung subkloniert (Oi und Herzenberg,
in Selected Methods in Cellular Immunology, (1980) Mishell und Shigii,
Hrsg., S. 351–72),
und Klone wurden in gleicher Weise gescreent.
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KG-1a-Zellen wurden mit 1 × 108 Zellen/ml in Laemmli-Probenpuffer (0,0625 M Tris-HCl, pH
6,8; Nature 227: 680, 1970), der 0,5% Triton X-100 und 2 mM PMSF
enthielt, solubilisiert und abzentrifugiert (30.000 × g, 30
min), und die Überstände wurden
in Gegenwart von 50 mM DTT, 4% SDS und 10% Glycerin reduziert (60
min, 37°C).
Die Elektrophorese erfolgte gemäß der Laemmli-Methode (Nature 227:
680, 1970) mit den Modifikationen von Jones (in Selected Methods
in Cellular Immunology, (1980) Mishell und Shigii, Hrsg., S. 398–440) auf
8–16%igen
SDS-Polyacrylamid-Porengradientengelen.
Die Proteine wurden dann zur Immunoblotanalyse auf Nitrocellulosemembranen überführt (Towbin
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979, und Burnette,
Anal. Biochem. 112: 195, 1981), wobei ein mit alkalischer Phosphatase
konjugierter Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (BioRad Labs, Richmond,
CA) mit BCIP/NBT als Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg,
MD) zum Nachweis verwendet wurde.
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Der Hybridoma-Klon K6.1 wurde als
Produzent eines monoklonalen Antikörpers des IgG2a-Isotyps identifiziert,
bestimmt mit einem ELISA-Kit zum Isotypen-Screening (Zymed Laboratories,
5. San Francisco, CA) an immobilisierten KG-1a-Zellen (Cobbold und waldmann, J. Immunol.
Methods 44: 125, 1981). Die Hybridome wurden in Rollerflaschen in
IMDM mit fetalem Kälberserum
(Hyclone) expandiert. Nach Ernten des Überstands wurde der K6.1-Antikörper durch
Hydroxylapatit-Chromatographie
(Stanker et al., J. Immunol. Methods 76: 157, 1985) und anschließende pH-Gradientenelution
aus Protein A-Sepharose
(Ey et al., Immunochemistry 15: 429, 1978) gereinigt. Die Antikörperausbeute
betrug 40–45 μg/l Überstand.
Dieser wurde auf Ultrafiltrationsmembranen (Amicon YM-10, Danvers,
MA) konzentriert und gegen übliche
Kochsalzlösung
dialysiert. Die Analyse der Antikörperreinheit erfolgte an 30–40 μg reduzierten
und nicht-reduzierten Proben durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter
Laemmli-Bedingungen mit anschließender Färbung mit Coomassie-Blau.
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Zur positiven Immunselektion von
CD34+-Zellen wurden alle Wasch-, Inkubations-
und Selektionsschritte für
die Zellen bei 4°C
(falls nicht anders angegeben) in 0,2 μm-sterilfiltriertem "Immunselektions-Waschpuffer" durchgeführt. Der
Immunselektions-Waschpuffer bestand aus Hanks' physiologischer Salzlösung (Hanks' balanced salt solution)
mit 12,5 mM HEPES-Puffer,
1000 Einheiten/ml DNAse I (Calbiochem) und 5% hitzeinaktiviertem
gepooltem humanem AS-Serum (#34004-1, Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer,
WI). Das Humanserum wurde zuvor ausgiebig (40 Volumenteile × 5 Austausche)
gegen PBS dialysiert, um Spuren von Biotin zu entfernen. Dies war
als eine Quelle für
Human-IgG enthalten, um Fc-Rezeptoren abzusättigen und die zytophile Bindung
des zellspezifischen Antikörpers
(d. h. K6.1) zu minimieren; für
die Zwecke der therapeutischen Immunselektion wurde angenommen,
daß Substitute
wie dialysiertes Serum des Markspenders oder pharmazeutisch zugelassene
Gammaglobuline zur Injektion verwendet würden.
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Mononukleäre Knochenmarkszellen wurden
gewaschen und auf eine Konzentration von 50 × 106/ml eingestellt.
Biotinylierter K6.1-Antikörper
wurde durch Mischen von gereinigtem K6.1 mit NaHCO3 hergestellt, was
eine Lösung
ergab, die 3 mg Antikörper/ml
in 0,1 M NaHCO3 enthielt. Biotin-N-hydroxysuccinimidester (Calbiochem,
La Jolla, CA) wurde in einer Konzentration von 12 mg/ml in Dimethylsulfoxid
(DMSO) gelöst
und 5,0 μl
hiervon wurden zu jedem ml Antikörperlösung gegeben.
Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde NH4HCO3 bis zu einer Endkonzentration von 50 mM
zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Dann wurde die Mischung zum
Entsalzen und zum Pufferaustausch durch eine Sephadex PD-10-Säule (Pharmacia)
laufen gelassen, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS,
6,7 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 137 mM NaCl) äquilibriert war. Der biotinylierte
K6.1-Antikörper
wurde in einem Verhältnis
von 6–10 μg/ml Zellsuspension
zugegeben und unter gelegentlichem Mischen 30 min bei 4°C inkubiert.
Dann wurden die Zellen durch 3-4malige Zentrifugation gewaschen
und auf eine Konzentration von 25 × 106/ml
eingestellt.
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DYNABEADS M-450 (Dynal Incorporated,
Great Neck, NY) wurden mit Ziege-anti-Biotin-Antikörper aktiviert.
Die Zahl der eingesetzten DYNABEADS war proportional zur Gesamtzahl
mononukleärer
Knochenmarkszellen, wobei ein Verhältnis von 1 Kügelchen/10
Zellen verwendet wurde. Anti-Ziege-IgG-DYNABEADS wurden 4-5mal magnetisch
mit einem Seltenerden-Magnet gewaschen. Die Kügelchen wurden dann in einer Konzentration
von 1 × 108/ml in Waschpuffer suspendiert, der 2,5 μg/ml affinitätsgereinigten
Ziege-anti-Maus-Biotin-Antikörper
(#SP- 3000, Vector
Laboratories, Burlingame, CA) enthielt, 30 min bei Raumtemperatur
kräftig
gemischt und dann zweimal magnetisch gewaschen und mit 1 × 108/ml resuspendiert. Diese anti-Biotin-Konzentration wurde
bei vorläufigen
Titrationsuntersuchungen optimiert, wobei als ein Endpunkt die Kinetik
der Zelldissoziation von den magnetischen Kügelchen verwendet wurde. Die
Bindung von anti-Ziege-anti-Biotin erreicht unter diesen Bedingungen
kein Gleichgewicht; Die Variation des anti-Biotins stellte durch Kontrolle des
Ausmaßes
der Biotin-anti-Biotin-Vernetzung
eine bequeme Möglichkeit
zur indirekten Kompensation für
unterschiedliche Dichten von Zelloberflächenantigenen dar.
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Die mononukleären Knochenmarkszellen, die
mit biotinyliertem K6.1-Antikörper
beschichtete Targetzellen enthalten, wurden mit den anti-Biotin-DYNABEADS
30 min auf einem Roller (etwa 30 rpm) inkubiert.
Die magnetischen CD34+-Zellen wurden dann durch Anziehung an
einen Samarium-Cobalt-Magneten
und Entfernung der freien Nicht-Targetzellen in der Suspension selektiert.
Diese Zellen wurden durch 4–5
weitere Waschzyklen, bei denen der Magnet entfernt wurde, gereinigt,
die Zellen resuspendiert und der Magnet wieder zugegeben, wobei
die freien Nicht-Targetzellen in Suspension entfernt wurden. Schließlich wurden
die magnetischen CD34+-Zellen in Medium
(z. B. IMDM) mit 2,5 mg/ml Biotin suspendiert, 1–2 h auf einen Roller gegeben, und
freie CD34+-Zellen wurden von den magnetisch
immobilisierten DYNABEADS zurückgewonnen.
Die magnetische Trennung kann mit der magnetischen Trennvorrichtung
erfolgen, die in US-Patent Nr. 4,710,472 beschrieben ist, die am
1. Dezember 1987 für
Saur, Reynolds und Black erteilt wurde.
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Zellen nach diesem Verfahren zeigten
bei Analyse mittels Durchflußzytometrie > 99% positive Reaktivität mit einem
zweiten CD34-spezifischen monoklonalen Antikörper MY10 (HPCA-2) (Becton
Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), was anzeigte,
daß eine
hochgereinigte Population von Zellen, die das CD34-Oberflächenmembranantigen
exprimierten, erhalten wurde, die hochangereicherte hämatopoetische
Stammzellen, Progenitorzellen und im wesentlichen keine reifen Blutzellen
enthielt.
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Isolierte CD34+-Knochenmarkszellen
wurden kryokonserviert (1–5 × 106 Zellen/1 ml-Fläschchen) und bis zum Versuch
unter flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Vor Verwendung wurden die CD34+-Zellen
mit Standardmethoden aufgetaut.
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BEHANDLUNG VON CD34+-ZELLEN ZUR KULTIVIERUNG
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Kryokonservierte CD34+-Zellen
wurden rasch bei 37°C
aufgetaut, verdünnt
in 10 × Volumen
vorgewärmtem
(37°C) komplettem
Kulturmedium. Die aufgetauten CD34+-Knochenmarkszellen
wurden zweimal in komplettem Kulturmedium gewaschen und mit 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellvitalität betrug > 99%, wie durch Trypanblau-Ausschluß festgestellt
wurde (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, (1992), Greene
Publishing and Wiley-Interscience, New York).
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Zu Beginn des Versuchs wurde eine
Probe von CD34+-Zellen kultiviert, um die
Zahl und den Typ der hämatopoetischen
Colony Forming Cells (CFC) mit einem Colony Forming-Assay mit Methylcellulose
zu bestimmen (Meisenberg et al., Blood 79: 2267, 1992). Kurz gesagt
wurden gereinigte CD34+-Knochenmarkszellen
und nichtadärente
hämatopoetische
Zellen aus geernteten Kulturen in 35 mm-Lux-Suspensionskulturschalen
(Miles Laboratories, Naperville, IL) mit einer Modifikation der
zuvor beschriebenen Methode (Meisenberg et al., Blood 79: 2267,
1992) kultiviert. 1 ml Kultur bestand aus
5–500 × 102 Knochenmarkszellen, IMDM-Medium (Quality
Biologicals, Rockville, MD), 1% Methylcellulose, 30% hitzeinaktiviertem
fetalem Kälberserum (FCS),
2 U/ml Erythropoietin zur Gewebekultur (Amgen, Thousand Oaks, CA),
2 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml IL-3 (R&D
Systems, Minneapolis, MN) und 5% konditioniertem Medium von der
Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (ATCC, Rockville, MD). Das konditionierte
Medium von der Zelllinie 5637 wurde als Quelle für Kolonie-stimulierende Aktivität verwendet.
Die Kulturen wurden bei 37°C
in einer Feuchtatmosphäre
mit 5% CO2 in Luft inkubiert. An Tag 14
der Inkubation wurden die Kulturen evaluiert, um die Kolonienzahl
zu bestimmen (> 50
Zellen), die sich entwickelt hatten. An Tag 14 wurden Aggregate
Hämoglobin-enthaltender
Zellen als BFU-E; Aggregate aus Granulozyten und/oder Makrophagen
und/oder Megakaryozyten als CFU-MIX; und Aggregate nur mit Granulozyten
und Makrophagen als CFU-GM identifiziert.
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ENDOTHELZELLENKULTUR
UND KULTURBEDINGUNGEN
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Porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen
(PMVEC) wurden isoliert und wie zuvor beschrieben gezüchtet (Robinson
et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990). Die Phänotyp- und
Wachstumseigenschaften dieser Zellen wurden bereits ausführlich.
charakterisiert (Robinson et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990
und Robinson et al., Blood 77: 294–305, 1991).
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Kurz gesagt wurden PMVECs aus Hirn
von 4 bis 6 Monate alten Yucatan-Minipigs isoliert. Die Hirne wurden
steril zusammengegeben, 2 min in 10%iges Povidon-Iod (Sherwood Pharmaceutical
Co., Rahway, NJ) getaucht und 5–6
mal mit Hank's physiologischer
Salzlösung
(HBSS) (Gibco, Grand Island, NY) gewaschen, um restliches Iod zu
entfernen. Graues Gehirnmaterial der Cortices wurde durch eine Pasteurpipette
aufgesaugt, 10 min bei 500 g zentrifugiert (Raumtemperatur), in
HBSS resuspendiert und in einem 40 ml-Dounce-Homogenisator homogenisiert.
Das Homogenat wurde zentrifugiert, resuspendiert und anschließend durch
steriles Nylongewebe mit 149, 76 und 20 μm Maschenweite gesiebt. Die
zurückgehaltenen
Mikrogefäße wurden
in 6 ml HBSS resuspendiert und durch diskontinuierliche Ficoll-Paque-Gradienten
(33%–67% und
67%–75%)
(Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) zentrifugiert. Die pelletierten
Mikrogefäße wurden
in 2 ml HBSS resuspendiert und es wurden 2 ml Kollagenase (1 mg/ml)
(Worthington Biomedical, Freehold, NJ) zugegeben. Nach 2 Minuten
wurden die Mikrogefäße mit HBSS
gewaschen und in M199-Medium (Quality Biological Inc., Gaithersburg,
MD), das mit 10% fetalem Kälberserum,
500 μg/ml Natriumheparin
(Sigma Chemicals, St. Louis, MO) und 2–10 μl/ml Wachstumsfaktor aus Retina
(siehe Robinson et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990)
supplementiert war, in mit Fibronektin (Pierce Chemical, Rockport,
IL) beschichtete 16 mm-Vertiefungen
plattiert. Die Kulturen wurden dann bei 37°C in Luft mit 5% CO2 gezüchtet. Nach
7 Tagen wurden die Zellen subkultiviert und subkloniert. Nach Subklonierung
wurden die PMVEC-Zellinien in IMDM, das mit 10% fetalem Kälberserum,
100 mg/ml L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin supplementiert war
(komplettes Kulturmedium) wachsen gelassen.
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PMVECs wurden zweimal wöchentlich
mit komplettem Medium gefüttert.
Sobald sie konfluent waren, wurden die PMVEC-Monolayer mit PBS gewaschen, trypsiniert
(0,25 m Trypsin/ml, 5 mM EDTA, 37°C,
10 Minuten, Sigma, St. Louis, MO) und entweder in einem Verhältnis von
1 : 5 in 75 cm2-Kolben oder mit einer Zellkonzentration
von 1 × 105 Zellen/Vertiefung in gelatinebeschichteten
6-Loch-Gewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA), die 3 ml komplettes
Kulturmedium enthielten, das mit zusätzlichen 10% FCS supplementiert war,
subkultiviert. Nach 48–72
h wurden die adhärenten
PMVEC-Monolayer (70–80%
konfluent) zweimal mit komplettem Kulturmedium gewaschen, um nichtadhärente PMVECs
zu entfernen, und das Kulturmedium wurde durch 5 ml komplettes Zellkulturmedium
ersetzt.
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ZYTOCHEMISCHE
FÄRBUNG
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Zur morphologischen Analyse von Zellpopulationen
wurden 105 Zellen in 0,1 ml Medium 7 min
bei 500 rpm mit einer Cytospin-2-Zentrifuge
(Shandon Instruments, Sewickley, PA) auf Mikroskop-Objektträger zentrifugiert.
Luftgetrocknete Zellpräparate
wurden in absolutem Methanol fixiert und durch Wright-Giemsa-Färbung gefärbt. Morphologische Differentialzellzählungen
wurden durch Ölimmersions-Mikroskopie
erhalten. Es wurden wenigstens 200 Zellen pro Objektträger untersucht.
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STATISTISCHE ANALYSE
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Das Signifikanzkriterium (P < 0,05) wurde mit
dem Student's t-Test
bestimmt.
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PROLIFERATION VON CD34+-KNOCHENMARKSZELLEN IN KULTUR
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Um die Fähigkeit von Flüssigsuspensionskulturen,
PMVEC-Nonkontakt-Monolayerkulturen
und PMVEC-Monolayer-Kontaktkulturen
zu vergleichen, das Wachstum von CD34+-Knochenmarkszellen
zu unterstützen,
wurden gereinigte CD34+-Zellen (1 × 105 Zellen/Vertiefung)
(> 99,5% positiv)
in jede Vertiefung (5 ml Endvolumen) von 6-Loch-Gewebekulturplatten
(Costar, Cambridge, MA) gegeben, die kein PMVEC-Monolayer (Flüssigkulturen),
konfluente PMVEC-Monolayer (Kontaktkulturen) enthielten, sowie in
die obere Kammer eines kollagenbehandelten Transwell-Einsatzes (0,4
um Porengröße, Costar,
Cambridge, MA), der über
PMVEC-Monolayern plaziert war (Nonkontaktkulturen).
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Die Kulturen wurden mit optimalen
Dosen an GM-CSF, GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 und GM-CSF + IL-3
+ SCF + IL-6 behandelt. Insbesondere wurden die Zytokine in den
folgenden Konzentrationen eingesetzt: 2 ng/ml GM-CSF; 10 ng/ml IL-3;
100 ng/ml SCF; und 10 ng/ml IL-6. Alle Kulturen wurden bei 37°C in einer
Feuchatmosphäre
mit 5% CO2 in Luft gehalten. Rekombinante
humane Wachstumsfaktoren (gekauft von R&D Systems, Minneapolis, MN), die
zur Stimulierung der Koloniebildung verwendet wurden, umfaßten IL-3,
GM-CSF, IL-6 und SCF.
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Nach mehreren Tagen Kultivierung
wurden nichtadärente
Zellen schonend von den Endothelzell-Monolayern entfernt, zweimal
mit komplettem Kulturmedium gewaschen, und es wurden manuelle Hämazytometer-Zellzählungen
mittels Trypanblau-Ausschluß durchgeführt. 1 zeigt die Anzahl nichtadhärenter Zellen, die
pro Kulturbedingung nach 7 Tagen Inkubation geerntet wurden. Die
Ergebnisse sind ausgedrückt
als Mittelwert der nichtadhärenten
Zellen + 1 SD, die für
jeweils vier Kulturansätze
in sechs Versuchen ausgezählt wurden.
Wie man sieht war die Zunahme geernteter nichtadhärenter Zellen
für jede
spezielle Zytokinkombination in den Kulturen am größten, in
denen CD34+-Stammzellen in Kontakt mit dem
PMVEC-Monolayer gezüchtet
wurden, lag in der Transwell/Nonkontaktkultur im mittleren Bereich
und war in den Flüssigkulturen
am geringsten.
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Verglichen mit CD34+-Knochenmarkszellen,
die in Flüssigkultur
gezüchtet
wurden, war die Anzahl geernteter nichtadärenter Zellen insbesondere
bei in Kontakt mit PMVEC gezüchteten
und mit GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 oder IL-3 + GM-CSF + SCF
+ IL-6 stimulierten Kulturen signifikant höher (2,3–4,0 fach). Ferner war die
Kombination aus GM-CSF + SCF + IL-6 bei jeder Kulturbedingung besser
als die aus GM-CSF + SCF oder IL-3 + SCF + IL-6. Es gab eine 10,9-,
18,9- und 39,6 fache Zunahme der Anzahl nichtadhärenter Knochenmarkszellen,
die aus mit GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 bzw. GM-CSF + IL-3 +
SCF + IL-6 stimulierten Kontakt-PMVECs geerntet wurden. Der am wenigsten
wirksame Stimulus war die Kombination aus GM-CSF + SCF, während der
wirksamste Stimulus die Kombination aus GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6
war. Die Zugabe von IL-3 + IL-6 erhöhte die Anzahl nichtadhärenter Zellen
3,6 fach. Keine der Zytokinkombinationen schien eine Wirkung auf
die Entwicklungsgeschwindigkeit der morphologischen Organisation
der adhärenten PMVEC-Monolayer
zu haben.
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IMMUNOPHÄNOTYP VON
KULTIVIERTEN KNOCHENMARKSZELLEN
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Die Wirkungen verschiedener Zytokinkombinationen
und Kulturbedingungen auf die Proliferation und Reifung von hämatopoetischen
CD34+-Knochenmarkszellen nach 7 Tagen Kultur
wurde durch Messung der Expression von CD34- und CD38-Zelloberflächenantigenen
bestimmt. Die Ergebnisse für
7 Tage lang kultivierte Zellen sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
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Simultane zytometrische Zweifarbenanalyse
kultivierter nichtadhärenter
Zellen wurde an Tag 7 der Kultur durchgeführt. Kurz gesagt wurden nichtadhärente, aus
Flüssigkulturen,
Endothelzellen-Kontaktkulturen und Nonkontakt-Endothelkulturen (oberes
Kompartiment der Transwell-Kammer) entnommene Zellen geerntet, zweimal
in komplettem Kulturmedium gewaschen und in PBS, das mit 2% (Gew./Vol.)
Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid supplementiert war
(Färbemedium),
resuspendiert. Nichtadhärente
Zellen wurden zuerst 30 min mit Sättigungskonzentrationen von
anti-CD34-Antikörper
(K6.1 MAb) inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit Färbemedium
wurden die Zellen weitere 30 min mit biotinyliertem Ziege-anti-Maus-IgG1 inkubiert.
Nach einer zweiten Serie mit zwei Waschschritten mit Färbemedium
wurden FITC-konjugierter CD38 und APC-Streptavidin zusammen zugegeben
und weitere 30 min inkubiert. Schließlich wurden die Zellen zweimal
mit Färbemedium
gewaschen und mit 1% Paraformaldehyd fixiert. Jeder Inkubationsschritt
wurde im Dunkeln bei 4°C
durchgeführt
und Zellen, die mit den passenden konjugierten Isotyp-Antikörpern gefärbt waren, wurden
als Kontrollen verwendet. Wenigstens 10.000 Events wurden im Listmode
auf einem Coulter Elite-Durchflußzytometer (Coulter, Hialeah,
FL) gesammelt.
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Weder unstimulierte noch Zytokin-behandelte
PMVECs färbten
positiv auf anti-Human-CD34- und -CD38-Oberflächenantigene. Wie in der nachfolgenden
Tabelle 1 gezeigt, nahm die Zahl der CD34+-Knochenmarkszellen
in PMVEC-Kontakt-Zellkulturen in Gegenwart von GM-CSF + SCF, IL-3
+ SCF + Il-6 bzw. GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 1,5-, 1,9- und 7,6
fach zu. Außerdem
waren 68–78%
dieser geernteten CD34+-Zellen auch negativ
für das
CD38-Antigen. (Siehe 2 und 3).
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Im Gegensatz zu den mit PMVEC-Kontaktkulturen
erhaltenen Ergebnissen wurde bei PMVEC-Nonkontaktkulturen ein geringerer
Expansionsgrad von CD34+-Knochenmarksstammzellen
gemessen, wobei mehr als 67% dieser Zellen den CD34+ CD38+-Phänotyp
exprimierten.
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In der Flüssigsuspensionskultur wurden
die eingesetzte Menge der CD34+-Knochenmarkszellen
nur bei Zytokinbehandlung mit GM-CSF + IL-3. + SCF + IL-6 (1,2 fache
Zunahme) erhalten, jedoch exprimierten mehr als 85% dieser Zellen
das hämatopoetische
CD38-Differenzierungsantigen.
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POTENTIAL ZUR HÄMATOPOETISCHEN
KOLONIEBILDUNG VON NICHTADHÄRENTEN,
AN TAG 7 AUS KULTUREN GEERNTETEN ZELLEN
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Das Wachstum hämatopoetischer Progenitorzellen
aus nichtadhärenten
Zellen von Tag 7, die aus Zytokin-behandelten Flüssigsuspensionskulturen, PMVEC-Nonkontakt-Monolayerkulturen
und PMVEC-Monolayer-Kontaktkulturen geerntet worden waren, wurde
ebenfalls untersucht. Die Daten in der nachfolgenden Tabelle 2 zeigen
die Gesamtzahl der pro Kulturbehandlung wiedergewonnenen CFC, CFU-GM,
CFU-MIX, CFU-BLAST, CFU-MK und BFU-E. Die Kulturen wurden mit 5 × 105 CD34+-Zellen, die
5,5 × 104 CFU-GM, 2,8 × 104 CFU-MIX,
1,1 × 104 BFU-E, 1,8 × 104 CFU-BLAST und 2,2 × 104 CFU-MK enthielten, initiiert. Die Gesamtzahl
an Colony Forming Cells (CFC), die sich nach 7 Tagen in Flüssigsuspensionskultur
gebildet hatten, nahm in mit GM-CSF + SCF behandelten Kulturen 25%
ab, in mit IL-3 + SCF + IL-6 behandelten Kulturen um das 1,5 fache
zu und in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 um das 32 fache
zu. Im Gegensatz dazu expandierte der gesamte klonogene Zellgehalt
in PMVEC Nonkontaktkul turen 3,3– , 4,4- und 8,9 fach und in mit
GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 bzw. GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6
behandelten PMVEC-Kontaktkulturen 10,5-, 20,3- und 37,4 fach. Eine
maximale Zunahme von nichtadhärenten
Zellen insgesamt (42,0 fach), CFU-GM (33,3 fach), CFU-MIX (31,0
fach), BFU-E (50,2 fach), CFU-BLAST (33,6 fach) und CFU-MK (9,2
fach) wurden in mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelten PMVEC-Kontaktkulturen erhalten,
was die Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontakts zeigt.
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Beispiel 2
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LANGZEIT-WACHSTUMSPOTENTIAL
VON HÄMATOPOETISCHEN
CD34+KNOCHENMARKSPROGENITORZELLEN AUF ZYTOKINBEHANDELTEN
PMVEC-MONOLAYERN
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Gereinigte humane CD34+-Knochenrnarkszellen
(5 × 105 Zellen/Kolben wurden in 75 cm2-Kolben inokuliert,
die konfluente PMVEC-Monolayer und 15 ml komplettes Kulturmedium,
das mit GM-CSF (2 ng/ml), IL-3 (10 ng/ml), SCF (100 ng/ml) und IL-6
(10 ng/ml) supplementiert war, enthielten. Alle Kulturen wurden
bei 37°C
in einer Feuchtatmosphäre
mit 5% CO2 in Luft gehalten. Nach 7 Tagen
und anschließend
in wöchentlichen
Abständen
wurden alle nichtadhärenten
Zellen entnommen und gezählt
(siehe 4), und 2 × 106 nichtadhärente Zellen wurden erneut
auf frischen PMVEC-Monolayerkulturen angesät, die frisches, mit Wachstumsfaktoren
supplementiertes Medium enthielten. Nichtadhärente Zellen wurden auf CD34-
und CD38-Zelloberflächenantigene
immunphänotypisiert
und in Methylcellulose untersucht, um ihren
Gehalt an klonogenen Zellen zu bestimmen (siehe 4, 5 und 6).
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Die Wirkung optimaler Konzentrationen
von GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 auf das Wachstum von hämatopoetischen
Progenitorzellen in Langzeitkultur wird in den 4, 5 und 6 gezeigt. Bei allen Probenahmeintervallen
war die Zellvitalität
geernteter nichtadhärenter
Zellen, bestimmt durch Trypenblau-Ausschluß, > 95%. Die Anzahl von nichtadhärenten Zellen
und von CFC-Progenitorzellen nahm während der 35 tägigen Kulturdauer
dramatisch zu. Die Produktion nichtadhärenter Zellen erreichte an
Tag 35 mit mehr als einer berechneten 531 × 105 fachen
Zunahme der Zellzahl ihren Höhepunkt.
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Außerdem wurde an Tag 28 in der
Kultur eine 4510-, 5677-, 5177-, 2607-, 2407- und 4150 fache Zunahme
der Gesamtzahl klonogener Zellen, CFU-GM, CFU-MIX, CFU-BLAST, BFU-E
und CFU-MK, gefunden. Obwohl der Prozentsatz an Zellen in der Kultur,
die das CD34+-Oberflächenantigen exprimierten, an
den Tagen 7, 14, 21 und 28 auf 26,6%, 13,0, 33% bzw. 1,7% abnahm,
nahm die berechnete absolute Zahl von CD34+-Zellen,
die in diesem Kultursystem gebildet wurden, über den gleichen Zeitraum 10,0-,
105-, 498- und 2854 fach zu. An Tag 35 waren < 1% CD34+-Zellen vorhanden,
was mit einer signifikanten Abnahme der Zahl nachweisbarer CFU-MIX,
CFU-MK, CFU-BLAST und BFU-E korrelierte; im Vergleich mit den Werten
an Tag 28 wurden jedoch keine signifikanten Änderungen bei der Zahl der
CFU-GM beobachtet. Darüber
hinaus nahm die Inzidenz von Zellen, die entweder das CD15- oder
das CD11b-Oberflächenantigen
exprimierten, unter Verlust der CD34-Antigenexpression rasch zu,
wobei an den Tagen 14, 21, 28 bzw. 35 der Kultur 14,8%, 42,4%, 43,4% und
64,9 der Zellen CD15+ und 44%, 43%, 59%
und 66% der Zellen CD11b+ waren. Das immunphänotypisch beobachtete
myeloide Differenzierungsmuster wurde durch zytologische Analyse
der geernteten Zellenin verschiedenene Zeitabständen bestätigt.
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Beispiel 3
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MURINE TRANSPLANTATION
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Mäuseweibchen
(C57BL/6) wurden von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine erworben
und es wurden 5 bis 10 Mäuse
pro Käfig
gehalten. Die Tiere wurden bei einem 12 stündigen hell/dunkel-Zyklus gehalten
und erhielten Futter (Wayne Roden Blox) und Wasser ad libitum. Es
wurden 12–14
Wochen alte Mäuse
für diese
Untersuchungen verwendet. Die Untersuchungen wurden entsprechend
den im "Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals" aufgestellten Prinzipien durchgeführt, die
vom Institute of Laboratory Animal Resources, National Research
Council, entwickelt wurden.
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KULTURBEDINGUNGEN
FÜR ENDOTHELZELLEN
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Porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen
(PMEVC) wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Zellen aktiv wachsender
Monolayer (Passagierungen 8–21)
wurden mit einer Zellkonzentration von 3 × 104 Zellen/Vertiefung in
gelatinebeschichtete 24-Loch-Gewebekulturplatten mit QBSF-56-Medium
(Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) plattiert, das mit 20% FBS
(Hyclone, Ogden, UT) supplementiert war. Nach 24–48 h wurde das Kulturmedium
durch ein definiertes Medium mit niedrigem Serumgehalt ersetzt,
das aus QBSF-56 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) bestand,
das mit 1% hitzeinaktiviertem FBS, 100 μg/ml L-Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin
supplementiert war.
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IN VITRO-EXPANSION
VON KNOCHENMARKSZELLEN
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Mittels Ficoll-Hypaque abgetrennte
mononukleäre
Knochenmarkszellen aus Mäusefemora
(5 × 103/Vertiefung) wurden mit rekombinantem murinem
GM-CSF (5 ng/ml) und IL-3 (5 ng/ml) in jede der Vertiefung einer
24-Loch-Kulturplatte gegeben (Endvolumen 2 ml/Vertiefung) und bei
37°C in
einer Feuchtatmosphäre
mit 5% CO2 in Luft inkubiert. Nach 7 Tagen
Inkubation wurden gepoolte Zellen aus Blast-Kolonien mit Kulturmedium
unter Zuhilfenahme einer sterilen 5 ml-Pipette vom endothelialen
Monolayer abgelöst.
Die Blastzellen wurden durch Zentrifugation konzentriert und in
einer PBS-Lösung,
die mit 1% FCS und 100 μg/ml
Penicillin/Streptomycin supplementiert war, resuspendiert.
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ZELLSUSPENSIONEN
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Die Mäuse wurden durch Genickluxation
getötet
und Femora und Milz wurden entnommen. Die Zellen wurden aus den
Femora mit 5 ml PBS, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum
(Hyclone, Logan, UT) enthielt, ausgespült und durch eine 25 Gauge-Nadel
dispergiert, bis eine Suspension aus Einzelzellen erhalten wurde.
Milz wurden durch Edelstahlmaschensiebe gepreßt und die Zellen wurden mit
5 ml Medium von den Sieben abgewaschen. Zellkonzentrationen und
Zellvitalität
wurden mittels Trypanblau-Ausschluß durch manuelle Zählung mit
einem Hämatozytometer
bestimmt.
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ZÄHLUNG PERIPHERER BLUTZELLEN
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Peripheres Blut wurde aus Metaphan-anästhesierten
Mäusen
durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen erhalten, die mit
22 Gauge-Nadeln versehen waren. Weiße Blutzellen, rote Blutzellen
und Thrombozyten wurden mit einem Baker Hematology 9000 Series Cell
Counter System (Baker, Allentown, PA) ausgezählt. Ferner wurden Blutausstriche
präpariert
und mit Diff-Quick (Bayer Healthcare Corp, McGaw Park, IL) gefärbt. Ein
morphologisches WBC-Differentialblutbild wurde mittels Ölimmersionsmikroskopie
erhalten. Es wurden wenigstens 20 Zellen pro Objektträger analysiert.
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ASSAY AUF GRANULOZYTEN-MAKROPHAGEN-KOLONIE-BILDENDE
ZELLEN (GM-CFC)
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CFU-GM aus Knochenmark und Milz wurden
in 35 mm-Luxschalen (Miles Laboratory, Naperville, IL) mit einer
Modifikation der zuvor beschriebenen Methode analysiert (Meisenberg
et al., Blood 79: 2267, 1992). 1 ml Kultur bestand aus 5–50 × 104 Zellen, Iscove's MEM (GIBCO, Grand Island NY), 1% Methylcellulose,
30% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum
(FCS), 5 ng/ml rmGM-CSF und 5 ng/ml rmIL-3 (Genzyme, Boston MA). Kulturen
wurden bei 37°C
in einer Feuchtatmosphäre
mit 5% CO2 in Luft inkubiert. An Tag 14
der Inkubation wurde die Zahl der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden
Zellen (CFU-GM) in situ bestimmt.
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STATISTISCHE
ANALYSE
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Zum Test der statistischen Differenz
wurde der zweiseitige ("two-tailed") Student's t-Test verwendet. Das
Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05
gesetzt.
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ÜBERLEBEN VON MÄUSEN, DENEN
ZELLEN AUS BLASTKOLONIEN TRANSPLANTIERT WURDEN, DIE AUF ENDOTHELZELLEN
IN GEGENWART VON GM-CSF GEZÜCHTET
WORDEN WAREN
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Mäuse
wurden zweiseitiger Gammastrahlung mit einer Dosisleistung von 1,0
Gy/min aus einer Cäsium-137-Strahlungsquelle
ausgesetzt und am folgenden Tag über
die Schwanzvene entweder mit Kochsalzlösung, 5 × 104 nichtadhärenten Zellen
aus mit GM-CSF + IL-3 behandelten Flüssigsuspensionskulturen oder mit
5 × 104 gepoolten Blastzellen aus Blastzellkolonien
von Tag 7, die auf mit GM-CSF behandelten endothelialen Monolayern
gezüchtet
worden waren, infundiert. Mäuse,
die eine Gesamtstrahlungsdosis von 10,0 Gy und entweder Kochsalzlösung (Kontrolle)
oder 5 × 104 nichtadhärente Zellen aus Flüssigsuspensionskulturen mit
GM-CSF + IL-3 von Tag 7 erhielten, starben nach durchschnittlich
14 ± 3
Tagen.
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Peripheres Blut wurde aus Metaphan-anästhesierten
Mäusen
durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen erhalten, die mit
22 Gauge-Nadeln versehen waren. Weiße Blutzellen, rote Blutzellen
und Thrombozyten wurden mit einem Baker Hematology 9000 Series Cell
Counter System (Baker, Allentown, PA) ausgezählt. Ferner wurden Blutausstriche
präpariert
und mit Diff-Quick (Bayer Healthcare Corp, McGaw Park, IL) gefärbt. Ein
morphologisches WBC-Differentialblutbild wurde mittels Ölimmersionsmikroskopie
erhalten. Es wurden wenigstens 200 Zellen pro Objektträger analysiert.
Die Zahl der weißen
Blutzellen (WBC) und der Thrombozyten erreichte 4 Tage nach Bestrahlung
einen Tiefpunkt und erholte sich vor dem Tod der Tiere nicht mehr. Letal
bestrahlte Mäuse,
die Knochenmarkstransplantate von 5 × 104 gepoolten
Blastzellen aus Kolonien von Tag 7 erhielten, die auf endothelialen
Monolayern in Gegenwart von GM-CSF + Il-3 gezüchtet worden waren, überlebten
alle > 60 Tage nach
Transplantation.
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HÄMATOPOETISCHE
RESTITUTION IM KNOCHENMARK UND IN DER MILZ
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Die Gesamtzahl an GM-CFC pro Femur
und Milz wurde an den Tagen 0, 4, 8, 12, 15, 19, 24, 28 und 60 nach
letaler Strahlungsexposition von 10,0 Gy und Knochenmarkstransplantation
analysiert (7 und 8). Gepoolte Blastzellen,
die aus mit GM-CSF + IL-3 behandelten PMVEC-Monolayern geerntet
worden waren, induzierten Hämatopoese
in alle Linien ("Multilineage
Hematopoiesis"),
wie sich in Änderungen
des Anteils der Milz- und Knochenmarks-Stamm- und -Progenitorzellen
zeigte. Die Zellularität
im Knochenmark von transplantierten Mäusen war 24 h nach Bestrahlung
auf 5,6 × 105 Zellen pro Femur (etwa 10% der normalen
Knochenmarkszellularität)
reduziert. Die geringsten GM-CFC-Zahlen in der Milz wurden an Tag
4 nach Bestrahlung beobachtet; die Milzrestitution erfolgte etwa
2-Wochen nach Transplantation,
wobei die Zahl der Progenitorzellen die Werte für den Kontrolltag 0 vor der
Normalisierung übertrafen.
Knochenmarksstammzellen und Progenitorzellen nahmen vier Tage nach
Transplantation ab und nahmen von Tag 12 an allmählich zu. Sie erholten sich
jedoch bis zu Tag 60 nach Transplantation auf ein normales Niveau.
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HÄMATOPOETISCHE
RESTITUTION IN PERIPHEREM BLUT
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Die erhöhte Progenitorzellaktivität auf der
Ebene der Knochenmarks- und Milzstammzellen sowie der Progenitorzellen
beeinflußte
den Spiegel an reifen Blutzellen grundlegend, wie sich an einem
beschleunigten Wiederauftreten reifer weißer Blutzellen (WBC), roter
Blutzellen (RBC) und Thrombozyten (PLT) (9) in peripherem Blut zeigte. Tieren,
denen 5 × 104 gepoolte Blastzellen transplantiert worden
waren, begannen ihre Gesamtzahl weißer Blutzellen, Neutrophiler
und Thrombozyten zwischen 12 und 15 Tagen nach Transplantation zu
restituieren.
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Die in vitro-Expansion von Knochenmarksstammzellen
und Progenitorzellen auf mit GM-CSF + IL-3 behandelten PMVEC-Monolayern erhöhte die
Zahl an Granulozyten-, Megakaryozyten- und Erythroidvorläufern sowie die Stammzellen
im Femur und der Milz und beschleunigte daher die Restitution peripherer
Blutleukozyten, Neutrophiler, Thrombozyten und Erythrozyten in letal
bestrahlten Wirtsmäusen.