DE69433168T2

DE69433168T2 - In vitro vermehrung von stammzellen

Info

Publication number: DE69433168T2
Application number: DE69433168T
Authority: DE
Inventors: A. Thomas DAVIS; Steven Kessler; Douglas H. Robinson
Original assignee: US Department of Navy
Current assignee: US Department of Navy
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-27
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2014-10-28
Also published as: EP0812201A4; WO1995011692A1; US5599703A; AU8128094A; EP0812201B1; DE69433168D1; EP0812201A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation hämatopoetischer Stammzellen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Amplifikation humaner Knochenmarksstammzellen durch Kultivieren der Zellen mit Endothelzellen in Gegenwart von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen.
Die Erfindung umfaßt keine humanen Embryozellen.
Beschreibung des Standes der Technik
Hämatopoese, die Bildung reifer Blutzellen, beinhaltet ein komplexes Differenzierungsschema in viele Linien (Metcalf, Nature 339: 27–30, 1989). Hämatopoese erfolgt hauptsächlich im Knochenmark, wo hämatopoetische Stammzellen (pluripotente Stammzellen) proliferieren und zu Progenitorzellen differenzieren, die sich dann zu den verschiedenen Typen reifer Blutzellen entwickeln (Gordon et al., Bone Marrow Transplant 4: 335, 1989; Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio. 3: 423, 1987). Die hämatopoetische Stammzelle ist funktionell durch ihre ausgiebige und lang anhaltende Selbsterneuerungskapazität sowie ihre Fähigkeit charakterisiert, zu differenzieren und dadurch zu Zellen aller lymphohämatopoetischen Reihen zu führen (Sprangrude et al., Science 241–58, 1988; Terstappen et al., Blood 77: 1218, 1991; Civin et al., Exp. Hematol. 15: 10, 1987; Civin et al., J. Immunol. 133: 157, 1984; Strauss et al., Exp. Hematol. 14: 878, 1986). Phänotypisch ist der augenblicklich einzige gut definierte humane hämatopoetische Stammzellmarker das hämatopoetische Zelloberflächenantigen CD34 (Civin et al., J. Immunol. 133: 157, 1984; Strauss et al., Exp. Hematol. 14: 878, 1986). Dieses Zelloberflächenantigen ist ein hochglykosyliertes integrales 115 kd-Membranprotein vom Typ I mit unbekannter Funktion (Civin, Exp. Hematol. 18: 461, 1990).
Die Sequenz der cDNA für humanes CD34 läßt vermuten, daß es mehrere O-verknüpfte Glykosylierungsstellen gibt (Simmons et al., J. Immunol. 148: 267, 1992) und daß das Anhängen linienspezifischer Glykane an das CD34-Grundgerüst die Bindung an Lectine an Knochenmarksstromazellen oder der extrazellulären Matrix erlaubt. Das CD34-Antigen wird von etwa 1–5% der Zellpopulation des humanen Knochenmarks exprimiert (Civin et al., Exp. Hematol. 15: 10, 1987; Civin et al., J. Immunol. 133: 157, 1984; Strauss et al., Exp. Hematol. 14: 878, 1986) und schließt pluripotente Zellen sowie Vorläuferzellen für jede der hämatopoetischen Zellinien ein (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Berstein et al., Blood 77: 2316, 1991). Ferner wird das CD34-Antigen auf humanen vaskulären Endothelzellen exprimiert (Fina et al., Blood 75: 2417, 1990), was eine mögliche Rolle für das Antigen bei Adhäsion oder zellulären Wechselwirkungen vermuten läßt. Gereinigte CD34⁺-Zellen können in vivo Hämatopoese rekonstituieren (Berenson et al., J. Clin. Invest. 81: 951, 1988; Berenson et al., Blood 77: 1717, 1991) und unterstützen die Myelopoese zusammen mit Stromazellen in Langzeit-Knochenmarkskulturen über mehrere Monate (Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984; Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Sutherland et al., Blood 74: 1563, 1989; Gordon et al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987; Gordon et al., Br. J. Haematol. 60: 129, 1985; Verfaillie et al., J. Exp. Med. 172: 509, 1990). Weitere Untersuchungen zeigten, daß die pluripotente hämatopoetische Stammzelle durch weitere phänotypische Marker, einzeln und in Kombination, identifiziert werden kann. Die primitivsten pluripotenten humanen hämatopoetischen Knochenmarksstammzellen sind kleine (geringe Vorwärts-Lichtstreuung und Seitwärtsstreuung) CD34⁺, Thy1^+/–, c-Kit⁺, HLA-DR^–, CD38^–, CD15^–, Rhodamin-123-schwache und 4-Hydroperoxycyclophosphamid-resistente Zellen, sind aber hämatopoetischer Linienmarker-negativ (Lin.^–) (Baum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2804, 1992; Briddle et al., Blood 79: 3159, 1992; Craig et al., J. Exp. Med. 177: 1331, 1993). Ähnlich zeigten jüngere Reinigungsversuche, daß die primitivsten murinen hämatopoetischen Stammzellen über zahlreiche phänotypischer Marker isoliert wurden, wie Thy-1, c-Kit, Weizenkeimagglutinin (WGA) und Stammzellantigen (Okada et al., Blood 78: 1706, 1991; Ikuta und Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1502, 1992), aber Lin^– sind (Sprangrude et al., Science 241: 58, 1988).
Das Knochenmark dient in vivo als die notwendige Mikroumgebung, in der konstitutive Hämatopoese, Stammzelldifferenzierung und Selbsterneuerung der Stammzellen erfolgen (Gordon et al., Bone Marrow Transplant 4: 335, 1989; Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio. 3: 423, 1987; Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984). Diese Mikroumgebung besitzt zwei Hauptkomponenten – die lymphohämatopoetischen Elemente und das Knochenmarksstroma. Das Knochenmarksstroma, das aus Fibroblasten, Endothelzellen, Adipozyten und Makrophagen/ Monozyten besteht, liefert ein heterogenes adhärentes Zelllayer. Es wurde gezeigt, daß nur diese heterogenen adhärenten Zelllayer bei der Unterstützung von Langzeit-Stammzellproliferation und -differenzierung in vitro wirksam sind (Dorshkind, Annu. Rev. Immunol. 8: 111, 1990; Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335, 1977; Allan et al., Exp. Hematol. 12: 517, 1984). Innerhalb des Knochenmarksstromas durchlaufen hämatopoetische Progenitorzellen Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Sutherland et al., Blood 74: 1563, 1989; Gordon et al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987; Gordon et al., Br. J. Haematol. 60: 129, 1985). Man nimmt an, daß an der Proliferation und Differenzierung von Stammzellen in Stroma-abhängigen Kulturen Zell-Zell-Wechselwirkungen (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; verfaillie et al., J. Exp. Med. 172: 509, 1990; Gordon et al., J. Cell Physiol. 130: 150, 1987), aus Stroma stammende Zytokine (Berstein et al., Blood 77: 2316, 1991; Dorshkind, Annu. Rev. Immunol. 8: 111, 1990; Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335, 1977; Clark et al., Science 236: 1229, 1987) und extrazelluläre Matrixproteine (Campbell et al., J. Clin. Invest. 75: 2085, 1985; Campbell et al., Nature 329: 744, 1987; Tsai et al., Blood 69: 1587, 1987; Liesveld et al., Blood 73: 1794, 1989) beteiligt sind. Es bestand großes Interesse und viel Arbeit wurde investiert, um ein in vitro-Kultursystem für hämatopoetische Zellen zu etablieren (Edgington et al., Bio/Technology 10: 1099, 1992). In vitro kultivierte hämatopoetische Zellen könnten in der Humantherapie verwendet werden. Beispielsweise könnten solche Zellen bei Knochenmarkstransplantationen (BMT) eingesetzt werden. Die meisten BMT-Protokolle versuchen, die Hämatopoesefunktion nach Exposition mit myeloablativen Mitteln zu restaurieren. BMT ist daher ein wichtiger Bestandteil der therapeutischen Behandlung von fortgeschrittener Malignitäten (sowohl hämatologischen als auch nicht-hämatologischen), intrinsischen Knochenmarksdefekten und Knochenmarksverletzung durch extrinsische Mittel (beispielsweise Strahlung oder Toxine). Ferner ist zu erwarten, daß BMT zusammen mit den sich entwickelnden genetischen Therapiemethoden eine zunehmend größere Rolle bei der Behandlung zahlreicher Erkrankungen spielt. Zur allgemeinen Übersicht siehe Negrin et al. (Marrow Transplantation Reviews 2: 23, 1992) und Antman (Marrow Transplantation Reviews 2: 27, 1992).
Hämatopoetische Kultursysteme können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, Flüssigkultursysteme und Stroma-Cokultur-Systeme. Flüssigkultursysteme züchten hämatopoetische Zellen suspendiert in flüssigen Medien mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren und Zytokinen (Haylock et al., Blood 80: 1405, 1992; Brugger et al., Blood 81: 2579, 1993). Obwohl Flüssigkulturen leicht zu erhalten und technisch für eine umfangreiche Expansion hämatopoetischer Zellen zur therapeutischen Verwendung gut geeignet sind, gelang es mit keiner von ihnen, CD34⁺-Stammzellen in größerer Zahl zu erzeugen, wie sie zur langfristigen Ansiedelung (Engraftment) notwendig sind Dies spiegelt sich auch in der Tatsache wider, daß es schwierig ist, diese Kulturen über einen längeren Zeitraum (Monate) zu erhalten, da die pluripotenten Stammzellen alle schnell zu reiferen Zellen differenzieren. Das Unvermögen, einen Pool undifferenzierter pluripotenter Stammzellen zu erhalten und zu expandieren, ist vermutlich auf das Fehlen einer durch die Stromaelemente des Knochenmarks gebildeten geeigneten Mikroumgebung zurückzuführen. Um dieses Problem zu lösen, züchten Stroma-Cokultur-Systeme hämatopoetische Zellen mit oder ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen auf oder in einem adhärenten Layer von Knochenmarksstroma (einer heterogenen Population von Endothelzellen, Adipozyten, Fibroblasten und Makrophagen).
Eines der ersten Langzeitsysteme für Knochenmarkskulturen (Long-Term Bone Marrow Culture Systems, LTBMCS) wurde von Dexter et al. beschrieben (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Bio. 3: 423, 1987). Die LTBMCS von Dexter et al. zeigten, daß sich unter in vitro-Kulturbedingungen verlängertes Zellwachstum und verlängerte Entwicklung erreichen läßt. In diesem System scheint ein adhärentes Layer von Knochenmarksstroma die Wachstumsfaktoren und die zelluläre Umgebung zu liefern, die für die Proliferation hämatopoetischer Stammzellen und ihre Differenzierung zu einer Vielzahl determinierter Progenitorzellen notwendig sind (Andrews et al., J. Exp. Med. 172: 355, 1990; Gordon et al., Br. J. Haematol. 60: 129, 1985). Die Einflüsse der Mikroumgebung und die Regulierung der Hämatopoese in diesem Kultursystem sind jedoch aufgrund der Heterogenität der Zelltypen, die das Knochenmarksstroma bilden, schwer zu analysieren. Diese Komplexität der Mikroumgebung verhindert auch großenteils Versuche, Elemente zu definieren, die für spezifische Stadien der hämatopoetischer Zellentwicklung verantwortlich sind.
Trotz der Fähigkeit der LTBMCS, über einen längeren Zeitraum einen länger anhaltenden Ausstoß von Zellen zu generieren (was den Erhalt eines Pools pluripotenter Stammzellen anzeigt), sind diese Systeme zur Zeit schwer für therapeutische Zwecke einsetzbar. Erstens gibt es die obengenannte Komplexität der heterogenen zellulären Mikroumgebung, die eine sorgfältige Analyse der ablaufenden biologischen Mechanismen unmöglich macht und eine deutliche Verbesserung des Kultursystems verhindert. Zweitens erfordern LTBMCS vor dem Ansäen hämatopoetischer Zellen in der Kultur die Etablierung eines Layers von Knochenmarksstroma. Etablierung des Stromalayers dauert häufig Wochen, eine signifikante Verzögerung. Dies verhindert auch LTBMCS im Großmaßstab, die für eine therapeutische Anwendung erforderlich sind. Schließlich gibt es keinen raschen und signifikanten Ausstoß von hämatopoetischen Zellen aus diesen Kultursystemen, was ihren Nutzen für therapeutische Zwecke wiederum limitiert.
In einem Versuch, die Komplexität und die Limitierungen der Dexter-LTBMCS zu vermeiden, wurden Perfusionsbioreaktorsysteme entwickelt, in denen hämatopoetische Zellen kultiviert werden konnten. Perfusionsbioreaktoren helfen, eine definierte Kulturumgebung zu erhalten und physikalische Störungen zu reduzieren. Siehe beispielsweise Schwartz et al. (PNAS USA 88: 6760, 1991), Roller et al. (Bio/Technology 11: 358, 1993), Koller et al. (Blood 82: 378, 1993) und Palsson et al. (Bio/Technology 11: 368, 1993). Die meisten dieser Perfusionsbioreaktorsysteme sind jedoch modifizierte Flüssigkultursysteme und leiden in ihrer Unfähigkeit, den pluripotenten hämatopoetischen Stammzellpool, Zellen, die zum langzeitigen/permanenten Engraftment und zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems wesentlich sind, zu expandieren, an vielen der gleichen Mängel. Dies schränkt den Nutzen dieser Kultursysteme für Knochenmarkstransplantation und Gentherapie von hämatopoetischen Stammzellen ein.
Daher besteht weiterhin Bedarf an in vitro-Kultursystemen, die zur klinisch brauchbaren Amplifikation von humanen hämatopoetischen CD34⁺-Stammzellen sowie von anderen hämatopoetischen Elementen in der Lage sind. Es wird ein System benötigt, das zur Produktion großer Mengen bestimmter Knochenmarkselemente in der Lage ist, um für ausreichende Mengen dieser Elemente bei der Humantherapie zu sorgen, beispielsweise für Knochenmarkstransplantationen, transfundierbare Blutkomponenten oder zur Gentherapie.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur in vitro-Amplifikation von humanen hämatopoetischen Knochenmarksstammzellen bereitzustellen, das ausreichende Mengen von Stammzellen zur humantherapeutischen Verwendung liefert. Dieses einzigartige Kultursystem gibt dem Fachmann die Möglichkeit, die Vorgänge, die die Stammzellproliferation, die Selbsterneuerung und die Determinierung steuern, in einer Umgebung zu untersuchen, die die in vivo-Situation nachbildet. Diese Technologie zur Expansion hämatopoetischer Stammzellen kann dazu verwendet werden, rasch eine genügende Anzahl von Progenitor- und Postprogenitorzellen zur klinischen Applikation bei Knochenmarkstransplantationen und für die Gentherapie zu erzeugen. Ferner kann die Beeinflussung bestimmter Elemente der Kulturbedingungen (z. B. der eingesetzten Zytokine usw.) zur Determinierung der Linien der Stammzellennachkommen führen, so daß sie zu spezifischen Knochenmarkselementen differenzieren. Die Möglichkeit, Knochenmarksprogenitorzellen zu reifen funktionellen Blutzellen wie Granulozyten oder Thrombozyten zu entwickeln, böte eine leistungsfähige therapeutische Anwendung. Ferner sorgt die Fähigkeit dieses Systems, primitive hämatopoetische Stammzellen rasch und signifikant zu expandieren, für ein attraktives System zur Transduktion/ Transfektion primitiver pluripotenter hämatopoetischer Stammzellen für die Gentherapie.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, um die optimalen Kulturbedingungen, Wachstumsfaktorkombinationen, Fütterungsschemata und Bioreaktorkonfigurationen für eine maximale Proliferation nichtadhärenter Zellen, CD34⁺-Stammzellenexpansion und Aktivität multipotenter Kolonie-bildender Zellen (Colony Forming Cells) (z. B. LT-IC, CFU-BLAST, CFU-MIX und CFU-GM) unter Verwendung von ungetrennten mononukleären Zellen, Lin^–-Zellen und gereinigten CD34⁺-Zellen aus kranken und normalen Knochenmarksaspiraten, peripherem Blut und Nabelschnurblut zu bestimmen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ferner darin, ein Kultursystem bereitzustellen, um primitive hämatopoetische Stammzellen selektiv zu expandieren und das Kurzzeit- und Langzeitpotential dieser mit verschiedenen Stammzellexpansions- und -transfusionsmethoden erzeugten Zellen zur hämatopoetischen Rekonstitution in hämatopoetischen Tiermodellen (Nager und Primaten), die eine strahlungsinduzierte oder chemisch induzierte Myelosuppression nachbilden, zu testen. Insbesondere kann man die Restitutionskinetik von Progenitorzellen des peripheren Bluts, von Knochenmarksvorläuferzellen und von ihren reifen Zellnachkommen testen. Ferner kann das langzeitige in vivo-Repopulationspotential gebildeter Zellen (LT-IC) in Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) und auch durch chirurgische in utero-Implantation dieser Zellen in fetale Schafe getestet werden, wobei der hämatopoetische Besiedelungsgrad in verschiedenen zeitlichen Intervallen der Gestation festgestellt wird.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht ferner darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, um normale hämatopoetische Stammzellen, die von den leukämischen Zellen von Leukämiepatienten vor Chemotherapie und autologer Knochenmarkstransplantation abgetrennt wurden, selektiv zu expandieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das die Proliferation und Expansion hämatopoetischer Stammzellen erlaubt und ihre Transduktion oder Transfektion mit Genkonstrukten bei der Gentherapie und verwandten Methoden zuläßt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Bioreaktor-Zellkultursystem im Großmaßstab für klinische Versuche der Phase I bereitzustellen (Stammzellexpansion und autologe BMT nach Knochenmarksablation). Diese Methode für den Großmaßstab kann durchgeführt werden, um die Morbidität, die Mortalität, die Kosten, den Krankenhausaufenthalt und das mit der Standardtherapie verbundene Patientenmanagement zu reduzieren, aber auch um aggressivere Therapieprotokolle und komprimierte Therapieschemata zu untersuchen, so daß ein größerer Teil der Patienten den Krebs überlebt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das eine bessere Charakterisierung der molekularen Mechanismen und zellulären Wechselwirkungen erlaubt, die bei der Regulierung der Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen und bei der Determinierung der Differenzierung der davon abstammenden Populationen eine Rolle spielen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Kultursystem bereitzustellen, das eine bessere Evaluation der Rolle des direkten Kontakts mit Stromazellen oder mit akzessorischen Zellen und/oder davon abstammenden Faktoren bei der Modulation der Proliferation und Differenzierung verschiedener Untergruppen hämatopoetischer Vorläuferzellen erlaubt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ferner darin, ein Zellkultursystem bereitzustellen, das eine Amplifikation und Isolierung von spezifischen, in ihrer Entwicklung definierten Untergruppen hämatopoetischer Zellen ermöglicht, um eine Analyse und Manipulation genetischer oder anderer molekularer Elemente, die an der Selbsterneuerung und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen beteiligt sind, zu erleichtern.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden teils in der nachfolgenden Beschreibung erläutert und teils sind sie aus der Beschreibung offensichtlich oder ergeben sich bei der Durchführung der Erfindung. Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung lassen sich mittels der in den anhängenden Ansprüchen besonders hervorgehobenen Elemente und Kombinationen erkennen und erreichen.
Zur Lösung der Aufgaben und gemäß dem Zweck der Erfindung, wie sie hier verkörpert und ausführlich beschrieben wird, umfaßt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur in vitro-Amplifikation humaner Knochenmarksstammzellen. Das Verfahren umfaßt die Isolierung von Stammzellen aus humanem Knochenmark; das In-Kontakt-Bringen der isolierten Stammzellen mit Endothelzellen; und das Kultivieren der in Kontakt gebrachten Stamm- und Endothelzellen in Gegenwart wenigstens eines Zytokins in einer Menge, die ausreicht, um die Expansion der Stammzellen zu unterstützen.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ansiedeln von Stammzellen in einem Patienten. Bei diesem Verfahren werden zuerst Stammzellen aus humanem Knochenmark isoliert. Dann werden die Stammzellen mit Endothelzellen in Kontakt gebracht und die Kombination wird in Gegenwart von wenigstens einem Zytokin in einer Menge, die ausreicht, um die Expansion der Stammzellen zu unterstützen, kultiviert. Nach Amplifikation werden die Stammzellen aus der Kultur isoliert und in den Patienten infundiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ansiedeln höher differenzierter hämatopoetischer Zellen in einem Patienten, um die schnelle, kurzfristige Rekonstitution reifer Blutzellen im Blutkreislauf zu ermöglichen. Bei diesem Verfahren werden zuerst CD34⁺-Stammzellen aus humanem Knochenmark isoliert. Dann werden die CD34⁺-Zellen mit Endothelzellen in Kontakt gebracht und die Kombination wird in Gegenwart von wenigstens einem Zytokin in einer Menge, die ausreicht, um die Expansion und Differenzierung der CD34⁺-Zellen zu unterstützen, kultiviert. Nach der Expansion wird die gesamte Population der CD34⁺-Stammzellen sowie der höher differenzierten Zellen in den Patienten infundiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung läßt sich ohne weiteres durch die nachfolgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und die begleitenden Zeichnungen erreichen, wobei gleiche Bezugszeichen in den verschiedenen Figuren gleiche Strukturen oder Elemente bedeuten. Die Darstellungen in jeder der Figuren sind schematisch, ohne den Versuch zu unternehmen, einen tatsächlichen Maßstab oder genaue Verhältnisse anzugeben. Proportionalitätsbeziehungen sind als Näherungen angegeben.
1 zeigt die Effekte optimaler Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF) + Stammzellfaktor (SCF), Interleukin-3 (IL-3) + SCF + Interleukin-6 (IL-6) und GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 auf die Produktion nichtadhärenter Zellen in Flüssigsuspensionskulturen (n = 6), Nonkontaktkulturen von porcinen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (PMVEC) (n = 6) und PMVEC-Kontaktkulturen (n = 12). Jede Säule stellt die durchschnittliche Anzahl der gesamten vitalen nichtadhärenten Zellen ±1 SD dar, die nach 7 Tagen Kultur pro 1 × 10⁵ humanen CD34⁺-Knochenmarkszellen, die anfänglich kultiviert wurden, geerntet wurden. Es sind die Ergebnisse von fünf verschiedenen Versuchen dargestellt.
2 zeigt die Expansion von humanen CD34⁺-Zellen nach 7 Tagen Kultur in PMVEC, die mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelt worden waren.
3 zeigt die Expansion von CD34⁺-Knochenmarkszellen auf Zytokin-behandelten PMVEC-Monolayern. PMVEC-Monolayer wurden mit 5 × 105 gereinigten humanen CD34⁺-Knochenmarkszellen initiiert und 7 Tage in Gegenwart von GM-CSF (2 ng/ml) + IL-3 (100 ng/ml) + IL-6 (10 ng/ml) kultiviert. Nach 7 Tagen Kultur wurden nichtadhärente hämatopoetische Zellen aus den PMVEC-Monolayern geerntet und mit monoklonalen APC-konjugierten anti-CD34- und FITC-konjugierten anti-CD38-Antikörpern gefärbt. (3A) Isotypenkontrolle von Zellen geernteter nichtadhärenter Zellen, die unspezifische FITC- (x-Achse) und APC-Fluoreszenz (y-Achse) zeigen. (3B) Log Fluoreszenzverteilung von CD34⁺-Zellen entlang der y-Achse und von CD38⁺-Zellen entlang der x-Achse von kultivierten nichtadhärenten hämatopoetischen Knochenmarkszellen an Tag 7.
4 zeigt die Anzahl von humanen nichtadhärenten Zellen und von CD34⁺-Zellen im PMVEC-Kultursystem in verschiedenen. Stadien der Kultur.
5 zeigt die Anzahl von humanen Colony Forming Cells (CFC) in den PMVEC-Kulturen in verschiedenen Stadien der Kultur.
6 zeigt die Anzahl von humanen Colony Forming Cells (CFC) in den PMVEC-Kulturen in verschiedenen Stadien der Kultur.
7 zeigt Änderungen in der Anzahl muriner CFU-GM pro Mausfemur. Mäuse wurden einer Bestrahlung von 10,0 Gy ausgesetzt und es wurden ihnen entweder 5 × 10⁴ MNC-Knochenmarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen an Tag ⁷, die mit GM-CSF + IL-3 (∎) behandelt worden waren, verabreicht oder 5 × 10⁴ gepoolte Blastzellen von Blastzellkolonien von Tag 7, die auf PMVEC-Monolayern in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 (•) gezüchtet worden waren. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE von 8 Mäusen aus zwei getrennten Versuchen dar.
8 zeigt Änderungen in der Anzahl muriner CFU-GM pro Mäusemilz. Mäuse wurden einer Bestrahlung von 10,0 ^Gy ausgesetzt und es wurden ihnen entweder 5 × 10⁴ MNC-Knochenmarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen von Tag 7, die mit GM-CSF + IL-3 (∎) behandelt worden waren, verabreicht oder 5 × 10⁴ gepoolte Blastzellkolonien, die in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 auf PMVEC-Monolayern gezüchtet worden waren (•). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE von 8 Mäusen aus zwei getrennten Versuchen dar.
9 zeigt die Restitution von weißen Blutzellen, roten Blutzellen und der Thrombozytenzahlen aus murinem peripherem Blut. Mäuse wurden einer Bestrahlung von 10,0 Gy ausgesetzt und es wurden ihnen entweder 5 × 10⁴ MNC-Knochenniarkszellen aus Flüssigsuspensionskulturen, die mit GM-CSF + IL-3 behandelt worden waren (∎), verabreicht oder 5 × 10⁴ gepoolte Blastzellen von Blastzellkolonien von Tag 7, die in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 auf PMVEC-Monolayern gezüchtet worden waren (•). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE von 8 Mäusen aus zwei getrennten Versuchen dar.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in. vitro-Kultursystem, das die Proliferation und Expansion sowohl von primitiven hämatopoetischen Knochenmarkszellen als auch von Blutstammzellen (CD34⁺ CD38^–) und von Vorläuferzellen für alle hämatopoetischen Zellinien unterstützt. Unter Verwendung von Zytokin-behandelten Endothelzellen wurde ein Kultursystem entwickelt, das die Expansion von primitiven hämatopoetischen Stammzellen unterstützt. In diesem Kultursystem werden isolierte Stammzellen in Kontakt mit Endothelzellen in Gegenwart von Zytokin(en) kultiviert, um die Expansion und Amplifikation der Stammzellen zu fördern.
Die pluripotente hämatopoetischen Stammzelle kann sowohl funktionell als auch phänotypisch definiert werden. Funktionell sind Stammzellen solche hämatopoetischen Zellen, die die Fähigkeit zu längerer Selbsterneuerung sowie die Fähigkeit zur Differenzierung zu allen lymphohämatopoetischen Zellinien besitzen. Pluripotente hämatopoetische Stammzellen, wenn sie sich in der geeigneten Mikroumgebung befinden, können daher die hämatopoetischen und lymphoiden Kompartimente vollständig und dauerhaft rekonstituieren. Stammzellen können auch phänotypisch durch Zelloberflächenmarker identifiziert werden. Es wurden eine Reihe phänotypischer Marker allein und in Kombination beschrieben, um die pluripotente hämatopoetische Stammzelle zu identifizieren. Humane Stammzellen wurden als kleine Zellen charakterisiert, die CD34⁺, CD38^–, HLA-DR^–, Thy1^+/–, CD15^–, Lin^–, c-Kit⁺, 4-Hydroperoxycyclophosphamid-resistent und Rhodamin 123-schwach sind. Äquivalente murine Stammzellen wurden als Lin^–, Sca⁺ und Thy1.1⁺ charakterisiert. Vorzugsweise sind die humanen Stammzellen, die für das vorliegende Kultursystem verwendet werden, CD34⁺ CD38^–.
Die Stammzellen, die bei dem vorliegenden Kulturverfahren verwendet werden, können mit allgemein bekannten Methoden aus Knochenmark, peripherem Blut oder Nabelschnurblut isoliert werden. Da sich das vorliegende Kulturverfahren zur Amplifikation von Stammzellen aus verschiedenen Spezien eignet, können die Stammzellen beispielsweise aus Menschen, nichthumanen Primaten oder Mäusen isoliert sin. Die Stammzellen, die für das vorliegende Verfahren verwendet werden, sind vorzugsweise stark angereichert, d. h. arm an reifen lymphoiden und myeloiden Zellen. Vorzugsweise sind die Stammzellen zu wenigstens 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 95% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 99% angereichert. Verschiedene Methoden, mit denen Stammzellen isoliert und mittels positiver Immunselektion bis auf einen hohen Reinheitsgrad angereichert werden können, wurden von Berenson et al. (Journal of Immunoloaical Methods, 91: 11–19, 1986), Thomas et al. (Prog. Clin. Biol. Res. 377: 537–44, 1992), Okarma et al. (Prog. Clin. Biol. Res. 377: 487–502, 1992) und Kessler (US-Patentanmeldung Seriennr._, eingereicht am_) beschrieben.
In dem vorliegenden Kultursystem werden die angereicherten Stammzellen in direkten Kontakt mit Endothelzellen gebracht. Bevorzugte Endothelzellen sind mikrovaskuläre Hirnendothelzellen, insbesondere porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen (PMVEC). Beispiele für andere Endothelzellen, die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, humane Endothelzellen, mikrovaskuläre Endothelzellen, Hirnendothelzellen, porcine Endothelzellen und verschiedene Typen immortalisierter Endothelzellen.
Um die Expansion zu maximieren ist es wichtig, daß die Stammzellen in Kontakt mit den Endothelzellen stehen. Beispielsweise können die Stammzellen auf einem 70–100%igen semikonfluenten Monolayer aus PMVECs angesät werden. Die in vitro-Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen nimmt innerhalb von 7 Tagen signifikant zu, wenn die Stammzellen direkt auf Endothelzellen kultiviert werden. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die man erhält, wenn Stammzellen mit Endothelzellen in Diffusionskammern kultiviert werden, die Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Endothelzellen verhindern.
Die Verwendung von PMVECs besitzt mehrere Vorteile gegenüber anderen hämatopoetischen Kultursystemen. Beispielsweise sind PMVECs im Vergleich mit Monolayern aus Knochenmarksstromazellen, einer heterogenen Zellpopulation, die Endothelzellen, Fibroblasten, Adipozyten, Makrophagen und Osteoklasten enthält, eine homogene Zellinie. Diese heterogenen primären Monolayer aus Knochenmarksstromazellen wurden üblicherweise bei früheren hämatopoetischen Kultursystemen eingesetzt. Die Analyse der an der Hämatopoese beteiligten Mechanismen ist daher bei dem homogenen PMVEC-Kultursystem sehr viel leichter als bei dem heterogenen Kultursystem mit Knochenmarksstroma. Ferner wächst die PMVEC-Zellinie mit einer Verdoppelungsrate von 48 Stunden rasch, kann bis zu 6 Monate (oder 54 Passagierungen) passagiert werden, besitzt minimale Wachstumsanforderungen und kann leicht unter Kulturbedingungen mit niedrigem Serumgehalt (1% FCS) gehalten werden. Im Gegensatz dazu haben Stromazellen eine limitierte Passagierfähigkeit.
Ferner ist das PMVEC-Zellkultursystem in der Lage, eine signifikante Stammzellexpansion zu unterstützen. Beispielsweise zeigt dieses Kultursystem zwischen den Tagen 7 und 14 einer Kultur eine signifikante Stammzellenexpansion. An Tag 7 wurde eine etwa 10fache Expansion von CD34⁺-Zellen gemessen und eine mehr als 95fache Expansion von CD34⁺-Zellen wurde an Tag 14 der Kultur gemessen. Im Vergleich dazu liefern Flüssigkultur- und Stromazellen-Cokultur-Systeme üblicherweise eine ≤ 3fache Expansion an Tag 7 und der Prozentsatz an CD34⁺-Zellen nimmt bis zu Tag 14 der Kultur rasch ab. Die Fähigkeit des vorliegenden Verfahrens, die Zahl von CD34⁺ CD38^–-Stammzellen, von CFU-GM und von nichtadhärenten Zellen nach 7 Tagen Kultur signifikant zu expandieren, macht das Kultursystem zu einer attraktiven Alternative zu anderen Kurzzeit- und Langzeit-Kultursystemen. Das PMVEC-Zellkultursystem hat ferner den Vorteil, daß es die Proliferation hämatopoetischer Progenitorzellen von Menschen, nicht-humanen Primaten und Mäusen unterstützt. Dies macht es möglich, Hämatopoese sowohl bei Menschen als auch in Tiermodellen zu untersuchen. Ferner können sowohl bestrahlte als auch Formalin-fixierte PMVEC-Monolayer die Expansion hämatopoetischer Progenitorzellen unterstützen.
Die Stammzellen werden in dem vorliegenden Verfahren mit Endothelzellen cokultiviert und mit Zytokinen behandelt. Um die Expansion der Stammzellen zu fördern, werden der Kultur aus CD34⁺-Zellen und Endothelzellen Zytokine zugegeben, die zu den eingesetzten Stammzellenspezien passen. Obwohl die Verwendung wenigstens eines Zytokins für die Expansion von CD34⁺-Zellen erforderlich ist, können auch Kombinationen von Zytokinen eingesetzt werden und sind sogar bevorzugt. Beispiele für geeignete Zytokinkombinationen zur Verwendung bei der Expansion von humanen CD34⁺-Zellen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, GM-CSF allein; GM-CSF + SCF; IL-3 + SCF + IL-6 und GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6. Vorzugsweise wird die Kultur aus Stammzellen und Endothelzellen mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelt. Die Menge von jedem eingesetzten Zytokin und der Kombination ausgewählter Zytokine schwankt abhängig von verschiedenen Variablen, läßt sich aber leicht vom Fachmann feststellen. Beispielsweise können Stammzellen-Endothelzellen mit 0,1–20,0 ng/ml GM-CSF, 1,0–200,0 ng/ml IL-3, 5,0–500,0 ng/ml SCF und/oder 10–100,0 ng/ml IL-6 kultiviert werden. Vorzugsweise werden 2 ng/ml GM-SCF + 10 ng/ml IL-3 + 100 ng/ml SCF + 10 ng/ml IL-6 eingesetzt.
Wenn hochgereinigte Stammzellen kurzzeitig (7 Tage) mit Kombinationen aus entweder GM-CSF + SCF, Il-3 + SCF + IL-6 oder GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 in Flüssigsuspension kultiviert wurden, wurde keine Expansion oder keine Erhaltung der Zahl primitiver Stammzellen beobachtet, obwohl die Gesamtzahl an nichtadhärenten Zellen und von CFC in mit GM-CSF + IL3 + SCF + IL-6 behandelten Kulturen 10,2- bzw. 2,9fach zunahm. Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß Zytokine allein für die in vitro-Expansion von Stammzellen auf endothelialen Monolayern nicht ausreichen und daß Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und PMVECs, andere lösliche Wachstumsfaktoren, membrangebundene Wachstumsfaktoren, Zelladhäsionsmoleküle oder extrazelluläre Matrixproteine, die von Zytokin-aktivierten Endothelzellen produziert werden, eine Rolle spielen können. Ferner kann die von Endothelzellen stammende extrazelluläre Matrix diese Wachstumsfaktoren binden und der Stammzelle diese Moleküle in aktiver Form präsentieren.
Der Mechanismus, über den das vorliegende Kultursystem die Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen unterstützt, ist nicht klar. Es ist jedoch möglich, daß die mit Zytokin behandelten PMVEC ein oder mehr potentielle neue hämatopoetische Wachstumsfaktoren produzieren, die die Expansion primitiver Stammzellen unterstützen. Der Mechanismus, über den die PMVEC-Monolayer die Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen in Reaktion auf eine Kombination exogener Wachstumsfaktoren unterstützen, wird zur Zeit untersucht.
Es wurde gezeigt, daß gereinigte Stammzellen aus humanem Knochenmark zur langzeitigen hämatopoetischen Rekonstitution und zur hämatopoetischen Rekonstitution aller Linien in der Lage sind. Bei Knochenmarkstransplantationen sind determinierte Progenitorzellen, beispielsweise die CFU-GM, zusammen mit pluripotenten Stammzellen erforderlich, damit der Empfänger eine frühe Aplasie übersteht und zur vollständigen hämatopoetischen Rekonstitution gelangt. Ein wichtiger Durchbruch bei der klinischen Knochenmarkstransplantation ist die Anwendbarkeit des vorliegenden Kultursystems auf einen Großbioreaktor unter Verwendung dieses Kultursystems, das die Expansion primitiver hämatopoetischer Stammzellen unterstützt, die Progenitorzellen enthalten, die zur Selbsterneuerung, Differenzierung zu allen Linien und zur langfristigen Hämatopoese in der Lage sind. Insbesondere können innerhalb von 14 Tagen Kultur 1,5 × 10⁷ CFU-GM-Progenitorzellen aus nur 1–2 × 106 CD34⁺-Stammzellen gebildet werden. Dies ist die Zahl der CFU-GM, die für ein Engraftment beim Menschen nach autologer Knochenmarkstransplantation erforderlich ist. Diese Menge von Stammzellen kann in einer Arztpraxis routinemäßig aus einem 15 ml-Knochenmarksaspirat erhalten werden. Die Expansion von Stammzellen in dem vorliegenden Kultursystem reduziert ferner das Volumen des zu erntenden Knochenmarks, senkt die Wahrscheinlichkeit für eine generelle Anästhesie, fördert eine frühe Hämatopoeserestitution, verbessert schwere Zytopenie und begünstigt kürzere Krankenhausaufenthalte und eine höhere Überlebensdauer bei Personal, das myelotoxischen Agenzien und/oder Strahlung ausgesetzt ist. Das vorliegende Kulturverfahren beeinflußt daher nicht nur deutlich und bedeutsam die Therapie von onkologischen Erkrankungen durch Knochenmarkstransplantationen, sondern auch die Behandlung von Syndromen des Knochenmarksversagens und, potentiell, den Einsatz von Gentransfermethoden bei der somatischen Gentherapie.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Ansiedeln von Stammzellen in einem Patienten. Dieses Verfahren beinhaltet die Isolierung von Stammzellen und die Cokultivierung der isolierten Stammzellen mit Endothelzellen in Gegenwart von Zytokinen wie oben ausgeführt. Das Verfahren erfordert ferner die Isolierung der amplifizierten Stammzellen aus der Kultur. (Das vorliegende Verfahren kann auch mit ungetrenntem Knochenmark anstelle von gereinigten CD34⁺-Zellen angewandt werden.)
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Ansiedeln reiferer hämatopoetischer Zellen in einem Patienten zur kurzfristigen hämatopoetischen Unterstützung. Dieses Verfahren beinhaltet die im vorhergehenden Absatz dargelegte Isolierung und Expansion von CD34⁺-Zellen. Dieses Verfahren erfordert keine weitere Isolierung von CD34⁺-Zellen, da die gesamte expandierte Population von CD34⁺-Zellen und von höher differenzierten hämatopoetischen Zellen wie oben ausgeführt in den Patienten infundiert wird. Dies kann mit allgemein bekannten Methoden erfolgen. Schließlich werden die isolierten amplifizierten Zellen mit allgemein bekannten Methoden in den Patienten infundiert.
In dieser Kultur proliferierende CD34⁺-Stammzellen (sowie reifere Elemente) können auch mit Methoden der Geninsertion/Gentherapie manipuliert werden, bevor sie wieder im Patienten angesiedelt werden. Das vorliegende Kultursystem könnte daher die Gentherapie von Stammzellen revolutionieren und eine Heilungsmöglichkeit für beispielsweise Sichelzellanämie bieten.
Die vorliegende Methode kann auch zusammen mit Methoden zur "Knochenmarksreinigung" verwendet werden, um unerwünschte Zellen (z. B. Tumorzellen, T-Lymphozyten) vor Reinfusion in den Patienten zu entfernen. Die Kulturbedingungen können auch so manipuliert werden, daß ein spezifischer Blutzellentyp (wie Thrombozyten oder rote Blutzellen) produziert wird, der in die Patienten reinfundiert/rücktransfundiert werden kann. Beispielsweise ist eine autologe Transfusion sehr nützlich bei Krebspatienten oder in Situationen, wo der Donorpool durch ein infektiöses Agens kontaminiert sein kann.
Die Verwendung dieses Kultursystems im Großmaßstab könnte bei der in vitro-Amplifikation primitiver hämatopoetischer Stammzellen und determinierter Progenitorzellen von Nutzen sein, indem es die Infusion autologer Zellen oder allogener Zellen in Menschen erlaubt, beispielsweise bei medikamenteninduzierter Neutropenie oder nach Knochenmarktransplantationen, sowie bei der Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen. Es könnte möglich sein, das vorliegende Kultursystem in bekannten Bioreaktoren einzusetzen, um große Mengen Stammzellen zu erzeugen.
Nachdem die Erfindung beschrieben wurde, sollen die folgenden Beispiele spezielle Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung veranschaulichen, einschließlich der augenblicklich besten bekannten Ausführungsform der Erfindung. Diese speziellen Beispiele sollen den Umfang der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
CD34⁺-KNOCHENMARKSZELLEN
Humanes Knochenmark aus Wirbelkörpern wurde aus Leichengewonnen. Das zur Gewinnung des Knochenmarks eingesetzte Verfahren wird in der Veröffentlichung No. 90–62 des Naval Medical Research Institute beschrieben (("The Procuring and Processing of Human Cadaveric Bone Marrow", T. R. Faloon), erhältlich vom Defense Technical Information Center, AD# A226 538). Kurz gesagt wurde Mark mittels Sterilverfahren aus der Knochenmatrix erhalten und in sterile Erhaltungsnährmedien gegeben. Mononukleäre Zellen mit niedriger Dichte wurden bei 22°C 30 min bei 400 g über Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten (relative Dichte 1,077 g/ml; Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) abgetrennt. Zellen niedriger Dichte an den Grenzflächen wurden geerntet, zweimal durch Zentrifugation gewaschen (10 min bei 400 g) und in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM, MA Bioproducts, Walkersville, MD), das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 mg/ml L-Glutamin (Gibco, Grand Island, NY) und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY) supplementiert war, resuspendiert. Falls nicht anders angegeben, wird dieses Kulturmedium als komplettes Kulturmedium bezeichnet.
CD34⁺-Knochenmarksprogenitorzellen wurden durch positive immunmagnetische Selektion mit einem für das CD34-Antigen spezifischen monoklonalen Antikörper (K6.1) wie in der oben diskutierten Patentanmeldung von Kessler beschrieben weiter gereinigt. Der monoklonale Antikörper K6.1 wurde durch Fusion von SP-2/0-AG14-Plasmazytomazellen (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) mit Splenozyten aus einer BALB/cByJ-Maus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), die mit vitalen KG-1a-Zellen (ATCC, Rockville, MD) hyperimmunisiert worden war, hergestellt. Injektionen mit 10 bis 20 Millionen mit Kochsalzlösung gewaschenen KG-1a-Zellen erfolgten etwa monatlich über eine Dauer von 6 Monaten; die erste und letzte Immunisierung waren intravenös und die anderen Immunisierungen waren intraperitoneal. Die letzte Injektion erfolgte 3 Tage vor der Fusion. Zellhybridisierung und Selektion in HAT-Medium wurden entsprechend den Methoden von Köhler und Milstein (Nature 256: 495, 1975) mit den Modifikationen von Fazekas de St. Groth und Scheldegger (J. Immunol. Methods 35: 1, 1980) und Lane et al. (J. Immunol. Methods 72: 71, 1984) durchgeführt.
Die etwa 2 Wochen nach der Fusion gesammelten Kulturüberstände wurden durch Immunoblotanalyse ("Western blot") in KG-1a-Zellysaten auf Antikörperaktivität gegen MY-10/CD34-Antigen gescreent. Anfänglich wurden Pools von etwa 10 wachstumspositiven Hybridoma-Vertiefungen gescreent und dann wurden einzelne Vertiefungen antikörperpositiver Pools gescreent. Antikörperpositive Vertiefungen wurden durch limitierende Verdünnung subkloniert (Oi und Herzenberg, in Selected Methods in Cellular Immunology, (1980) Mishell und Shigii, Hrsg., S. 351–72), und Klone wurden in gleicher Weise gescreent.
KG-1a-Zellen wurden mit 1 × 10⁸ Zellen/ml in Laemmli-Probenpuffer (0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8; Nature 227: 680, 1970), der 0,5% Triton X-100 und 2 mM PMSF enthielt, solubilisiert und abzentrifugiert (30.000 × g, 30 min), und die Überstände wurden in Gegenwart von 50 mM DTT, 4% SDS und 10% Glycerin reduziert (60 min, 37°C). Die Elektrophorese erfolgte gemäß der Laemmli-Methode (Nature 227: 680, 1970) mit den Modifikationen von Jones (in Selected Methods in Cellular Immunology, (1980) Mishell und Shigii, Hrsg., S. 398–440) auf 8–16%igen SDS-Polyacrylamid-Porengradientengelen. Die Proteine wurden dann zur Immunoblotanalyse auf Nitrocellulosemembranen überführt (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979, und Burnette, Anal. Biochem. 112: 195, 1981), wobei ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (BioRad Labs, Richmond, CA) mit BCIP/NBT als Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) zum Nachweis verwendet wurde.
Der Hybridoma-Klon K6.1 wurde als Produzent eines monoklonalen Antikörpers des IgG2a-Isotyps identifiziert, bestimmt mit einem ELISA-Kit zum Isotypen-Screening (Zymed Laboratories, 5. San Francisco, CA) an immobilisierten KG-1a-Zellen (Cobbold und waldmann, J. Immunol. Methods 44: 125, 1981). Die Hybridome wurden in Rollerflaschen in IMDM mit fetalem Kälberserum (Hyclone) expandiert. Nach Ernten des Überstands wurde der K6.1-Antikörper durch Hydroxylapatit-Chromatographie (Stanker et al., J. Immunol. Methods 76: 157, 1985) und anschließende pH-Gradientenelution aus Protein A-Sepharose (Ey et al., Immunochemistry 15: 429, 1978) gereinigt. Die Antikörperausbeute betrug 40–45 μg/l Überstand. Dieser wurde auf Ultrafiltrationsmembranen (Amicon YM-10, Danvers, MA) konzentriert und gegen übliche Kochsalzlösung dialysiert. Die Analyse der Antikörperreinheit erfolgte an 30–40 μg reduzierten und nicht-reduzierten Proben durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter Laemmli-Bedingungen mit anschließender Färbung mit Coomassie-Blau.
Zur positiven Immunselektion von CD34⁺-Zellen wurden alle Wasch-, Inkubations- und Selektionsschritte für die Zellen bei 4°C (falls nicht anders angegeben) in 0,2 μm-sterilfiltriertem "Immunselektions-Waschpuffer" durchgeführt. Der Immunselektions-Waschpuffer bestand aus Hanks' physiologischer Salzlösung (Hanks' balanced salt solution) mit 12,5 mM HEPES-Puffer, 1000 Einheiten/ml DNAse I (Calbiochem) und 5% hitzeinaktiviertem gepooltem humanem AS-Serum (#34004-1, Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer, WI). Das Humanserum wurde zuvor ausgiebig (40 Volumenteile × 5 Austausche) gegen PBS dialysiert, um Spuren von Biotin zu entfernen. Dies war als eine Quelle für Human-IgG enthalten, um Fc-Rezeptoren abzusättigen und die zytophile Bindung des zellspezifischen Antikörpers (d. h. K6.1) zu minimieren; für die Zwecke der therapeutischen Immunselektion wurde angenommen, daß Substitute wie dialysiertes Serum des Markspenders oder pharmazeutisch zugelassene Gammaglobuline zur Injektion verwendet würden.
Mononukleäre Knochenmarkszellen wurden gewaschen und auf eine Konzentration von 50 × 10⁶/ml eingestellt. Biotinylierter K6.1-Antikörper wurde durch Mischen von gereinigtem K6.1 mit NaHCO₃ hergestellt, was eine Lösung ergab, die 3 mg Antikörper/ml in 0,1 M NaHCO₃ enthielt. Biotin-N-hydroxysuccinimidester (Calbiochem, La Jolla, CA) wurde in einer Konzentration von 12 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und 5,0 μl hiervon wurden zu jedem ml Antikörperlösung gegeben. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde NH₄HCO₃ bis zu einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Dann wurde die Mischung zum Entsalzen und zum Pufferaustausch durch eine Sephadex PD-10-Säule (Pharmacia) laufen gelassen, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 6,7 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 137 mM NaCl) äquilibriert war. Der biotinylierte K6.1-Antikörper wurde in einem Verhältnis von 6–10 μg/ml Zellsuspension zugegeben und unter gelegentlichem Mischen 30 min bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Zellen durch 3-4malige Zentrifugation gewaschen und auf eine Konzentration von 25 × 10⁶/ml eingestellt.
DYNABEADS M-450 (Dynal Incorporated, Great Neck, NY) wurden mit Ziege-anti-Biotin-Antikörper aktiviert. Die Zahl der eingesetzten DYNABEADS war proportional zur Gesamtzahl mononukleärer Knochenmarkszellen, wobei ein Verhältnis von 1 Kügelchen/10 Zellen verwendet wurde. Anti-Ziege-IgG-DYNABEADS wurden 4-5mal magnetisch mit einem Seltenerden-Magnet gewaschen. Die Kügelchen wurden dann in einer Konzentration von 1 × 10⁸/ml in Waschpuffer suspendiert, der 2,5 μg/ml affinitätsgereinigten Ziege-anti-Maus-Biotin-Antikörper (#SP- 3000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) enthielt, 30 min bei Raumtemperatur kräftig gemischt und dann zweimal magnetisch gewaschen und mit 1 × 10⁸/ml resuspendiert. Diese anti-Biotin-Konzentration wurde bei vorläufigen Titrationsuntersuchungen optimiert, wobei als ein Endpunkt die Kinetik der Zelldissoziation von den magnetischen Kügelchen verwendet wurde. Die Bindung von anti-Ziege-anti-Biotin erreicht unter diesen Bedingungen kein Gleichgewicht; Die Variation des anti-Biotins stellte durch Kontrolle des Ausmaßes der Biotin-anti-Biotin-Vernetzung eine bequeme Möglichkeit zur indirekten Kompensation für unterschiedliche Dichten von Zelloberflächenantigenen dar.
Die mononukleären Knochenmarkszellen, die mit biotinyliertem K6.1-Antikörper beschichtete Targetzellen enthalten, wurden mit den anti-Biotin-DYNABEADS 30 min ^auf einem Roller (etwa 30 rpm) inkubiert. Die magnetischen CD34⁺-Zellen wurden dann durch Anziehung an einen Samarium-Cobalt-Magneten und Entfernung der freien Nicht-Targetzellen in der Suspension selektiert. Diese Zellen wurden durch 4–5 weitere Waschzyklen, bei denen der Magnet entfernt wurde, gereinigt, die Zellen resuspendiert und der Magnet wieder zugegeben, wobei die freien Nicht-Targetzellen in Suspension entfernt wurden. Schließlich wurden die magnetischen CD34⁺-Zellen in Medium (z. B. IMDM) mit 2,5 mg/ml Biotin suspendiert, 1–2 h auf einen Roller gegeben, und freie CD34⁺-Zellen wurden von den magnetisch immobilisierten DYNABEADS zurückgewonnen. Die magnetische Trennung kann mit der magnetischen Trennvorrichtung erfolgen, die in US-Patent Nr. 4,710,472 beschrieben ist, die am 1. Dezember 1987 für Saur, Reynolds und Black erteilt wurde.
Zellen nach diesem Verfahren zeigten bei Analyse mittels Durchflußzytometrie > 99% positive Reaktivität mit einem zweiten CD34-spezifischen monoklonalen Antikörper MY10 (HPCA-2) (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), was anzeigte, daß eine hochgereinigte Population von Zellen, die das CD34-Oberflächenmembranantigen exprimierten, erhalten wurde, die hochangereicherte hämatopoetische Stammzellen, Progenitorzellen und im wesentlichen keine reifen Blutzellen enthielt.
Isolierte CD34⁺-Knochenmarkszellen wurden kryokonserviert (1–5 × 10⁶ Zellen/1 ml-Fläschchen) und bis zum Versuch unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Vor Verwendung wurden die CD34⁺-Zellen mit Standardmethoden aufgetaut.
BEHANDLUNG VON CD34⁺-ZELLEN ZUR KULTIVIERUNG
Kryokonservierte CD34⁺-Zellen wurden rasch bei 37°C aufgetaut, verdünnt in 10 × Volumen vorgewärmtem (37°C) komplettem Kulturmedium. Die aufgetauten CD34⁺-Knochenmarkszellen wurden zweimal in komplettem Kulturmedium gewaschen und mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellvitalität betrug > 99%, wie durch Trypanblau-Ausschluß festgestellt wurde (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, (1992), Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York).
Zu Beginn des Versuchs wurde eine Probe von CD34⁺-Zellen kultiviert, um die Zahl und den Typ der hämatopoetischen Colony Forming Cells (CFC) mit einem Colony Forming-Assay mit Methylcellulose zu bestimmen (Meisenberg et al., Blood 79: 2267, 1992). Kurz gesagt wurden gereinigte CD34⁺-Knochenmarkszellen und nichtadärente hämatopoetische Zellen aus geernteten Kulturen in 35 mm-Lux-Suspensionskulturschalen (Miles Laboratories, Naperville, IL) mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Methode (Meisenberg et al., Blood 79: 2267, 199²) kultiviert. 1 ml Kultur bestand aus 5–500 × 10² Knochenmarkszellen, IMDM-Medium (Quality Biologicals, Rockville, MD), 1% Methylcellulose, 30% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS), 2 U/ml Erythropoietin zur Gewebekultur (Amgen, Thousand Oaks, CA), 2 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN) und 5% konditioniertem Medium von der Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (ATCC, Rockville, MD). Das konditionierte Medium von der Zelllinie 5637 wurde als Quelle für Kolonie-stimulierende Aktivität verwendet. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO₂ in Luft inkubiert. An Tag 14 der Inkubation wurden die Kulturen evaluiert, um die Kolonienzahl zu bestimmen (> 50 Zellen), die sich entwickelt hatten. An Tag 14 wurden Aggregate Hämoglobin-enthaltender Zellen als BFU-E; Aggregate aus Granulozyten und/oder Makrophagen und/oder Megakaryozyten als CFU-MIX; und Aggregate nur mit Granulozyten und Makrophagen als CFU-GM identifiziert.
ENDOTHELZELLENKULTUR UND KULTURBEDINGUNGEN
Porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen (PMVEC) wurden isoliert und wie zuvor beschrieben gezüchtet (Robinson et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990). Die Phänotyp- und Wachstumseigenschaften dieser Zellen wurden bereits ausführlich. charakterisiert (Robinson et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990 und Robinson et al., Blood 77: 294–305, 1991).
Kurz gesagt wurden PMVECs aus Hirn von 4 bis 6 Monate alten Yucatan-Minipigs isoliert. Die Hirne wurden steril zusammengegeben, 2 min in 10%iges Povidon-Iod (Sherwood Pharmaceutical Co., Rahway, NJ) getaucht und 5–6 mal mit Hank's physiologischer Salzlösung (HBSS) (Gibco, Grand Island, NY) gewaschen, um restliches Iod zu entfernen. Graues Gehirnmaterial der Cortices wurde durch eine Pasteurpipette aufgesaugt, 10 min bei 500 g zentrifugiert (Raumtemperatur), in HBSS resuspendiert und in einem 40 ml-Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde zentrifugiert, resuspendiert und anschließend durch steriles Nylongewebe mit 149, 76 und 20 μm Maschenweite gesiebt. Die zurückgehaltenen Mikrogefäße wurden in 6 ml HBSS resuspendiert und durch diskontinuierliche Ficoll-Paque-Gradienten (33%–67% und 67%–75%) (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) zentrifugiert. Die pelletierten Mikrogefäße wurden in 2 ml HBSS resuspendiert und es wurden 2 ml Kollagenase (1 mg/ml) (Worthington Biomedical, Freehold, NJ) zugegeben. Nach 2 Minuten wurden die Mikrogefäße mit HBSS gewaschen und in M199-Medium (Quality Biological Inc., Gaithersburg, MD), das mit 10% fetalem Kälberserum, 500 μg/ml Natriumheparin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) und 2–10 μl/ml Wachstumsfaktor aus Retina (siehe Robinson et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 169–180, 1990) supplementiert war, in mit Fibronektin (Pierce Chemical, Rockport, IL) beschichtete 16 mm-Vertiefungen plattiert. Die Kulturen wurden dann bei 37°C in Luft mit 5% CO₂ gezüchtet. Nach 7 Tagen wurden die Zellen subkultiviert und subkloniert. Nach Subklonierung wurden die PMVEC-Zellinien in IMDM, das mit 10% fetalem Kälberserum, 100 mg/ml L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin supplementiert war (komplettes Kulturmedium) wachsen gelassen.
PMVECs wurden zweimal wöchentlich mit komplettem Medium gefüttert. Sobald sie konfluent waren, wurden die PMVEC-Monolayer mit PBS gewaschen, trypsiniert (0,25 m Trypsin/ml, 5 mM EDTA, 37°C, 10 Minuten, Sigma, St. Louis, MO) und entweder in einem Verhältnis von 1 : 5 in 75 cm²-Kolben oder mit einer Zellkonzentration von 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in gelatinebeschichteten 6-Loch-Gewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA), die 3 ml komplettes Kulturmedium enthielten, das mit zusätzlichen 10% FCS supplementiert war, subkultiviert. Nach 48–72 h wurden die adhärenten PMVEC-Monolayer (70–80% konfluent) zweimal mit komplettem Kulturmedium gewaschen, um nichtadhärente PMVECs zu entfernen, und das Kulturmedium wurde durch 5 ml komplettes Zellkulturmedium ersetzt.
ZYTOCHEMISCHE FÄRBUNG
Zur morphologischen Analyse von Zellpopulationen wurden 10⁵ Zellen in 0,1 ml Medium 7 min bei 500 rpm mit einer Cytospin-2-Zentrifuge (Shandon Instruments, Sewickley, PA) auf Mikroskop-Objektträger zentrifugiert. Luftgetrocknete Zellpräparate wurden in absolutem Methanol fixiert und durch Wright-Giemsa-Färbung gefärbt. Morphologische Differentialzellzählungen wurden durch Ölimmersions-Mikroskopie erhalten. Es wurden wenigstens 200 Zellen pro Objektträger untersucht.
STATISTISCHE ANALYSE
Das Signifikanzkriterium (P < 0,05) wurde mit dem Student's t-Test bestimmt.
PROLIFERATION VON CD34⁺-KNOCHENMARKSZELLEN IN KULTUR
Um die Fähigkeit von Flüssigsuspensionskulturen, PMVEC-Nonkontakt-Monolayerkulturen und PMVEC-Monolayer-Kontaktkulturen zu vergleichen, das Wachstum von CD34⁺-Knochenmarkszellen zu unterstützen, wurden gereinigte CD34⁺-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) (> 99,5% positiv) in jede Vertiefung (5 ml Endvolumen) von 6-Loch-Gewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA) gegeben, die kein PMVEC-Monolayer (Flüssigkulturen), konfluente PMVEC-Monolayer (Kontaktkulturen) enthielten, sowie in die obere Kammer eines kollagenbehandelten Transwell-Einsatzes (0,4 um Porengröße, Costar, Cambridge, MA), der über PMVEC-Monolayern plaziert war (Nonkontaktkulturen).
Die Kulturen wurden mit optimalen Dosen an GM-CSF, GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 und GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelt. Insbesondere wurden die Zytokine in den folgenden Konzentrationen eingesetzt: 2 ng/ml GM-CSF; 10 ng/ml IL-3; 100 ng/ml SCF; und 10 ng/ml IL-6. Alle Kulturen wurden bei 37°C in einer Feuchatmosphäre mit 5% CO₂ in Luft gehalten. Rekombinante humane Wachstumsfaktoren (gekauft von R&D Systems, Minneapolis, MN), die zur Stimulierung der Koloniebildung verwendet wurden, umfaßten IL-3, GM-CSF, IL-6 und SCF.
Nach mehreren Tagen Kultivierung wurden nichtadärente Zellen schonend von den Endothelzell-Monolayern entfernt, zweimal mit komplettem Kulturmedium gewaschen, und es wurden manuelle Hämazytometer-Zellzählungen mittels Trypanblau-Ausschluß durchgeführt. 1 zeigt die Anzahl nichtadhärenter Zellen, die pro Kulturbedingung nach 7 Tagen Inkubation geerntet wurden. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert der nichtadhärenten Zellen + 1 SD, die für jeweils vier Kulturansätze in sechs Versuchen ausgezählt wurden. Wie man sieht war die Zunahme geernteter nichtadhärenter Zellen für jede spezielle Zytokinkombination in den Kulturen am größten, in denen CD34⁺-Stammzellen in Kontakt mit dem PMVEC-Monolayer gezüchtet wurden, lag in der Transwell/Nonkontaktkultur im mittleren Bereich und war in den Flüssigkulturen am geringsten.
Verglichen mit CD34⁺-Knochenmarkszellen, die in Flüssigkultur gezüchtet wurden, war die Anzahl geernteter nichtadärenter Zellen insbesondere bei in Kontakt mit PMVEC gezüchteten und mit GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 oder IL-3 + GM-CSF + SCF + IL-6 stimulierten Kulturen signifikant höher (2,3–4,0 fach). Ferner war die Kombination aus GM-CSF + SCF + IL-6 bei jeder Kulturbedingung besser als die aus GM-CSF + SCF oder IL-3 + SCF + IL-6. Es gab eine 10,9-, 18,9- und 39,6 fache Zunahme der Anzahl nichtadhärenter Knochenmarkszellen, die aus mit GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 bzw. GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 stimulierten Kontakt-PMVECs geerntet wurden. Der am wenigsten wirksame Stimulus war die Kombination aus GM-CSF + SCF, während der wirksamste Stimulus die Kombination aus GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 war. Die Zugabe von IL-3 + IL-6 erhöhte die Anzahl nichtadhärenter Zellen 3,6 fach. Keine der Zytokinkombinationen schien eine Wirkung auf die Entwicklungsgeschwindigkeit der morphologischen Organisation der adhärenten PMVEC-Monolayer zu haben.
IMMUNOPHÄNOTYP VON KULTIVIERTEN KNOCHENMARKSZELLEN
Die Wirkungen verschiedener Zytokinkombinationen und Kulturbedingungen auf die Proliferation und Reifung von hämatopoetischen CD34⁺-Knochenmarkszellen nach 7 Tagen Kultur wurde durch Messung der Expression von CD34- und CD38-Zelloberflächenantigenen bestimmt. Die Ergebnisse für 7 Tage lang kultivierte Zellen sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
Simultane zytometrische Zweifarbenanalyse kultivierter nichtadhärenter Zellen wurde an Tag 7 der Kultur durchgeführt. Kurz gesagt wurden nichtadhärente, aus Flüssigkulturen, Endothelzellen-Kontaktkulturen und Nonkontakt-Endothelkulturen (oberes Kompartiment der Transwell-Kammer) entnommene Zellen geerntet, zweimal in komplettem Kulturmedium gewaschen und in PBS, das mit 2% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid supplementiert war (Färbemedium), resuspendiert. Nichtadhärente Zellen wurden zuerst 30 min mit Sättigungskonzentrationen von anti-CD34-Antikörper (K6.1 MAb) inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit Färbemedium wurden die Zellen weitere 30 min mit biotinyliertem Ziege-anti-Maus-IgG1 inkubiert. Nach einer zweiten Serie mit zwei Waschschritten mit Färbemedium wurden FITC-konjugierter CD38 und APC-Streptavidin zusammen zugegeben und weitere 30 min inkubiert. Schließlich wurden die Zellen zweimal mit Färbemedium gewaschen und mit 1% Paraformaldehyd fixiert. Jeder Inkubationsschritt wurde im Dunkeln bei 4°C durchgeführt und Zellen, die mit den passenden konjugierten Isotyp-Antikörpern gefärbt waren, wurden als Kontrollen verwendet. Wenigstens 10.000 Events wurden im Listmode auf einem Coulter Elite-Durchflußzytometer (Coulter, Hialeah, FL) gesammelt.
Weder unstimulierte noch Zytokin-behandelte PMVECs färbten positiv auf anti-Human-CD34- und -CD38-Oberflächenantigene. Wie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt, nahm die Zahl der CD34⁺-Knochenmarkszellen in PMVEC-Kontakt-Zellkulturen in Gegenwart von GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + Il-6 bzw. GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 1,5-, 1,9- und 7,6 fach zu. Außerdem waren 68–78% dieser geernteten CD34⁺-Zellen auch negativ für das CD38-Antigen. (Siehe 2 und 3).
Im Gegensatz zu den mit PMVEC-Kontaktkulturen erhaltenen Ergebnissen wurde bei PMVEC-Nonkontaktkulturen ein geringerer Expansionsgrad von CD34⁺-Knochenmarksstammzellen gemessen, wobei mehr als 67% dieser Zellen den CD34⁺ CD38⁺-Phänotyp exprimierten.
In der Flüssigsuspensionskultur wurden die eingesetzte Menge der CD34⁺-Knochenmarkszellen nur bei Zytokinbehandlung mit GM-CSF + IL-3. + SCF + IL-6 (1,2 fache Zunahme) erhalten, jedoch exprimierten mehr als 85% dieser Zellen das hämatopoetische CD38-Differenzierungsantigen.
Tabelle 1
POTENTIAL ZUR HÄMATOPOETISCHEN KOLONIEBILDUNG VON NICHTADHÄRENTEN, AN TAG 7 AUS KULTUREN GEERNTETEN ZELLEN
Das Wachstum hämatopoetischer Progenitorzellen aus nichtadhärenten Zellen von Tag 7, die aus Zytokin-behandelten Flüssigsuspensionskulturen, PMVEC-Nonkontakt-Monolayerkulturen und PMVEC-Monolayer-Kontaktkulturen geerntet worden waren, wurde ebenfalls untersucht. Die Daten in der nachfolgenden Tabelle 2 zeigen die Gesamtzahl der pro Kulturbehandlung wiedergewonnenen CFC, CFU-GM, CFU-MIX, CFU-BLAST, CFU-MK und BFU-E. Die Kulturen wurden mit 5 × 10⁵ CD34⁺-Zellen, die 5,5 × 10⁴ CFU-GM, 2,8 × 10⁴ CFU-MIX, 1,1 × 10⁴ BFU-E, 1,8 × 10⁴ CFU-BLAST und 2,2 × 10⁴ CFU-MK enthielten, initiiert. Die Gesamtzahl an Colony Forming Cells (CFC), die sich nach 7 Tagen in Flüssigsuspensionskultur gebildet hatten, nahm in mit GM-CSF + SCF behandelten Kulturen 25% ab, in mit IL-3 + SCF + IL-6 behandelten Kulturen um das 1,5 fache zu und in Gegenwart von GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 um das 32 fache zu. Im Gegensatz dazu expandierte der gesamte klonogene Zellgehalt in PMVEC Nonkontaktkul turen 3,3– , 4,4- und 8,9 fach und in mit GM-CSF + SCF, IL-3 + SCF + IL-6 bzw. GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelten PMVEC-Kontaktkulturen 10,5-, 20,3- und 37,4 fach. Eine maximale Zunahme von nichtadhärenten Zellen insgesamt (42,0 fach), CFU-GM (33,3 fach), CFU-MIX (31,0 fach), BFU-E (50,2 fach), CFU-BLAST (33,6 fach) und CFU-MK (9,2 fach) wurden in mit GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 behandelten PMVEC-Kontaktkulturen erhalten, was die Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontakts zeigt.
Beispiel 2
LANGZEIT-WACHSTUMSPOTENTIAL VON HÄMATOPOETISCHEN CD34⁺KNOCHENMARKSPROGENITORZELLEN AUF ZYTOKINBEHANDELTEN PMVEC-MONOLAYERN
Gereinigte humane CD34⁺-Knochenrnarkszellen (5 × 10⁵ Zellen/Kolben wurden in 75 cm2-Kolben inokuliert, die konfluente PMVEC-Monolayer und 15 ml komplettes Kulturmedium, das mit GM-CSF (2 ng/ml), IL-3 (10 ng/ml), SCF (100 ng/ml) und IL-6 (10 ng/ml) supplementiert war, enthielten. Alle Kulturen wurden bei 37°C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO₂ in Luft gehalten. Nach 7 Tagen und anschließend in wöchentlichen Abständen wurden alle nichtadhärenten Zellen entnommen und gezählt (siehe 4), und 2 × 10⁶ nichtadhärente Zellen wurden erneut auf frischen PMVEC-Monolayerkulturen angesät, die frisches, mit Wachstumsfaktoren supplementiertes Medium enthielten. Nichtadhärente Zellen wurden auf CD34- und CD38-Zelloberflächenantigene immunphänotypisiert und in Methy^lcellulose untersucht, um ihren Gehalt an klonogenen Zellen zu bestimmen (siehe 4, 5 und 6).
Die Wirkung optimaler Konzentrationen von GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 auf das Wachstum von hämatopoetischen Progenitorzellen in Langzeitkultur wird in den 4, 5 und 6 gezeigt. Bei allen Probenahmeintervallen war die Zellvitalität geernteter nichtadhärenter Zellen, bestimmt durch Trypenblau-Ausschluß, > 95%. Die Anzahl von nichtadhärenten Zellen und von CFC-Progenitorzellen nahm während der 35 tägigen Kulturdauer dramatisch zu. Die Produktion nichtadhärenter Zellen erreichte an Tag 35 mit mehr als einer berechneten 531 × 10⁵fachen Zunahme der Zellzahl ihren Höhepunkt.
Außerdem wurde an Tag 28 in der Kultur eine 4510-, 5677-, 5177-, 2607-, 2407- und 4150 fache Zunahme der Gesamtzahl klonogener Zellen, CFU-GM, CFU-MIX, CFU-BLAST, BFU-E und CFU-MK, gefunden. Obwohl der Prozentsatz an Zellen in der Kultur, die das CD34⁺-Oberflächenantigen exprimierten, an den Tagen 7, 14, 21 und 28 auf 26,6%, 13,0, 33% bzw. 1,7% abnahm, nahm die berechnete absolute Zahl von CD34⁺-Zellen, die in diesem Kultursystem gebildet wurden, über den gleichen Zeitraum 10,0-, 105-, 498- und 2854 fach zu. An Tag 35 waren < 1% CD34⁺-Zellen vorhanden, was mit einer signifikanten Abnahme der Zahl nachweisbarer CFU-MIX, CFU-MK, CFU-BLAST und BFU-E korrelierte; im Vergleich mit den Werten an Tag 28 wurden jedoch keine signifikanten Änderungen bei der Zahl der CFU-GM beobachtet. Darüber hinaus nahm die Inzidenz von Zellen, die entweder das CD15- oder das CD11b-Oberflächenantigen exprimierten, unter Verlust der CD34-Antigenexpression rasch zu, wobei an den Tagen 14, 21, 28 bzw. 35 der Kultur 14,8%, 42,4%, 43,4% und 64,9 der Zellen CD15⁺ und 44%, 43%, 59% und 66% der Zellen CD11b⁺ waren. Das immunphänotypisch beobachtete myeloide Differenzierungsmuster wurde durch zytologische Analyse der geernteten Zellenin verschiedenene Zeitabständen bestätigt.
Beispiel 3
MURINE TRANSPLANTATION
Mäuseweibchen (C57BL/6) wurden von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine erworben und es wurden 5 bis 10 Mäuse pro Käfig gehalten. Die Tiere wurden bei einem 12 stündigen hell/dunkel-Zyklus gehalten und erhielten Futter (Wayne Roden Blox) und Wasser ad libitum. Es wurden 12–14 Wochen alte Mäuse für diese Untersuchungen verwendet. Die Untersuchungen wurden entsprechend den im "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" aufgestellten Prinzipien durchgeführt, die vom Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, entwickelt wurden.
KULTURBEDINGUNGEN FÜR ENDOTHELZELLEN
Porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen (PMEVC) wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Zellen aktiv wachsender Monolayer (Passagierungen 8–21) wurden mit einer Zellkonzentration von 3 × 104 Zellen/Vertiefung in gelatinebeschichtete 24-Loch-Gewebekulturplatten mit QBSF-56-Medium (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) plattiert, das mit 20% FBS (Hyclone, Ogden, UT) supplementiert war. Nach 24–48 h wurde das Kulturmedium durch ein definiertes Medium mit niedrigem Serumgehalt ersetzt, das aus QBSF-56 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) bestand, das mit 1% hitzeinaktiviertem FBS, 100 μg/ml L-Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin supplementiert war.
IN VITRO-EXPANSION VON KNOCHENMARKSZELLEN
Mittels Ficoll-Hypaque abgetrennte mononukleäre Knochenmarkszellen aus Mäusefemora (5 × 10³/Vertiefung) wurden mit rekombinantem murinem GM-CSF (5 ng/ml) und IL-3 (5 ng/ml) in jede der Vertiefung einer 24-Loch-Kulturplatte gegeben (Endvolumen 2 ml/Vertiefung) und bei 37°C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO₂ in Luft inkubiert. Nach 7 Tagen Inkubation wurden gepoolte Zellen aus Blast-Kolonien mit Kulturmedium unter Zuhilfenahme einer sterilen 5 ml-Pipette vom endothelialen Monolayer abgelöst. Die Blastzellen wurden durch Zentrifugation konzentriert und in einer PBS-Lösung, die mit 1% FCS und 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin supplementiert war, resuspendiert.
ZELLSUSPENSIONEN
Die Mäuse wurden durch Genickluxation getötet und Femora und Milz wurden entnommen. Die Zellen wurden aus den Femora mit 5 ml PBS, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (Hyclone, Logan, UT) enthielt, ausgespült und durch eine 25 Gauge-Nadel dispergiert, bis eine Suspension aus Einzelzellen erhalten wurde. Milz wurden durch Edelstahlmaschensiebe gepreßt und die Zellen wurden mit 5 ml Medium von den Sieben abgewaschen. Zellkonzentrationen und Zellvitalität wurden mittels Trypanblau-Ausschluß durch manuelle Zählung mit einem Hämatozytometer bestimmt.
ZÄHLUNG PERIPHERER BLUTZELLEN
Peripheres Blut wurde aus Metaphan-anästhesierten Mäusen durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen erhalten, die mit 22 Gauge-Nadeln versehen waren. Weiße Blutzellen, rote Blutzellen und Thrombozyten wurden mit einem Baker Hematology 9000 Series Cell Counter System (Baker, Allentown, PA) ausgezählt. Ferner wurden Blutausstriche präpariert und mit Diff-Quick (Bayer Healthcare Corp, McGaw Park, IL) gefärbt. Ein morphologisches WBC-Differentialblutbild wurde mittels Ölimmersionsmikroskopie erhalten. Es wurden wenigstens 20 Zellen pro Objektträger analysiert.
ASSAY AUF GRANULOZYTEN-MAKROPHAGEN-KOLONIE-BILDENDE ZELLEN (GM-CFC)
CFU-GM aus Knochenmark und Milz wurden in 35 mm-Luxschalen (Miles Laboratory, Naperville, IL) mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Methode analysiert (Meisenberg et al., Blood 79: 2267, 1992). 1 ml Kultur bestand aus 5–50 × 10⁴ Zellen, Iscove's MEM (GIBCO, Grand Island NY), 1% Methylcellulose, 30% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS), 5 ng/ml rmGM-CSF und 5 ng/ml rmIL-3 (Genzyme, Boston MA). Kulturen wurden bei 37°C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO₂ in Luft inkubiert. An Tag 14 der Inkubation wurde die Zahl der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden Zellen (CFU-GM) in situ bestimmt.
STATISTISCHE ANALYSE
Zum Test der statistischen Differenz wurde der zweiseitige ("two-tailed") Student's t-Test verwendet. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 gesetzt.
ÜBERLEBEN VON MÄUSEN, DENEN ZELLEN AUS BLASTKOLONIEN TRANSPLANTIERT WURDEN, DIE AUF ENDOTHELZELLEN IN GEGENWART VON GM-CSF GEZÜCHTET WORDEN WAREN
Mäuse wurden zweiseitiger Gammastrahlung mit einer Dosisleistung von 1,0 Gy/min aus einer Cäsium-137-Strahlungsquelle ausgesetzt und am folgenden Tag über die Schwanzvene entweder mit Kochsalzlösung, 5 × 10⁴ nichtadhärenten Zellen aus mit GM-CSF + IL-3 behandelten Flüssigsuspensionskulturen oder mit 5 × 10⁴ gepoolten Blastzellen aus Blastzellkolonien von Tag 7, die auf mit GM-CSF behandelten endothelialen Monolayern gezüchtet worden waren, infundiert. Mäuse, die eine Gesamtstrahlungsdosis von 10,0 Gy und entweder Kochsalzlösung (Kontrolle) oder 5 × 10⁴ nichtadhärente Zellen aus Flüssigsuspensionskulturen mit GM-CSF + IL-3 von Tag 7 erhielten, starben nach durchschnittlich 14 ± 3 Tagen.
Peripheres Blut wurde aus Metaphan-anästhesierten Mäusen durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen erhalten, die mit 22 Gauge-Nadeln versehen waren. Weiße Blutzellen, rote Blutzellen und Thrombozyten wurden mit einem Baker Hematology 9000 Series Cell Counter System (Baker, Allentown, PA) ausgezählt. Ferner wurden Blutausstriche präpariert und mit Diff-Quick (Bayer Healthcare Corp, McGaw Park, IL) gefärbt. Ein morphologisches WBC-Differentialblutbild wurde mittels Ölimmersionsmikroskopie erhalten. Es wurden wenigstens 200 Zellen pro Objektträger analysiert. Die Zahl der weißen Blutzellen (WBC) und der Thrombozyten erreichte 4 Tage nach Bestrahlung einen Tiefpunkt und erholte sich vor dem Tod der Tiere nicht mehr. Letal bestrahlte Mäuse, die Knochenmarkstransplantate von 5 × 10⁴ gepoolten Blastzellen aus Kolonien von Tag 7 erhielten, die auf endothelialen Monolayern in Gegenwart von GM-CSF + Il-3 gezüchtet worden waren, überlebten alle > 60 Tage nach Transplantation.
HÄMATOPOETISCHE RESTITUTION IM KNOCHENMARK UND IN DER MILZ
Die Gesamtzahl an GM-CFC pro Femur und Milz wurde an den Tagen 0, 4, 8, 12, 15, 19, 24, 28 und 60 nach letaler Strahlungsexposition von 10,0 Gy und Knochenmarkstransplantation analysiert (7 und 8). Gepoolte Blastzellen, die aus mit GM-CSF + IL-3 behandelten PMVEC-Monolayern geerntet worden waren, induzierten Hämatopoese in alle Linien ("Multilineage Hematopoiesis"), wie sich in Änderungen des Anteils der Milz- und Knochenmarks-Stamm- und -Progenitorzellen zeigte. Die Zellularität im Knochenmark von transplantierten Mäusen war 24 h nach Bestrahlung auf 5,6 × 10⁵ Zellen pro Femur (etwa 10% der normalen Knochenmarkszellularität) reduziert. Die geringsten GM-CFC-Zahlen in der Milz wurden an Tag 4 nach Bestrahlung beobachtet; die Milzrestitution erfolgte etwa 2-Wochen nach Transplantation, wobei die Zahl der Progenitorzellen die Werte für den Kontrolltag 0 vor der Normalisierung übertrafen. Knochenmarksstammzellen und Progenitorzellen nahmen vier Tage nach Transplantation ab und nahmen von Tag 12 an allmählich zu. Sie erholten sich jedoch bis zu Tag 60 nach Transplantation auf ein normales Niveau.
HÄMATOPOETISCHE RESTITUTION IN PERIPHEREM BLUT
Die erhöhte Progenitorzellaktivität auf der Ebene der Knochenmarks- und Milzstammzellen sowie der Progenitorzellen beeinflußte den Spiegel an reifen Blutzellen grundlegend, wie sich an einem beschleunigten Wiederauftreten reifer weißer Blutzellen (WBC), roter Blutzellen (RBC) und Thrombozyten (PLT) (9) in peripherem Blut zeigte. Tieren, denen 5 × 10⁴ gepoolte Blastzellen transplantiert worden waren, begannen ihre Gesamtzahl weißer Blutzellen, Neutrophiler und Thrombozyten zwischen 12 und 15 Tagen nach Transplantation zu restituieren.
Die in vitro-Expansion von Knochenmarksstammzellen und Progenitorzellen auf mit GM-CSF + IL-3 behandelten PMVEC-Monolayern erhöhte die Zahl an Granulozyten-, Megakaryozyten- und Erythroidvorläufern sowie die Stammzellen im Femur und der Milz und beschleunigte daher die Restitution peripherer Blutleukozyten, Neutrophiler, Thrombozyten und Erythrozyten in letal bestrahlten Wirtsmäusen.

Claims

Verfahren zur in vitro-Amplifikation von humanen Knochenmarks-Stamm- und -Progenitorzellen mit Ausnahme von humanen Embryozellen, umfassend die Stufen: (i) In-Kontakt-Bringen der isolierten Stamm- und Progenitorzellen mit Endothelzellen und (ii) Kultivieren der in Kontakt gebrachten Stamm- und Progenitorzellen in Gegenwart mindestens eines Zytokins in einer Menge, die ausreicht, um eine Amplifikation der Stamm- und Progenitorzellen zu unterstützen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stamm- und Progenitorzellen mit einer semikonfluenten Einzelschicht aus Endothelzellen in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Endothelzellen Hirnendothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Endothelzellen mikrovaskuläre Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Endothelzellen porcine Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Hirnendothelzellen mikrovaskuläre Hirnendothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Endothelzellen porcine mikrovaskuläre Hirnendothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Zytokin aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) + Stammzellfaktor (SCF); Interleukin-3 (IL-3) + SCF + Interleukin-6 (IL-6); und GM-CSF + IL3 + SCF + IL-6.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine Zytokin GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Zytokin GM-SCF ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Knochenmarks-Stamm- und -Progenitorzellen aus CD34⁺- und CD38^–-Stamm- und -Progenitorzellen ausgewählt sind.
Verfahren zur in vitro-Amplifikation von humanen CD34⁺-Knochenmarks-Stamm- und -Progenitorzellen mit Ausnahme von humanen Embryozellen, umfassend die Stufen: (i) In-Kontakt-Bringen der isolierten Stammzellen mit porcinen mikrovaskulären Hirnendothelzellen und (ii) Kultivieren der in Kontakt gebrachten Stammzellen und Endothelzellen in Gegenwart mindestens eines Zytokins in einer Menge, die ausreicht, um die Amplifikation der Stamm- und Progenitorzellen zu unterstützen.
Verfahren zur in vitro-Amplifikation von humanen peripheren Blut- oder Nabelschnurblut-Stamm- und -Progenitorzellen mit Ausnahme von humanen Embryozellen, umfassend die Stufen: (i) In-Kontakt-Bringen der isolierten Stamm- und Progenitorzellen mit Endothelzellen und (ii) Kultivieren der in Kontakt gebrachten Stamm- und Progenitorzellen und Endothelzellen in Gegenwart mindestens eines Zytokins in einer Menge, die ausreicht; um eine Amplifikation der Stamm- und Progenitorzellen zu unterstützen, wobei das mindestens eine Zytokin aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) + Stammzellfaktor (SCF); Interleukin-3 (IL-3 + SCF + Interleukin-6 (IL-6); und GM-CSF + IL-3 + SCF + IL-6.