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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Produkte zur Manipulation von interzellulären und
zwischengeweblichen Wechselwirkungen. Die gegenwärtige Erfindung stellt Produkte
für die
Inhibierung einer Zelladhäsion
an extrazelluläre
Matrixkomponenten oder für
die Bildung eine funktionellen Basallamina und für die Beeinflussung der Ergebnisse
solcher Anlagerungen bereit. So betrifft die gegenwärtige Erfindung
die Modifikation- von zellulären
Wechselwirkungen mit extrazellulären
Komponenten und Verfahren zur Erhaltung eines Zellphänotyps, einer
Zellentwicklungsstufe und einer Zellplastizität in vivo und in vitro.
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Beschreibung des Standes
der Technik
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Die
Basalmembran (Basallamina) ist eine plattenartige, extrazelluläre Matrix,
die eine Grundkomponente aller Gewebe darstellt. Die Basallamina
sorgt für
die Kompartimentierung der Gewebe und wirkt als Filter für Substanzen,
die zwischen Gewebekompartimenten wandern. Üblicherweise liegt die Basallamina
eng assoziiert mit einem Epithel oder Endothel in allen Geweben
eines Tieres vor, einschließlich
Blutgefäße und Kapillaren.
Die Basallaminakomponenten werden durch Zellen sekretiert und selbstassemblieren
dann, um ein kompliziertes extrazelluläres Netzwerk zu bilden. Die
Bildung einer biologisch aktiven Basallamina ist für die Entwicklung
und Differenzierung von assoziierten Zellen wichtig.
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Die
Cnidarian, Hydra ist ein vereinfachter Vielzeller, dessen Körperwand
aus einem epithelialen Bilayer mit einer intervenierenden extrazellulären Matrix
(ECM), bezeichnet als Mesoglea, besteht. Es wurde gezeigt, dass
die Hydramesoglea eine Anzahl von Komponenten aufweist, die in der
ECM oder den Basalmembranen von höheren Invertebraten oder Vertrebraten vorgefunden
wurden, wobei diese beinhalten: Fibronectin, Typ IV Collagen, Laminin
und Haparansulfatproteoglycan. Die Hydra-Zellaggregation schließt die komplette
Morphogenese von erwachsenen Hydra aus Pellets von dissoziierten
Hydrazellen mit ein. Während
diesem Entwicklungsprozess scheiden sich die Zellen in einen epithelialen
Bilayer ab und sondern dann vor der Fortsetzung der Morphogenese
eine neue extrazelluläre
Matrix ab.
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Extrazelluläre Matrixkomponenten
(ECM-Komponenten) spielen eine kritische Rolle in der Entwicklung
durch Einwirkungen auf solche Zellprozesse, wie Zellteilung, Zellanlagerung,
Zellmigration und Zelldifferenzierung (Übersichtsartikel durch Timpl
et al., 1989, Int. Rev. Exp. Pathol. 29:1–112; Damsky und Bernfield, 1991,
Current Opn. in Cell Bio. 3:777–778;
Hynes, 1992, Cell 69:11–25).
Es wurde gezeigt, dass ECM/Zell-Wechselwirkungen von einer Vielzahl
von Vertebraten- und Invertebraten-Spezies verwendet werden, was
solche primitiven Organismen, wie Cnidarian, Hydra, umfasst. Hydra
ist in dieser Hinsicht besonders interessant, da sie eine der ersten
Tierphyla darstellt, die definierte Gewebeschichten entwickelt,
die durch eine azelluläre,
extrazelluläre
Matrix getrennt sind (Field et al., 1988, Science 239:748–752). Vorhergehende Studien
haben gezeigt, dass Hydra ECM, bezeichnet als Mesoglea, Typ IV Collagen,
Laminin, Fibronectin und Heparansulfatproteoglycane enthält (Sarras
et al., 1991a, Dev. Biol. 148:481–494). Diese Moleküle werden fortlaufend
synthetisiert und in der Mesoglea von erwachsenen Hydra deponiert
und während
der Hydra-Kopfregeneration
(Hausman et al., 1971, J. Exp. Zool. 177:435–446). Andere Studien haben
gezeigt, dass Entwicklungsprozesse in Hydra, wie die Kopfregeneration,
abhängig
von der normalen Bildung der ECM sind. Diese Studien haben gezeigt,
dass die Kopfregeneration in der Hydra-Morphogenese blockiert werden kann durch Verwendung
von Arzneimittteln, welche die Collagen-Quervernetzung stören oder
von Arzneimitteln, welche die Proteoglycan-GAG-Kettenverlängerung
stören
(Sarras et al., 1991b, Dev. Biol. 148:495–500). Diese Studien wurden
kürzlich
auf das Hydra-Zellaggregatsystem
ausgeweitet. Dieses System ermöglicht
die Bildung eines Pellets mit dissoziierten Hydrazellen und dann
die Beobachtung der vollständigen
Regeneration der erwachsenen Hydrakörper innerhalb von 72 bis 96
Stunden durch den Prozess der Cytodifferenzierung und Morphogenese
(Gierer et al., 1972, Nature New Biol. 239:98–101; Sarras et al., 1993,
Dev. Biol. 157:383–398). Solche
Studien der Hydraentwicklung und die Rolle der ECM haben sich stark
auf ein chemisches Vorgehen konzentriert (Barzanski et al., 1974,
Amer. Zool. 14:575–581;
Sarras et al., 1991 ab, supra). Hydrazellaggregate bilden zuerst
ein epitheliales Bilayer und deponieren dann eine ECM bevor die
Morphogenese weitergeht. Die Hydrazellaggregatentwicklung wird blockiert
durch Arzneimittel, welche eine ECM-Bildung stören und durch Antikörper, welche
gegen isolierte Hydramesoglea gerichtet sind. Diese Studien demonstrieren,
dass funktionelle Studien einer ECM/Zell-Wechselwirkung unter in
vivo Bedingungen mit Hydra durchgeführt werden können.
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Es
hat sich gezeigt, dass Typ IV Collagen eine strukturelle Hauptkomponente
der Basalmembranen ist und auch in der Hydra-ECM vorliegt. Die protomere
Form von Typ IV Collagen wird als Heterotrimer gebildet, welches
aus einer Anzahl von unterschiedlichen Untereinheitenketten, bezeichnet
als α1(IV), α2(IV) etc. gebildet
wird. Das Typ IV Collagen-Heterotrimer ist durch drei voneinander
verschiedene strukturelle Domänen gekennzeichnet:
der nicht-Collagen-(NC1)-Domäne
an dem Carboxylterminus, der tripelhelikalen Collagen-Domäne in der
mittleren Region und der 7S-Collagen-Domäne an dem Aminoterminus ( 1) (Martin et al., 1988;
Adv. Protein Chem. 39:1–50;
Gunwar et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14088–14094). Typ IV Collagen existiert
als supramolekulare Struktur in der ECM und man geht davon aus,
dass diese Struktur als Netzwerk dient, welches mechanische Stabilität für die ECM
bereitstellt (Timpl et al., 1986, supra) und als ein Gerüst für die Bindung
und Ausrichtung anderer ECM-Moleküle wie Fibronectin, Laminin,
Eutectin und Heparansulfatproteoglycane dient (Gunwar et al., 1991,
supra). Die biologische Funktion von Typ IV Collagen hängt kritischerweise
von der Bildung einer intakten ECM ab, da die Zerstörung der
Collagen-Quervernetzung
durch β-Aminopropionitril
die Mesoglea-Bildung stört,
und dies führt
zu einer Blockade in der normalen Hydra-Morphogenese (Sarras et
al., 1991 b, 1993, supra).
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Die
Hydrazellaggregatentwicklung beinhaltet die komplette Morphogenese
von erwachsenen Hydrastrukturen innerhalb von 96 Stunden aus Pellets,
die aus dissoziierten Hydrazellen gebildet sind (Grierer et al.,
1972, supra; Sato et al., 1992, Dev. Biol. 151:111–116; Technau
et al., 1992, Dev. Biol. 151:117–127; Sarras et al., 1993,
supra). Morphologisch kann die Hydrazellaggregatentwicklung in zwei
Stufen unterteilt werden. Die initiale Stufe ist von Zeitpunkt 0
bis 24 Stunden, wenn sich die Aggregate aus einer festen Zellmasse
zu einer flüssigkeitsgefüllten Zyste
entwickeln, wobei die äußere Wand
aus einem epithelialen Bilayer mit einer intervenierenden ECM, bezeichnet
als Mesoglea, gebildet wird. Diese Stufe umfasst eine aktive Zellsortierung zwischen
ektodermalen und endodermalen Zellen (Technau et al., 1992, supra)
und eine nachfolgende Mesoglea-Bildung, wenn einmal der Bilayer
gebildet ist. Die späteren
Entwicklungsstufen (24-96
Stunden) umfassen Prozesse, die üblicherweise
mit der Gewebehistogenese verbunden sind, nämlich Veränderungen in der Form der epithelialen
Schichten, in der Zellmigration, in der Zelldifferenzierung, und
andere Prozesse, die eine Morphogenese von Fuß-, Kopf- und Tentakelstrukturen
zur Folge haben. In Bezug auf die initialen Stufen der Hydrazellaggregatentwicklung
hat sich gezeigt, dass eine Kopfregeneration in Aggregaten nicht
von der Zusammenlagerung der Zellen aus den ursprünglichen
Kopfregionen herrührt.
Es wurde vorgeschlagen, dass die Kopfregeneration de novo aus Foci
von Entwicklungsgradienten entsteht, die sich um die sphärischen
Aggregate gebildet haben (Gierer et al., 1972, supra; Technau et
al., 1992, supra). Das deutet darauf hin, dass eine Zelldifferenzierung
oder Transdifferenzierung in Kopfregionzellen aktiv während der
Hydrazellaggregatentwicklung auftritt. Zusätzlich zu einer Positionsinformation
und möglichen
Aktivatoreinflüssen,
können
die Zellen unter den Einflüssen
anderer Entwicklungsanzeichen, wie Signale, die aus der ECM entstehen,
differenzieren oder transdifferenzieren.
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Frühere Studien
haben gezeigt, dass Fibronectin in Vertrebraten während dem
Matrixzusammenbau mit verschiedenen Collagenen wechselwirkt, was
Typ IV Collagen einschließt
(Carter, 1984, J. Cell Bio. 99:105–114). Zusätzlich hatten Antikörper gegen
die Collagenbindungsdomäne
von Fibronectin die Fähigkeit, den
ECM-Zusammenbau durch humane Lungenfibroblasten zu blockieren (McDonald,
1982, J. Cell Biol. 92:485-492).
Andere Studien erhoben Zweifel bezüglich der Wechselwirkung; während polyklonale
Antikörper gegen
die Collagenbindungsdomäne
den Matrixzusammenbau blockierten, zeigten aufgereinigte Collagenbindungsdomänen keinen
inhibitorischen Effekt in diesem Zusammenbauprozess (McDonald et
al., 1987, J. Biol. Chem. 262:2957-2967; Hynes, 1990, Cell 48:549–554). Im
Allgemeinen erscheint Fibronectin (FN) vor Collagen während dem
Zusammenbau von Vertrebraten Matrizes, jedoch in dem Fall der Hydra
ECM-Bildung erschienen FN und Collagen in der Mesoglea zu etwa derselben
Zeit, was auf Immunofluoreszenzstudien basiert. Typ IV Collagen
wurde als wichtig bei verschiedenen humanen Krankheiten vorgeschlagen
(Hudson et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:26033–26036). Die Basalmembran und
ihre Komponenten spielen eine Rolle in der Lymphozytenadhäsion, -migration
und -proliferation (Li und Cheung, 1992, J. of Immunology 149:3174–3181).
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Neilson
et al. (J. Biol.Chem. 268:8402–8405
(1993)) offenbaren, dass die NC1-Domäne der α3(IV)-Kette
das vermutliche Ziel für
Autoantikörper
in Patienten mit Goodpasture (GP)-Syndrom ist; und es werden Experimente
beschrieben, bei denen die Spezifität von GP-Antikörpern für die fünf NC1-Domänen bestimmt
wurde indem rekombinante NC1 Domänen
als Antigen verwendet wurden. Es wurde gefunden, dass die GP-Antikörper stark
mit der rekombinanten α3(IV)NC1-Domäne reagieren,
jedoch beim Test gegenüber den
anderen vier rekombinanten Monomeren nicht reaktiv waren.
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Die
grundlegende Rolle, die die ECM in der Gewebeentwicklung und der
Zelldifferenzierung spielt, erstreckt sich über Phyla und Reiche, um die
Aufmerksamkeit auf die meisten Grundelemente, die für alle Gewebewechselwirkungen
benötigt
werden, zu lenken. Die Verwendung von Hydra als Modellsystem für die Studie
der Grundelemente von komplexen Gewebewechselwirkungen, ist ein
anerkannter Ansatz. Anstatt man versucht, die Wechselwirkung zwischen
isoliertem Gewebe von höheren
Tieren herzuleiten, können
die gleichen Mechanismen und Phänomene
in vivo durch Verwendung des gesamten Tieres in Hydra beobachtet
werden. Dieser Versuch führte
zu der Verwendung von Hydra; um die Effekte von Glucose auf die
Gewebemorphologie mit ausgezeichneten Ergebnissen in einem Ausmaß zu untersuchen,
um die pathologischen Effekte der unkontrollierten Diabetes auf
Nierenglomeroli zu verstehen (Zhang et al., 1990, Diabetologia 33:704–707).
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Vor
kurzem wurde das β-1-Laminin-Gen
aus Hydra kloniert und sequenziert, das eine sehr hohe Homologie
zu dem menschlichen Gegenstück
zeigt. Die Homologen von Fibronectin und Collagen liegen auch vor.
Es ist eine Überlegung
bezüglich
der grundlegenden Rolle, die ECM spielt, dass Hydra und höhere Tiere die
gleichen Zellmatrixwechselwirkungen mit ähnlichen Komponenten, die gleichen
Domänenwechselwirkungen,
die gleichen Rezeptormoleküle
und die gleiche Antwort auf extrazelluläre Signale zeigen. Säugetierhormone
und sogar menschliche Hormone zeigen Bioaktivität und Effekte auf das Zellverhalten,
wenn sie auf Hydra angewendet werden. Es ist möglich, humanes Insulin zu verwenden,
um die Zellproliferation in Hydra zu stimulieren. Andere solche
Quer-Phylum-Aktivitäten
gelten auch für
viele Wachstumsfaktoren, z.B. EGF (epidermal growth factor, epidermaler
Wachstumsfaktor), TGF-β,
FGF (fibroblast growth factor, Fibroblastenwachstumsfaktor), PDGF,
um nur ein paar zu nennen.
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Spezifische
Verfahren zur Manipulation der Zelladhäsion an ECM, an Basallamina
oder an benachbarte Zellen wären
nützlich
für die
in vivo Manipulation von Gewebe und Zellen. Verfahren, die sich
auf die grundlegenden Elemente der Zell- und Gewebewechselwirkungen
beziehen, sind auf alle Systeme anwendbar, die ähnliche charakteristische Merkmale
aufweisen. Solche in vivo Verwendungen beinhalten und sind nicht
limitiert auf die Inhibition der Basallaminabildung, die Inhibition
der Basallamina/Zell-Wechselwirkungen,
und unterstützen
Zellen dabei, ihre phänotypische
Plastizität
zu erhalten. Solche Verfahren sind auch nützlich für die in vivo Manipulation
von Zellen und Geweben, z.B. bei der Erhaltung von Zellkulturen
in undifferenzierten oder homeostatischen Zuständen, bei der nicht-enzymatischen
Ausbreitung von Zellen aus Anlagerungen oder bei der Erhaltung von
konfluierenden Zellen in Suspensionen zur Propagierung, Erhaltung
oder Sammlung.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
gegenwärtige
Erfindung stellt ein isoliertes NC1-Monomer von Typ IV Kollagen
zur Verwendung als Medikament zur Inhibierung von Basallaminamembran-Bildung
in der Zell- oder Gewebeentwickung bereit. Die in der gegenwärtigen Erfindung
verwendeten Monomere können
in Verfahren zur in vitro Kultivierung von Zellenverwendet werden,
die das Inkontaktbringen der zu kultivierenden Zellen mit den Monomeren
umfassen, um die Basallamina-Bildung oder extrazelluläre Matrixkontakte
zu unterbrechen. Die in der gegenwärtigen Erfindung verwendeten
Monomere können
auch in Verfahren zur Störung
von Basallaminamembran-Bildung in Geweben verwendet werden, die
das Inkontaktbringen der Gewebe mit den Monomeren umfassen.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete isolierte NC1-Monomer von
Typ IV Kollagen ist ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem α1 NC1-Monomer, einem α2 NC1-Monomer
und aus im wesentlichen homologen Proteinkonstrukten davon, welche
die speziellen wirksamkeitvermittelnden Strukturelemente innerhalb
der entsprechenden NC1-Domäne
enthalten. % der normalen Morphogenese
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 besteht aus zwei Diagrammen,
die Segmente von Typ IV Collagen (1A)
und Fibronectin proteolytischen Fragmenten (1B), die in Blockierungsexperimenten
verwendet wurden, veranschaulichen.
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2 ist eine graphische Darstellung,
die die Ergebnisse der Blockade der Aggregatmorphogenese erläutert, die
mit dem Monomer der NC1-Domäne
und der 7S-Domäne
beobachtet wird, wenn alle Typ IV Collagen-Fragmente auf einer gleichen
molaren Basis (0,03 μM)
verglichen werden). Von links nach rechts: Kontrollgruppe; NC1-Monomer;
NC1-Hexamer; 80-kDa-Fragment
von NC1; 7S-Domäne;
Typ I Collagen. Die Ergebnisse werden als % der normalen Morphogenese,
wie unten beschrieben, angegeben.
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3 besteht aus Fotografien
von repräsentativen
Hydra-Zellaggregaten
bei einer Entwicklung von 96 Stunden. Kontrollaggregate entwickeln
Kopf- und Tentakelstrukturen (3A),
während
blockierte Aggregate in der charakteristischen 24 Stunden cystischen
Stufe (3B) verbleiben.
Balken = 286 μm.
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4 ist eine graphische Darstellung,
die den Konzentrationseffekt der verschiedenen Blockierungsmittel
erläutert.
Bei höheren
Konzentrationen zeigte das Hexamer der NC1-Domäne auch Blockierungseffekte, wobei
keine Blockierung mit dem 80-kDa-Fragment von NC1 beobachtet wurde.
Von links nach rechts: Kontrollgruppe; NC1-Monomer (MN) bei 0,03 μM; Hexamer
aus der NC1-Domäne
(HEX) bei 0,1 μM;
Hexamer der NC1- Domäne (HEX)
bei 0,03 μM;
80-kDa-Fragment der NC1-Domäne
(80K) bei 0,3 μM;
80-kDa-Fragment der NC1-Domäne
(80K) bei 0,03 μM;
7S-Domäne
(7S) bei 0,1 μM
und 7S-Domäne
(7S) bei 0,03 μM.
Die Ergebnisse sind in % der normalen Morphogenese, wie unten beschrieben,
angegeben.
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5 besteht aus elektronenmikroskopischen
Aufnahmen, die eine repräsentative
Morphologie von Kontrollaggregatzellen (5A) und blockierten (5B) Aggregatzellen zeigen.
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6 ist eine graphische Darstellung,
die die Ergebnisse der Blockierung der Aggregatbildung durch Verwendung
von Fibronectin und von Fibronectin-abgeleiteten proteolytischen
Fragmenten veranschaulicht. Alle Proben wurden bei 0,5 mg/ml getestet.
Von links nach rechts: BSA (Bovine Serum Albumin, Rinderserumalbumin);
FN (intact fibronectin; intaktes Fibronectin); 120K (das 120-kDa-Fragment
von FN); 45K (das 45-kDa-Fragment
von FN); 40K (das 40-kDa-Fragment von FN); 30K (das 30-kDa-Fragment von
FN); RGDS (RGDS-Peptid); RADS (RADS-Peptid). Die Ergebnisse werden
als % der normalen Morphogenese, wie unten beschrieben, angegeben.
Es hat sich gezeigt, dass die Effektivität der Blockierungsmittel konzentrationsabhängig ist.
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7 veranschaulicht die Effekte
der NC1-(Hexamer) und 7S-Domänen von
Typ IV Collagen bei einer Konzentration von 50 μg/ml auf die Angiogenese von
Mausbrustschlagaderorgankulturen.
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8 veranschaulicht die Effekte
der NC1-(Hexamer)-Domäne
von Typ IV Collagen auf die Aniogenese von Mausbrustschlagaderorgankulturen.
Die Domänenkonzentrationen,
die in diesem Experiment verwendet wurden, betrugen 0 μg/ml (Kontrolle);
0,5 μg/ml;
5 μg/ml
und 50 μg/ml.
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9 veranschaulicht die Effekte
der 7S-Domäne
von Typ IV Collagen auf die Angiogenese von Mausbrustschlagaderorgankulturen.
Die Domänenkonzentrationen,
die in diesem Experiment verwendet wurden, betrugen 0 μg/ml (Kontrolle);
0,5 μg/ml;
5 μg/ml
und 50 μg/ml.
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10 besteht aus Fotografien
von Mausbrust schlagadersegmenten, die in MatrigelTM (EHS-Basalmembranmatrix,
Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) eingebettet sind,
nach 5 Kulturtagen. Kontrollpräparate
(0 μg/ml-
der NC1-(Hexamer)- und der 7S-Domänen) zeigten
ein Wachstum von Mikrogefäßen von
dem kultivierten Gewebe in die Matrix (10A). Im Gegensatz dazu war die Angiogenese
in Präparaten inhibiert,
die mit 50 μg/ml
der 7S-Domäne
(10B) und der NC1-(Hexamer)-Domäne (10C) kultiviert wurden.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Unsere
Studien zeigen, dass die Bildung einer geeigneten ECM-Struktur,
die mit Fibronectin und Typ IV Collagen verbunden ist, kritisch
für eine
Zellaggregatentwicklung ist und dass sich die Störung der ECM-Bildung negativ
auf die Zellteilung und Zelldifferenzierung während der Bildung von komplexen
Zellaggregationen und Geweben auswirkt. Das ist bezeichnend für die kritische
Rolle der ECM und Zell-ECM-Wechselwirkungen, die in der Gewebeentwicklung
in allen Organismen, welche differenzierte Gewebe aufweisen, eine
Rolle spielen. Strukturelle Veränderungen
in Mesoglea, die Inhibierung der Zellproliferation und die Veränderungen
in dem Zelldifferenzierungsmuster sind mit der Blockierung der Zellaggregate
verbunden. So ist Typ IV Collagen kritisch für die frühen Stufen der Zellaggregatentwicklung,
wenn die Mesoglea anfänglich
gebildet wird und diese Störung
der Aggregatentwicklung durch Fragmente von Typ IV Collagen resultiert
in Veränderungen
in der Hydrazellteilung, der Hydrazelldifferenzierung und der Hydramorphogenese.
Es wurde gezeigt, dass Typ IV Collagen-Komponenten ein kritisches
Element in der Bildung jeglicher Zell-zu-ECM-(Basallamina)-Kontakte sind,
und dass diese Wechselwirkung durch Anwendung der geeigneten Verfahren
auf eine vorhersagbare Art und Weise manipuliert werden kann.
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Die
folgenden Beispiele sollen die besonderen Ausführungsformen der gegenwärtigen Erfindung
veranschaulichen und sind nicht dazu gedacht, die Breite oder den
Umfang der Lehren, die in der vorliegenden Beschreibung ausgeführt sind,
zu limitieren. Einem Fachmann ist es möglich, die Lehren der vorliegenden
Beschreibung zu verwenden und die vorliegende. Erfindung in anderen
besonderen Ausführungsformen
anzuwenden.
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Beispiel 1 Zerstörung der
Zellaggregatentwicklung
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Alle
Experimente verwendeten Hydra vulgarie (im vorhergehenden als Hydra
attenuata bezeichnet). Die Tiere wurden wie vorangehend beschrieben
kultiviert (Sarras et al., 1991a, supra) und wurden 24 Stunden lang
vor der Verwendung nicht gefüttert.
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Hydrazellaggregate
wurden nach Gierer et al., (1972, supra) mit den Modifikationen,
die durch Sarras et al. (1993, supra) beschrieben sind, hergestellt.
Sie wurden entweder in Mikrotiterplatten (NUNS, Dänemark) mit
einem Aggregat/Well/10 μl
Inkubationslösung
oder in 96-Well-Platten (Falcon) mit drei bis fünf Aggregaten/Well/50 μl Inkubationslösung inkubiert.
Antibiotika wurden über
alle Schritte der Aggregatherstellung hinweg verwendet, um sicherzustellen,
dass die Aggregate, die in dieser Studie verwendet wurden, frei
von jeglichen symbiontischen Bakterienpopulationen sind (Sarra et
al., 1993, supra). Zahlreiche Analysen zeigten, dass Aggregate unter
diesen Bedingungen frei von Bakterien sind. Bei, einer Zellpelletbildung
von 24 Stunden entwickelten die Hydrazellaggregate septate Verbindungen
zwischen Epithelzellen (Wood et al., 1980, J. Ultrastruc. Res. 70:104–117). Diese
Verbindungen verhindern die Einführung
von Makromolekülen
aus dem Medium in die Mesoglea. Daher wurden exogene Matrixproben
(z.B. Fibronectin, Typ IV Collagen und Typ IV Collagen-Fragmente,
Peptide oder Antikörper)
unmittelbar nach der Pelletbildung (Zeitpunkt 0) zu dem Kulturmedium
gegeben. Kontrollhydrazellaggregate wurden in Hydramedium, Rinderserumalbumin
(Sigma, St. Louis, MO) oder nicht immunem Serum kultiviert. Nach
24-stündiger Inkubation
wurden die Aggregate (sowohl Kontrolle als auch experimentelle Gruppen)
in frisches Hydramedium überführt und
die Kultivierung wurde bis 96 Stunden fortgeführt.
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Typ
IV Collagen-Fragmente, die in Blockierungsexperimenten verwendet
wurden, sind in 1A veranschaulicht.
Das NC1-Monomer – eine
Mischung aus α1(IV), α2(IV); NC1-Hexamer;
80-kDa protomeres verkürztes
Fragment (NC1-Domäne
mit einem Teil der Tripelhelix) – und die 7S-Domäne wurden
alle durch enzymatischen Verdau und durchnachfolgende chromatographische
Reinigung von Rindernierenglomerulibasalmembran oder Rinderlinsenbasalmembran
erhalten (Langeveld et al., 1988; J. Biol. Chem. 263: 10481–10488; Gunwar
et al., 1991, supra). Antikörper
gegen die NC1-(α1(IV)
+ α2(IV))-Domäne von Typ
IV Collagen wurden in Kaninchen hergestellt, die mit monomeren Untereinheiten,
welche von der globulären
Domäne
von Rindernierenbasalmembran Typ IV Collagen (Langeveld et al.,
1988, supra) isoliert wurden, immunisiert waren. Die genauen molaren
Konzentrationen dieser Fragmente wurden durch Spektrophotometrie
und Aminosäurezusammensetzungsanalyse
bestimmt.
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Das
Kriterium für
die Morphogenese war wie folgt. Die morphologische Entwicklung der
Hydrazellaggregate wurde unter Verwendung eines Präpariermikroskops
(Wild, Herbrugg) untersucht. Die Beobachtungen wurden am Zeitpunkt
0, 24, 48, 72 und 96 Stunden durchgeführt. Die normale Morphogenese
der Hydrazellaggregate zwischen Zeitpunkt 0 und 96 Stunden wurde
bereits früher
durch Gierer et al. (1972, supra) und Sarras et al. (1993, supra)
beschrieben. Eine abnormale Entwicklung (Blockierung) der Hydrazellaggregate
wurde in Betracht gezogen, wenn ein Aggregat keine Kopf- und Tentakelstrukturen
bei 96 Stunden zeigte, d. h. in einer cystischen Stufe verblieb
(3). Der Prozentanteil
der Aggregate mit Kopf- und Tentakelstrukturen bei 96-stündiger Entwicklung
wurde berechnet und Daten für
jede Gruppe von unterschiedlichen Experimenten wurden gesammelt
und graphisch dargestellt. Ein Minimum von fünf Aggregaten wurde pro Gruppe
getestet und alle Experimente wurden wenigstens dreimal wiederholt,
mit Ausnahme dort, wo es angezeigt ist. In dem ein statistischer
ANOVA-Test verwendet wurde, wurde ein P-Wert < 0,05 als Anzeichen eines signifikanten
Unterschiedes in allen Gruppen analysiert. Der statistische ANOVA-Test
wurde für
alle Datenanalysen verwendet.
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Transmissionselektronenmikroskopie
wurde angewendet, um die feine Struktur und Morphologie von Kontroll-
und behandelten Aggregaten zu untersuchen. Die Zellaggregate wurden
in Karnovsky's Fixierungsmittel über Nacht
bei 4 °C
eingetaucht und in 1 %-igem OsO4 für 1 Stunde
nachfixiert. Die Proben wurden dann en bloc in 0,5 %-igem Uranylmagnesiumacetat über Nacht
bei 4 °C
angefärbt.
Nach Dehydrierung und Infiltration wurden die Proben in Spurr's Harz eingelegt.
Blöcke
wurden mit einem Reichert-Jung-Microtom
herausgeschnitten, mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt und
unter Verwendung eines JOEL 100S Transmissionselektronenmikroskops
betrachtet. Eine Morphometrieanalyse wurde durchgeführt wie
vorangehend beschrieben (Zhang et al., 1990, supra).
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Ein
Immunfluoreszenzscreening für
Typ IV Collagen in Hydra-Zeflaggregaten bei verschiedenen Zeitpunkten
nach der Pelletbildung zeigte, dass ein Signal bei 48 Stunden beobachtet
wurde und das zunehmend stärker
wurde und in der Mesoglea durch alle späteren Stufen der Aggregatentwicklung
erhalten blieb. 3 veranschaulicht
das typische Aussehen von Kontroll- und blockierten Aggregaten bei
96 Stunden. Blockierte Aggregate entwickelten sich nicht über die
24 Stunden Stufe hinweg und verblieben entweder in einer cystischen
Stufe oder disaggregierten in dissoziierte Zellen bei 96 Stunden.
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Wie
in 2 gezeigt, waren
die 7S-Domäne
und die Monomere der NC1-Domäne am wirksamsten
in der Blockierung der Hydrazellaggregatmorphogenese, wenn die Fragmente
auf einer gleichen molaren Basis untersucht wurden. Diese Blockierung
war auch konzentrationsabhängig.
Das NC1-Hexamer blockierte die Aggregatentwicklung bei höheren Konzentrationen,
wobei das 80-kDa-Fragment
keinen Effekt zeigte (4). Antikörper gegen
die NC1-Domäne
zeigten einen ähnliche
Bfockierungseffekt (Tabelle 1).
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Tabelle
1 Behandlung mit einem Antikörper
gegen ECM-Komponenten
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Ähnliche
Studien wurden unter Verwendung von Fibronectin als Inhibitor durchgeführt. Intaktes
Fibronectin, proteolytische Fragmente, RGDS-Peptide und Antikörper gegen
Fibronectin wurden untersucht, um ihren Effekt auf die Hydrazellaggregatentwicklung
zu bestimmen. 1B zeigt
ein Diagramm der Beziehung zwischen den verschiedenen Fragmenten
und dem intakten Fibronectinmolekül. Aus diesen zeigte sich,
dass intaktes Fibronectin und seine 30-kDa-Gelatinbindungsdomäne am wirksamsten
in der Blockierung der Aggregatentwicklung sind bei 0,5 mg/ml (6). Es zeigte sich, dass
die Wirksamkeit konzentrationsabhängig ist. Antikörper gegen
Fibronectin zeigten auch Blockierungseffekte (Tabelle 1).
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Die
Transmissionselektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Ultrastruktur
von Mesoglea unter dem Einfluss jedes exogen eingeführten ECM-Moleküls zu untersuchen.
Blockierte Aggregate, wurden für
eine TEM-Analyse
zu verschiedenen Zeitpunkten der Experimente behandelt und die Ultrastruktur
ihrer Mesoglea wurde mit der der Kontrollaggregate, die zu dem gleichen
Entwicklungszeitpunkt fixiert wurden, verglichen. Ein Vergleich
mit den Präparaten
der Kontrollgruppe zeigt (5A),
dass die Ultrastruktur der Mesoglea in blockierten Aggregaten eine
verminderte Dicke aufwies, ungleichmäßig an ihrer epithelialen Grenze
war und den Anschein machte, ein Teil ihrer normalen ultrastrukturellen
Organisation (5B) verloren
zu haben. Die morphometrische Analyse (Tabelle 2) zeigte, dass die
Mesoglea von blockierten Aggregaten, wenn verglichen mit Kontrollen,
um etwa 50 % in der Dicke reduziert war, und diese Reduktion, wenn
bestimmt unter Verwendung statistischer Analysen, signifikant war.
Diese veränderte
Mesoglea-Ultrastruktur wurde mit allen getesteten Blockierungsreagenzien
beobachtet.
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Tabelle
2 Morphometrische Analyse
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Um
zu bestimmen, ob die Inhibierung der Zellproliferation für die Blockierung
der Zellaggregatmorphogenese verantwortlich war, wurden die Aggregate
zum Zeitpunkt 0 bis 96 Stunden mit 10 μM Hydroxyharnstoff (HU, hydroxy
urea) behandelt, von dem gezeigt wurde, dass er die DNA-Synthese
in Hydrazellen inhibiert (Bode et al., 1976, J. Cell Sci. 20:29–46). Obwohl
HU die DNA-Synthese vollständig
blockierte, inhibierte das Arzneimittel die Morphogenese von Hydra-Zellaggregaten
nicht.
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Eine
kritische Rolle für
Collagen in dem Prozess der Matrixbildung folgt aus früheren pharmakologischen
Studien, die lanthrytische Agenzien verwenden (Barzanski et al.,
1974, supra; Sarras et al., 1993, supra). In der vorliegenden Demonstration
waren die Typ IV Collagen-Domänen
wirksam bei der Störung
der Mesoglea-Bildung und bei der Blockierung der Aggregatentwicklung.
In dieser Hinsicht waren das Monomer der NC1-Domäne
und das Fragment der 7S-Domäne
am meisten wirksam bei der Blockierung der Aggregatentwicklung,
wenn alle Typ IV Collagen-Fragmente auf einer gleichen molaren Basis
verglichen wurden. Andere haben vorgeschlagen, dass die NC1-Domäne und die
7S-Domäne
die Stellen sind, an denen das Typ IV Collagen-Protomer in intermolekulare
Verbrückung
während
der Bildung des supramolekularen Netzwerks verwickelt ist (Martin
et al., 1988, Adv. Protein Chem. 39:1–50).
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Es
ist noch nicht klar, warum das größere NC1-Hexamer und das 80-kDa
Fragment weniger wirksam bei der Blockierung der Entwicklung sind
als das kleinere NC1-Monomer. Das gleiche Phänomen wurde mit Fibronectin
beobachtet, wo der wirksamste Blockierer, das 7S-Fragment, eine
Masse von größer als
100 kDa aufweist. Auf einer Gesamtmassenbasis weist die 7S-Domäne einen
relativ hohen Anteil an Kohlenwasserstoffresten, die mit der Polypeptidkette
(15 bis 18 %) verbunden sind, auf und weitere Analysen dieser Kohlenwasserstoffreste
zeigen, dass sie einzigartige strukturelle Merkmale wie die Anwesenheit
von terminalen α-D-Gal-Resten
auf N-verknüpften
Oligosaccharidgruppen aufweisen (Langenveld et al., 1991, supra;
Nayak et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 13978–13987). Die Unfähigkeit
von Typ I Collagen, die Entwicklung zu blockieren, ist übereinstimmend
mit der Tatsache, dass es in Hydramesoglea noch nicht beobachtet
wurde.
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Der
Effekt der Mesoglea-Komponenten auf das Hydrazellverhalten mag auf
zwei Ebenen betrachtet werden. Auf der einen Ebene mag Mesoglea
nur einfach als strukturelle Einheit betrachtet werden, die als Grundlage
für die
Stabilität
und die Erhaltung des epithelialen Bilayers benötigt wird. Auf der anderen
Ebene jedoch stellen ECM-Komponenten in Mesoglea Entwicklungsanzeichen
bereit, die solche Zellprozesse, wie Zellteilung, migration und
-differenzierung, während
der Hydramorphogenese modulieren. Es ist klar, dass die ECM-Komponenten
nicht nur einfach strukturelle Moleküle sind. Es hat sich gezeigt,
dass Fibronectin und Typ IV Collagen die endotheliale Zellproliferation
und -differenzierung kontrollieren (Tagami et al., 1992, Cell Tissue.
Res. 268:225–232;
Ingber, 1990, PNAS USA 87:3579–3583).
Es hat sich gezeigt, dass die mechano-chemischen Wechselwirkungen
zwischen quergestreiften unwillkürlichen
Muskelzellen in Qualle und transplantierter Mesoglea DNA-Replikation
und Zelltransdifferenzierung induzieren oder inhibieren können. In
den vorliegenden Beispielen, während
die Zellproliferation in den morphologisch blockierten Aggregaten
inhibiert ist, ist es offensichtlich, dass normale Aggregatmorphogenese
sogar in Abwesenheit der Zellproliferation auftreten kann. Daher
kann eine Reduktion der Zellteilung in blockierten Aggregaten nicht
für eine
Blockierung verantwortlich gemacht werden, die in der Aggregatmorphogenese
beobachtet wird.
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Die
Homologie zwischen dem Hydramodellsystem und dem, was über die
Entwicklungsmechanismen und die regulatorischen Mechanismen höherer Organismen
bekannt ist, macht die Verwendung von Typ IV Collagen-Fragmenten in diesem
System auf die gleichen Zell- und Gewebewechselwirkungen in anderen
Organismen anwendbar. Die vorliegenden Verfahren sind unter anderem
anwendbar auf die Inhibierung der Metastasierung, die Kontrolle
der Zellteilung, die Reduktion von Narbengewebebildung, den Eingriff
in die Epithelgewebebildung, die Inhibition der Angiogenese, die
Reduktion von Komplikationen aufgrund von Zelladhäsion in
Organtransplantaten, die Inhibition der angiogenetischen Invasion
des Gewebes oder die Inhibition der Lymphozytenadhäsion und
beweglichkeit.
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Beispie 12 Zellkulturerhaltung
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Die
Produkte der gegenwärtigen
Erfindung sind besonders nützlich
für die
Erhaltung von Zellen in Kultur, wo eine solche Erhaltung eine Erhaltung
des Zellphänotyps
und der Morphologie mit minimaler Adhäsion benötigt. Es ist gut bekannt, dass
es viele kritische Faktoren gibt, die zu der erfolgreichen Erhaltung
und Propagierung der Zellen in Kultur beitragen. Die Zellteilung
kann nämlich
fixierungsabhängig
sein und wird in manchen Fällen
eine dichte abhängige
Inhibierung zeigen. Im Allgemeinen sind die meisten Kulturen, die
aus Zellen hergestellt werden, welche aus Gewebe dissoziiert sind,
nicht jedoch Bakterien, nicht auf ein Leben in Suspension angepasst
und benötigen
eine feste Oberfläche,
auf der sie wachsen und sich teilen können. Zellen werden heutzutage
in Kulturen gezüchtet,
so dass sie an Plastik adhärieren.
Zellen können
in den Anforderungen an die Kulturmedien und die Natur des Trägers variieren
und einige Zellen können
nicht ohne die geeigneten ECM-Komponenten, die auf den Plastikplatten
aufgebracht wurden, wachsen. Anerkannte Verfahren für eine Säugetierzellkultur
können
in solch allgemeinen Literaturstellen gefunden werden, wie "Mammalian Cell Biotechnology", herausgegeben durch
M. Butler, Oxford University Press, 1991 und "Readings in Mammalian Cell Culture", 2. Auflage, herausgegeben
durch R. Pollack, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981.
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Die
Produkte der gegenwärtigen
Erfindung stellen ein Mittel bereit, durch das das Erfordernis einer
Adhäsion
eliminiert wird, durch Versorgung der Zellen mit einer wirksamen
Menge der Typ IV Collagen-Domänen, die
den Zellen ermöglichen,
in Lösung
zu verbleiben, während
sie immer noch an die ECM gebunden zu sein scheinen. Das wird die
Verwendung von Zellkulturen in Bioreaktoren und anderen großtechnischen,
kommerziellen Anwendungen stark verbessern. Die Verwendung der NC1-
oder 7S-Domäne
in etwa der gleichen wirksamen Konzentration pro Zelle, was in dem
vorangehenden Beispiel demonstriert ist, wird die Zellkulturen wirksam
verbunden lassen, ohne Adhäsion.
Des Weiteren wird die Isolation und Manipulation von Zellen nicht
die Verwendung von üblichen
pharmakologischen Agenzien benötigen,
die viele zelluläre
Funktionen auf eine unpräzise
und nicht spezifische Art und Weise beeinflussen.
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Primärkulturen,
solche die direkt aus Tiergewebe isoliert, wurden, können verwendet
werden, um sekundäre
Kulturen von spezifischen Zellen zu bilden. Auf diese Art können die
Zellen für
mehrere Wochen oder Monate subkultiviert werden, wobei sie den Phänotyp und
die Morphologie der elterlichen Zellen zeigen. Die meisten Vertrebratenzellen
werden nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen in Kultur sterben;
z.B. können humane
Hautzellen üblicherweise
für mehrere
Monate leben, wobei sie sich 50 bis 100 mal teilen, bevor sie sterben.
Zahlreiche Zelllinien können
jedoch entstehen, die unsterblich dadurch sind, dass sie für eine unbestimmte
Zeit in Zellkultur propagiert werden können. Diese Zellen wachsen üblicherweise
am besten, wenn sie an einen festen Träger gebunden sind und hören üblicherweise
auf zu wachsen, wenn sie einmal eine zusammenfließende Schicht
auf der Oberfläche
gebildet haben, wobei Kontaktinhibierung angezeigt wird. Zelllinien, die
aus Krebszellen hergestellt werden, unterscheiden sich von solchen,
die aus normalen Zellen auf verschiedene Arten hergestellt wurden.
Solche Zellen neigen dazu, ohne Oberflächenträger zu proliferieren und werden
auf eine viel höhere
Dichte als normale Zellen anwachsen.
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So
können
die Produkte der gegenwärtigen
Erfindung verwendet werden, um primäre und sekundäre Zellkulturen
so zu beeinflussen, dass sie sich verhalten, als ob sie sich in
Kontakt mit einem festen Träger
befinden, jedoch ohne die Effekte der zellulären Kontaktinhibierung. So
können
elterliche Zelllinien in vitro unter Bedingungen erhalten werden,
welche die Erhaltung des Zellphänotyps
und der Zellmorphologie unterstützen.
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Ein
Gebiet von großem
Interesse ist die Isolierung und Kultur von embryonalen oder pluripotenten Stammzelten
in vitro für
eine evtl. Manipulation und die Verwendung in vivo. Die Isolation
und Erhaltung von solch relativ undifferenzierten Zellen und die
Propagierung solcher Zellen würde
die Herstellung riesiger Mengen spezifischer Zellen erlauben, die
die Basis der Geweberegeneration oder Ersetzung bilden könnten. So können die
Lehren der gegenwärtigen
Erfindung auf die Erhaltung von pluripotenten Zellisolaten verwendet werden
und erlauben die Propagierung dieser Zellen, während sie morphologische Veränderungen
und die Differenzierung in vitro inhibieren.
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Beispiel 3 In Vitro Effekte
auf die Aniogenese
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Die
Angiogenese, der Prozess der Bildung neuer Blutgefäße, spielt
eine wichtige Rolle in physiologischen Prozessen wie der embryonalen
und postnatalen Entwicklung als auch in der Wundheilung. Die Bildung von
Blutgefäßen kann
auch durch pathologische Prozesse, welche verwickelt sind in eine
Entzündung
(z.B. diabetische Retinopathie und Arthritis) oder Neoplasie (z.B.
Krebs) (Folkman, 1985, Perspect. Biol. Med. 29, 10), induziert werden.
Die Gefäßneubildung
wird reguliert durch angiogenetische Wachstumsfaktoren, die durch
einen Tumor oder normale Zellen sekretiert werden, wie auch durch
die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und durch die Aktivität von endothelialen
Enzymen (Nicosia und Ottinetti, 1990, Lab. Invest. 63, 115).
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Während der
anfänglichen
Stadien der Angiogenese erscheinen die wachsenden endothelialen
Zellen durch Öffnungen
in der Basalmembran von vorher vorhandenen Blutgefäßen (Nicosia
und Ottinetti, 1990, supra; Schoefl, 1963, Virchous Arch. Pathol.
Anat. 337, 97–141;
Ausprunk und Folkman, 1977, Microvasc. Res. 14, 53–65; Paku
und Paweletz, 1991, Lab. Invest. 63, 334–346). Wenn sich neue Gefäße bilden,
durchläuft ihre
Basalmembran komplexe strukturelle und Zusammensetzungs-bezogene
Veränderungen,
von denen geglaubt wird, dass sie die angiogenetische Antwort beeinflussen
können
(Nicosia et al., 1994, Exp. Biology, 164, 197-206). Frühere planate Kulturmodelle
haben gezeigt, dass die Basalmembranmoleküle die Anlagerung, Migration
und Proliferation und das organisatorische Verhalten von Endothelzellen
modulieren (Nicosia et al., 1994, supra). Neuere Studien mit dreidimensionalen
aortischen Kulturmodellen, die genauer genommen, angiogenetische
Bedingungen, die während
der Wundheilung auftreten, simulieren, schlagen vor, dass die Basalmembran
ein dynamischer Regulator der Angiogenese ist, dessen Funktion entsprechend
seiner molekularen Komponenten variiert (Nicosia et al., 1994, supra).
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Die
Verfahren von Nicosia und Ottinetti (1990,. supra) und Nicosia et
al. (1994, supra) wurden mit Modifikationen für die Experimente verwendet,
die entwickelt wurden, um den Effekt von Typ IV Collagen auf die Angiogenese
unter in vitro Bedingungen zu untersuchen. Das Modell wurde verwendet,
um die Effekte der Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrixmoleküle auf die
angiogenetische Antwort zu untersuchen und verwendet aortische Ringe,
die in dreidimensionalen Collagengenen unter Serumfreien Bedingungen
kultiviert wurden. Diese Experimente werden unten beschrieben.
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A. Verfahren
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Die
Experimente wurden mit männlichen
Swiss Webster Mäusen,
die 1 bis 3 Monate alt waren, durchgeführt. Nach der Narkose wurde
die Brustschlagader unter aseptischen Bedingungen herausgeschnitten
und in steriles MCDB 131 Wachstumsmedium (Clontics, San Diego, CA),
das Antibiotika enthielt, überführt. Fett wurde
von der Aorta präpariert
und etwa 6 bis 8 1-mm-Brustaortasegmente wurden aus jedem Präparat erhalten.
Die Segmente wurden in 48-Well-Gewebekulturplatten überführt. Die
Wells, dieser Platten wurden vor dem Transfer der Aortasegmente
mit 100 Mikrolitern MatrigelTM überschichtet
(EHS-Basalmembran, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA).
Das MatrigelTM wurde 1:1 mit MCDB 131 Wachstumsmedium
vor dem Gebrauch verdünnt.
Die Segmente wurden in den Wells zentriert und zusätzliche
100 Mikroliter des MatrigelTM wurde dann über den
Präparaten
platziert. Die Aortasegmente wurden dadurch in die Basalmembranmatrix
eingebettet. Jedes Well erhielt dann 300 Mikroliter MCDB 131 Wachstumsmedium.
Die Platten wurden in einen Inkubator platziert, der bei 37 °C mit 5 %
CO2 gehalten würde. Die Präparate wurden täglich über einen Zeitraum
von 7 Tagen beobachtet. Neu wachsende Mikrogefäße wurden gezählt, indem
ein invertiertes Phasenmikroskop bei verschiedenen Zeitpunkten während der
Kulturperiode verwendet wurde, die Daten sind jedoch bei 3 und 5
Kulturtagen gezeigt. Um den Effekt von Typ IV Collagen auf die Angiogenese
zu testen, werden Domänen
bekannter Konzentration mit dem MatrigelTM und
mit dem MCDB 131 Wachstumsmedium gemischt. Frisches MCDB 131 Wachstumsmedium
(plus und minus Collagen-Domänen)
wurde jeden dritten Tag gewechselt.
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B. Ergebnisse
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Nach
Festsetzung des Zeitverlaufs der Angiogenese unter Kontrollbedingungen
(MatrigelTM und MCDB 131 Wachstumsmedium)
wurden Experimente durchgeführt,
in denen verschiedene Konzentrationen von Typ IV Collagen (isoliert
aus Rinderlinsen) NC1-(Hexamer) und 7S-Domänen
verwendet wurden. Die Daten stellen die Analyse von wenigstens 3
Präparaten
pro experimenteller Bedingung dar. In dem ersten Experiment (7) zeigt die Analyse an,
dass eine Konzentration von 50 Mikrogramm/ml NC1-Domäne und 7S-Domäne die Angiogenese
signifikant inhibierte, wie bei 3 und 5 Tagen der Kultur aufgezeichnet
wurde. In dem zweiten Experiment wurden zahlreiche Konzentrationen
dieser Domänen
analysiert. Wie in 9 angezeigt, inhibierte
die 7S-Domäne
bei 50 Mikrogramm/ml wiederum signifikant die Angiogenese bei 3
und 5 Tagen. Die Inhibierung war reduziert bei Konzentrationen von
5 und 0,5 Mikrogramm/ml. Wie in 8 gezeigt,
war die, NC1-Domäne
weniger wirksam bei der Blockierung der Angiogenese, verglichen
mit der, die in dem ersten Experiment- beobachtet wurde (7). Zusätzlich lag verglichen mit der
7S-Domäne
eine geringere Korrelation zwischen der Konzentration und der inhibitorischen
Wirkung vor.
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10 besteht aus Fotografien
von Mäusebrustaortassegmenten,
die in MatrigelTM (EHS Basalmembranmatrix,
Collarborative Biomedical Produkts, Bedford, MA) bei 5 Tagen Kulturzeit
in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μg/ml Typ IV Collagen-Domänen eingebettet
wurden. Die Kontrollpräparate
(keine Domänen)
zeigten Wachstum von Mikrogefäßen aus
dem kultivierten Gewebe in die Matrix (10A). Im Gegensatz dazu wurde eine Angiogeneseinhibierung
in Geweben beobachtet, die in Anwesenheit von 50 μg/ml der 7S-Domäne (10B) und der NC1 (Hexamer)-Domäne (10C) kultiviert wurden.
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Die
Ergebnisse dieser Experimente schlagen vor, dass die 7S-Domäne von Typ
IV Collagen, wie zuvor bereits mit Hydrazellaggregaten beobachtet,
verglichen mit der NC1-Domäne
wirksamer als Blockierungsmittel ist.
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Zusammenfassend
sind die erfindungsgemäßen Produkte
anwendbar für
die Inhibierung der Metastasierung, die Kontrolle der Zellteilung,
die Reduktion von Narbengewebebildung, den Eingriff in die epitheliale Gewebebildung,
die Inhibierung der Angiogenese, die Reduktion von Komplikationen.
aufgrund von Zelladhäsion
in Organtransplantaten, die Inhibierung der angiogenetischen Invasion
von Gewebe oder die Inhibierung der Lymphozytenadhäsion und
-beweglichkeit, die Erhaltung von pluripotenten Zellisolaten in
vitro, während morphologische
Veränderungen
und die Differenzierung inhibiert werden. Bei der Durchführung solcher
Verfahren ist die verwendete Menge oder der verwendete Dosierungsbereich
des NC1- (Hexamer) von Typ IV Kollagen so, dass die Zelladhäsion an
extrazelluläre
Matrixkomponenten oder die Bildung einer funktionellen Basallamina
inhibiert oder zerstört
wird. Im Allgemeinen beträgt
eine inhibierende Menge einer Domäne, die angewendet werden kann
von etwa 5 bis 50 μg/ml.
