DE388136T1 - Verfahren zur Herstellung von Restriktionsendonuklease und -Methylase-MwoI. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Restriktionsendonuklease und -Methylase-MwoI.

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DE388136T1
DE388136T1 DE90302641T DE90302641T DE388136T1 DE 388136 T1 DE388136 T1 DE 388136T1 DE 90302641 T DE90302641 T DE 90302641T DE 90302641 T DE90302641 T DE 90302641T DE 388136 T1 DE388136 T1 DE 388136T1
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DE
Germany
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mwo
gene
cloning vector
dna
restriction endonuclease
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DE90302641T
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Keith D Lunnen
Geoffrey G Wilson
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New England Biolabs Inc
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New England Biolabs Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
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Claims (13)

90302641.7 M:NE27O7A1 New England Biolabs Inc. Patentansprüche
1. Ein Klonierungsvektor, welcher ein Mwo I Restriktionsendonukleasegen einschließt.
2. Ein transformierter Wirt, welcher den Klonierungsvektor gemäß Anspruch 1 enthält.
3. Der Klonierungsvektor nach Anspruch 1, worin das Mwo I Gen ausgeschnitten wurde aus Methanobacterium wolfei (DSM2970).
4. Ein Klonierungsvektor, welcher ein Mwo I Modifikationsgen einschließt.
5. Ein transformierter Wirt, der den Klonierungsvektor gemäß Anspruch 4 enthält.
6. Ein Verfahren zum Klonieren eines Mwo I Restriktionsendonukleasegenes, welches die folgenden Schritte umfaßt:
25
a) Bilden einer Bibliothek aus DNA von M. wolfei;
b) Isolieren von Klonen, die das Mwo I Modifikationsgen enthalten und;
c) Testen von Klonen, welche das Modifikationsgen enthalten und Isolieren von Klonen, welche das Mwo I Restriktionsendonukleasegen enthalten.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bibliothek gebildet wird durch die folgenden Schritte:
a) Reinigen von DNA aus M. wolfei;
b) Verdauen der gereinigten DNA um DNA-Fragmente zu bilden,
c) Ligieren der Fragmente in einen Klonierungsvektor;
d) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (c), um eine Zellbibliothek zu bilden; und
e) Reinigen rekombinanter Vektoren aus der Zellbibliothek, um eine Plasmidbibliothek zu bilden.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Klonierungsvektor pBR322 ist.
9. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ein E. coli Stamm ist, welcher hsdR" ist.
10. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Klon, welcher das Mwo I Modifikationsgen enthält, isoliert wird durch Verdauen der Plasmidbibliothek mit Mwo I, um einen Verdauungspool zu bilden; Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Auswählen von Klonen, welche das Modifikationsgen enthalten.
11. Ein Verfahren zum Herstellen von Mwo I Restriktionsendonuklease, welches umfaßt:
a) Reinigen von DNA aus M. wolfei;
b) Verdauen der gereinigten DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease, um DNA-Fragmente zu bilden;
c) Ligieren der Fragmente in den Klonierungsvektor, um eine DNA-Mischung zu bilden;
d) Transformieren einer Wirtszelle mit der DNA-Mischung aus Schritt (c), um eine Bibliothek zu bilden;
e) Isolieren von Klonen, welche das Mwo I Modifikatxonsmethylasegen enthalten;
f) Testen von Klonen, welche das Mwo I Modifikatxonsmethylasegen enthalten und Isolieren von Klonen, welche das Mwo I Restriktionsendonukleasegen enthalten;
g) Kultivieren der Wirtszellen, welche die Klone aus Schritt (f) enthalten; und
h) Gewinnen der Mwo I Restriktxonsendonuklease aus der Kultur.
12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Klonierungsvektor ein Plasmid- oder virales DNA-Molekül ist.
13. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Plasmid
pBR322 ist.
25
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EP0388136B1 (de) 1995-11-22
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