DE388212T1 - Verfahren zur Herstellung der Hinc-II-Restriktionsendonuklease und Methylase. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung der Hinc-II-Restriktionsendonuklease und Methylase.Info
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Claims (16)
1. Ein Klonierungsvektor, welcher ein Hinc II Restriktionsendonukleasegen
einschließt.
2. Ein transformierter Wirt, welcher den Klonierungsvektor gemäß Anspruch 1 enthält.
3. Der Klonierungsvektor nach Anspruch 1, worin das Hinc
II Gen ausgeschnitten ist aus Haemophilus influenzae
II Gen ausgeschnitten ist aus Haemophilus influenzae
Rc-Genom DNA.
4. Ein Klonierungsvektor, welcher ein Hinc II Modifikationsgen einschließt.
5. Ein transformierter Wirt, welcher den Klonierungsvektor
gemäß Anspruch 4 enthält.
6. Ein Verfahren zum Klonieren eines Hinc II Restriktions-
endonukleasegenes, welches umfaßt:
25
25
(a) Bilden einer Bibliothek aus Plasmid-DNA aus
Haemophilus influenzae Rc;
(b) Isolieren von Klonen, welche das Hinc II oder das Hinc II Modifikationsgen enthalten;
(C) Reinigen des Restriktionsendonukleaseproteins f
und Erhalten der Proteinsequenz.
(d) Bestimmen der Richtung der Endonuklease über DNA
Sequenzierung, Bestimmen des Ortes der Endonuklease in dem Methylaseklon und Bestimmen des
Ortes der Endonuklease in dem Haemophilus influenzae
Rc-Genom;
(e) Bilden einer Bibliothek basierend auf den Daten, Erhalten in b-d;
(f) Isolieren von Klonen, welche die Hinc II Modifikations- und Restriktionsgene enthalten.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bibliothek gebildet wird durch die Schritte:
(a) Reinigen von Genom-DNA aus Haemophilus influenzae Rc;
(b) Verdauen der gereinigten DNA, um DNA-Fragmente zu bilden;
(C) Ligieren der Fragmente in einen Klonierungsvektor;
(d) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor
aus Schritt (c), um eine Zellbibliothek zu bilden; und
(e) Reinigen von rekombinanten Vektoren aus der Zellbibliothek, um eine Plasmidbibliothek zu
bilden.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Klonierungsvektor
pBIIHI.2, pBIIOI oder pUC19 ist.
9. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle ein
E.coli Stamm ist, welcher Mrr~ ist.
35
35
10. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Klon, welcher
das Hinc II Modifikationsgen enthält, isoliert wird
durch Verdauen der Plasmidbibliothek mit Hinc II, um
einen Verdauungspool zu bilden, Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Auswählen von Klonen, welche das Modifikationsgen enthalten.
durch Verdauen der Plasmidbibliothek mit Hinc II, um
einen Verdauungspool zu bilden, Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Auswählen von Klonen, welche das Modifikationsgen enthalten.
11. Ein Verfahren zum Herstellen von Hinc II Restriktionsendonuklease,
welches umfaßt:
(a) Reinigung von DNA aus Haemophilus influenzae Rc;
(b) Verdauen der gereinigten DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease, um DNA-Fragmente
zu bilden;
(c) Ligieren der Fragmente in den Klonierungsvektor, um eine DNA-Mischung zu bilden;
(d) Transformieren einer Wirtszelle mit der DNA-Mischung aus Schritt (c), um eine Bibliothek zu
bilden;
(e) Isolieren von Klonen, welche das Hinc II Modifikationsmethylasegen
enthalten;
(f) Testen von Klonen, welche das Hinc II Modifikationsmethylasegen
enthalten und Isolieren von Klonen, welche ebenfalls das Hinc II Restriktionsendonukleasegen enthalten;
(g) Kultivieren der Wirtszellen, welche die Klone aus Schritt (f) enthalten; und
(h) Gewinnen einer Hinc II Restriktionsendonuklease
aus der Kultur.
ü38S
12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Klonierungsvektor ein Plasmid- oder virales DNA-Molekül ist.
13. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Plasmid
pBIIOI ist.
pBIIOI ist.
14. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Plasmid pUC19 ist.
15. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Plasmid
pBIIHI.2 ist.
pBIIHI.2 ist.
16. Ein Klon, welcher die Hinc II Modifikations- und Re-
striktxonsgene enthält, welche die folgende DNA-Sequenz darin aufweisen:
5' TAC TCA AAG TAT TTT GGA TAA ATA GTC CTA TAA TTG NNA ATA TTA ATC GGG CAA AAA GTG AAA CGT CCT AAA TCA
GGT ACT CTG TCA GGT CAT GCT GCA GGG GAA CCA TTT GAA AAA TTA GTA TAT AAG TTT TTG AAA GAA AAC CTG TCA GAT TTA ACA
TTT AAG CAA TAT GAA TAT CTT AAT GAT TTA TTT ATG AAG AAC CCT GCG ATA ATT GAG CAT G 3'.
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