DE3879440T2

DE3879440T2 - Dactylocyclin a und dactylocyclin b.

Info

Publication number: DE3879440T2
Application number: DE8888121311T
Authority: DE
Inventors: Carol Ann Aklonis; Helen Anne Ax; Donald R Kirsch; Joseph O'sullivan; Adrienne Anne Tymiak; Jerry Scott Wells
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2008-12-21
Also published as: DE3879440D1; US5024839A; CA1336695C; JPH01202291A; EP0322717A2; EP0322717B1; EP0322717A3; ES2053697T3; ATE87033T1

Description

Die Züchtung eines Stammes des Mikroorganismus Dactylosporangium sp., der in der "American Type Culture Collection" als ATCC-Nr. 53693 hinterlegt worden ist, ergibt die antibiotische Substanz EM5586. EM5586 ist analysiert worden, dabei wurde gefunden, daß es aus vier Komponenten besteht. Eine dieser Komponenten ist 7-Chlor-4-dimethylamino-8-methoxy- 1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,4a,6,10,12,12a-hexahydroxy-6- methyl-1,11-dioxo-2-naphthacencarboxamid (nachstehend als "4a- Hydroxy-8-methoxy-CTC" bezeichnet), eine Verbindung, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung W087/00832, veröffentlicht am 12. Februar 1987, beschrieben wird. Zwei weitere Komponenten, nämlich Dactylocyclin A und Dactylocyclin B, sind gegen grampositive Bakterien, einschließlich Tetracyclin-resistente Bakterien, wirksam.
Figur 1 zeigt das Infrarotspektrum von Dactylocyclin A in Kaliumbromid.
Figur 2 zeigt das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum von Dactylocyclin A im positiven Ionenmodus.
Figur 3 zeigt das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum von Dactylocyclin A im negativen Ionenmodus.
Figur 4 zeigt das 67,5 MHz ¹³C NMR-Spektrum von Dactylocyclin A in deuteriertem Methanol.
Figur 5 zeigt das 400 NHz ¹H NMR-Spektrum von Dactylocyclin A in deuteriertem Methanol.
Figur 6 zeigt das Infrarotspektrum von Dactylocyclin B in Kaliumbromid.
Figur 7 zeigt das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum von Dactylocyclin B im positiven Ionenmodus.
Figur 8 zeigt das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum von Dactylocyclin B im negativen Ionenmodus.
Figur 9 zeigt das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum von Dactylocyclin B in deuteriertem Methanol.

Der Mikroorganismus

Der zur Erzeugung der antibiotischen Substanz EM5586 verwendete Mikroorganismus ist ein Stamm von Dactylosporangium, der aus in Sumpfwasser gefundenen Blattresten isoliert wurde. Eine Tochterkultur des Mikroorganismus kann von der ständigen Sammlung der "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, erhalten werden. Die Hinterlegungs-Nr. dieser Aufbewahrungsstelle ist ATCC-Nr. 53693. Selbstverständlich können zur Erzeugung von EM5586 zusätzlich zu dem hier beschriebenen und charakterisierten spezifischen Mikroorganismus auch Mutanten des Mikroorganismus kultiviert werden (z.B. Mutanten, die durch Anwendung von Röntgenstrahlen, UV-Strahlung, genetischer Manipulation oder Stickstofflost-Substanzen erzeugt werden).
Die Isolierung von Dactylosporangium sp. ATCC-Nr. 53693 aus Blattresten, in denen es vorliegt, kann durchgeführt werden, indem die Blattreste zuerst in einem sterilen Verdünnungsmittel (z.B. gepufferter Kochsalzlösung, die 0,01% Gelatine enthält) suspendiert und 20 Minuten bei 70ºC inkubiert werden. Sodann wird die Suspension auf ein mit Cycloheximid angereichertes Nährmedium plattiert. Das Medium ist folgendermaßen zusammengesetzt: Gramm Agar Kolloidales Chitin* Destilliertes Wasser Cycloheximid*** Hergestellt wie von Mekkar, N.S., und T. Cross, J. Appl. Bacteriol., 52:209-218, 1982, beschrieben. ** sterilfiltriert und zum Medium hinzugefügt, das bereits 30 Minuten bei 121ºC sterilisiert worden ist.
Nach 8 Tagen Inkubation bei 28ºC werden Kolonien von Dactylosporangium sp. ATCC-Nr. 53693 aus der plattierten Probe isoliert und auf ein Agarmedium überführt, das folgendermaßen zusammengesetzt ist: Gramm Glucose Lösliche Stärke Fleischextrakt Trypton Hefeextrakt CaCO&sub3; Leitungswasser Liter
Das Medium wird durch zwanzigminutiges Autoklavieren bei 121ºC sterilisiert.
Dactylosporangium sp. ATCC-Nr. 53693 ist durch die Bildung kurzer fingerähnlicher Sporangien charakterisiert, die direkt aus dem vegetativen Mycel auf der Oberfläche des Agars entstehen. Sporangien werden auf Calciummalat-Agar (Waksman, S.A., in "The Actinomycetes: A Summary of Current Knowledge", Ronald Press, New York, 1967) und Bodenextrakt-Agar (Waksman, S.A., in "The Actinomycetes", Bd. II, Classification, Identification and Description of Genera and Species, Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1961) reichlich gebildet. Jedes Sporangium enthält eine gerade Reihe von drei bis vier Sporen, die bewegungsfähig sind. Die Kultur erzeugt außerdem kugelförmige Körper, die seitlich auf dem vegetativen Mycel entstehen. Die mikroskopische Untersuchung dieser kugelförmigen Körper zeigt darin eine amorphe Masse, die sich nicht zu Sporen entwickelt. Echte Sporen kommen überwiegend auf Calciummalat-Agar und Bodenextrakt-Agar vor; in diesen Medien sieht man wenige kugelförmige Körper.
Ein Säurehydrolysat von ganzen Zellen enthält meso-Diaminopimelinsäure und Glycin, die aus der Zellwand stammen. Xylose und Arabinose sind die überwiegenden Zuckerreste der Zellwand. Diese Zusammensetzung zeigt eine Typ-II-Zellwand an, die von Lechevalier und Lechevalier (Intern. J. Syst. Bacteriol., 20:435-443, 1970) beschrieben wird.
Wegen der morphologischen Kennzeichen, d.h., Bildung von fingerähnlichen Sporangien und kugelförmigen Körpern, gekoppelt an eine Typ-II-Zellwand, wird dieser Organismus in die Gattung Dactylosporangium eingeordnet, einem Mitglied der Familie Actinoplanaceae gemäß der von Thiemann et al., (Thiemann, J., H. Pagani und G. Baretta, Archiv. für Mikrobiol., 58:42-52, 1967) gegebenen Beschreibung der Gattung.

Herstellung des Antibiotikums

Das Antibiotikum EM5586 kann erzeugt werden, indem Dactylosporangium sp. ATCC-Nr. 53693 bei genau oder etwa 28ºC unter aeroben Bedingungen im Submersverfahren in einem wässerigen Nährmedium gezüchtet wird, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält. Die Fermentation wird solange durchgeführt, bis eine wesentliche Erzeugung der gewünschten antibiotischen Substanz stattgefunden hat, üblicherweise etwa 120 bis 144 Stunden. Dies kann mit einem Test bestimmt werden, der entwickelt wurde, um die Hemmung der Proteinsynthese, d.h., die Hemmung von de-novo-Synthese der β-Lactamase bei Induktion durch Penicillin G, zu messen. Die anschließenden Isolierungsverfahren können auch mit Hilfe dieser Technik überwacht werden.
Dactylocyclin A und Dactylocyclin B können mittels Techniken, die in Fachkreisen bekannt sind, sowohl aus Nährlösungüberstand als auch aus der Zellmasse nach deren Abtrennung durch Zentrifugation isoliert werden. Zur Gewinnung der Antibiotika aus dem Nährlösungüberstand wird der pH-Wert auf etwa 5 eingestellt und die Aktivität sodann mit Essigsäureethylester extrahiert. Das organische Extrakt wird under vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingeengt, der sodann auf Kationen- und Anionenaustauscher-Harzen und anschließend durch zentrifugale Gegenstrom-Chromatographie gereinigt wird, wodurch die reinen EM5586-Komponenten Dactylocyclin A und Dactylocyclin B erhalten werden. In der ersten Stufe wird zur Adsorption Bio-Rad AGMP-50*-Kationenaustauscher-Harz, H&spplus;-Form, verwendet (*Bio-Rad AGMP-50: makroretikuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharz mit angehängten -CH&sub2;N&spplus;(CH&sub3;)&sub3;-Gruppen, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), von dem die aktiven Komponenten mit Pyridin-Acetonitril-Wasser eluiert werden. Das aktive Eluat wird sodann an das Anionenaustauscher-Harz Bio- Rad AGMP-1*, Cl&supmin;-Form, adsorbiert (*Bio-Rad AGMP-1: makroretikuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharz mit angehängten -SO&sub3;-Gruppen, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), und die Elution mit Essigsäure-Acetonitril-Wasser durchgeführt. Die anschließende Chromatographie auf Sephadex LH-20** (** Sephadex LH-20: Kügelchen aus alkyliertem vernetztem Dextran-Gel, Pharmacia Fine Chemical AB, Uppsala, Schweden) mit Acetonitril-Wasser-Trifluoressigsäure trennt die EM5586-Komponenten Dactylocyclin A, Dactylocyclin B und Dactylocyclin C von der bekannten Verbindung 4a-Hydroxy-8-methoxy-CTC ab. Die zentrifugale Gegenstrom-Chromatographie mit der unteren Phase von Chloroform-Methanol-Wasser dient zur Abtrennung der neuen Verbindungen Dactylocyclin A, Dactylocyclin B und Dactylocyclin C.
Dactylocyclin A, Dactylocyclin B und Dactylocyclin C können auch aus der Zellmasse durch Extraktion mit Methanol erhalten werden. Das methanolische Extrakt wird unter vermindertem Druck eingeengt. Die resultierende wässerige Lösung wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt, und die Aktivität durch Extraktion mit Essigsäureethylester gewonnen. Eine weitere Reinigung wird sodann wie vorstehend beschrieben mittels Chromatographie auf Kationen- und Anionenaustauscher-Harzen, LH20- Chromatographie und zentrifugaler Gegenstrom-Chromatographie durchgeführt.
Dactylocyclin A und Dactylocyclin B sind gegen grampositive Bakterien, einschließlich Tetracyclin-resistente Bakterien, wirksam. Beide können zur Behandlung von grampositiven bakteriellen Infektionen in Säugerarten, wie z.B. Menschen, verwendet werden.
Das nachstehende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel

Herstellung von Dactylocyclin A und Dactylocyclin B

Schrägagarzubereitungen, zusammengesetzt aus Hafermehl 2% und Tomatenpaste 2% in Leitungswasser, wurden mit Dactylosporangium sp. ATCC-Nr. 53693 beimpft und 14 Tage bei 28ºC inkubiert. Mit der resultierenden gewachsenen Kultur wurden 100 ml-Portionen eines wässerigen Mediums, die in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben enthalten waren, beimpft. Das Kulturmedium war folgendermaßen zusammengesetzt: Gramm Glucose Lösliche Stärke Fleischextrakt Trypton Hefeextrakt CaCO3 Kaltes Leitungswasser auf 1000 ml
Das auf pH-Wert 7,0 eingestellte Medium wurde vor Verwendung 30 Minuten bei 121ºC sterilisiert.
Die beimpften Kulturkolben wurden bei 28ºC auf einem Kreisschüttler 96 Stunden inkubiert. Der Schüttler lief mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM bei einer Kreisbewegung von 2 Inch.
Sodann wurde eine 1%-Übertragung aus den Kulturkolben in frische 100 ml-Portionen des gleichen Mediums, die in 200 Erlenmeyer-Kolben 500 ml enthalten waren, durchgeführt. Die beimpften Kolben wurden 144 Stunden bei 28ºC auf einem Kreisschüttler inkubiert, der mit 200 UpM bei einer Kreisbewegung von 2 Inch lief. Die Erzeugung von Bioaktivität wurde durch einen Test gemessen, der entwickelt wurde, um die Hemmung der de novo-Proteinsynthese, z.B., der β-Lactamase, zu messen. In diesem Test wird die zu testende Probe (250 u1) zu 2 ml Antibiotika-Test-Bouillon (Antibiotic Assay Broth, BBL Laboratories, Cockeysville, Md.) in einem sterilen Röhrchen hinzugefügt. Außerdem werden 0,5 ml einer Übernachtkultur in Antibiotika-Test-Bouillon von Bacillus licheniformis SC 9262 aus der Squibb-Kultursammlung und 100 41 einer Penicillin-G-Lösung (100 ug/ml) hinzugegeben. Nach 2,5-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden außerdem 30 ul einer Lösung hinzugefügt, enthaltend 50 mg eines chromogenen Cephalosporins, nämlich (6R- trans)-3-[2-(2,4-Dinitrophenyl)ethenyl]-8-oxo-7-[(phenylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-2-carbonsäure, das in 5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit 95 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, verdünnt war. Ein rascher Farbumschlag von gelb zu rosa zeigt die Hydrolyse des chromogenen Cephalosporins durch das induzierte Enzym β-Lactamase an. Die Hemmung des Farbumschlags ist ein Maß für die Erzeugung der erfindungsgemäßen Antibiotika, da sie die Herstellung des Enzyms β- Lactamase hemmen.
Zur Ernte wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und die vereinigte Nährlösung zentrifugiert, wodurch etwa 16 Liter Überstand und 5,5 kg feuchte Zellen erhalten wurden. Der auf einen pH-Wert von etwa 5 eingestellte Überstand wurde mit drei 6,7-Liter-Portionen Essigsäureethylester extrahiert. Die Extrakte aus insgesamt 54 Liter Nährlösungüberstand wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem öligen Feststoff (3,46 g) eingeengt. Der Feststoff wurde in Acetonitril-Wasser 1:1 (70 ml) gelöst und auf eine Säule AGMP-50, H&spplus;-Harz, 200- bis 400-Mesh (1,5 x 13 cm), aufgetragen, wobei zum Packen das gleiche Lösungsmittel verwendet wurde. Nach Waschen der Säule mit 180 ml des Lösungsmittels wurden die Antibiotika mit 215 ml eines Lösungsmittels, bestehend aus Pyridin-Acetonitril- Wasser 8:46: 46, eluiert. Das Eluat wurde über eine 1,5 x 10 cm-Säule von AGMP-1, Cl&supmin;-Harz, 100- bis 200-Mesh, gegeben, wobei zum Packlen Acetonitril-Wasser 1:1 verwendet wurde. Nach einer anfänglichen Waschung des Harzes mit 225 ml dieses Lösungsmittels wurden die Antibiotika mit 175 ml Lösungsmittel, bestehend aus Essigsäure-Acetonitril-Wasser 2:49:49, eluiert. Das aktive Eluat wurde unter vermindertem Druck zu 0,28 g eines braunen Feststoffs eingeengt.
Eine Probe des Feststoffs zu 0,14 g wurde in 2 ml Acetonitril-Wasser-Trifluoressigsäure 66:33:0,1 gelöst und auf einer 2,5 x 40 cm-Säule mit Sephadex LH-20 chromatographiert, wobei zum Packen das gleiche Lösungsmittelgemisch verwendet wurde. Die ersten aktiven Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch 37 mg des Dactylocyclin-Komplexes erhalten wurden. Der als zweites eluierte aktive Peak wurde gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch 75 mg der bekannten Verbindung 4a-Hydroxy- 8-methoxy-CTC erhalten wurden.
Der wie vorstehend beschrieben erhaltene Dactylocyclin- Komplex (115 mg) wurde in 4 ml eines zweiphasigen Lösungsmittelgemisches, bestehend aus Chloroform-Methanol-Wasser 7:13:8, gelöst und in diesem Lösungsmittelsystem auf einem Ito-Mehrschicht-Wicklung-Trenn-Extraktionsapparatur ("Multi- Layer Coil Separator-Extractor", P.C. Inc., Potomac, Md.), chromatographiert, die bei 800 UpM unter Verwendung einer Mehrschicht-Teflonschlauchwicklung (1,6 mm, i.D.) mit einem Volumen von 330 ml arbeitete. Die Elution wurde mit der oberen, leichtflüssigen Phase durchgeführt. Nach Sammlung von 565 ml leichtflüssiger Phase wurde die untere Phase gewonnen und Fraktionen gemäß dem Biotest kombiniert. Vier aktive Peaks wurden gewonnen, von denen drei Dactylocyclin A, Dactylocyclin B und Dactylocyclin C und der vierte das verbliebene 4a-Hydroxy-8-methoxy-CTC darstellen. Die Reihenfolge und Menge der gewonnenen Substanzen waren: Dactylocyclin C (2,7 mg, 110-115 ml), Dactylocyclin A (26,3 mg, 125-150 ml), 4a-Hydroxy-8-methoxy-CTC (11 mg, 355-485 ml) und Dactylocyclin B (13,7 mg, 785- 885 ml).
Dactylocyclin A besitzt UV-Absorptionsmaxima in Methanol (E1%) bei 369(160), 261(170) und 238(200) nm, neben der Endabsorption. Bei Zusatz von Säure sind keine Veränderungen der Absorptionsmaxima nachweisbar. Bei Zusatz von Base ändern sich die Absorptionsmaxima auf 386(150), 279(170) und 243(210) nm. Das Infrarotspektrum von Dactylocyclin A in Kaliumbromid ist in Figur 1 dargestellt. Die folgenden Peaks stechen hervor: 1677, 1609, 1384, 1241, 1204 und 1136 cm&supmin;¹. Das Fast-Atom-Bombardment(FAB)-Massenspektrum im positiven Ionenmodus in Dimethylsulfoxid-Dithiothreit-Dithioerythrit-Glycerin (nachstehend als DDDG bezeichnet) ist in Figur 2 dargestellt. Das FAB-Massenspektrum im negativen Ionenmodus in DDDG ist in Figur 3 dargestellt. Die hochauflösende Massenbestimmung des M+H-Ions ergab eine Masse von 698,2282 Daltons. Das 67,5 MHz ¹³C NMR-Spektrum von Dactylocyclin A in deuteriertem Methanol ist in Figur 4 dargestellt; das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum in deuteriertem Methanol ist in Figur 5 dargestellt. Dactylocyclin A ist löslich in Methanol, Acetonitril-Wasser-Gemischen und Dimethylsulfoxid, jedoch im wesentlichen nicht löslich in Acetonitril, Chloroform, Benzol oder Wasser.
Dactylocyclin A hat einen Rf-Wert von 0,33, wenn es auf Whatman KC&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Dünnschichtplatten (200 um) mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Dimethylformamid-Acetonitril- Puffer, pH 4,2, 3:4:3, chromatographiert wird. Der Puffer ist folgendermaßen zusammengesetzt: 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz, 15 mM Citronensäure, 20 mM Natriumcitrat und 50 mM Kaliumnitrat. Dactylocyclin A weist eine Retentionszeit von 3,28 Minuten auf, wenn es mittels HPLC auf einer Waters uBondapak-Phenyl-Säule (0,45 x 30 cm) mit einer Durchflußmenge von 1 ml pro Minute chromatographiert wird. In diesem System wird das gleiche Lösungsmittelsystem verwendet, das vorstehend für die dünnschichtchromatographische Analyse beschrieben wurde.
Dactylocyclin B besitzt UV-Absorptionsmaxima in Methanol (E1%) bei 373(190), 262(200) und 238(250) nm, neben der Endabsorption. Bei Zusatz von Säure ändern sich die Absorptionsmaxima auf 368(180), 261(220) und 238(240). Bei Zusatz von Base ändern sich die Absorptionsmaxima auf 385(180), 281(200) und 243(260) nm. Das Infrarotspektrum von Dactylocyclin B in Kaliumbromid ist in Figur 6 dargestellt. Die folgenden Peaks stechen hervor: 1725, 1606, 1546, 1382, 1240, 1102 und 993 cm&supmin;¹. Das FAB-Massenspektrum im positiven Ionenmodus von Dactylocyclin B in DDDG ist in Figur 7 dargestellt. Das FAB-Massenspektrum im negativen Ionenmodus von Dactylocyclin B in DDDG ist in Figur 8 dargestellt. Aus dem hochauflösenden Massenspektrum des M+H-Ions wurde eine Masse von 712,2165 Daltons bestimmt. Das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum von Dactylocyclin B in deuteriertem Methanol ist in Figur 9 dargestellt.
Dactylocyclin B hat einen Rf-Wert von 0,11, wenn es auf Whatman KC&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Dünnschichtplatten (200 um) mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Dimethylformamid-Acetonitril- Puffer, pH 4,2, 3:4:3, chromatographiert wird. Der Puffer ist folgendermaßen zusammengesetzt 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz, 15 mM Citronensäure, 20 mM Natriumcitrat und 50 mM Kaliumnitrat. Dactylocyclin B weist eine Retentionszeit von 4,85 Minuten auf, wenn es mittels HPLC auf einer Waters uBondapak-Phenyl-Säule (0,45 x 30 cm) mit einer Durchflußmenge von 1 ml pro Minute chromatographiert wird. In diesem System wird das gleiche Lösungsmittelsystem verwendet, das vorstehend für die dünnschichtchromatographische Analyse beschrieben wurde.
Dactylocyclin C hat UV-Absorptionsmaxima in MeOH(E1%) bei 381(120) und 275(170) nm, neben der Endabsorption.

Biologische Aktivität

Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (nachstehend als MIC bezeichnet) der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden die nachstehenden Verfahren verwendet. Die Testorganismen wurden in 20 ml Antibiotika-Test-Bouillon (Antibiotic Assay Broth, Difco) gezüchtet, indem die Kulturbouillon (in Röhrchen) mit einer Impföse voll Organismen aus einer BHI(Difco)-Schrägagarkultur beimpft wurde. Die beimpften Röhrchen wurden 18 bis 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Man setzte voraus, daß diese Kulturen 10&sup9; koloniebildende Einheiten (CFU) pro ml enthielten. Die Kulturen wurden 1:100 verdünnt, wodurch eine durchschnittliche Impfmaterialmenge von 10&sup7; CFU erhalten wurde; die Verdünnungen wurden mit Hefe-Rindfleisch-Bouillon (Yeast-Beef-Broth, Difco) zubereitet. Die Testverbindungen wurden in einem geeigneten Verdünnungsmittel bei einer Konzentration von 1000 ug/ml gelöst. Doppelte Verdünnungen wurden in Hefe-Rindfleisch-Bouillon (Difco) zubereitet, wobei Konzentrationen im Bereich von 1000 ug/ml bis 0,5 ug/ml erhalten wurden. Von jeder Verdünnung wurde eine Probe 1,5 ml in einzelne Petrischalen gegeben, zu denen 13,5 ml K-10-Agar hinzugefügt wurde. Der K-10-Agar ist folgendermaßen zusammengesetzt:
Fleischextrakt 1,5 g
Hefeextrakt 3,0 g
Pepton 6,0 g
Dextrose 1,0 g
Agar 15,0 g
Destilliertes Wasser auf 1 Liter
Die endgültige Arzneistoffkonzentration im Agar lag im Bereich von 100 ug/ml bis 0,05 ug/ml. Platten zur Kontrolle des Organismenwachstums, die nur Agar enthielten, wurden hergestellt und vor und nach den Testplatten beimpft. Die Organismen wurden auf die Agaroberfläche jeder Platte mit einem Denly-Mehrpunkt-Impfinstrument aufgebracht, das etwa 10&sup4; CFU an die Agaroberfläche abgibt.
Die Platten wurden 18 Stunden bei 37ºC inkubiert und die MICs bestimmt. Die MIC ist die niedrigste Konzentration der Verbindung, die das Wachstum des Organismus hemmt.
Die für diese Studie ausgewählten Testorganismen sind Paare von Tetracyclin-empfindlichen und Tetracyclin-resistenten Stämmen. Die nachstehend dargestellten Ergebnisse zeigen, daß zwischen den neuen Verbindungen dieser Erfindung und Tetracyclin keine Kreuzresistenz besteht. Organismus* Tetracyclin Dactylocyclin Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus faecalis * Alle Organismen von der Squibb-Kultursammlung, E. R. Squibb & Sons, Inc., Princeton, New Jersey.

Claims

1. Dactylocyclin A, das das Infrarotspektrum in Kaliumbromid nach Figur 1, das Fast-Bombardment-Massenspektrum im positiven Ioneninodus nach Figur 2, das Fast-Bombardment- Massenspektrum im negativen Ionenmodus nach Figur 3, das 67,5 MHz ¹³C NMR-Spektrum nach Figur 4 und das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum nach Figur 5 besitzt.

2. Dactylocyclin B, das das Infrarotspektrum in Kaliumbromid nach Figur 6, das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum im positiven Ionenmodus nach Figur 7, das Fast- Atom-Bombardment-Massenspektrum im negativen Ionenmodus nach Figur 8 und das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum nach Figur 9 besitzt.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, nämlich Dactylocyclin A, die das Infrarotspektrum in Kaliumbromid nach Figur 1, das Fast-Bombardment-Massenspektrum im positiven Ionenmodus nach Figur 2, das Fast-Bombardment- Massenspektrum im negativen Ionenmodus nach Figur 3, das 67,5 MHz ¹³C NMR-Spektrum nach Figur 4 und das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum nach Figur 5 besitzt, gekennzeichnet durch die Kultivierung von Dactylosporangium, sp. A.T.C.C. Nr. 53693.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, nämlich Dactylocyclin B, die das Infrarotspektrum in Kaliumbromid nach Figur 6, das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum im positiven Ionenmodus nach Figur 7, das Fast- Atom-Bombardment-Massenspektrum im negativen Ionenmodus nach Figur 8 und das 400 MHz ¹H NMR-Spektrum nach Figur 9 besitzt, gekennzeichnet durch Kultivierung von Dactylosporangium, sp. A.T.C.C.-Nr. 53693.

5. Arzneimittel, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Dactylocyclin A gemäß Anspruch 1.

6. Arzneimittel, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Dactylocyclin B, gemäß Anspruch 2.

7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 5 oder 6 mit antibakterieller Wirkung.

8. Verwendung von Dactylocyclin A nach Anspruch 1 zur Herstellung eines antibakteriellen Arzneimittels.

9. Verwendung von Dactylocyclin B nach Anspruch 2 zur Herstellung eines antibakteriellen Arzneimittels.