DE3326917A1 - Antitumor-antibiotikum bbm-1644, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische mittel - Google Patents
Antitumor-antibiotikum bbm-1644, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische mittelInfo
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Description
PROF. DR. DR. J. REiTSTOTTER ' DR. WERNER KINZEBACH
DR. ING. WOLFRAM BUNTE <ιβββ-ΐ97β)
- if-
REITSTOTTtR. KINZEBACH Λ PARTNER
POSTFACH 7ΘΟ. D-SOOO MÜNCHEN 43
PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT
EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
TELEFON: IO8&) 2 7t es 83
TELEX: O521S2OS ISAR D
München, 26. Juli 19
OURREF: M/24
BETREFF:
RE
BRISTOL-MYERS COMPANY
345, Park Avenue
New York, N.Y. 10154, U.S.A.
Antitumor-Antibiotikum BBM-1644, Verfahren zu dessen
Herstellung und pharmazeutische Mittel
POSTANSCHRIFT: D-8000 MÜNCHEN 43. POSTFACH 78Ο
KJ /L \J yJ I I
: M/24 163
- S-
Die Erfindung betrifft das Antitumor-Antibiotikum
BBM-1644, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und pharmazeutische Mittel, die diese Verbindung enthalten,
sowie den Mikroorganismus Actinomadura sp. . (ATCC 39144) .
, Das Antibiotikum BBM-1644 ist in der Medizin als antibakterielles Mittel oder als Antitumormittel brauchbar.
Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum
BBM-1644 ist ein neues Antibiotikum aus der Gruppe der Protein-Antitumor-Antibiotika, zu denen beispielsweise
Neocarcinostatin, Macromomycin und Auromomycin
gehören.
Neocarcinostatin (das auch als Zinostatin bezeichnet wird) ist ein saures Proteinmakromolekül mit einem
Molekulargewicht von 10 700, welches aus einer einzigen Polypeptidkette aus 109 Aminosäuren besteht, die
25 durch 2 Disulfidbrücken vernetzt sind. Die Herstellung
von Neocarzinostatin durch Fermentation von Streptomyces carzinostaticus var. Neocarzinostatikus-Stämmen ist
in der US-PS 3 334 022 und in J. Antibiotics 18, 68 bis 76 (1965) beschrieben. Die Aminosäuresequenz
30 von Neocarcinostatin ist in Cancer Treatment Reviews §_,
239-249 (1979) beschrieben.
Macromomycin ist ein neutrales oder schwach saures Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr
15 000. Die Herstellung von Macromomycin durch
M/24 163 "2
- 6-
Fermentation von Streptomyces macromomyceticus
(NIHJ NC-8-42) ist in der US-PS 3 595 954 und in J. Antibiotics 2±, 44-49 (1968) offenbart. Die
Reinigung von Macromomycin und die charakteristischen
Daten der gereinigten Verbindung sind in J. Antibiotics 29, 415 bis 423 (1976) beschrieben. ^y
Auromomycin ist ein schwach saures Polypeptid mit
einem Molekulargewicht von ungefähr 12500 und einem isoelektrischen Punkt bei pH 5,4. Es besteht aus
16 verschiedenen Aminosäuren. Die Isolierung von
15 Auromomycin aus der Nährbrühe von Streptomyces
macromyceticus und die charakteristischen Eigenschaften
des gereinigten Produkts1sind in J. Antibiotics,
3_2, 330-339 (1979) beschrieben.
BBM-1644 kann von bekannten Polypeptid-Antitumorantibiotika,
wie Neocarcinostätin, Macromomycin und Auromomycin, anhand der physikalisch chemischen
Eigenschaften, wie Molekulargewicht, Aminosäuregehalt und Papierelektrophorese, unterschieden werden.
M/24 163
Gegenstand der Erfindung ist das Antitumor-Antibio-5
tikum BBM-1644.
Das Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums ist dadurch gekennzeichnet/ daß man einen neuen Stamm
von Actinoitiadura, der als Actinomadura sp. -Stamm
H710-49 (ATCC 39144) bezeichnet wird, in einem wäßrigen
Nährmediuni/ das assimilxerbare Kohlenstoff- und Stickstoff
quellen enthält, unter aeroben, Submers-Bedingungen züchtet, bis der erwähnte Organismus in dem Kulturmedium
eine bestimmte Menge BBM-1644 gebildet hat, und
1^ indem man dann gegebenenfalls BBM-1644 aus dem Kulturmedium
gewinnt. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum BBM-^1644 in verdünnter Lösung, als rohes Konzentrat,
a]Ls rohen Feststoff und als gereinigten Feststoff.
Figur 1 stellt das Infrarot-Spektrum von BBM-1644 dar
(KBr Preßling) .
Figur 2 stellt das Ultraviolett-Spektrum von
BBM-1644 in Wasser, 0,01 N HCL und 0,01 NaOH dar. 30
M/24 163
Der oben erwähnte Organismus, Actinomadura sp. Stamm
H-710-49, wurde von einer in der Bundesrepublik
Deutschland gesammelten Bodenprobe isoliert. Eine biologisch reine Kultur des Organismus wurde bei
der American Type Culture Collection, Washington D.C. unter der Bezeichnung ATCC 39144 hinterlegt.
BBM-1644 inhibiert das Wachstum verschiedener grampositiver und säurefester Bakterien- Das Antibiotikum
besitzt auch Phagen-induzierende Eigenschaften bei
15 lysogenen Bakterien und inhibiert das Wachstum von
lymphatischen und festen Tumoren, wie P388 Leukämie, bei Mäusen. Das erfindungsgemäße
Antibiotikum kann man deshalb als antibakterielles Mittel oder als Antitumormittel zur Inhibierung von
Tumoren bei Säuretieren, einschließlich des Menschen, verwenden.
Der Actinomycete~Stamm, H-710-49 wurde aus einer Bodenprobe
isoliert und zur Charakterisierung in Form einer biologische reinen Kultur anhand üblicher Verfahren
hergestellt. Der Stamm H710-49 bildet sowohl ein Substrat- als auch ein Luftmycel. Das Substratmycel
ist lang, verzweigt und nicht in kurze Filamente fragmentiert. Kurze Sporenketten befinden sich an
der Spitze oder den monopodialen Verzweigungen des Luftmycels. Die Sporenketten enthalten 2 bis 15
Sporen pro Kette (am häufigsten 4 bis 8 Sporen)und besitzen eine langgestreckte, Haken- oder schleifenförmige
Gestalt. Die Sporen haben eine warzige Oberfläche und eine ovale bis elliptische Gestalt
M/24 163
(0.5 's^->
0,6 χ 0,7 S^s 1,2 μπι) mit einem runden oder
5 spitzen Ende. Reife Sporen sind häufig durch leere Hyphen getrennt. Ein Anschwellen der Hyphen am Ende
wird gelegentlich beim Substratmycel in Czapek's und Bennett's Agar beobachtet. Bewegliche Sporen,
Sporangia oder skierotische Granula wurden in 10 keinem der geprüfen Medien beobachtet.
Im Gegensatz zu üblichen Arten der Gattung Streptomyces,
wächst der Stamm H710-49 langsam und bildet ein
schwach ausgeprägtes Luftmycel in chemisch definierten und natürlichen organischen Medien. Das Luftmycel ist
weiß und nimmt nach der Sporulation in Hafermehl-Agax,
anorganischen Salzen-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin
Agar eine rosa Schattierung an. Das Substratmycel ist farblos, gelb, rötlich-braun oder dunkel-grau-
2Q braun. Ein melanoides Pigment wird nicht produziert,
jedoch ist ein zitronengelbes, diffusibles Pigment bei Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar
und Pridham-Gottlieb's Grundagar, ergänzt durch Glyzerin, L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Glucose,
25 D-Fructose, Trehalose und D-Mannit, zu beobachten.
Der Stamm H710-49 wächst bei 20 0C, 28 0C und 37 0C,
nicht jedoch bei 10 PC oder 41 °C. Er ist empfindlich auf NaCl bei 10 %, nicht jedoch bei 7 %, und beständig
gegenüber Lysozym bei 0,001%. D-Galactose, D-Mannose,
Sacharose, Raffinose und Inosit werden von dem Stamm nicht verwertet. Die physiologischen Eigenschaften und die
Eigenschaften der Kulturen des Stammes H710-49 sind in
den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt. Die Verwertung der Kohlenstoffquelllen durch den Stamm ist in
35 Tabelle 3 zusammengestellt.
M/24
- /ίο
Charakteristische Eigenschaften der Kultur des Stammes H710-49
Trypton-Hefe Extraktbrühe (ISP Nr. 1)
Saccharose-Nitrat | Agar | G |
(Czapek's Agar) | R | |
A | ||
D | ||
Glucose-Asparagin | Agar | G |
R | ||
A | ||
D | ||
Glycerin-Asparagin | Agar | G |
(ISP No. 5) | R |
anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4)
Tyrosin Agar (ISP No. 7) G** gut bis mäßig; flockig, sedxmentiert und nichtpigmentiert.
spärlich
spärlich
farblos bis schwach orangegelb (73)***
spärlich; weiß (263) keine
schlecht
spärlich; weiß (263) keine
schlecht
gelblich-weiß (92) bis dunkelorange-gelb (69) sehr spärlich; weiß (263)
keine
schlecht bis mäßig schwach gelb (89) bis dunkel orange-gelb (72)
A schlecht; weiß (263) bis schwach gelbrosa (31)
D leuchtend gelb (83) G schlecht bis mäßig, R farblos bis tiefgelb (85)
A schlecht; weißrosa (9) bis schwach gelbrosa (31)
D keine
G mäßig
R braun-orange (54) bis mäßig rotbraun (43)
A schlecht; weiß (263) bis schwach gelb (89)
D kräftig gelb (84)
M/24 163 | G | schlecht bis mäßig |
Nähr-Agar | R | gelblich weiß (92) bis mäßig |
gelbbraun (77) | ||
A | schlecht; weiß (263) | |
D | keine | |
G | mäßig | |
Hefeextrakt-Malz | R | dunkelgelb (88) bis dunkelbraun(59) |
extrakt- Agar | A | spärlich; weiß (263) |
(ISP No. 2) | D | leicht olivebraun (94) |
G | schlecht | |
Hafermehl-Agar | R | farblos |
(ISP No. 3) | A | schlecht; weiß (263) bis weiß- |
rosa (9) | ||
D | keine | |
G | mäßig | |
Bennett's Agar | R | grau-gelbes Braun (80) bis dunkel |
graubraun (62) | ||
A | sehr spärlich; weiß (263) | |
D | mäßig oliv-braun (95) | |
G | schlecht | |
Pepton-Hefeex- | R | gräulich gelb (90) bis dunkel |
trakt-Eisen Agar | grau-braun (62) | |
(ISP No. 6) | A | schlecht; weiß (263) |
D | keine bis mäßig gelb-braun (77) | |
beobachtet nach 3-wöchiger Inkubierung bei 28 °c, **Abkürzungen: G - Wachstum; R - Farbe der Rückseite;
A - Luftmycel; D - diffusibles Pigment
*** Die Zahlen in Klammern entsprechen dem Farbenstandard in "Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS
color name charts illustrated with Centroid Colors. US Dept. of Comm. Circ. 553, Washington, D.C.
Nov. 1975"
Tabelle 2
Physiologische Eigenschaften des Stammes H710-49
Physiologische Eigenschaften des Stammes H710-49
Wachsturnstemperaturbereich
Gelatineverflüssigung
Stärkehydrolyse
Reaktionen in entrahmter
Melanoidbildung
Nitratreduktion
Ansprechen
maximales Wachstum bei 28°C, mäßiges Wachstum bei 2O0C und 37°C. Kein
Wachstum bei 1O0C und 410C
verflüssigt
hydrolysiert
hydrolysiert
nicht koaguliert und vollständig peptonisiert nicht beobachtet
Reduziert
Beständigkeit gegenüber NaCl Mäßig beständig. Wachstum
bei 7%, nicht jedoch bei 10 %.
Lysozym Beständig. Wachstum bei
0.001%.
Wachstum bei 6.0; aber
nicht bei 5.0.
Methode und Medium
Bennet 's Agar
Bennet 's Agar
to
(T. U)
Glucose-Pepton-Gelatine-Medium Stärke-Agar-Platte
Difco Skimmed Milk
Trypton-Hefeextraktbrühe, Tyrosin-Agar
und Peptone-Hefeextrakt-Eisenagar Czapek's Glucose-Nitrat-Brühe und
Glucose-Hefeextrakt-Nitratbrühe Trypton-Hefeextrakt Agar
Trypton-Hefeextrakt-Agar
Trypton-Hefeextrakt-Agar
I ·
CO GO NJ
M/24 163 "* ~ αχ
ι " flb~
Tabelle 3
Verwertung der Kohlefnstof f.quellen durch den Stamm H710-49
Verwertung der Kohlefnstof f.quellen durch den Stamm H710-49
Glycerin +
D (-)-Arabinose
L(+)-Arabinose +
D-Xylose +
D-Ribose +
L-Rhamnose +
D-Glucose +
D-Galactose
D-Fructose +
D-Mannose
L (-)-Sorbose
L (-)-Sorbose
Saccharose
Lactose -
Cellobiose +
Melibiose -
Trehalose +
Raffinose -
D(+)-Melezitose
lösliche Stärke +
Cellulose
DuIcit -
DuIcit -
Inosit -
D-Mannit +
D-Sorbit
Salicin
30
30
* Beobachtet nach 3-wöchiger Inkubation bei 28 0C.
Grundmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium.
M/24 163 -
1 - Atf
Die gereinigten Zellwände von Organismen des Stammes
H710-49 enthalten meso-Diaminopimelinsäure, sie enthalten
jedoch kein Glycin. Das Hydrolysat ganzer Zellen ergibt die Anwesenheit von Madurose (3-O-Methyl-D-galactose),
Glucose, Ribose und einer geringen Menge Mannose. Im Hinblick auf die Zusammensetzung der Zellwände und
der Zuckerbestandteile ganzer Zellen des Stammes
10 H710-49 ist dieser dem Zellwand-Typ HL zuzuordnen.
Die oben beschriebenen Charakteristika des Stammes H 710-49 ähneln denjenigen der Gattung Actinomadura.
Gemäß der von Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. Vl2_:
95-111 (1979) beschriebenen numerischen Taxonomie von
Actinomadura und verwandten Actinomyceten werden die
meisten Actinomydura-Arten, die aus dem Boden isoliert wurden, von den 14 beschriebenen Clustern als Cluster Nr.
klassifiziert. Die Verwandtschaft des Stammes H 710-49 ist am größten mit den Arten des Clusters 7. Nonomura
und Ohara berichten in J. Ferment. Technol. £9_r 904-912
(1971) über fünf saprophytische Arten der Gattung
Actinomadura; Nonomura (J. Ferment. Technol. b2_, 71-77
(1974)) und Preobrazhenskaya et al. (Actinomycetes and
Related Organisms, YZ^, 30-38 (1977)) beschreiben die
Identifizierung und Klassifizierung von Actinomadura-Arten.
Aufgrund eines Vergleiches mit bekannten, in der Literatur beschriebenen Actinomadura-Arten wird
der Stamm H710-49 als zu einer neuen Actinomadura-Spezies,
30 ähnlich den in der oben zitierten Publikation von
Preobrazhenskaya et al. und in Japanese Kokai 55/94391 beschriebenen A. roseola, S. salmones, A. vinacea oder
A. corallina, zugehörig erachtet.
- An -M/24 163
Es wird darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung nicht durch die Herstellung von BBM-1644,
5 die detailliert unter Bezug auf den Stamm Actinomadura sp. H710-49 (ATCC 39144) beschrieben wird, mit Hilfe
dieses Mikroorganismus oder mit Hilfe von Mikroorganismen, welche durch die im Rahmen der vorliegenden
Anmeldung angegebenen Charakteristika beschrieben 10 werden, beschränkt ist. Vielmehr umfaßt die Erfindung
den Stamm H710-49 und alle natürlichen und durch Umwandlung hergestellten, BBM1644 produzierenden
Varianten und Mutanten davon.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum BBM-1644 kann hergestellt
werden, indem man einen BBM-1644 produzierenden
Stamm der Gattung Actinomadura, vorzugsweise einen Actinomadura sp.-Stamm, der die Charakteristika des
Stamms ATCC 39144 aufweist,oder einen Mutant davon, in einem üblichen, wäßrigen Nährmedium züchtet. Das
Nährmedium enthält bekannte Nährstoffquellen für
25 Actinomyceten, d.h. assimilierbare Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen, sowie gegebenenfalls anorganische Salze und weitere bekannte Wachstumsfaktoren. Für
die Herstellung großer Mengen an Antibiotikum verwendet man vorzugsweise aerobe Submers-Bedingungen, während
man für die Herstellung geringer Mengen auch Oberflächenkulturen
und Flaschen verwenden kann. Die für die Züchtung anderer Actinomyceten geeigneten, allgemeinen
Verfahren sind auch im Rahmen der Erfindung anwendbar.
1 M/24 163
Das Nährmedium soll eine geeignete, assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Glycerin, L-(+)-Arabinose,
D-Xylose, D-Ribose, D-Glucose, D-Fructose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Cellobiose enthalten. Als
Stickstoffquellen kann man Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,
Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und dergl. entweder allein oder in Kombination mit
organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl und dergleichen^verwenden. Falls
erforderlich, kann man auch anorganische Nährstoffsalze
zugeben, um für Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Ammonium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Carbonat-,
Zink-,, Magnesium-, Mangan-, Kobalt-, Eisenquellen und dergleichen f zu sorgen.
Die Herstellung des Antibiotikums BBM-1644 kann bei
jeder Temperatur erfolgen, die ein zufriedenstellendes Wachstum der Organismen gewährleistet, beispielsweise
bei 20 bis 37 0C. Zweckmäßigerweise arbeitet man bei einer Temperatur um 27 bis 32 0C. Eine optimale
Produktion erhält man gewöhnlicherweise in Schüttelkolben nach einem Inkubationszeitraum von ungefähr
6 bis 7 Tagen. Für eine Tankfermentation ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen,
indem man die Brühenkultur mit einer Schräg-
30 oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur
des Organismus inokuliert. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum hergestellt hat, wird es aseptisch
zu dem Medium des Fermentationstanks gegeben. Die Antibiotikumproduktion kann mit Hilfe des Papierdisk-Agar-Diffusions-Assays
unter Verwendung von Bacillus
\J L. U yj I /
M/24 163
*>
subtilis M45 [Rec Mutant; Mutation Res. V6_, 165-174
(1972)] als Testorganismus verfolgt werden.
Nach dem Ende der Fermentation und nach dem Äbtrennen
der festen Bestandteile der Fermentationsbrühe durch Filtration oder Zentrifugieren findet sich BBM-1644
hauptsächlich im flüssigen Teil der Fermentationsbrühe. Demzufolge kann man die Brühe durch Zentri-
15 fugieren in einen Mycelkuchen und in überstehende Brühe trennen. Das Filtrat wird dann konzentriert
und zur Beseitigung von permeablen Verunreinigungen gegen Leitungswasser unter Verwendung einer semipermeablen
Membran, wie einem Cellophanrohr, dialysiert.
Die im Inneren zurückgehaltene Lösung (nach Entfernen
unlöslichen Materials) f die BBM-1644 enthält, kann
dann mit einem zum Aussalzen geeigneten Reagenz, wie Ammoniumsulfat, gesättigt werden, um BBM-1644
als rohen Feststoff auszufällen. Dieser Feststoff kann dann in Wasser gelöst und durch Dialyse gegen
Leitungswasser entsalzt werden.
Die weitere Reinigung des rohen BBM-1644 kann dann
anhand üblicher, für andere saure Polypeptide verwendeter Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann
die BBM-1644 enthaltende wäßrige Lösung an einem Ionenaustauscher, wie DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose,
CM-Sephadex oder CM-Cellulose, adsorbiert und mit
einer neutralen Salzlösung eluiert werden. Man verwendet vorzugsweise hintereinandergeschaltete
3 3 2 B y 1
Μ/24 163
chromatographische Stufen und als Eluierungsmittel eine Salzlösung mit einem Konzentrationsgradienten.
Die das gereinigte BBM-1644 enthaltenden Fraktionen werden dann durch Lyophilisierung zur Trockne eingeengt.
BBM-1644 wird nach der Lyophilisierung als amorphes, weißes Pulver isoliert. Bei Anwendung einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese
(4500 V in 0,05 M Barbitalpuffer bei pH 8,6) wandert BBM-1644 aufgrund seiner Säurenatur
nach einer Stunde 8,7 cm in Richtung der Anode. BBM-1644 zeigt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt und
zersetzt sich allmählich oberhalb von 240 0C.
Das Antibiotikum ist in Wasser löslich,, aber praktisch unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln,
wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat und n-Hexan. Das Antibiotikum zeigt in einer 0,25 %igen wässrigen
Lösung eine optische Drehung von [α] = -75.6°.
Sein in Figur 2 dargestelltes UV-Spektrum in wäßriger
1 % Lösung hat ein Absorptionsmaximum bei 275 nm (E1 8.2)
und 310 nm (E1 4 ,6 ; Schulter) . Die UV-Spektren einer
wässrigen und einer 0,01 N HCl-Lösung sind nahezu identisch, während das UV-Spektrum einer 0,01 N NaOH-
30 Lösung lediglich ein einziges Maximum bei 285 nm
1 %
(E 8.9) aufweist. Das in KBr vermessene IR-Spektrum von BBM-1644 ist in Figur 1 dargestellt. Das Spektrum
(E 8.9) aufweist. Das in KBr vermessene IR-Spektrum von BBM-1644 ist in Figur 1 dargestellt. Das Spektrum
deutet auf die Anwesenheit von NH und OH Gruppen
-1 -1
(3300 ; 2980 cm ) und Amidgruppen (1650 und 1540 cm )
35 hin.
JJZ.UJ I /
M/24 163
, /93-
Das Antibiotikum gibt positive Reaktionen mit Folin-Lowry7 Xanthoprotein7 Biuret- und Ninhydrin-Reagentien
und entfärbt Kaliumpermanganatlösung. Es verhält sich negativ gegenüber der Anthron- und
Sakaguchi-Reaktion. Bei der Co-Chromotographie an Sephadex G-75 mit Ovalbumin (Molekulargewicht 43 000),
Chymotrypsinogen (25 000) und Ribonuclease A (13 700) wird BBM-1644 kurz nach Chymotrypsinogen eluiert, so
~ daß sein Molekulargewicht auf ungefähr 22 000 geschätzt wird. Die Elementaranalyse von BBM-1644
ergibt für Kohlenstoff 46,60 %, Wasserstoff 6,45 %,
Stickstoff 13,34 % und Schwefel 0,20 %. Die Anwesenheit von 13 verschiedenen Aminosäuren im
BBM-1644-Molekül wurde anhand der in der Tabelle 4
zusammengestellten Aminosäureanalyse gefunden. Aminosäuren wie Lysin, Histidin und Arginin sind in
BBM-1644 nicht vorhanden.
- 1-6 Μ/24 163 _ 20,
Relative Zusammensetzung* der 10 Aminosäure Aminosäuren
Alanin 8.8
Asparaginsäure 6.0
halb-Cystin 1.0
Glutaminsäure 5.7
Glycin 8.7
Isoleucin 2.3
Leucin 1 .0
Phenylalanin 1.4
Prolin 4.1
Serin 1.6
Threonin 7.2
Tyrosin 0.6
Valin 11.1
25
* Der Gehalt an Leucin wurde willkürlich auf festgelegt.
M/24 163
BBM-1644 ist im pH-Bereich von 2 bis 9 relativ stabil,
5 außerhalb dieses Bereichs fällt die Stabilität jedoch stark ab. Eine wäßrige Lösung von BBM-1644 ist bei
50 0C und neutralem pH 2 Stunden stabil. Bei Bestrahlen
mit ultraviolettem Licht geht die antibiotische Aktivität von BBM-1644 innerhalb von 20 Minuten ver-10
loren.
Die oben beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften von BBM-1644 zeigen, daß es zu der Gruppe
der Protein-Antitumor-Antibiotika gehört, welche Neocarzinostatin, Macromomycin und Auromomycin umfaßt.
Von den bekannten Protein-Antitumor-Antibiotika kann BBM-1644 jedoch anhand des Molekulargewichts,
des Aminosäuregehalts und der Papier-Elektrophorese unterschieden werden. Die Papier-elektrophoretischen
Mobilitäten von BBM-1644, Neocarzinostatin und Macromomycin sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Tabelle 5
Papier-Elektrophorese*
Papier-Elektrophorese*
BBM-1644 +87
Neocarzinostatin +31
Macromomycin -20
* 4 500 V, 1 Stunde; Barbitalpuffer pH 8,6.
M/24 163
Die Neocarzinostatin-Antibiotika-Gruppe zeigt üblicherweise
zwei UV-Absorptionsmaxima bei ungefähr 275 und 350 nm, wohingegen BBM-1644 UV-Maxima bei ungefähr
275 und 310 nm besitzt. Vor kurzem wurde in Biochem. Res. Commun. 9J5, 1351-1356 (1980) beschrieben, daß
das Maximum der Neocarzinostatin-Antibiotika bei 350 nm auf Nicht-Proteinchromophoren, welche für
10 die biologische Aktivität ausschlaggebend sind,
zurückzuführen ist. Es ist zu bemerken, daß BBM-1644 einen Chromophor aufweist, der von demjenigen der
bekannten Neocarzinostatin-Antibiotika-Gruppe verschieden
ist.
Die antibakterielle Aktivität von BBM-1644 wurde mit
Hilfe der 2-fach Reihenagarverdünnungsmethode bestimmt. Für grampositive und gramnegative Bakterien verwendete
man Agarnährmedien, für säurebeständige Bakterien Agarnährmedium mit 4 % Glycerin und für Pilze
Sabouraud Agarmedium. Die Aktivität wurde als minimale Hemmkonzentration (MHK) im Agarmedium ausgedrückt,
die Ergebnisse sind in Tabelle 6 denjenigen von Neocarzinostatin gegenübergestellt. BBM-1644 zeigt
eine starke Hemmwirkung gegenüber grampositiven und
säurebeständigen Bakterien, es inhibiert ■ jedoch das Wachstum von gram-negativen Bakterien und Pilzen
nicht. Das antibakterielle Spektrum von BBM-1644 ist ählich demjenigen von Neocarzinostatin, wohingegen die
Aktivität von BBM-1644 (intrinsic activity) in Bezug auf einige Test-Organismen größer ist.
χΜ/24 163
+9 - | |
* | |
Tabelle | 6 |
MHK in mcg/ml Te storgani smus
Staphylococcus aureus FDA 209P Staphylococcus aureus Smith
Streptococcus pyogenes A20201 Micrococcus. luteus PCI 1001
Micrococcus flavus D12 Bacillus subtilis PCI 219 Escherichia coli NIHJ
Klebsieila pneumoniae D-11 Proteus vulgaris A9436
Pseudomonas aeruginosa A9930 Mycobacterium smegmat.is 607 D87
Mycobacterium phlei D88 Candida albicans IAM 4888
25 Die Fähigkeit von BBM-1644, Prophagen bei lysogenen
Bakterien (ILB) zu induzieren wurde anhand der Methode von Lein et al. (Nature 196, 783-784, 1962) unter
Verwendung von Neocarzinostatin als Vergleichsverbindung
bestimmt. Die Bestimmung der Zahl der Plaquen erfolgte
30 bei Agar-Platten, die Testmaterial (T) enthielten und
bei Kontrollplatten (C). Ein T/C-Verhältnis von mehr als 3 wurde als signifikant erachtet. Die ILB-Aktivität
wurde als minimale induzierende Konzentration an Testverbindung ausgedrückt. Wie aus der Tabelle 7
35 ersichtlich ist, ist die ILB-Aktivität von BBM-1644 ähnlich derjenigen von Neocarzinostatin, wobei die
minimale induzierende Konzentration 1 mcg/ml beträgt.
BBM-1644 | Neocarzinostatin |
0.4 | 1.6 |
0.2 | 0.8 |
6.3 | 3.1 |
1.6 | 1.6 |
1.6 | 1 .6 |
0.8 | 3.1 |
>100 | >100 |
7100 | >100 |
>100 | >100 |
>100 | >100 |
12.5 | 50 |
3.1 | 12.5 |
>100 | >100 |
Μ/24 163
Tabelle 7
5
5
ILB-Aktivität (T/C) * 100 10 1 0.1 mcg/ml
BBM-1644 10.4 10.3 6.0 1.2 Neocarzinostatin 28T6 20.4 10.8 0.7
* signifikante Aktivität: T/C von >3.0
Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 wurde bei Mäusen (BDF1 Stamm) gegenüber lynphogytischer - Leukämie P388
bestimmt. Jeder Maus wurden intraperitoneal 3 χ Tumorzellen inokuliert. Das Antibiotikum wurde in
abgestuften Dosierungen Mäusen intraperitoneal 24 Stunden nach der Tumor-Implantatiön verabreicht.
Die Behandlungen erfolgten einmal pro Tag am 1.,
25 4. und 7. Tag (q3d χ 3 Plan) oder neun aufeinanderfolgenden
Tagen (qd 1-»9 Plan). Als Vergleich diente Neocarzinostatin, die Ergebnisse sind in Tabelle 8
zusammengestellt. BBM-1644 war stark wirksam gegenüber Leukämie bei Mäusen in einem Dosisbereich von
0,03~Ί,0 mg/kg/Tag bei beiden Behandlungsarten.
Die Antxtumoraktivität von BBM-1644 war, bezogen auf die minimale effektive Dosis, ungefähr die gleiche
(qd 1-*9 Plan) oder 3-mal stärker (q3d χ 3 Plan) wie
die Aktivität von Neocarcinostatin.
M/24 163
-
-
Antitumor-Aktivität gegenüber Leukämia P388
T/C (%) in MST Dosis in mg/kg/Tag, ip. q3d χ
BBM-1644 | 1 | 0,3 | 0,1 | 0 | ,03 | 0 | ,01 | |
10 | Neocarzinostatin | |||||||
188 | 188 | 138 | 1 | 25 | 1 | 13 | ||
163 | 150 | 125 | 1 | 13 | ||||
in | T/C (%) | in MST | d | 1 | -> 9 | |
Dosis | 0 | mg/kg/Tag, | r iPr q | 1 | ||
0.3 | ,1 0,03 | 0,0 | ||||
BBM-1644 125 175 138 113 Neocarzinostatin 163 138 125 113
* mittlere Überlebenszeit; signifikante Aktivität:
T/C von Λ 125 %
Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 zeigte sich auch anhand eines weiteren Tests gegenüber P388-Leukämie
bei Mäusen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Einzelheiten dieses Tests
sind in Cancer Chemother. Rep. 3_, 1-87 (Teil 3) , 1972 beschrieben.
35
35
M/24 163 | Tabelle 9 | V VV | ΒΒΜ-1644 D.1 | 0.05 | MST | ν V* ν * |
332 | 6917 | |
2.56 | Tage | ||||||||
1.28 | 8.0 | ||||||||
- 22 - | 0.64 | 10.5 | |||||||
< lie. | 0.32 | 15.5 | |||||||
0.16 | 15.0 | Leukämie | |||||||
Effekt von BBM-1644 auf P388 | 0.08 | 13.5 | Effekt | AWC | über | ||||
Behandlungs | 0.04 | 12.0 | MST | gin | leben de am |
||||
plan Dosis,ip | 0.02 | 9.0 | %T/C | d.6 | UP | ||||
Material mg/kg/Inj | D.1,4&7 X·28 | 14.0 | 89 | -4.8 | 6/6 | ||||
Neocarzxno- D.1,4&7 1·6 | 0.64 | 14.5 | 117 | -4.3 | 6/6 | ||||
statin ; QB | 0.32 | 16.5 | 172 | -3.2 | 6/6 | ||||
0.4 | 0.16 | 14.0 | 167 | -2.5 | 6/6 | ||||
0.2 | 0.08 | 12.0 | 150 | -1.2 | 6/6 | ||||
0.1 | 0.04 | 10.5 | 133 | -1.7 | 6/6 | ||||
0.02 | 11.0 | 100 | - | 4/6 | |||||
0.01 | 23.5 | 156 | -4.1 | 6/6 | |||||
QD 1 >9 0.64 | 19.0 . | 161 | -4.9 | 6/6 | |||||
0.32 | 18.5 | 183 | -4.8 | 6/6 | |||||
0.16 | 14.5 | 156 | -4.1 | 6/6 | |||||
0.08 | 12.0 | 133 | -2.8 | 6/6 | |||||
0.04 | 12.0 | 117 | -2.7 | 6/6 | |||||
0.02 | 10.0 | 122 | -2.5 | 6/6 | |||||
0.01 | 10.0 | 261 | -3.3 | 6/6 | |||||
8.0 | 211 | -3.5 | 6/6 | ||||||
0.00S | 10.0 | 206 | -4.3 | 6/6 | |||||
19,0 | 161 | -3.8 | 6/6 | ||||||
18.0 | 133 | -3.3 | 6/6 | ||||||
15.5 | 133 | -2.9 | 6/6 | ||||||
13.0 | 111 | -2.5 | 6/6 | ||||||
12.0 | 111 | -1.9 | 6/6 | ||||||
11.0 | 89 | -5.2 | 6/6 | ||||||
111 | -4.2 | 6/6 | |||||||
211 | -4.3 | 6/6 | |||||||
200 | -4.2 | 6/6 | |||||||
172 | -3.5 | 6/6 | |||||||
144 | -3.3 | 6/6 | |||||||
133 | -2.2 | 6/6 | |||||||
122 | -1.1 | 6/6 |
M/24 163
- 23 -
Tabelle 9, Fortsetzung
Material
Behandlungs plan
Dosis, ip, MST mg/kg/Inj Tage
Effekt
MST
% T/C
MST
% T/C
Über-AWC lebende
gin am 5. d.6 Tag (30)
Kontrolle 107 | Kochsalzlösung | 8.0 | 10/10 |
106 | Kochsalzlösung | 9,0 | -0,3 20/20 |
105 | Kochsalzlösung | 11 ,0 | 10/10 |
104 | Kochsalzlösung | 14,0 | 10/10 |
Tumor-Inokulumj^ 10 ascites Zellen, ip (plus Titration)
Wirt:
Toxisch: Bewertung: Effekt: Beurteilung:
Toxisch: Bewertung: Effekt: Beurteilung:
CDF Mäuse
< 4/6 Mäuse am 5. Tag am Leben MST = mittlere Überlebenszeit
% T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle)x100
% T/C $5-125 als signifikante Antitumoraktivität erachtet.
Die akute Toxizität von BBM-1644 wurde an Mäusen (dd Y Stamm)
nach einer einzigen intraperitonealen Verabreichung bestimmt, wobei sich die LD50 zu 5.8 mg/kg errechnete.
Wie oben gezeigt, besitzt BBM-1644 eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und säurebeständigen
Bakterien und ist somit bei der therapeutischen Behandlung von durch derartige Bakterien hervorgerufenen
infektiösen Erkrankungen bei Säuretieren, einschließlich des Menschen, und weiteren Tieren brauchbar.
Darüberhinaus kann
- 2-4 Μ/24 163
ΒΒΜ-1644 auch für weitere übliche Anwendungsarten
von antibakteriellen Mitteln, beispielsweise für die Desinfektion von medizinischem und zahnärztlichem
Material verwendet werden.
Aufgrund der Induktion von Prophagen bei lysogenen 10 Bakterien und aufgrund der-starken Antitumor-'
Aktivität gegenüber P388-Leukämie bei Mäusen ist BBM-1644 therapeutisch auch für die Inhibierung des
Wachstums von Tumoren bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, brauchbar.
15
15
Die Behandlung einer antibakteriellen Infektion oder eines malignen Tumors erfolgt durch Verabreichung
einer wirksamen antibakteriellen oder tumorinhibierenden Dosis von BBM-1644 oder eines pharmazeutischen Mittels
auf der Grundlage von BBM-1644.
Die Erfindung betrifft auch ein pharmazeutisches Mittel, das eine wirksame antibakterielle oder tumorinhibierende
Menge an BBM-1644 in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel
enthält. Die erfindungsgemäßen Mittel können in jeder zur parenteralen Verabreichung geeigneten
Form hergestellt werden.
30 Derartige Präparate zur parenteralen Verabreichung
umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Die erfindungsgemäßen
Mittel können auch in Form von sterilen Feststoffzusammensetzungen hergestellt werden, welche unmittel-
35 bar vor Gebrauch in sterilem Wasser, phyiologischer
- 25 M/24 163 * £3
Kochsalzlösung oder einem anderen, sterilen, injizierbaren 5 Medium gelöst werden.
Die zur Verabreichung bevorzugten Mengen an BBM-1644
variieren in Abhängigkeit von der speziellen Formulierung, der Art der Verabreichung, der zu behandelnden
Stelle und Erkrankung und dem zu behandelnden Erkrankten. Der Fachmann hat viele Faktoren, die
die Wirkung des Arzneimittels modifizieren können, in Betracht zu ziehen, beispielsweise Alter, Körpergewicht,
Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Art
der Verabreichung, Ausscheidungsrate und Zustand
des Erkrankten, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeit und Schwere der Erkrankung. Die
Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch im Rahmen der maximalen, tolerierbaren Dosis erfolgen.
20 Ausgehend von bestimmten Bedingungen kann die optimale Applikationsrate vom Fachmann unter Zugrundelegung
obiger Richtlinien und unter Verwendung üblicher Tests zur Bestimmung der Dosierung festgelegt werden.
25 Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne sie zu begrenzen. DEAE Cellulose
ist eine Diäthylaminoäthyl-Ionenaustauschercellulose. SEPHADEX G-50 ist ein Filtrationsgel, hergestellt
von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. DEAE SEPHADEX A-50
ist ein Diäthylaminoäthyl-Anionenaustauschergel, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.
SEPHADEX^ ist ein Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Ine.
- 26 -
Μ/24 163
Eine Agar-Schrägkultur mit Actinomadura sp. H710-49-
. Kolonien wurde zur Inokulation eines Impfmediums
(100 ml in einem 500 ml Erlenmeyerkolben), das 1 % Mannit, 2 % Pepton und 1 % Hefeextrakt enthielt,
verwendet, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,2 eingestellt wurde. Die Impfkultur wurde auf
einer Schüttelapparatur (250 üpm) 72 Stunden bei 32 0C inkubiert. 5 ml dieser Kultur wurden in ein
zweites Impfmedium (100 ml) der gleichen Zusammensetzung wie das erste Impfmedium überführt. Die
Züchtung erfolgte unter den gleichen Bedingungen
20 wie für die erste Impfkultur. 5 ml des so hergestellten
Inokulums verwendete man, um die Fermentation in 500 ml Erlenmeyerkolben in Gang zu bringen, welche
100 ml Fermentationsmedium mit einem Gehalt an 2,5 % Mannit, 0,5 % Glucose, 1 % Sojabohnenmehl, 0,5 %
25 Pepton, 1 % Fleischextrakt, 0,3 % CaCO3 und 0,2 %
NaCl enthielten. Die Fermentation erfolgte bei 28 0C auf einer Schüttelapparatur (rotary shaker)
bei 250 Upm. Die Antibiotika-Produktion wurde mit Hilfe des Papierdisc-Agardiffusions-Assays unter
30 Verwendung von Bacillus Subtilis M45 (Rec Mutant) als Testorganismus verfolgt. Die antibiotische Aktivität
der Kulturenbrühe erhöhte sich allmählich mit fortschreitender Fermentation und erreichte nach 6~ 7
Tagen ungefähr 300 mcg/ml.
35
35
-Vt-Μ/24 163
Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbrühe
(18 Liter) trennte man unter Verwendung einer Zentrifuge (sharpless centrifuge apparatus; Kokusan No. 4A)
in Mycelkuchen und überstehende Flüssigkeit. Das Filtrat wurde unterhalb 40 0C auf 1/10 seines ur-
10 sprünglichen Volumens eingeengt und dann unter Verwendung
eines Cellophan-Rohrs (Union Cabide) in einem Kälteraum gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Inneren
zurückgehaltene Lösung wurde auf ungefähr 1,5 1 eingeengt, und zur Entfernung von unlöslichem Material
zentrifugiert (8000 G). Die klare überstehende Flüssigkeit sättigte man mit Ammoniumsulfat und ließ
sie 5 Stunden bei 5 0C stehen. Der gebildete Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren isoliert/ in Wasser (3oo ml) gelöst und mittels Dialyse gegen Leitungswasser
entsalzt. Die dialysierte Lösung (700 ml) enthielt 22 g BBM-1644 als rohen Feststoff; dies konnte
durch Lyophilisierung eines Teils der Lösung gezeigt
werden. Der verbleibende Teil der Lösung wurde zur anschließenden Reinigung ohne Einengung verwendet,
25 um Zersetzung zu vermeiden. Die antibiotische Lösung
wurde über eine DEAE-Cellulosesäule (Cl , 400 ml)
gegeben. Die Säule wurde mit Wasser (1 Liter) gewaschen und mit 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,3 M
Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die Wirkstoff
30 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (300 ml), 18 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert und an
einer DEAE-Cellulose-Säule (400 ml), welche mit 1/15 M
Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert wurde, chromatographiert. Die Säule wurde mit der gleichen
Pufferlösung, die eine steigende Menge Natriumchlorid (0 bis ungefähr 0.2M) enthielt, entwickelt. Das
ό 3 2 b y Ί
— 2£ — Μ/24 163
< 32,
Wirkstoffe enthaltende Eluat wurde mittels Dialyse
5 entsalzt und auf eine DEAE-Sephadex A-50 Säule
(17 ml) gegeben. Die Säule wurde mit 1/15 M Phosphatpuffer
(pH 7,5), der einen Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten (0 bis ungefähr 0,3 M) enthielt, eluiert.
Die wirkstoff-enthaltenden Fraktionen, bestimmt mit Hilfe des B. subtilis M45-Assay wurden vereinigt und
18 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert. Die entsalzte Lösung chromatographierte man an einer
DEAE-Sephadex A-50 Säule (18 ml) "unter Verwendung eines 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,O)-NaCl (0 bis ungefähr
0,3 N) Systems als Eluierungsmittel. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, auf 10 ml eingeengt und
zur Entsalzung auf eine Sephadex G-50 Säule gegeben. Man eluierte die Säule mit entsalztem Wasser und
lyophilisierte das Wirkstoff enthaltende Eluat,
20 wobei man 120 mg eines weißen Pulvers erhielt.
Mit Hilfe der Polyacrylamid~Gelelektrophorese konnte
gezeigt werden, daß die so erhaltene BBM-1644 Probe homogen war.
- 33-Leerseite
Claims (6)
1. Antitumor-Antibiotikum BBM-1644, dadurch gekennzeichnet,
daß es
a) das Wachstum von gram-positiven und säurebeständigen Bakterien wirksam inhibiert;
b) das Wachstum von P388 Leukämie bei Mäusen wirksam inhibiert;
c) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert;
d) in Wasser löslich, aber praktisch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat
und η-Hexan ist;
e) im Infrarot-Spektrum im wesentlichen Maxima bei 3250, 2980, 1650, 1540, 1450, 1400, 1240,
1090 und 940 cm aufweist;
f) im Ultraviolettspektrum in Wasser und 0,01 N
HCl Maxima bei 275 nm (E' 8,2) und 310 nm
1% 1cm
^E1cm 4/6) und in °'01 N Na0H ein Maximura
bei 285 nm (. e]% 8,9) aufweist;
g) in 0,25 %-iger wäßriger Lösung eine optische Drehung von [α]D = -75,6° besitzt;
h) keinen definierten Schmelzpunkt aufweist, aber 35
sich allmählich oberhalb von 240 ?.C zersetzt;
1 M/24 163
i) bei der Papierelektrophorese bei 4500 V unter Verwendung
eines · 0,05 M Barbitalpuffers von pH 8,6 nach einer Stunde etwa 8,7 cm in Richtung
auf die Anode läuft;
j) folgende Elementaranalyse aufweist:
10 C, 46,60 %; H, 6,45 %; N, 13,34 %; S 0,20 %
und O (durch Differenzbildung), 33,41 %;
k) ein hochmolekulares Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 22 000 ist;
1) Kaliumpermanganatlösung entfärbt und positive
Folin-Lowry-, Xanthoprotein-, Biuret- und Ninhydrin-Reaktionen und negative Anthron-
und Sakaguchi-Reaktionen ergibt;
m) nach Hydrolyse die folgende relative Aminpsäurezusammensetzung,
bezogen auf den willkürlich auf 1,0 festgelegten Gehalt an Leucin, aufweist: Alanin (8,8), Asparaginsäure (6,0), HaIb-Cystin
(1,0), Glutaminsäure (5,7), Glycin (8,7), Isoleucin (2,3), Leucin (1,0), Phenylalanin (1,4),
Prolin (4,1), Serin (1,6), Threonin (7,2), Tyrosin (0,6) und Valin (11,1).
M/24 163 - 3 -
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen
BBM-1644 produzierenden Actinomadura sp. Stamm in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Submersbedingungen züchtet.
10
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum BBM-1644 aus dem Kulturmedium
gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der BBM-1644 produzierende Organismus die Charakteristika von Actinomadura Sp. H710-49
20 (ATCC 39144) aufweist.
5. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine wirksame
Menge des Antibiotikums nach Anspruch 1 in Kom-25 bination mit einem pharmazeutischen Träger oder
Verdünnungsmittel.
6. Mikroorganismus Actinomadura sp. (ATCC 39144).
30
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