DE3888004T2

DE3888004T2 - Glycopeptid-Antibiotika pa-45052.

Info

Publication number: DE3888004T2
Application number: DE3888004T
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Hayashi; Toshiyuki Kamigauchi; Yoshimi Kawamura; Masaaki Kobayashi; Eiji Kondo; Takao Konishi; Koichi Matsumoto; Naoki Tsuji
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1987-04-16
Filing date: 1988-04-15
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2008-04-16
Also published as: DE3888004D1; KR880012625A; EP0287110B1; CA1340338C; EP0287110A3; KR960012063B1; US5071749A; EP0287110A2; ES2051786T3

Description

Diese Erfindung betrifft PA-45052-Antibiotika, die durch die folgende Formel dargestellt werden:
(in der R den Rest
oder ein Wasserstoffatom und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet),
ihre pharmazeutisch verträglichen Salze, ihre Herstellung, Organismen, die sie erzeugen, und ein wachstumsstimulierendes Mittel, das mindestens eins von ihnen enthält.
Da Antibiotika in letzter Zeit überall verwendet worden sind, verursacht das Auftauchen mehrfach arzneimittelresistenter Bakterien, insbesondere Methicillin-resistenter Bakterien, ernste Probleme. Die Methicillin-resistenten Bakterien zeigen nicht nur Resistenz gegen Methicillin, sondern auch gegen verschiedene Antibiotika, wie Aminoglykoside, Tetracycline, Cepheme, Penicilline, Carbapeneme und Makrolide.
Es wurde festgestellt, daß Glykopeptide, insbesondere Vancomycine, Wirksamkeit gegen Methicillin-resistente Bakterien zeigen (Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 28, 660-662 (1985)). Vancomycin ist ein wohlbekanntes Antibiotikum (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 33-8450) und neue Vancomycin-Analoga sind entwickelt worden (Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 28, 660-662 (1985), Journal of Antibiotics, 37, 446-453 (1984), 38, 1-8 (1985), 38, 51-57 (1985), Japanisches Offengelegtes Patent Nr. 60-139623, 60-199397, 60-231698, 60-237099 usw.). Andererseits -fanden die vorliegenden Erfinder, daß ein zur Gattung Nocardia gehörender Stamm die Vancomycin-Antibiotika PA-42867-A und PA-42867-B mit starker antibakterieller Wirksamkeit (Japanische Patentanmeldung Nr. 61-14389) erzeugt und außerdem Derivate davon hervorbrachte (Japanische Patentanmeldung Nr. 61-188865). Die PA-45052-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind Vancomycine mit völlig neuen Strukturen, die nicht mit denen der vorstehenden Verbindungen übereinstimmen.
Es ist gut bekannt, daß Glykopeptid-Antibiotika wie Vancomycine das Wachstum bei Tieren stimulieren (zum Beispiel Japanische Ungeprüfte Patentveröffentlichungen Nr. 57-129693, 59-213394, 59-213395, 60-199397, 60-231698, 60-237099, 61-122300, 61-251699, 62-126970 und 61-502335; US-Patente Nr. 4537770 und 4558036; Europäische Patentveröffentlichung Nr. 119575 usw.). Es war jedoch nicht bekannt, daß die Verbindungen dieser Erfindung eine wachstumsfördernde Wirksamkeit besitzen. Jetzt ist Thiopeptin als wachstumsstimulierendes Mittel auf dem Markt.
EP-A-265 071 ist Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC. Dieses Dokument betrifft neue Glykopeptid-Antibiotika der Vancomycin-Gruppe und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika. Insbesondere betrifft dieses Dokument antibiotisches A82846.
EP-A-201 251 betrifft Glykopeptid-Derivate mit antibakterieller Wirksamkeit und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Insbesondere offenbart dieses Dokument auf Seite 6 der Beschreibung die Strukturformel dieser Glykopeptide.
EP-A-231 111 ist Stand der Technik unter Artikel 54(3) EPC und betrifft Glykopeptid-Antibiotika, deren Herstellung und Verwendung in Mikroorganismen zu ihrer Erzeugung. Insbesondere offenbart dieses Dokument den Mikroorganismus Nocardia orientalis PA-42687 (FERM BP-1320) zur Herstellung dieser Glykopeptide.
Die Probleme von durch Methicillin-resistente Bakterien verursachten Infektionen sind klinisch ernst geworden und es ist bekannt, daß Glykopeptid-Antibiotika, insbesondere Vancomycin-Antibiotika, gegen diese wirksam sind. Das dieser Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, neue Vancomycin-Antibiotika mit antibakterieller und wachstumsstimulierender Wirksamkeit bereitzustellen.
Diese Erfindung stellt die Glykopeptid-Antibiotika PA-45052-B und -C bereit, die durch Anlegen einer Kultur von Nocardia orientalis PA-45052 erzeugt werden und starke Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, insbesondere Methicillin-resistente Bakterien zeigen und das Wachstum bei Tieren stimulieren.
Abb. 1 zeigt die Infrarot-Absorptionsspektren von PA-45052-B und PA-45052-C. Abb. 2 stellt die Spektren der Massenanalyse von PA-45052-B und PA-45052-C dar (durch # markierte Peaks sind diejenigen von Standardstoffen zur Markierungskorrektur) und Abb. 3 zeigt die ¹H-NMR-Spektren von PA-45052-B und PA-45052-C.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt der zur Gattung Nocardia gehörende Stamm PA-45052 Verbindungen, die durch die folgende Formel dargestellt werden:
(in der R den Rest
oder ein Wasserstoffatom und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet)
und die eine starke antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, und eine Verbindung, in der R in der Formel den Rest
darstellt und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet, als PA-45052-B bezeichnet, eine weitere Verbindung, in der R ein Wasserstoffatom darstellt und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet, als PA-45052-C bezeichnet. Die vorliegende Erfindung schließt nicht nur diese Verbindungen, sondern auch deren pharmazeutisch verträgliche Salze ein. In dieser Patentschrift beschriebenes PA-45052 bedeutet hauptsächlich eine der zwei vorstehenden Verbindungen, aber in einigen Fällen spezifiziert es alle diese Verbindungen.
Die physikochemischen Eigenschaften der Verbindungen dieser Erfindung sind nachstehend gezeigt. Die Ausdrücke PA-45052-B (HCl) und PA-45052-C (HCl) bedeuten, daß alle von ihnen Hydrochloride sind.

Physikochemische Eigenschaften

Ultraviolett-Absorptionsspektrum PA-45052-B (HCl)
λmax 0,01N HCl nm (E 1% 1 cm): 281,2 (41,1)
λmax 0,01N NaOH.aq nm (E 1% 1 cm): 302,0 (46,8)
PA-45052-C (HCl)
λmax 0,01N HCl nm (E 1% 1 cm): 279,6 (46,7)
λmax 0,01N NaOH.aq nm (E 1% 1 cm): 296,4 (87,0)
Spezifische Drehung
PA-45052-B (HCl)
[α]D25º: -67,3 ± 2 1 (c = 0,51, Wasser) PA-45052-C (HCl)
[α]D25º: -59,9 ± 1,9 (c = 0,52, Wasser)
Infrarot-Absorptionsspektrum IR (KBr) cm&supmin;¹ (Siehe Abb. 1)
PA-45052-B (HCl) 3392, 1665, 1589(sh), 1505, 1423, 1400, 1332, 1231, 1132, 1064, 1015, 892, 848
PA-45052-C (HCl) 3392, 1665, 1624(sh), 1603(sh), 1515, 1501(sh), 1430, 1399, 1233, 1133, 1060, 1002, 889, 848
Massenspektrometrie (SIMS) (Siehe Abb. 2) PA-45052-B (frei) 1448 (M + H)&spplus;
PA-45052-C (HCl) 1286 (M + H)&spplus;
Elementaranalyse
PA-45052-B (HCl) Anal. Ber. für C&sub6;&sub6;H&sub7;&sub5;O&sub2;&sub4;N&sub9;Cl&sub2;·HCl·5H&sub2;O (%): C: 50,21; H: 5,68; N: 7,98; Cl: 6,74 Gefunden (%): C: 50,38; H: 5,60; N: 8,13; Cl: 6,75
PA-45052-C (HCl) Anal. Ber. für C&sub6;&sub0;H&sub6;&sub5;O&sub1;&sub9;N&sub9;Cl&sub2;·2HCl·6H&sub2;O (%): C: 49,09; H: 5,42; N: 8,59; Cl: 9,66 Gefunden (%): C: 49,14; H: 5,49; N: 8,76; Cl: 9,88
Kernresonanzspektrum
¹H-NMR [400 MHz, d&sub6;-DMSO (intern TMS)] {ppm} (Siehe Abb. 3)
PA-45052-B (frei) [Temp. 100ºC]
8,40 (br), 8,29 (d, 6,5), 8,04 (d, 8,5), 7,88 (d, 1,8), 7,52 (dd, 8,4, -2), 7,40 (br-s-ähnlich), 7,34 (br-d, 8,4), 7,27 (d, 8,4), 7,23 (br), 7,15 (d, 2,2), 6,80 (dd, 8,4, 2,2), 6,71 (d, 8,4), 6,45 (br), 6,39 (d, 2,2), 6,38 (d, 2,2), 5,96 (br-d, -11), 5,73 (s-ähnlich), 5,71 (br-d, -8,5), 5,36 (d, 7,4), 5,23 (s-ähnlich), 5,20 (s-ähnlich), 5,14 (d, 4,0), 4,76 (d, 4,0), 4,67 (d, 4,2), 4,52 (d, 6,5), 4,50 (d, -6,5), 4,35 (br-m), 4,23 (br-d, -11), 3,71 (d-ähnlich, 11,5), 3,62 (q-d, 6,0, 9,7), 3,55 (dd, 11,5, 4,5), 3,44 (t-ähnlich), 3,13 (t-ähnlich), 3,1 (m), 2,86 (d, 9,7), 2,55 (dd, 16, 7,2), 2,32 (s), 2,17 (dd, 16, 7,2), 1,90 (br-d, 13,5), 1,77 (m), 1,61 (dd, 13,5, 4,2), 1,52 (m), 1,42 (m), 1,17 (d, 6,0), 1,13 (s), 0,92 (d, 6,5), 0,89 (d, 6,5)
PA-45052-C (HCl) [Temp. 100ºC] 8,63 (br), 8,37 (d, 5,8), 7,96 (br-d, -8,5), 7,80 (br), 7,59 (br-d, -8,5), 7,36 (br), 7,33 (br), 7,30 (br), 7,19 (br), 7,18 (br-s-ähnlich), 6,84 (br-d-ähnlich, -8,5), 6,57 (d, -8,5), 6,43 (d, 2,3), 6,33 (d, 2,3), 5,62 (s-ähnlich), 5,57 (br), 5,23 (s-ähnlich), 5,21 (br), 5,18 (s-ähnlich), 4,87 (br), 4,76 (d, 4,0), 4,57 (d, 5,8), 4,50 (d, 5,8), 4,27 (d, 12,0), 3,63 (q-d, 6,1, 9,5), 3,28 (br-d, -9,7), 2,51 (nicht klar), 2,39 (s), 2,25 (nicht klar), 1,77 (m), 1,61 (m), 1,49 (m), 1,48 (br), 1,23 (d, 6,1), 0,92 (d, 6,5), 0,90 (d, 6,5)
Dünnschichtchromatographie Vorbeschichtete Kieselgel-DC-Platte 60F254 von Merck
Entwicklungslösungsmittel Chloroform : Methanol : konzentriertes Ammoniakwasser sekundäres Butanol : Wasser ( 5 : 10 : 5 : 5 : 2)
PA-45052-B (HCl) Rf = 0,22
PA-45052-C (HCl) Rf = 0,26
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Säule: Cosmosil 5Ph 4,6·150 mm (Nakarai Chemicals, Ltd.)
Detektion: UV 220 nm
Flußrate: 1 ml/min Mobile Phase: 10% Acetonitril-0,05 M Phosphatpuffer (pH 3,5)
PA-45052-B (HCl) Retentionszeit: 9,2 min
Mobile Phase: 17% Acetonitril-0,05 M Phosphatpuffer (pH 3,5)
PA-45052-C (HCl) Retentionszeit: 8,8 min
Säule: Nucleosil 5C8 4,6·150 mm (Chemco)
Detektion: UV 220 nm
Flußrate: 1 Milliliter/Min.
Mobile Phase: 10% Acetonitril-0,05 M Phosphatpuffer (pH 3,5)
PA-45052-B (HCl) Retentionszeit: 8,8 min
Mobile Phase: 17% Acetonitril-0,05 M Phosphatpuffer (pH 3,5)
PA-45052-C (HCl) Retentionszeit: 7,6 min
Färbung: Positiv in Ninhydrin-Reaktion
Löslichkeit: löslich in Wasser und Dimethylsulfoxid, etwas löslich in Methanol und Ethanol und unlöslich in Ether, Benzol, Chloroform und Essigester
Eigenschaften: Amphoterer Stoff, weißes nichtkristallines Pulver
Nach den vorstehenden physikochemischen Eigenschaften sollen die Verbindungen PA-45052 dieser Erfindung die folgenden sterischen Strukturen besitzen.
(Wobei R den Rest
oder ein Wasserstoffatom und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet.)
Wie vorstehend beschrieben, haben die Verbindungen PA-45052 andere Eigenschaften als die bekannten Glykopeptid- Antibiotika, folglich sind sie neue Glykopeptid-Antibiotika.
Der PA-45052-Stamm kann zum Beispiel einer der PA-45052 erzeugenden Organismen sein, der aus einer Bodenprobe isoliert wird. Unter taxonomischen Gesichtspunkten ist der Stamm von der gleichen Art wie Nocardia orientalis und er ist bei dem Fermentation Research Institute (1-3, Higashi 1 chome Tsukubashi Ibaraki-ken, 305 Japan) seit dem 26. März 1987 als Nocardia orientalis PA-45052 (FERM BP-1320) hinterlegt. Hier in dieser Beschreibung bedeutet der PA-45052 erzeugende Organismus einen Stamm, der mindestens eine der Verbindungen PA-45052-B und -C erzeugt.
Die mykologischen Eigenschaften des Stamms sind folgendermaßen.

1) Morphologische Eigenschaften

Dieser Stamm wächst gut in Hefe-Malz-Agar-, Tyrosin- Agar- und Bennett's Agarmedium und die Lufthyphen haften gut daran und die Sporenbildung ist zufriedenstellend. Die Verzweigungen sind einfach ohne guirlständige Verzweigungen. Die Lufthyphen sind verhältnismäßig lang und deren Spitzen sind gerade oder gewellt. Gemäß der Beobachtung unter einem Elektronenmikroskop haben die Sporen eine elliptische zylindrische Form von 0,3 bis 0,5 um in der Breite und 1,2 bis 1,8 um in der Länge und die Oberflächenstruktur ist glatt. Weder Sporangien, geißelförmige Sporen noch Sklerotien können beobachtet werden. 2) Eigenschaften auf Medien (14-tägige Kultivierung bei 28ºC) Kulturmedium Wachstum Lufthyphe Bildung Farbe Farbe der Basalhyphe Lösliches Pigment Saccharose-Nitrat-Agarmedium Gut Weiß Blaßgelblich braun Keines Glucose-Asparagin-Agarmedium Glycerin-Asparagin-Agarmedium Anorganisches Salz-Stärke-Agarmedium Recht Gut Tyrosin-Agarmedium Nähr-Agarmedium Nicht gebildet Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium Hafermehl-Agarmedium Bennett's Agarmedium
Die Farben entsprechen dem "GUIDE TO COLOUR STANDARD" (Japanisches Farbinstitut).
Wachstumstemperatur (14 Tage auf Bennett's Agarmedium bei den folgenden Temperaturen gezüchtet)
10ºC: Kein Wachstum
28ºC: Vorzuziehen für Wachstum, Bildung von Lufthyphen und Sporenbildung
37ºC: Vorzuziehen für Wachstum, Lufthyphen wurden etwas gebildet.
45ºC: Kein Wachstum

3) Physiologische Beschreibungen (28ºC, 14-tägige Züchtung)

Melanoide chromogene Fähigkeit Negativ
Tyrosinasereaktion Negativ
Koagulation von Milch Negativ
Peptonisierung von Milch Positiv
Fähigkeit zur Verflüssigung von Gelatine Positiv
Fähigkeit zur Hydrolyse von Stärke Negativ

4) Nutzung von Kohlenstoffquellen

Beim Wachstum gut genutzte Zucker L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Inosit, Rhamnose, D-Mannit
Beim Wachstum nicht genutzte Zucker Raffinose

5) Zusammensetzung der Zellwand

Diaminopimelinsäure besitzt die meso-Form.
Aus den vorstehenden Eigenschaften wird geurteilt, daß der Stamm ein zur Gattung Nocardia gehörender Stamm ist. Beim Durchsuchen von "The Actinomycetes" (Waxman, Bd. 2, 1961), "International Journal of Systematic Bacteriology" [Report of International Streptomyces Project, Shirling und Gottlieb, Bd. 18 (1968), Bd. 19 (1969), Bd. 22 (1972)], Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Auflage, 1974) und anderen Actinomvces betreffenden Materialien nach einer nah verwandten Art dieses Stamms wurde gefunden, daß Nocardia orientalis (in den folgenden Materialien als Streptomyces orientalis beschrieben: International Journal of Systematic Bacteriology Bd. 18, S. 154-157, 1968, The Actinomycetes Bd. 2, S. 254- 255, 1961) die nächste Art war. Beim Vergleichen der Eigenschaften von Nocardia orientalis mit denjenigen des PA-45052- Stamms stimmten die meisten der Haupteigenschaften gut überein, mit Ausnahme ihrer Saccharosenutzung. Folglich wurde ein PA-45052-Stamm als von der gleichen Art wie Nocardia orientalis identifiziert und wurde Nocardia orientalis PA-45052 benannt.
Alle Stämme, die zur Gattung Nocardia gehören und PA-45052-B und -C erzeugen, und auch der PA-45052-Stamm und seine natürlichen oder künstlichen Varianten können verwendet werden und sind im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen.
PA-45052 werden durch Züchtung eines PA-45052 erzeugenden Stamms in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Gewinnung von PA-45052 aus den Kulturen nach der Züchtung hergestellt. Die allgemeine Herstellung von PA-45052 ist nachstehend beschrieben.
Als Bestandteile und Bedingungen des Mediums können diejenigen angewandt werden, die im allgemeinen bei der Herstellung von Antibiotika verwendet werden. Das Medium enthält im Prinzip eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze. Vitamine und Vorläufer können nach Bedarf zugefügt werden. Kohlenstoffquellen, zum Beispiel Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse und organische Säure, werden allein oder als Gemisch verwendet. Stickstoffquellen, zum Beispiel Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Baumwollensamenpulver, Pepton, Weizenkeim, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat werden allein oder als Gemisch verwendet. Außerdem werden bekannte anorganische Salze, zum Beispiel Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Manganchlorid, Zinksulfat, Kobaltchlorid und Phosphate, dem Medium nach Bedarf zugefügt.
Die Züchtung kann ausgeführt werden, indem man sich nach dem Verfahren richtet, das im allgemeinen zur Herstellung von Antibiotika verwendet wird, vorzugsweise eine Flüssigkultur, und zum Zweck der Massenproduktion ist eine Submers-Belüftungskultur geeignet. Falls der pH-Wert des Mediums schwanken kann, kann dem Medium ein bestimmter Puffer, wie Calciumcarbonat, zugefügt werden. Die Züchtung sollte bei etwa 20 bis 40ºC, vorzugsweise bei 25 bis 32ºC ausgeführt werden. Der Züchtungszeitraum hängt vom Ausmaß der Fermentation ab und 5 bis 7 Tage sind in der Massenproduktion erforderlich. Wenn eine starke Schaumbildung während der Züchtung auftritt, ist es besser, einen Entschäumer, wie Pflanzenöl, Schweineschmalz und Polypropylenglykol in geeigneter Weise vor oder während der Züchtung hinzuzufügen.
Um PA-45052 nach der Züchtung aus der Kultur zu gewinnen, werden zweckmäßigerweise Verfahren verwendet, die normalerweise bei der Gewinnung eines fermentierten Stoffes verwendet werden. Es ist besser, zum Beispiel Filtration, Zentrifugation, Adsorption oder Desorption und Chromatographie unter Verwendung der verschiedensten Ionenaustauscherharze und anderer aktivierter Adsorptionsmittel und Extraktion mit den verschiedensten organischen Lösungsmitteln in geeigneter Weise zu kombinieren.
Zum Zweck der Isolierung oder zu ihrem zweckmäßigen Gebrauch als Arzneimittel für Menschen oder Tiere, ist es manchmal bevorzugt, PA-45052-Salze herzustellen. Die Basen, die mit PA-45052 Salze erzeugen können, sind Alkalimetalle, wie Kalium und Natrium, Erdalkalimetalle, wie Magnesium und Aluminium, während für Säuren anorganische Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, und organische Säuren, wie Essigsäure und Fumarsäure, Beispiele sind.
PA-45052 und deren pharmazeutisch verträgliche Salze können oral oder parenteral an Menschen oder Tiere als Wirkstoffe eines antibakteriellen Mittels verabreicht werden. Sie können oral als Tabletten, Kapseln oder Pulver unter Verwendung allgemein angewandter Träger, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Feuchthaltemittel und Tenside verabreicht werden und andererseits können sie parenteral als Injektionen, Einreibemittel und Zäpfchen verabreicht werden. Die Dosis ist in Abhängigkeit vom Zweck der Therapie, Alter des Patienten und von den Symptomen sehr verschieden, aber hauptsächlich ist 0,1 bis 10 g pro Tag durch intravenöse Injektion für einen Erwachsenen bevorzugt.
Die Verbindungen PA-45052 der vorliegenden Erfindung zeigen starke antibakterielle Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, insbesondere Methicillin-resistente Bakterien, und sind deshalb als Arzneistoffe sowohl für Menschen als auch Tiere wirksam. Da sie in einer hohen Reinheit erhalten werden können, sind sie außerdem zum Gebrauch als Injektionen und auch als orale Arzneistoffe geeignet.
Außerdem fanden die vorliegenden Erfinder, daß die Verbindungen PA-45052 eine starke Wirksamkeit gegen die Gattung Clostridium besitzen und Tiere ein beachtliches Wachstum zeigen, wenn sie mit einem Futter gefüttert werden, dem das PA-45052 zugefügt ist.
Obwohl die Glykopeptide dieser Erfindung selbst oral verabreicht werden können, wird das wachstumsstimulierende Mittel dieser Erfindung im allgemeinen als Gemisch mit üblichen Trägern, wie entfettetes Reismehl, entfettetes Bohnenpulver, Weizenkleie, Kaolin, Talk, Calciumcarbonat, Lactose, Wasser, usw., verabreicht oder vorzugsweise wird ein Futter oder Wasser verabreicht, das dieses Gemisch oder die Glykopeptide selbst enthält. Die darin verwendeten Glykopeptide müssen nicht rein sein; zum Beispiel ist die teilweise gereinigte Kultur des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung anwendbar. Ferner sind auch pharmazeutisch verträgliche Salze der Glykopeptide dieser Erfindung anwendbar; zum Beispiel Salze mit einem Alkalimetall, wie Kalium und Natrium, einem Erdalkalimetall, wie Magnesium, und mit Aluminium, einer anorganischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, und einer organischen Säure, wie Essigsäure und Fumarsäure.
Ein Futter, das ein oder mehrere Glykopeptide dieser Erfindung enthält, kann ein beliebiges sein, das im allgemeinen als Futter für Tiere verwendet wird; zum Beispiel das Gemisch des ganzen oder eines Teils von Mais, Weizenkleie, Reis, Weizen, Baumwollsamenkuchen, Milo, Sojabohnenkuchen, Fischpulver, entfettetem Reismehl, Öl, Alfalfal, Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Vitaminen, wie Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin B&sub1;, Vitamin B&sub2;, Vitamin B&sub6;, Vitamin B&sub1;&sub2;, Calciumpantothenat, Nicotinamid und Folsäure und anorganischen Säuren, wie Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Kobaltsulfat und Kaliumjodid. Außerdem können ein anderes Antibiotikum, keimtötendes Mittel, Anticoccidium und Anthelminthikum zugefügt werden.
Die Konzentration von einem oder mehreren der Glykopeptide dieser Erfindung in einem Futter kann 0,5 bis 100 ppm sein, wenn sie allein, als Gemisch von diesen, als diese enthaltende Zellen oder als diese enthaltender Rohextrakt verwendet werden.
Das wachstumsstimulierende Mittel dieser Erfindung kann im allgemeinen beliebigen Tieren verabreicht werden, zum Beispiel Geflügel, wie Huhn, Truthahn, Ente und Wachtel, und Vieh, wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Nerz und Kaninchen.
Beim Gebrauch des wachstumsstimulierenden Mittels dieser Erfindung können Tiere gemäß den im allgemeinen verwendeten Verfahren gefüttert werden.
Das wachstumsstimulierende Mittel dieser Erfindung fördert nicht nur das Wachstum der Tiere, sondern verbessert auch die Futtereffizienz. Natürlich ist es gegen Infektionen durch Bakterien wirksam. Außerdem besitzt es dadurch ausgezeichnete Eigenschaften, daß es geringe Virulenz für Tiere besitzt und nicht in Tieren akkumuliert. Die LD&sub5;&sub0;-Werte der vorliegenden Verbindungen nach Injektion in Mäuse sind nachstehend gezeigt.
LD&sub5;&sub0; (mg/kg) PA-45052-B 1439

Bezugsbeispiel

Die antimikrobielle Wirksamkeit des PA-45052 dieser Erfindung gegen Clostridium perfringens wurde in vitro und die wachstumsstimulierende Wirksamkeit an Brathähnchenküken untersucht.

1. In vitro-Test an Clostridium perfringens

Eine Gesamtmenge von 11 Stämmen von Cl. perfringens, die aus Kühen und Hühnern gewonnen wurden, wurde verwendet. Beim Messen der Empfindlichkeiten wurde GAM-Agarmedium (Nissui) als Prüfmedium verwendet und gemäß dem Agarplattenverdünnungsverfahren wurde eine anaerobe Züchtung ("gas pack method") ausgeführt. Der MHK-Wert wurde als die minimale Konzentration definiert, bei der nach 24 Stunden Inkubation bei 37ºC eine visuelle Hemmung der Bakterien eindeutig beobachtet wurde.
Es wurde berichtet, daß die antibakterielle Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, insbesondere Cl. perfringens, einer der Parameter der wachstumsstimulierenden Wirksamkeit von Antibiotika beim in vitro-Screening ist (Poultry Science 62, 1633-1638, 1983; Poultry Science 63, 2036-2042, 1984).
Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. In vitro-Wirksamkeit von PA-45052 gegen Cl. perfringens Stamm Herkunft Kuh Huhn

2. Wachstumsstimulationstest an Küken

Die wachstumsstimulierende Wirksamkeit von PA-45052-B an Brathähnchenküken (Arbor acre, 8 Tage alt) wurde unter Verwendung des bekannten Antibiotikums Thiopeptin als Bezugsmittel untersucht. Die Küken wurden mit einem Futterbrei (Konzentration an Rohprotein (CP) 18%, jeweilige Mittelkonzentration 20 ppm, nicht ergänzt mit anderen Antibiotika) 14 Tage in den Batteriebrutapparaten gefüttert. Das Verfahren dieses Experiments war folgendermaßen. Nachdem die Küken 0 bis 8 Tage in einem Bodenlaufstall mit einem Futter (CP-Konzentration 23%) gefüttert wurden, wurden sie in solch einer Weise in 5 Gruppen geteilt (24 Küken pro Gruppe, jeweils 12 männliche und weibliche Küken), daß die Durchschnittsgewichte der Gruppen gleich sind. Jeder Gruppe wurde 14 Tage PA-45052-B (20 ppm), Thiopeptin (20 ppm) oder nur Futter (CP 18%) verabreicht. Jede Gruppe wurde in Käfigen (435·600·410 mm, jeder Käfig hat 6-7 Küken) 14 Tage (bis zu einem Alter von 22 Tagen) bei 26 ± 2ºC gefüttert. Die Wirksamkeit wurde aus der Zunahme im Gewicht und der Futtereffizienz geschätzt.
Die Ergebnisse sind folgendermaßen. Wachstumsstimulierende Wirkung auf Brathähnchenküken Gruppe Ddosis Kükenzahl Gewichtszunahme Futtereffizienz Kontrolle Thiopeptin A: durchschnittliche Gewichtszunahme SD: durchschnittliche aufgenommene Futtermenge FCR: Futtereffizienz (B/A) Der Wert in Klammern ist ein Index für % Kontrollwert.

BEISPIEL

Die vorliegende Erfindung wird in den Beispielen genau beschrieben, die diese Erfindung jedoch nicht beschränken sollen.

(a) Fermentationsverfahren:

Ein 2-Liter Erlenmeyerkolben, beschickt mit 800 ml Kulturmedium, zusammengesetzt aus 0,5% löslicher Stärke, 0,5% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,25% Salz und entionisiertem Wasser (pH 7,0 vor Sterilisation), wird mit einer Stammkultur auf Schrägagar von Nocardia orientalis PA-45052 (FERM BP-1320) beimpft und 48 Stunden bei 28ºC unter Schütteln bei 180 U/min kultiviert. Jeweils 800 ml dieser Kulturlösung werden in einen 50-Liter Glasfermenter überführt, beschickt mit 30 Litern Kulturmedium, zusammengesetzt aus 3,6% Dextrin, 2,4% Melasse, 0,84% Bactopepton, 0,12% L-Tyrosin, 0,05% Entschäumer P-2000 (hergestellt von Dai Nippon Ink & Chemicals Inc.) und Wasser (pH 7,0 vor Sterilisation), und 137 Stunden bei 32ºC unter Belüftung mit 30 Litern/min, einem Innendruck von 0,35 kg/cm²G unter Rühren bei 550 U/min gezüchtet.

(b) Isolationsverfahren:

Die in dem vorstehenden Verfahren erhaltene Kulturlösung wird mit 10%igem Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10,5 eingestellt und 33 Liter Überstand werden durch Zentrifugation erhalten. Nach Einstellen dieses Überstands auf den pH-Wert 7,5 wird er auf eine 3,3-Liter HP-20-Säule aufgebracht (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). Die Säule wird mit 23 Litern Wasser gewaschen und dann mit 10 Litern 15% Methanol-0,005 N Salzsäure und mit 50% Methanol-0,005 N Salzsäure eluiert. Die Fraktionen (9 Liter), die in der "pulp disk diffusion method" unter Verwendung von Bacillus subtilis Wirksamkeit zeigen, werden vereint und auf den pH-Wert 7 eingestellt. Die Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 46,3 g eines Rohpulvers von PA-45052 erhalten werden.

(c) Reinigungsverfahren:

Herstellung von PA-45052-A, -B und -C

Zehn Gramm dieses Rohpulvers werden in 100 ml Wasser suspendiert und in 1 N Salzsäure gelöst, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die Suspension wird auf 100 ml MCI GEL CHP-20P aufgebracht (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), das dann mit 0,01 N Salzsäure, 10% Methanol- 0,01 N Salzsäure, 25% Methanol-0,01 N Salzsäure in dieser Reihenfolge eluiert wird, wobei der Gehalt in der Fraktion durch HPLC überprüft wird, und wird in PA-45052-A und -B enthaltende Fraktionen und eine PA-45052-C enthaltende Fraktion geteilt.
Die PA-45052-A und -B enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 6,0 eingestellt, eingeengt und auf 100 ml CHP-20P aufgebracht, das dann mit Wasser, 30% Methanol-Wasser, 50% Methanol-Wasser in dieser Reihenfolge eluiert wird, wobei der Gehalt durch HPLC überprüft wird. Es wird eine PA-45052-A enthaltende Fraktion und eine PA-45052-B enthaltende Fraktion erhalten. Die PA-45052-A enthaltende Fraktion wird auf den pH- Wert 7,0 eingestellt und eingeengt. Nach ihrem Aufbringen auf eine gepackte Säule RQ-2 (Fujigel Hanbai Co., Ltd.), wird sie mit 13% Acetonitril-0,05 M phosphatgepufferter Lösung (nachstehend mit PBS abgekürzt) (pH 7,0) und mit 15% Acetonitril- 0,05 M PBS (pH 7,0) nacheinander eluiert, wobei die Reinheit durch HPLC überprüft wird. Nach Vereinen der PA-45052-A-Fraktionen (HPLC-Reinheit 95% oder mehr) wird das Gemisch eingeengt und auf 12 ml CHP-20P aufgebracht, das mit Wasser gewaschen und mit 50% Methanol-Wasser eluiert wird. Das erhaltene Eluat wird auf den pH-Wert 4,0 eingestellt, eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 198 mg PA-45052-A (HCl) erhalten werden.
Die PA-45052-B enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt, eingeengt und auf eine gepackte Säule RQ-2 aufgebracht, die nacheinander mit 8% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 3,5) und 10% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 3,5) eluiert wird, wobei die Reinheit durch HPLC überprüft wird. Nach Vereinen der PA-45052-B-Fraktionen (HPLC-Reinheit 95% oder mehr) wird das Gemisch auf den pH-Wert 7,0 eingestellt, eingeengt und auf 12 ml CHP-20P aufgebracht, das mit Wasser gewaschen und mit 50% Methanol-Wasser eluiert wird. Da sie gefärbt ist, wird die Lösung wieder auf den pH-Wert 7,0 eingestellt, eingeengt, dann auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und auf 2 ml CHP-20P aufgebracht, das mit 0,001 N Salzsäure eluiert wird, wobei sie entfärbt wird. Dann werden die Fraktionen von PA-45052-B gesammelt, auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und eingeengt. Die erhaltene Lösung wird auf 12 ml CHP-20P aufgebracht, das mit Wasser gewaschen und mit 50% Methanol-Wasser eluiert wird. Die erhaltene Lösung wird eingeengt, auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und gefriergetrocknet, wobei 290 mg PA-45052-B (HCl) erhalten werden.
Die PA-45052-C enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 8,5 eingestellt und an 100 ml CHP-20P adsorbiert, das mit Wasser und 50% Methanol-Wasser gewaschen und mit 50% Methanol- 0,01 N Salzsäure eluiert wird. Nach Vereinen und Einengen der PA-45052-C enthaltenden Fraktionen wird die Lösung auf eine gepackte Säule RQ-2 aufgebracht, die nacheinander mit 15% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 3,5) und 18% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 3,5) eluiert wird, wobei die Reinheit durch HPLC überprüft wird. Nach Vereinen der PA-45052-C-Fraktionen (HPLC-Reinheit 90% oder mehr) wird die Lösung auf den pH-Wert 8,0 eingestellt, eingeengt und auf 12 ml CHP-20P aufgebracht, das nacheinander mit 18% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 7,0) und 21% Acetonitril-0,05 M PBS (pH 7,0) eluiert wird, wobei die Reinheit durch HPLC überprüft wird. Außerdem wird die Lösung nach Vereinen der Fraktionen von PA-45052-C (HPLC-Reinheit 95% oder mehr) eingeengt und auf 12 ml CHP-20P aufgebracht, das mit Wasser gewaschen, entsalzt und nacheinander mit 50% Methanol- Wasser und 50% Methanol-0,01 N Salzsäure eluiert wird. Das Eluat wird eingeengt, auf den pH-Wert 2,5 eingestellt und gefriergetrocknet, wobei 365 mg PA-45052-C (HCl) erhalten werden.

Herstellung von PA-45052-D

Zwanzig Gramm des Rohpulvers von PA-45052, wie vorstehend beschrieben, werden in 140 ml Wasser suspendiert und in 1 N Salzsäure gelöst, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Diese Lösung wird auf 100 ml MCI GEL CHP-20P (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) aufgebracht, das mit 0,01 N Salzsäure eluiert wird, wobei die Fraktionen durch HPLC überprüft werden. Die PA-45052-B und -D enthaltenden Fraktionen werden auf den pH-Wert 6,4 eingestellt, eingeengt und auf CHP-20P (100 ml) aufgebracht, das wieder mit 0,01 N Salzsäure eluiert wird, wobei eine PA-45052-B und -D enthaltende Fraktion erhalten wird. Die PA-45052-B und -D enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und eingeengt, dann auf eine gepackte Säule RQ-2 (Fujigel Hanbai Co., Ltd.) aufgebracht, die nacheinander mit 0,05 M PBS (pH 7,0), 13% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 15% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 18% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) und 30% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) eluiert wird. Aus dem Eluat mit 30% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) wird eine PA-45052-D enthaltende Fraktion erhalten. Die PA-45052-D enthaltende Fraktion wird eingeengt und an MCI GEL CHP-20P (10 ml) adsorbiert, das mit Wasser gewaschen und nacheinander mit 25% CH&sub3;OH-H&sub2;O und 50% CH&sub3;OH-H&sub2;O eluiert wird. Die entsalzten Fraktionen werden vereint und eingeengt. Nachdem sie mit Salzsäure auf den pH-Wert 4,0 eingestellt worden ist, wird sie gefriergetrocknet, wobei PA-45052-D (665 mg, Hydrochloridsalz) als weißes nichtkristallines Pulver erhalten wird.

Herstellung von PA-45052-E

Zwanzig Gramm des Rohpulvers von PA-45052, wie vorstehend beschrieben, werden in 140 ml Wasser suspendiert und in 1 N Salzsäure gelöst, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Diese Lösung wird auf 100 ml MCI GEL CHP-20P (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) aufgebracht, das mit 0,01 N Salzsäure, 10% Methanol-0,01 N Salzsäure und 25% Methanol-0,01 N Salzsäure in dieser Reihenfolge eluiert wird. Durch Überprüfen der Fraktionen mittels HPLC werden eine PA-45052-A, -B, -D und -E enthaltende Fraktion und eine PA-45052-C und -F enthaltende Fraktion erhalten. Die PA-45052-A, -B, -D und -E enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 6,4 eingestellt und eingeengt, dann auf CHP-20P (100 ml) aufgebracht, das wieder mit 0,01 N Salzsäure eluiert wird, wobei eine PA-45052-A enthaltende Fraktion und eine -B, -D und -E enthaltende Fraktion erhalten werden. Die -B, -D und -E enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt, eingeengt und auf eine gepackte Säule RQ-2 (Fujigel Hanbai Co., Ltd.) aufgebracht, die nacheinander mit 0,05 M PBS (pH 7,0), 13% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 15% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 18% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) und 30% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) eluiert wird. Aus dem Eluat mit 30% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) werden eine -D enthaltende Fraktion und eine -E enthaltende Fraktion erhalten. Die PA-45052-E enthaltende Fraktion wird eingeengt und an MCI GEL CHP-20P (10 ml) adsorbiert. Nachdem sie mit Wasser gewaschen worden ist, wird sie mit 25% CH&sub3;OH-H&sub2;O und 50% CH&sub3;OH-H&sub2;O in dieser Reihenfolge eluiert. Die -E enthaltenden Fraktionen werden vereint und eingeengt. Nach Einstellen auf den pH-Wert 4,0 mit Salzsäure, wird sie gefriergetrocknet, wobei PA-45052-E (245 mg, Hydrochloridsalz) als weißes nichtkristallines Pulver erhalten wird.

Herstellung von PA-45052-F

Die PA-45052-C und -F enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und an CHP-20P (100 ml) adsorbiert. Nachdem es mit Wasser und 50%iger Methanollösung gewaschen worden ist, wird es mit 50% Methanol-0,01 N Salzsäure eluiert. Die PA-45052-C und -F enthaltenden Fraktionen werden eingeengt und auf eine gepackte Säule RQ-2 aufgebracht, die mit 15% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 3,5) und 18% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 3,5) eluiert wird, wobei eine PA-45052-C und -F enthaltende Fraktion erhalten wird. Die PA-45052-C und -F enthaltende Fraktion wird auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und eingeengt und anschließend auf CHP-20P aufgebracht (10 ml), das mit 18% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 21% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0), 30% CH&sub3;CN-0,05 M PBS (pH 7,0) und 50% CH&sub3;CN-0,01 N Salzsäure in dieser Reihenfolge eluiert wird, wobei eine PA-45052-C enthaltende Fraktion und eine PA-45052-F enthaltende Fraktion erhalten werden. Die PA-45052-F enthaltende Fraktion wird eingeengt und an CHP-20P (10 ml) adsorbiert, das zur Entsalzung mit Wasser gewaschen und dann mit 50%iger Methanollösung und 50% Methanol-0,01 N Salzsäure eluiert wird. Nachdem sie eingeengt worden ist, wird sie auf den pH-Wert 2,5 eingestellt und gefriergetrocknet, wobei 30 mg PA-45052-F (Hydrochloridsalz) erhalten werden.

Beispiel 2

(a) Fermentationsverfahren:

Ein 2-Liter Erlenmeyerkolben, beschickt mit 800 ml Kulturmedium, zusammengesetzt aus 0,5% löslicher Stärke, 0,5% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,25% Salz und entionisiertem Wasser (pH 7,0 vor Sterilisation), wird mit einer Stammkultur auf Schrägagar von Nocardia orientalis PA-45052 (FERM BP-1320) beimpft und 48 Stunden bei 28ºC unter Schütteln bei 180 U/min kultiviert. Diese Kulturlösung (800 ml) wird in einen 30-Liter Glasfermenter überführt, beschickt mit 18 Litern Kulturmedium, zusammengesetzt aus den gleichen Bestandteilen wie den vorstehenden, und unter den Bedingungen von 18 Liter/min Belüftung, 0,35 kg/cm²G Innendruck, 200 U/min Rührgeschwindigkeit 23 Stunden bei 32ºC gezüchtet. Dann werden 8 Liter dieser Kultur in einen 250-Liter Fermentationstank überführt, beschickt mit 165 Litern eines Kulturmediums, zusammengesetzt aus 2,0% Kartoffelstärke, 1,0% Glucose, 3,0% Melasse, 1,1% Bactopepton, 0,05% Entschäumer P-2000 (hergestellt von Dai Nippon Ink and Chemicals) und Wasser (pH 7,0 vor Sterilisation), und werden 164 Stunden bei 32ºC mit einer Belüftungsrate von 165 Liter/min, einem Innendruck von 5 psi, bei einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min gezüchtet.

(b) Isolationsverfahren:

Die in dem vorstehenden Verfahren erhaltene Kulturlösung wird mit 10% Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10,5 eingestellt und 140 Liter Überstand werden durch Zentrifugation erhalten. Nach Einstellen dieses Überstands auf den pH-Wert 7,5 wird er auf eine 15 Liter HP-20 Säule (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries) aufgebracht. Nach Waschen mit 23 Litern Wasser und dann mit 30 Litern 15% Methanol-0,005 N Salzsäure wird sie dann mit 50% Methanol-0,005 N Salzsäure eluiert. Dann werden 53 Liter von Fraktionen, die bei der "pulp disk diffusion method" unter Verwendung von Bacillus subtilis Aktivität zeigen, gesammelt und auf den pH-Wert 7 eingestellt. Schließlich wird dieses Gemisch im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 150,8 g des Rohpulvers von PA-45052 erhalten werden.

6) Wirkungen der Erfindung

Die antibakterielle Wirksamkeit in vitro wurde durch das Agarverdünnungsverfahren, wie nachstehend beschrieben, bestimmt.

(1) Herstellung der Bakteriensuspension

Jeweils eine Ösenfüllung jedes Testbakteriums auf Schrägagar wurde in 1 ml eines Wachstumsmediums (Trypto Soy Broth, Eiken Chemical Co.) eingeimpft und 18-20 Stunden bei 37ºC inkubiert. Für das Wachstum von Streptococci wurde Mueller-Hinton-Nährbouillon (Difco) angewandt, ergänzt mit 3% (Vol./Vol.) Pferdeserum. Eine hundertfache Verdünnung der Kultur wurde als Impfstoffsuspension des Bakteriums verwendet.

(2) Probenlösung

Die Probe (9-10 mg) wurde gewogen und in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst.

(3) Agarplatte

Eine Probenlösung wurde nacheinander Zweifachverdünnungen mit sterilem Wasser (2000-0,25 ug/ml) unterworfen. Auf sterile Plastikpetrischalen (9 cm im Durchmesser) wurde ein 0,5 ml-Aliquot der Probenlösungen gegossen und mit 9,5 ml eines Agarmediums (Empfindlichkeitstestagar, "Nissui") gemischt. Für Streptococci wurde Pferdeserum zu 0,5% (Vol./Vol.) zur Verfügung gestellt.

(4) Messung des MHK-Wertes

Eine Ösenfüllung (1,0 ul) der Impfstoffsuspension wurde auf die Oberfläche der wie vorstehend beschrieben hergestellten Agarplatten aufgebracht. Das bakterielle Wachstum wurde nach Inkubation über Nacht (18-20 Stdn.) bei 37ºC visuell untersucht. Die niedrigste Konzentration, bei der das bakterielle Wachstum völlig gehemmt wird, wird als MHK (Minimale Hemm-Konzentration) definiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Testorganismus Staphylococcus aureus FDA 209P JC-1 Staphylococcus aureus SMITH Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus aureus SR14** Staphylococcus aureus SR3131* Staphylococcus aureus SR1626* Staphylococcus aureus SR3626* Streptococcus epidermidis ATCC 14490 Streptococcus pyogenes C-203 Streptococcus pneumoniae Typ I Streptococcus agalactiae SR 1247 Streptococcus faccalis SR 1004 *: Methicillin-resistente Bakterien **: Penicillin-resistente Bakterien
Die antibakterielle Wirksamkeit von PA-45052-B und -C in vivo ist danach in Tabelle 2 gezeigt.
Testverfahren: Der Testorganismus wird weiblichen Slc-ICR-Mäusen (8 Mäuse pro Gruppe) intraperitoneal eingeimpft und PA-45052-B oder -C (Zweifachverdünnung) wird zweimal eine Stunde später und 5 Stunden später subcutan verabreicht.
Ergebnisse: Die zu 50% wirksame Dosis (ED&sub5;&sub0;) wird aus der Überlebensrate an Tag 7 berechnet. Tabelle 2 Testorganismus ED&sub5;&sub0; (mg/kg/Dosis) Staphylococcus aureus SR3637* Staphylococcus aureus SR2030* Streptococcus pneumoniae Typ I Streptococcus pyogenes C-203 *: Methicillin-resistente Bakterien

Beispiel 3

Die Zugabe jeder Verbindung als wachstumsstimulierendes Mittel dieser Erfindung ist nachstehend als Beispiel dargestellt.
(1) Mais 46,45%
Milo 15,00%
Sojabohnenkuchen 5,00%
Fischpulver 3,00%
entfettetes Reismehl 25,00%
Alfalfal 3,00%
Calciumcarbonat 1,00%
Calciumphosphat 0,70%
Natriumchlorid 0,40%
Gemisch aus Vitaminen A, D und E 0,05%
*Gemisch anorganischer Salze 0,1%
**Gemisch aus B-Vitaminen 0,1%
PA-45052-A 10 ppm
*Gemisch anorganischer Salze: Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Kobaltsulfat und Kaliumjodid
**Gemisch aus B-Vitaminen: Vitamine B&sub1;, B&sub2;, B&sub6; und B&sub1;&sub2;, Biotin, Folsäure und Calciumpantothenat
(2) Mais 41,00%
Milo 25,00%
Sojabohnenkuchen 19,10%
Fischpulver 8,00%
Öl 4,00%
Calciumcarbonat 1,40%
Calciumphosphat 0,85%
*Gemisch aus Vitaminen und anorganischen Salze 0,26%
Methionin 0,10%
Natriumchlorid 0,29%
PA-45052-B 20 ppm
*Gemisch aus Vitaminen und anorganischen Salzen:
Vitamine A, D&sub3;, E, B&sub1;, B&sub2;, B&sub6;, B&sub1;&sub2; und K&sub4;, Calciumpantothenat, Nicotinamid, Cholinchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Kobaltsulfat und Kaliumjodid
(3) Mais 78%
Sojabohnenkuchen 9%
Fischpulver 10%
Öl 3,9%
Rohfaser 2,4%
Rohasche 5,1%
Calciumcarbonat 1,07%
Calciumphosphat 0,73%
Gemisch aus Alfalfalschrot, Natriumchlorid und Calciumcarbonat 3
PA-45052-B 20 ppm
(4) Eines oder mehrere von PA-45052 werden in einer dem Vorstehenden ähnlichen Weise gemischt, wobei ein mit dem Mittel ergänztes Futter hergestellt wird.

Claims

1. Verbindung PA-45052 der Formel:

in der R die Gruppe

oder ein Wasserstoffatom und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet, und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze.

2. Verbindung PA-45052-B nach Anspruch 1, wobei R die Gruppe

und R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet.

3. Verbindung PA-45052-C nach Anspruch 1, wobei R und R&sub1; jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten.

4. Verfahren zur Herstellung von PA-45052, umfassend die Züchtung eines PA-45052-produzierenden Organismus, der zur Gattung Nocardia gehört, in einem Medium und Gewinnung des PA-45052 aus dem Kulturmedium.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Organismus zur Art Nocardia orientalis gehört.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Organismus Nocardia orientalis PA-45052 ist.

7. Verwendung eines Organismus, der zur Gattung Nocardia gehört, zur Produktion der Verbindung PA-45052.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Organismus zur Art Nocardia orientalis gehört.

9. Norcardia orientalis PA-45052, FERM BP-l320.

10. Wachstumsstimulierendes Mittel für ein Tier, das eine oder mehrere Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 als Wirkstoff enthält.