DE3876761T2 - Denaturierende reagenzien zur bestimmung von haemoglobinderivaten im blut. - Google Patents
Denaturierende reagenzien zur bestimmung von haemoglobinderivaten im blut.Info
- Publication number
- DE3876761T2 DE3876761T2 DE8888118104T DE3876761T DE3876761T2 DE 3876761 T2 DE3876761 T2 DE 3876761T2 DE 8888118104 T DE8888118104 T DE 8888118104T DE 3876761 T DE3876761 T DE 3876761T DE 3876761 T2 DE3876761 T2 DE 3876761T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hemoglobin
- sample
- denatured
- derivative
- blood sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 55
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 104
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 17
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- -1 ferrous cyanide salt Chemical class 0.000 claims description 9
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 6
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- OXNSNGFUWQVOKD-UHFFFAOYSA-N iron(2+);dicyanide Chemical group [Fe+2].N#[C-].N#[C-] OXNSNGFUWQVOKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 31
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 abstract description 10
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 8
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 abstract description 5
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 25
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical class N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N N-chlorosuccinimide Chemical compound ClN1C(=O)CCC1=O JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDIZZJCWLCMMCS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyfuran-2-carbaldehyde Chemical compound Oc1ccoc1C=O ZDIZZJCWLCMMCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 1
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-M bromate Inorganic materials [O-]Br(=O)=O SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-N bromic acid Chemical compound OBr(=O)=O SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PANJMBIFGCKWBY-UHFFFAOYSA-N iron tricyanide Chemical compound N#C[Fe](C#N)C#N PANJMBIFGCKWBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007817 turbidimetric assay Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
- Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge eines bestimmten Hämoglobinderivats in Blutproben. Insbesondere betrifft die Erfindung die Bestimmung von Hämoglobinderivaten wie glykosiliertem Hämoglobin, welches die gesonderte Messung des Gesamthämoglobins wie auch die Messung des Hämoglobinderivats erfordert, um den Anteil oder Prozentsatz des derivatisierten Hämoglobins im Blut zu bestimmen.
- EP 164960 beschreibt ein analytisches Element und seine Verwendung in einem Vollbluttest.
- Die Bestimmung der relativen Menge von Hämoglobin, das im Blutstrom in einer bestimmten derivatisierten Form vorliegt, die durch in vivo Prozesse erzeugt wurde, ist bei einer Vielzahl von medizinischen Situationen wichtig. Von besonderer Bedeutung ist die Messung von glykosilierten Hämoglobinen. Die Messung von glykosiliertem Hämoglobin zur Erfassung der Langzeit-Blutglukose-Einstellung bei Diabetes mellitus wird mit steigender Häufigkeit eingesetzt. Das wichtigste Derivat von den glykosilierten Hämoglobinen bei der Diabetesbehandlung ist das im allgemeinen als Hämoglobin Alc bekannte Derivat. Dieses Hämoglobinderivat wird in vivo durch nichtenzymatische Reaktion von Glukose mit Hämoglobin erzeugt. Glukose wird kovalent in einer umgelagerten Form an den aminoterminalen Valinrest der beta-Kette im nativen Hämoglobin angeheftet. Bei normalen Individuen beträgt der Anteil am Gesamthämoglobin zwischen ca. 3 bis 6 Prozent der Alc Form, während ein nicht eingestellter Diabetiker bis zu 3 bis 4fach höhere Werte dieses Hämoglobinderivats im Blutstrom aufweisen könnte.
- Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Bestimmung von glykosilierten Hämoglobinen entwickelt worden. Die üblichen Verfahren basieren auf diversen Techniken, wie Kationenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Elektrophorese und Farbstoffkomplexierung (Hydroxyfurfural/Thiobarbitursäure). Diese Techniken sind als mühsam und komplex bekannt, erfordern spezielle technische Fähigkeiten und neigen zur Ungenauigkeit und Nichtspezifität. Jüngst wurden monoklonale Antikörper, die spezifisch für den glykosilierten N-terminalen Peptidrest im Hämoglobin Alc sind, entwickelt, die die Durchführung von Immuntests zur Bestimmung dieses Hämoglobinderivats ermöglichen (siehe US Patent Nr. 4,647,654).
- Die Immuntestbestimmung von Hämoglobin Alc unter Verwendung monoklonaler Antikörper ist hochspezifisch, und das Verfahren ist bedeutend weniger mühsam und komplex als Verfahren aus dem Stand der Technik. Trotzdem erfordern optimale Hämoglobin Alc Immuntests, daß die Blutprobe Denaturierungsbedingungen unterworfen wird, damit der glykosilierte N-terminale Peptidrest für die Antikörperbindung zugänglich wird (siehe US Patent Nr. 4,658,022). Typische Denaturierungsbedingungen waren daher bislang 3 M Guanidin-HCl unter Erhitzen auf 56ºC für 15 Minuten oder länger.
- Eine weitere Beschränkung der bekannten Verfahren einschließlich des Immuntests ist das Erfordernis, daß eine Gesamthämoglobin-Messung mit jeder Bestimmung durchgeführt werden muß, um den Spiegel an glykosiliertem Hämoglobin sinnvoll als Prozentwert auszudrücken. Dies erfordert nur zusätzliche Zeit und Aufwand zur Durchführung des Tests.
- Es wurde nun gefunden, daß ein ziemlich einfacher, rascher und genauer Test für ein bestimmtes Hämoglobinderivat, wie glykosiliertes Hämoglobin, durchgeführt werden kann durch Behandlung einer Blutprobe mit denaturierenden Reagenzien, die (i) ein Thiocyanatsalz zur Denaturierung des Hämoglobins in der Probe und (ii) ein Oxydationsmittel, das zur Umwandlung des Hämoglobins in Met-Hämoglobin in der Lage ist, enthalten, und anschließendes Testen der behandelten Proben auf Gesamt-Met-Hämoglobin und Testen der gleichen Probe oder eines anderen Teils der Probe auf die denaturierte Form des zu bestimmenden Hämoglobinderivats. Die beiden Testergebnisse werden dann zueinander nach einer bestimmten mathematischen Weise in Beziehung gesetzt, z.B. als Prozentwert, um einen quantitativen Meßwert der relativen Menge des Hämoglobinderivats in der Probe zu liefern.
- Met-Hämoglobin wird bequemerweise durch Messung seiner charakteristischen Absorption bei 540 Nanometer (nm) bestimmt. Die denaturierte Form des zu bestimmenden Hämoglobinderivats kann einfach und spezifisch durch einen Immuntest gemessen werden. Eine besonders geeignete Immuntesttechnik basiert auf der Inhibierung der Teilchenagglutinisierung, welche so gestaltet werden kann, daß sie turbidimetrisch bei jeder geeigneten Wellenlänge abgelesen werden kann, sogar bei derselben Wellenlänge wie bei der Met-Hämoglobin Messung, d.h. 540 nm. Daher erlaubt die vorliegende Erfindung die Bestimmung des Gehalts eines Hämoglobinderivats in Prozent, bezogen auf das gesamte Hämoglobin, und ermöglicht Hämoglobinderivatmessungen, die mit einem einfachen Spektralphotometer und mit geeigneten Leerwerten und Optimisierung bei einer einzigen Wellenlänge aufgenommen werden können.
- Es wurde gefunden, daß das Vorliegen eines Oxydationsmittels, welches natives Hämoglobin (Fe&spplus;²) im Blut in die (Fe&spplus;³) Met-Hämoglobin Form umwandelt, synergistisch mit dem Thiocyanat-Denaturierungsmittel unter Steigerung der Denaturierungsgeschwindigkeit des Probenhämoglobins für den Immuntestanteil des Tests wirkt. In Abwesenheit des Oxydationsmittels erfordert die Thiocyanat-Denaturierung bei Raumtemperatur bis zu 7 Minuten, um ein reproduzierbares Ausmaß einer im wesentlichen kompletten Denaturierung zu erreichen. Wenn eine wirksame Menge eines Oxydationsmittels vorliegt kann eine im wesentlichen vollständige Denaturierung in weniger als 3 Minuten erfolgen, und im Fall des bevorzugten Oxydationsmittels Eisen(III)cyanaid kann sie in weniger als 1 Minute bei Raumtemperatur erreicht werden. Die Kombination von Oxydationsmittel und Thiocyanat ermöglicht ebenfalls die Durchführung von Tests auf Gesamthämoglobin und Hämoglobinderivat in der gleichen Probe.
- Die vorliegende Erfindung verkürzt daher bedeutend die Gesamttestzeit und erlaubt die Durchführung eines raschen, einfachen und genauen Met-Hämoglobin/Immuntestverfahrens zur Quantifizierung der relativen Menge eines Hämoglobinderivats, wie Hämoglobin Alc, in einer Blutprobe.
- Die Zeichung ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse einer Korrelationsuntersuchung zwischen der vorliegenden analytischen Methode und einer üblichen Affinitäts-Chromatographie-Methode zur Bestimmung von Hämoglobin Alc in klinischen Proben.
- Die Kombination von Thiocyanatsalz und Oxydationsmittel als denaturierende Reagenzien liefert ein Mittel zur raschen und reproduzierbaren Umwandlung vom im wesentlichen gesamten Hämoglobin in einer Blutprobe in eine denaturierte Thiocyan-Met-Hämoglobin Form. Das erhaltene Thiocyan-Met-Hämoglobin dient als Ausgangsbasis für die Messung des Gesamtprobenhämoglobins, wobei die denaturierte Form des bestimmten zu messenden Hämoglobinderivats als Analyt im Immuntest auf die so denaturierte Spezies dient. Der Immuntest beruht vorzugsweise auf der spezifischen Affinität eines monoklonalen Antikörpers zu dem zu messenden denaturierten Hämoglobinderivat.
- Das Thiocyanatsalz kann ausgewählt sein aus jeder Salzform, die nach Ionisierung ein Thiocyanatanion (SCN&supmin;) liefert, das wirksam die Denaturierung des Hämoglobinderivats für den Nachweis im Test bewirkt. Das Gegenkation wird ausgewählt, um mögliche Beeinträchtigungen mit dem gesamten und derivatisierten Hämoglobintest zu minimieren oder zu eliminieren. Ammonium-, Kalium- und Natriumthiocyanat sind geeignete Salze für den erfindungsgemäßen Zweck. Die Thiocyanatsalzlösung wird zur Blutprobe in ausreichender Menge zugegeben, um eine wirksame Denaturierungskonzentration in der Mischung zu liefern. Im Normalfall wird eine Konzentration von zwischen ca. 0,5 und ca. 6,0 M, bevorzugt zwischen ca. 1,5 und ca. 3,5 M, in der Denaturierungsmischung eingesetzt. Steigende Denaturierungskonzentrationen führen zu einer schnelleren Denaturierung. Ebenfalls steigert die Erhöhung der Temperatur im allgemeinen die Denaturierungsgeschwindigkeit. Bevorzugte Bedingungen sind Denaturierung bei Raumtemperatur in Anwesenheit von Thiocyanat mit einer Konzentration von ca. 3 M oder größer. In Fällen, wo die Konzentration von Thiocyanat in der Denaturierungsmischung so hoch liegt daß die Durchführung des Immuntests auf das Hämoglobinderivat beeinträchtigt werden könnte, z.B. Konzentrationen oberhalb 1,5-2,0 M, wird die Mischung in geeigneter Weise verdünnt.
- Das Oxydationsmittel kann ausgewählt sein aus im wesentlichen jedem anorganischen oder organischen Oxydationsmittel mit geeignetem elektrochemischen Potential, um das native Hämoglobin-Eisen(II)ion in die Eisen(II)-Met-Hämoglobin Form umzuwandeln. Natürlich wird ein Vertreter eines Oxydationsmittels, der nach seinem Oxydationspotential ausgewählt ist, im Testsystem untersucht, um sicherzustellen, daß er nicht wesentlich den Test auf Gesamt- und Derivathämoglobin stört. Es sind eine Vielzahl von Oxydationsmitteln in der Literatur bekannt, die wirksam sind bei der Umwandlung von Hämoglobin in seine Met-Hämoglobin Form - siehe Advances in Clinical Chemistry 8: 142-185 (1965). Oxydationsmittel, die aufgrund ihres Oxydationspotentials geeignet sind, umfassen Eisen(II)cyanid, Jodat, Chlorat, Bromat, Chromat, Quecksilberchlorid, Cer- und Thalliumionen, Hypochlorit, Perjodat, Jodid, Hydroxylamin, Bromsuccinimid, Chlorsuccinimid, Chloramin und Peroxid. Das Ausmaß der Steigerung der Denaturierungskinetik, welches zu einer verkürzten Zeit für die im wesentlichen vollständige Denaturierung führt, wird natürlich entsprechend dem verwen- deten Oxydationsmittel variieren. Empirische Untersuchungen können leicht durchgeführt werden, um eine Auswahl des Oxydationsmittels zu erlauben, das in Kombination mit dem Thiocyanat eine ausreichend rasche Denaturierung liefert.
- Unter einer im wesentlichen vollständigen Denaturierung versteht man im erfindungsgemäßen Kontext den Punkt, bei dem die Denaturierung des Hämoglobins in der Blutprobe im wesentlichen die Maximalmenge des denaturierten Hämoglobinderivats, das unter Verwendung des bestimmten Immuntests nachgewiesen werden kann, zur Verfügung stellt. Daher beabsichtigt das Konzept der vollständigen Denaturierung nicht notwendigerweise die vollständige Auflösung der gesamten Tertiär- und Sekundärstruktur des Hämoglobinproteins, vielmehr die maximale Freilegung des Epitops des durch den ausgewählten Immuntest nachzuweisenden Hämoglobinderivats. Normalerweise basiert der Immuntest auf der Spezifität des monoklonalen Antikörpers für ein einzelnes Epitop, das für das Hämoglobinderivat charakteristisch ist. Daher bedeutet die im wesentlichen vollständige Denaturierung von Hämoglobin in einer Probe, daß im wesentlichen das gesamte Hämoglobin ausreichend denaturiert ist, so daß es im Test voll nachweisbar ist. Man bestimmt die Zeit, die für die im wesentlichen vollständige Denaturierung unter den gegebenen Denaturierungsbedingungen erforderlich ist, durch Durchführung des Hämoglobinderivat-Immuntests in bestimmten Zeitintervallen und Beobachtung des Punkts, bei dem die Testsignalkurve ein Plateau erreicht.
- Das Oxydationsmittel wird in Überschußmengen zugesetzt, z.B. in 5fachem überschuß zur Menge des normalerweise in der Probe vorhandenen Häms. Mengen bis zu 20fachem Uberschuß konnen vorteilhaft eingesetzt werden. Geeignete Mengen für bestimmte Tests können vom Fachmann auf diesen Gebiet bestimmt werden.
- In der Abwesenheit eines Oxydationsmittels erfordert die Thiocyanatdenaturierung bei Raumtemperatur bis zu 7 Minuten, um eine im wesentlichen vollständige Denaturierung zu erreichen. Oxydationsmittel, bei denen gefunden wurde, daß sie diese Denaturierungszeit verringern ohne im wesentlichen den Immuntest zu beeinträchtigen, umfassen Eisen(II)cyanid, Jodat, Chlorat, Chromat und Nitrit. Chlorat und Nitrit wurden als besonders geeignet gefunden, die Denatürierungszeit unter 3 Minuten zu verkürzen, wobei Eisen(II)cyanid die besten Ergebnisse für die im wesentlichen vollständige Denaturierung in weniger als 1 Minute bei Raumtemperatur mit Thiocyanatkonzentrationen von ca. 3 M oder größer liefert.
- Ein Hauptvorteil bei der Verwendung des Thiocyanat/Oxydationsdenaturierungsmittels ist die Möglichkeit, eine rasche Denaturierung bei Raumtemperatur zu erreichen. Die Denaturierung kann jedoch, falls erwunscht, weiter durch Temperaturerhöhung gesteigert werden. Ferner liegt die Verwendung einer Kombination verschiedener Oxydationsmittel mit Thiocyanat ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
- Das Thiocyanat/Oxydations-Denaturierungsmittel-Paar kann mit der Blutprobe nacheinander oder, wie es bevorzugt ist, gleichzeitig vermischt werden. Normalerweise wird eine Denaturierungsreagenslösung des Thiocyanats und Oxydationsmittels hergestellt und direkt mit der Blutprobe vermischt. Aus Stabilitätsgründen wird die Denaturierungsreagenslösung oftmals nur unmittelbar vor Verwendung im Test hergestellt. Wo es jedoch die Stabilität erlaubt oder wo stabilisierende Mittel oder Vorrichtungseinrichtungen verwendet werden, welche das Zusammensein von Thiocyanatsalzen und Oxydationsmittel erlauben, kann die Denaturierungsreagenslösung gelagert und/oder über längere Zeiträume abgepackt sein. Die Denaturierungskomponenten können in trockener Form vorliegen und gemischt oder anders zusammengegeben werden, so daß sie eine Reagenzlösung nach Rehydrierung mit der Testprobe und/oder einem Diluens oder Puffer ergeben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Test auf irgendein Hämoglobinderivat im Blut, welches in seiner denaturierten Form durch einen Immuntest nachgewiesen wird. Solche Hämoglobinderivate umfassen ohne Beschränkung Acetaldehyd-Hämoglobin-Addukte, die bei Alkoholmißbrauch auftreten, Harnstoff-Hämoglobin-Addukte, die im Blut urämischer Patienten vorliegen, Aspirin-Hämoglobin-Komplexe und insbesondere die Familie von glykosilierten Hämoglobinen, die durch nichtenzymatische Reaktion von Glukose mit reaktiven Amingruppen auf dem Hämoglobinprotein gebildet werden. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere bei der Bestimmung von Hämoglobin Alc wie oben definiert anwendbar.
- Die behandelte denaturierte Blutprobe wird getrennt auf das Gesamt-Met-Hämoglobin und auf das zu untersuchende Hämoglobinderivat getestet, wonach die Ergebnisse in eine mathematische Beziehung gesetzt werden, um die Meßwerte der relativen Menge des Bluthämoglobins, das in der zu untersuchenden derivatisierten Form vorliegt, zu erhalten. Das Gesamt-Met-Hämoglobin kann nach jeder üblichen Methode gemessen werden, wie z.B. dem Drabkins-Verfahren (National Commission for Clinical Laboratory Standards of the U.S., Proposed Standard PSH-15). Ein äußerst bequemes Verfahren zur Messung von Gesamt-Met-Hämoglobin wird durch Messung der Absorption in einer Losung bei einer bestimmten Wellenlänge, z.B. 540 nm, erreicht.
- Die Bestimmung des Hämoglobinderivats wird normalerweise durch einen Immuntest durchgeführt. Wie in den zuvor erwähnten US Patenten Nr. 4,647,654 und 4,658,022 beschrieben, können monoklonale Antikörper entwickelt werden, die spezifisch an das Epitop, welches für das Hämoglobinderivat charakteristisch ist, z.B. Hämoglobin Alc, im denaturierten Protein binden. Das bestimmte Immuntestverfahren und -format wie auch die Markierung und Nachweis des erzeugten Signals ist für die vorliegende Erfindung nicht wichtig. Im Prinzip sind nichtradioisotopische Verfahren bevorzugt, wie solche, die auf der Verwendung von Enzymmarkierungen (ELISA) und ähnlichen basieren.
- Ein Verfahren, das inbesondere aufgrund der Tatsache eingesetzt werden kann, daß es ohne Trennungsschritt durchgeführt und eine meßbare Absorptionsveränderung in Abhängigkeit von der Analytkonzentration liefert, ist der Inhibierungsimmuntest einer bestimmten Agglutinisierung. Ein solcher Test basiert auf der spezifischen Wechselwirkung eines Antikörperteilchenreagenses und eines Agglutinatorreagenses. Das Antikörperteilchenreagens enthält den Antikörper oder ein Fragment davon, das an ein wassersuspendierbares Teilchen gebunden ist (z.B. ein Polystyrol oder ein anderer Latex). Das Agglutinatorreagens enthält eine Vielzahl von epitopen Bindungsstellen für das Antikörperreagens. In Abwesenheit des Analyten binden das Antikörperteilchen und das Agglutinatorreagens miteinander unter Bildung eines lichtstreuenden Komplexes, der leicht turbidimetrisch quantifiziert werden kann. Bei Vorliegen steigender Menge an Analyten nimmt die Trübung der Lösung ab, da die Antikörperteilchen an den Analyten binden und nicht an das Agglutinatorreagens binden können. Das Agglutinatorreagens kann geeigneterweise ein Polymergerüst enthalten, an welches eine Anzahl organischer Einheiten, z.B. Peptidreste, angeheftet sind, die das Epitop definieren, welches für das zu untersuchende Hämoglobinderivat charakteristisch ist. Für Hämoglobin Alc Bestimmungen können z.B. die Epitope glykosilierte Peptidreste von wenigen Aminosäureeinheiten enthalten, die der Sequenz des glykosilierten N-terminalen Rests im Hämoglobin Alc entsprechen.
- Die entsprechenden Tests auf Gesamt-Met-Hämoglobin und Derivathämoglobin können mit dem gleichen oder verschiedenen Anteilen der behandelten Blutprobe durchgeführt werden. Im letzten Fall wird zunächst ein Volumenanteil der behandelten Blutprobe direkt auf Met-Hämoglobin getestet, im allgemeinen nach einer geeigneten Verdünnung mit Puffer, und ein zweiter Volumenanteil wird auf das denaturierte Hämoglobinderivat, wie oben beschrieben, getestet. Es ist auch möglich, beide Tests nacheinander mit demselben behandelten Probenvolumenanteil durchzuführen, so z.B. durch Herstellung einer geeigneten Verdünnung der behandelten Probe, Testen auf Thiocyan-Met-Hämoglobin und anschließend entweder Zugabe der Reagenzien für das Immuntestsystem oder Zugabe der Losung zu solchen Reagenzien.
- Unter Verwendung eines geeigneten Immuntests für die Teilchen- Agglutinisierungs-Inhibierung können eine Anzahl von Testvorschriften auf die Denaturierungsmischung angewandt werden, die durch Mischen der Blutprobe mit dem erfindungsgemäßen Denaturierungsmittel gebildet wird.
- Eine Vorschrift umfaßt die Verdünnung eines Teils der Denaturierungsmischung mit Puffer oder Wasser für die Hämoglobinmessung. Ein zweiter Teil der Denaturierungsmischung wird mit einem Antikörperteilchenreagens und dem Agglutinatorreagens für den Immuntest gemischt, der z.B. bei 540 nm entweder nach dem Endpunkt oder der Geschwindigkeitsmessung durchgeführt wird (bei Raumtemperatur oder 37ºC).
- Eine weitere Vorschrift umfaßt die Verdünnung der Denaturierungsmischung mit einer Lösung, die das Agglutinatorreagens enthält. Hämoglobin wird bei 550 nm in dieser Mischung gemessen. Anschließend wird das Antikörperteilchenreagens zugegeben, um den Immuntest zu starten, d.h. die Geschwindigkeitsmessung bei 600 nm.
- In einer weiteren Vorschrift wird die Denaturierungsmischung mit Puffer verdünnt und Hämoglobin gemessen. Die verdünnte Mischung wird anschließend mit dem Antikörperteilchen und Agglutinatorreagenzien gemischt und der Immuntest bei 540 nm durch Geschwindigkeitsmessung gemessen.
- Eine weitere Vorschrift umfaßt die Messung von Hämoglobin direkt in der denaturierten Mischung. Die Antikörperteilchen und Agglutinatorreagenzien in trockener Form werden anschließend in der Denaturierungsmischung gleichzeitig oder nacheinander gelöst (mit oder ohne einer dazwischenliegenden Leerwertablesung) und der Immuntest wie oben durchgeführt.
- Eine besonders geeignete Testvorschrift wird in den folgenden Beispielen beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Testsystem zur Durchführung eines Testverfahrens zur Verfügung, welches ein Thiocyanatsalz, ein Oxydationsmittel und Immuntestreagenzien zur Bestimmung des denaturierten Hämoglobinderivats enthält. Vorzugsweise werden als Immuntestreagenzien solche für ein Teilchen-Agglutinisierungs-Inhibierungssystem, wie oben beschrieben, verwendet. Met-Hämoglobin Reagenzien können ebenfalls enthalten sein, jedoch die bevorzugte Absorptionsmethode zur Bestimmung des Met-Hämoglobins wird natürlich keine anderen Reagenzien als möglicherweise destilliertes Wasser oder einen Pufferverdünner erfordern. Das Testsystem kann in jeder beliebigen Form vorliegen und wird normalerweise in Form eines Testkits vorliegen, das eine abgepackte Kombination von Behältern umfaßt die die Komponenten für das Testsystem enthalten.
- Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht als limitierend ausgelegt werden sollten.
- Erforderliche Materialien:
- 2 % Latexsuspension (0,085 um Durchmesser Polystyrollatex, Seragen, Indianapolis, IN, USA)
- Antikörperlösung (monoklonaler Antikörper hergestellt wie beschrieben im US Patent Nr. 4,647,654, gereinigt aus Ascitesflüssigkeit durch Protein A Affinitäts-Chromatographie (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA))
- 10 mM Glycinpuffer, 0,02 % Azid, pH 9,3
- 100 mM NaCl
- Die Antikörperbeschichtung erfolgt bei einer Latexkonzentration von 0,5 %, und der Antikörper wird normalerweise in einer Endkonzentration von 1 mg/ml in der Beschichtungsreaktion verwendet. Eine Antikörperlösung mit einer 2fachen Konzentration wird durch Verdünnung der erforderlichen Menge des Antikörpers in 10 mM Glycinpuffer mit Zusatz von NaCl unter Erhalt der erwunschten Endleitfähigkeit hergestellt (zwischen 0,5 und 1,8 S m&supmin;¹). Die 2 %ige Latexlosung wird auf eine 2fache Konzentration (oder 1 %) durch Mischung mit dem gleichen Volumen an 10 mM Glycinpuffer verdünnt. Die Reaktion wird durch Zugeben der Latexsuspension in einem Gefäß mit der Antikörperlösung in Gang gesetzt. Die Antikörperlösung wird mit einem Magnetrührer, während das Latex zugegeben wird, gemischt. Alle Lösungen sind bei Raumtemperatur. Das Mischen wird über Nacht fortgesetzt (mindestens 15 Stunden), wobei das Gefäß sorgfältig isoliert wird, so daß keine Erhitzung durch die Platte des Magnetrührers auftritt. Dies kann durch Halten des Gefässes überhalb der Rührerplatte mit einem Luftraum von ca. 1 Inch zur Isolierung erfolgen.
- Nach ca. 15 Stunden Mischzeit wird die erhaltene Suspension zu gleichen Teilen in Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (ca. 10 ml pro Röhrchen) für einen Sorvall SS-34 Rotor (DuPont, Wilmington, DE, USA) aufgeteilt. Die Suspension wird bei 15.000 UPM (2.700 x g) 60 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen. Das Pellet wird zweimal mit 10 mM Glycinpuffer, der das erwünschte Protein zur Beschichtung enthält (typischerweise 1 % proteasefreies Rinderserumalbumin (BSA-pf) erhältlich von Miles Inc., Elkhart, IN, USA), gewaschen. Zur Waschung des Pellets wird ein Volumen von Waschlösung, die dem ursprünglichen Volumen im Röhrchen entspricht, zugegeben. Das Pellet wird durch heftiges Schütteln und kurzzeitige Behandlung mit Ultraschall (10-15 Sekunden zu einem Zeitraum) resuspendiert. Nach der ersten Resuspendierung läßt man den Ab-Latex bei Raumtemperatur vor der nächsten Zentrifugierung stehen. Nach der ersten Resuspendierung und Zentrifugation werden die folgenden Suspensionen, sofort nachdem das Pellet vollständig dispergiert ist, zentrifugiert. Nach dem zweiten Waschvorgang werden die Pellets in einem gleichen Volumen mit dem ursprünglichen Reaktionsvolumen resuspendiert. Die Suspension wird durch ein 0,5 um Filter filtriert und bei 5ºC gelagert.
- Die Konzentration wird durch Messung der Absorption bei 546 nm des ursprünglichen Überstands, dem Überstand aus dem ersten und zweiten Waschvorgang und der 100fachen Verdünnung der Endprobe bestimmt. Die Summe dieser Absorptionswerte wird auf 100 % oder einem Äquivalent von 0,5 % Latex bezogen. Die Absorption der Endprobe wird durch die Summe der Absorptionen zur Berechnung von 100 % dividiert. Die Absorption der 100fachen Verdünnung der Endprobe wird mit 100 multipliziert, um einen Wert für die Absorption der Endprobe zu liefern.
- Probe A546
- Überstand 0,044
- erster Waschvorgang 0,034
- zweiter Waschvorgang 0,021
- abschließend (100x verd.) 0,051 x 100 = 5,1
- 100 % (oder 0,5 % Latex) = 5,10 + 0,044 + 0,034 + 0,021 = 5,199
- Latexkonzentration der Endprobe = (5,1/5,199) x 0,5 % = 0,49 %
- Poly(asparaginsäure) wurde nach dem Verfahren von Alpert J. Chromatography 266: 23 (1983) hergestellt.
- Aminoethanol (80 mM) und 4,9-Dioxy-1,12-dodecandiamin (20 mM) wurden in dimethylformamid (DMF) unter Argon gelöst. Die Lösung wurde mit einer Lösung von Poly(asparaginsäure) (10 mM) und DMF behandelt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde und anschließend bei 70ºC 2 Stunden gerührt. Die Mischung wurde anschließend gekühlt und ein Großteil der Flüssigkeit wurde durch Verdampfung unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wurde wiederholt mit Ether und anschließend mit warmem Tetrahydrofuran gewaschen. Das Produkt wurde verfestigt und durch Filtration gewonnen. Das Rohprodukt wurde in Wasser gelöst und der pH wurde auf neutral eingestellt. Die Lösung wurde anschließend mit einer BioRad P6-DG Entsalzungs-Gelsäule (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) gereinigt. Fraktionen mit dem aminofunktionalisierten Polymer wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Anzahl der Aminogruppe auf dem Polymer wurde durch Habeebs TNBS-Test bestimmt (Anal. Biochem. 14: 328-336 (1966)) und als 22 pro mg Polymer ermittelt.
- Aminofunktionalisierte Poly(asparaginsäure) (10,7 mg) und SMCC (30 mg) wurden in DMF gelöst. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden rühren. Es wurde Eiswasser zur Mischung hinzugegeben und das aktivierte Polymer aus der Mischung mit einer BioRad 6P-DG Gelsäule abgetrennt. Man ließ das aktivierte Polymer anschließend bei Raumtemperatur 3 Minuten mit dem glykosilierten Peptid (20 mg),
- hergestellt nach den in der Europäischen Patentveröffentlichung 185 870 beschriebenen Verfahren, reagieren. Nach der Reaktion wurde das Produkt wieder mit einer 6P-DG Gelsäule gereinigt und lyophilisiert.
- Die Anzahl der Maleinimidogruppen auf dem aktivierten Polymer wurde durch den PDS Test (Grassette und Murray, Arch. Biochem. Biophys. 119: 44-49 (1967)) gemessen und zu 0,46 uMol pro mg Polymer bestimmt. Die Mengen an Glc-Peptid auf den Polymeren wurde durch eine UV/Vis Absorptionsmessung unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten bei 275 nm für Tyrosin gemessen und ebenso zu 0,46 uMol pro mg Polymer bestimmt.
- Der konzentrierte Ab-Latex wird auf die geeignete Konzentration mit 200 mM Glycinpuffer, pH 9, 0,05 % BSA-pf und 0,1 % Natriumazid verdünnt. Im Puffer kann auch Mannitol in einer Konzentration von 4 % vorliegen. Nach Verdünnung wird die Ab-Latexlösung kurz mit Ultraschall behandelt (5 bis 10 Sekunden).
- Eine Arbeitslösung des Agglutinatorreagenses wird aus einer Stammlösung von 1,0 mg/ml hergestellt. Eine Lösung mit 10 ug/ml wird durch Verdünnung der Stammlösung mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 6, mit 0,1 % BSA-pf und 0,1 % Natriumazid hergestellt.
- Blutproben und Kalibrierungsproben auf Blutbasis müssen vor Verwendung denaturiert werden. Zur Verwendung im Test werden Blutproben gut mit einem Überkopfschüttler, wie einem Ames Aliquot-Mixer (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) gemischt. Diese Proben werden anschließend 1:31 mit Denaturierungs/Oxydationsmittel verdünnt (3 M NH&sub4;SCN, 2 mg/ml K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 10 mM Tris, pH 7,5). Das Vorliegen von Eisen(II)cyanid im Denaturierungsmittel erlaubt die Verwendung der verdünnten Probe oder Kalibrierungsprobe zur Verwendung bei der Bestimmung der Hämoglobinkonzentration. Man läßt die Proben mindestens 15 Sekunden vor Messung in einem OPTIMATE Instrument (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) für eine komplette Denaturierung des Proteins und Oxydation des Häms absetzen.
- Es wurden drei verschiedene Verfahren für das OPTIMATE Instrument zur Bestimmung von HbAlc eingesetzt. Zwei davon sind Endpunktformate; eines erfordert die Zugabe von Hand für die Agglutinatorlösung und das andere ist ein vollständig automatisierter Test. Das dritte Testformat ist ein Geschwindigkeitstest. Die folgende Beschreibung erläutert kurz das allgemeine Format der drei Tests.
- 1. Unter Verwendung des Chemistry 37 - Program New Test werden die folgenden Testparameter als USER CHEMISTRY #25 programmiert.
- Units - none
- Test Type - endpoint
- Decimal places - 2
- Dispenser Usage - A
- Lag Time A - 1.200 s (die Zeit zwischen Dispergierung der Reagenzien und Ablesen der Absorption)
- Equil Time - 6 s (die Zeit, während der die Probe in der Kuvette vor dem Ablesen der Absorption gehalten wird)
- Read Time - 5 s (die Zeit, über welche die Daten gesammelt werden, die Absorption wird 7,7 mal/Sek. abgelesen)
- Cuvette Temp - 25ºC
- Standard Conc. - none
- Factor - 1.000 (Faktor, mit dem das Ergebnis multipliziert wird, wandelt in Milliabsorptionseinheiten um)
- Low I/A (Abs) - 2.000 (Einstellung sowohl der niedrigen wie auch der hohen Absorptionsgrenzen auf 2,00 zwingt das
- High I/A (Abs) - 2.000 OPTIMATE, die tatsächlichen Absorptionsablesungen für jede Probe auszudrucken)
- Low Normal - none
- High Normal - none
- Absorbance Filter - 540 nm
- Transport Temp. - room temperature
- Sample Volume - 10 ul
- Reagent Volume - 0,5 ul
- 2. Vor Beginn des Tests ist sicherzustellen, daß die Pipettier/Verdünnungsvorrichtung mit einer 100 ul Probenspritze und einer 1,0 ml Reagensspritze ausgerüstet ist. Die Turrets der Pipettier/Verdünnungsvorrichtung werden auf 10 % (10 ul) für die Probenspritze und 50 % (0,5 ul) für die Reagensspritze eingestellt.
- 3. Mindestens 50 ul der Probe in die OPTIMATE Probengefäße einpipettieren.
- 4. Auffüllung der Pipettier/Verdünnungsvorrichtung mit der Ab-Latex Lösung.
- 5. Manuelles Dispergieren von 25 ul der Agglutinatorlösung in die OPTIMATE Reaktionsgefäße unter Verwendung einer Eppendorf Mehrfachpipette (1,25 ml Spitze, eingestellt = 1). Freilassen des Leergefäßes #60 und anderer Gefäße, in denen keine turbidimetrische Reaktion stattfindet. Einpipettieren von 25 ul Puffer (20 mM Phosphat, pH 6, 0,1 % BSA-pf, 0,1 % Natriumazid) in diese Gefäße.
- 6. Beginn des Chemistry #25 - USER CHEMISTRY #25 Programms entsprechend den Gebrauchsanweisungen. Das OPTIMATE pipettiert anschließend automatisch und füllt die Proben und Ab-Latex in die Reaktionsgefäße und liest die Absorption nach 20 Minuten ab.
- 1. Ausrüsten des OPTIMATE mit einem Gilford Automatic Dispenser mit einer 1,0 ml Spritze. Das Verbindungskabel wird mit Ausgang J4 auf der Rückseite des OPTIMATE verbunden. Die Verwendung dieses externen Dispensers wird ermöglicht durch:
- a. Eingeben Utility 15 und nachfolgendem Sicherheitskode 980456.
- b. Eingeben Utility 50, Check = 0- Option 20.
- Das Turret dieses Dispensers wird auf 50 % (0,5 ml) eingestellt.
- 2. Unter Verwendung des Chemistry 37 - Program New Test werden die folgenden Parameter als USER CHEMISTRY #25 programmiert.
- Units - none
- Test Type - endpoint
- Decimal places - 2
- Dispenser Usage - A and B
- Dispense B from Tower - yes
- Time from Dispense A to Dispense B - 5 s
- Lag Time A - 1.200 s
- Equil Time - 6 s
- Read Time - 5 s
- Cuvette Temp. - 25ºC
- Standard Conc. - none
- Factor - 1.000
- Low I/A (Abs) - 2.000
- High I/A (Abs) - 2.000
- Low Normal - none
- High Normal - none
- Absorbance Filter - 540 nm
- Transport Temp - room temperature
- Sample Volume - 10 ul
- Reagent Volume - 0,1 ul
- 3. Vor Beginn des Tests sicherstellen, daß die Pipettier/Verdünnungsvorrichtung mit einer 100 ul Probenspritze und einer 250 ul Reagensspritze ausgerüstet ist. Die Turrets der Pipettier/Verdünnungsvorrichtung werden auf 10 % (10 ul) für die Probenspritze und 10 % (25 ul) für die Reagensspritze eingestellt. Außerdem sicherstellen, daß eine Immuntestprobe für die Pipettier/Verdünnungsvorrichtung verwendet wird.
- 4. Pipettierung von mindestens 50 ul der Probe in die OPTIMATE Probengefäße.
- 5. Beladen der Pipettier/Verdünnungsvorrichtung mit der Agglutinatorlösung.
- 6. Beladen des externen Dispensers mit Ab-Latex Lösung.
- 7. Beginn des Chemistry #24 - USER CHEMISTRY #24 Programms entsprechend den Gebrauchsanweisungen. Der OPTIMATE pipettiert anschließend und füllt die Proben und Agglutinator in die Reaktionsgefäße, gefolgt vom Zusatz von Ab-Latex 5 Sekunden später. Die Absorption der Reaktion wird nach 20 Minuten abgelesen.
- 1. Ausrüsten des OPTIMATE mit einem Gilford Automatic Dispenser mit einer 1,0 ml Spritze. Das Verbindungskabel wird mit Ausgang J4 auf der Rückseite des OPTIMATE verbunden. Die Verwendung dieses externen Dispensers wird ermöglicht durch:
- a. Eingabe Utility 15 und anschließendem Sicherheitskode 980456.
- b. Eingabe Utility 50, Check = 0, Option 20.
- Das Turret des Dispensers wird auf 50 % (0,5 ml) eingestellt.
- 2. Verwendung des Chemistry 37 - Program New Test, die folgenden Programmparameter werden als USER CHEMISTRY #23 programmiert.
- Units - none
- Test Type - kinetic enzyme
- Decimal places - 2
- Dispenser Usage - A and B
- Dispense B from Tower - yes
- Time from Dispense A to Dispense B - 5 s
- Lag Time A - 20 s
- Equil Time - 5 s
- Read Time - 30 s
- Cuvette Temp. - 30ºC
- Standard Conc. - none
- Factor - 1.000
- Low I/A (Abs) - 2.000
- High I/A (Abs) - 2.000
- Absorbance Filter - 540 nm
- Transport Temp - 30ºC
- Sample Volume - 10 ul
- Reagent Volume - 0,1 ul
- 3. Vor Beginn des Tests sicherstellen, daß die Pipettier/Verdünnungseinrichtung mit einer 100 ul Probenspritze und einer 250 ul Reagensspritze ausgerüstet ist. Die Turrets der Pipettier/Verdünnereinrichtung werden auf 10 % (10 ul) für die Probenspritze und 10 % (25 ul) für die Reagensspritze eingestellt. Auch sicherstellen, daß eine Immuntestprobe für die Pipettier/Verdünnungseinrichtung verwendet wird.
- 4. Pipettieren von mindestens 50 ul der Probe in die OPTIMATE Probengefäße.
- 5. Beladen der Pipettier/Verdünnungseinrichtung mit der Agglutinatorlösung.
- 6. Beladen des externen Dispensers mit Ab-Latex Lösung.
- 7. Beginn Chemistry #23 - USER CHEMISTRY #23 entsprechend der Gebrauchsanweisung. Der OPTIMATE pipettiert anschließend automatisch und füllt die Proben und Agglutinator in die Reaktionsgefäße unter Zusatz von Ab-Latex 5 Sekunden später. Die Absorption dieser Reaktion wird nach einer 14sekündigen Zwischenzeit abgelesen. Die Absorption wird insgesamt über 30 Sekunden abgelesen. Der OPTIMATE bestimmt die lineare Regressionslinie durch seine gesammelten Daten und präsentiert die Daten in Abhängigkeit von der Veränderung der Absorption pro Minute.
- Für alle Blutproben muß die Konzentration des Hämoglobins in der Probe bestimmt werden, um den Prozentwert von HbAlc in der Probe zu berechnen. Für die Bestimmung von HbAlc wird dieselbe denaturierte Probe wie für die Hämoglobinbestimmung nach der folgenden Vorschrift verwendet.
- 1. Verwendung von Chemistry 37 - Program New Test, die folgenden Programmparameter werden als USER CHEMISTRY #26 programmiert.
- Units - none
- Test Type - end point
- Decimal places - 2
- Dispenser Usage - A
- Lag Time A - 300 s
- Equil Time - 6 s
- Read Time - 5 s
- Cuvette Temp. - 25ºC
- Standard Conc. - none
- Factor - 1.000
- Low I/A (Abs) - 2.000
- High I/A (Abs) - 2.000
- Low Normal - none
- High Normal - none
- Absorbance Filter - 540 nm
- Transport Temp - room temperature
- Sample Volume - 70 ul
- Reagent Volume - 0,5 ul
- 2. Vor Beginn des Tests sicherstellen, daß die Pipettier/Verdünnungseinrichtung mit einer 100 ul Probenspritze und einer 1,0 ml Reagensspritze ausgerüstet ist. Die Turrets der Pipettier/Verdünnungseinrichtung werden auf 70 % (70 ul) für die Probenspritze und 50 % (0,5 ul) für die Reagensspritze eingestellt.
- 3. Pipettieren von mindestens 120 ul Probe in die OPTIMATE Probengefäße.
- 4. Beschicken der Pipettier/Verdünnungseinrichtung mit 200 mM Glycin, pH 9 Puffer enthaltend 0,05 % BSA-pf und 0,1 % Natriumazid.
- 5. Beginn des Chemistry #26 - USER CHEMISTRY #26 Programms entsprechend den Gebrauchsanweisungen. Der OPTIMATE pipettiert anschließend automatisch und füllt die Proben und Puffer in die Reaktionsgefäße und liest die Absorption nach 5 Minuten ab.
- Es muß eine Anzahl von Berechnungen durchgeführt werden, um die vom OPTIMATE gelieferte Information in ein % HbAlc Ergebnis umzuwandeln.
- 1. Eine Latex Leerreaktion (500 ul Latex + 35 ul Puffer) ist in jedem Testlauf enthalten. Die Absorption dieser Reaktion muß von jedem anderen Ergebnis abgezogen werden.
- 2. Für alle Blutproben wird der Anteil der Absorption des H åmoglobins an der Reaktion unter Verwendung der Information aus USER CHEMISTRY #26 berechnet. Das Ergebnis für die Absorption, das hier erhalten wird, wird durch sieben geteilt, um die Absorption von 10 ul Blut zu berechnen. Dieser Wert wird anschließend von dem oben erhaltenen Absorptionsergebnis abgezogen.
- 3. Zur Berechnung einer Standardkurve wird ein Kalibrierimmuntest unter Verwendung von Immuntest #37 - Programm New Test programmiert. Die folgenden Parameter werden als USER IMMUNOASSAY #27 programmiert.
- Protocol - #1
- Calibrator Values - Eingabe der zugeordneten Kalibierungswerte für die Glc-Peptidkalibrierungen (als uM HbAlc). Diese sind unabhängig von der Charge des verwendeten Ab-Latex. Die Werte aller anderen Parameter sind nicht wichtig, müssen jedoch eingegeben werden, um die Kalibrierungswerte zu speichern.
- 4. Eine vierte Parameterlogit-Standardkurve wird unter Verwendung von Immuntest #33 erzeugt - Immuntestberechnungen.
- Test # - #27
- Calc Scheme - 1. 4 Param Logit
- Eingabe der Absorptionsergebnisse (minus Latexleerwert) für die Glc-Peptidkalibrierungen
- Der OPTIMATE erzeugt anschließend die Standardkurve unter Berechnung der Standardabweichung der Kurve und die vier Parameter. Nach dessen Abschluß, Berechnung von HbAlc der unbekannten Probe durch Eingabe der Absorption (-ltx blank, -Hb contrib) für alle Proben. Das ausgedruckte Ergebnis ist die uM HbAlc Konzentration.
- 5. Die Konzentration von Hämoglobin in jeder Blutprobe wird unter Einbeziehung der Information aus USER CHEMISTRY #26 berechnet. Die Hämoglobinkonzentration wird zunächst als g/dl berechnet und anschließend zur Bestimmung der mM Konzentration der vorliegenden Hämoglobin β-Ketten verwendet.
- worin 16114.5 = Molekulargewicht einer Hb Untereinheit
- 252 = Verdünnungsfaktor
- 9,79 = Viertel des millimolaren Extinktionskoeffizienten
- 10.000 = Korrektur für die Einheitenumwandlung
- Konzentration von Hämoglobin in mM Beta-Untereinheiten
- mM beta-Hb Untereinheiten
- worin 10 = Umwandlungsfaktor für g/l
- 64.456 = Molekulargewicht von Hämoglobin (vier Untereinheiten)
- 1.000 = Umwandlungsfaktor für mM
- 2 = Umwandlungsfaktor für Hb zu beta-Hb
- 6. Nachdem die uM HbAlc Konzentration und die Hämoglobinkonzentration (beide als Beta-Untereinheiten) bekannt sind, kann das % HbAlc berechnet werden.
- Klinische Proben (71) wurden aus einem örtlichen klinischen Labor erhalten, die Proben nach dem üblichen HbAlc Affinitäts-Chromatographie-Verfahren gemessen hatten (Isolab, Akron, OH, USA). Die Proben wurden wie oben erfindungsgemäß geprüft. Die Korrelation ist in der Zeichnung dargestellt.
- Verschiedene Oxydationsmittel (in 20 molarem Überschuß zur Häm-Konzentration des auf dem Blut basierenden Materials in der Denaturierungsmischung) wurden mit 3M NH&sub4;SCN in 10 mM Tris, pH = 7,5 Puffer gemischt. Die Mischung wurde zur Denaturierung der Blutproben nach dem im obigen Abschnitt Probenherstellung beschriebenen Verfahren denaturiert. Nach Zugabe der Blutproben und nach verschiedenen Zeitintervallen wurde die Immunreaktivität der Proben durch turbidimetrischen Test für den HbAlc Test, wie in der vorhergehenden Abschnitten beschrieben, geprüft. Die minimalen Zeiten, die für die Erzeugung der höchsten Immunreaktivität (und ebenfalls konstanten) erforderlich waren, wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle l gezeigt. Tabelle 1 Einfluß von Oxydations- und Denaturierungsmitteln auf Hämoglobin Denaturierungsmittel Oxydationsmittel Zeit für vollständige Denaturierung (min/Raumtemperatur) * In einem 20 molaren Überschuß zur Häm-Konzentration im Test. ** In einem 200 molaren Überschuß. **** Stört Immuntest
Claims (10)
1. Analytisches Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge
eines bestimmten Hämoglobinderivats in einer Blutprobe, worin die Menge
des Gesamthämoglobins und die Menge des bestimmten Hämoglobinderivats
individuell bestimmt und in Beziehung gesetzt werden, dadurch
gekennzeichnet, daß die Methode die Schritte umfaßt:
(a) Behandlung der Blutprobe mit (i) einem Thiocyanatsalz, das
zur Denaturierung im wesentlichen des gesamten Hämoglobins in der Probe
in der Lage ist und (ii) einem Oxydationsmittel, das zur Umwandlung von
im wesentlichen des gesamten Hämoglobins in der Probe in die
Met-Hämoglobin Form in der Lage ist,
(b) Testen der denaturierten Blutprobe auf die Menge an hierin
vorhandenem Gesamt-Met-Hämoglobin,
(c) Testen der denaturierten Blutprobe durch Immuntest auf die
Menge der denaturierten Form des hierin vorhandenen bestimmten
Hämoglobinderivats und
(d) Inbezugsetzen der Testergebnisse aus Schritten (b) und (c).
2.Verfahren nach Anspruch 1, worin das bestimmte
Hämoglobinderivat Hämoglobin Alc ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin das
Oxydationsmittel ausgewählt ist aus Eisen(II)cyanid, Chlorat und Nitrit.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das
Oxydationsmittel ein Eisen(II)cyanidsalz ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Schritt
(a) bei Raumtemperatur durchgeführt wird und die Konzentration des
Thiocyanatsalzes ca. 3 M oder größer ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin Schritt (b)
durch Messung der Absorption bei ca. 540 nm durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der
Immuntest auf Schritt (c) auf einer Teilchen-Agglutinisierungs-Inhibierung
beruht, worin ein monoklonales Antikörperreagens, das spezifisch für die
denaturierte Form von Hämoglobin Alc ist, an ein wassersuspendierbares
Teilchen gebunden wird, und worin denaturiertes Hämoglobin Alc mit einer
Agglutinatorverbindung mit einer Mehrzahl von epitopen Bindungsstellen
für das Antikörperreagens um Bindung an das Reagensteilchen konkurriert.
8. Testsystem zur Bestimmung der relativen Menge eines
bestimmten Hämoglobinderivats in einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß
das System umfaßt:
(1) ein Thiocyanatsalz, das zur Denaturierung von im
wesentlichen allem Hämoglobin, das normalerweise in der Probe erwartet werden
kann, in der Lage ist,
(2) ein Oxydationsmittel, das zur Umwandlung von im wesentlichen
aller Hämoglobinformen, die normalerweise in einer Blutprobe vorhanden
sind, in ihre Met-Hämoglobin Formen in der Lage ist, wobei das
Oxydationsmittel vorzugsweise Eisen(II)cyanid, Chlorat oder Nitrit ist, und
(3) Reagenzien zum Immuntest der denaturierten Blutprobe, die
durch Vereinigung der Blutprobe mit dem Thiocyanatsalz und
Oxydationsmittel erhalten wird, auf die Menge der denaturierten Hämoglobinform des
darin vorhandenen bestimmten Hämoglobinderivats.
9. Verwendung des Testsystem von Anspruch 8 zur Bestimmung von
Hämoglobin Alc.
10. Testsystem nach Anspruch 8, worin die Immuntestreagenzien
enthalten: (i) einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon,
gebunden an wassersuspendierbare Teilchen und (ii) ein
Agglutinatorreagens mit einer Vielzahl von epitopen Bindungsstellen für das
Antikörperreagens, wodurch die Immuntestreagenzien zur Messung von
denaturiertem Hämoglobin Alc durch Teilchen-Agglutinisierungs-Inhibierung in
der Lage sind.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/118,476 US4970171A (en) | 1987-11-09 | 1987-11-09 | Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3876761D1 DE3876761D1 (de) | 1993-01-28 |
DE3876761T2 true DE3876761T2 (de) | 1993-04-22 |
Family
ID=22378843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE8888118104T Expired - Lifetime DE3876761T2 (de) | 1987-11-09 | 1988-10-31 | Denaturierende reagenzien zur bestimmung von haemoglobinderivaten im blut. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4970171A (de) |
EP (1) | EP0315864B1 (de) |
JP (1) | JP2683572B2 (de) |
AT (1) | ATE83561T1 (de) |
AU (1) | AU601086B2 (de) |
CA (1) | CA1340220C (de) |
DE (1) | DE3876761T2 (de) |
DK (1) | DK174495B1 (de) |
ES (1) | ES2043762T3 (de) |
IE (1) | IE62086B1 (de) |
IL (1) | IL87682A (de) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5162237A (en) * | 1988-04-11 | 1992-11-10 | Miles Inc. | Reaction cassette for preforming sequential analytical assays by noncentrifugal and noncapillary manipulations |
US5151369A (en) * | 1989-07-13 | 1992-09-29 | Miles Inc. | Lithium salts as red blood cell lysing and hemoglobin denaturing reagents |
US5258311A (en) * | 1989-07-13 | 1993-11-02 | Miles Inc. | Lithium salts as red blood cell lysing and hemoglobin denaturing reagents |
IL94724A (en) * | 1989-07-13 | 1994-02-27 | Miles Inc | Decomposition of red blood cells and denaturation of hemoglobin by the use of lithium salts |
US5183739A (en) * | 1990-02-27 | 1993-02-02 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies specific for non-a1c glycated hemoglobin and immunoassay methods |
DE4206932A1 (de) * | 1992-03-05 | 1993-09-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunologische methode zur bestimmung eines haemoglobinderivates |
WO1994000592A1 (en) * | 1992-06-26 | 1994-01-06 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies against glycated low density lipoprotein |
US5372948A (en) * | 1993-03-17 | 1994-12-13 | Miles Inc. | Assay and reaction vessel with a compartmentalized solubilization chamber |
US6043043A (en) * | 1993-04-02 | 2000-03-28 | Bayer Corporation | Method for the determination of hemoglobin adducts |
US5874229A (en) * | 1995-08-07 | 1999-02-23 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Method for avoiding influence of hemoglobin |
JP3269765B2 (ja) | 1995-12-14 | 2002-04-02 | 富士写真フイルム株式会社 | ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法及びその方法に用いる処理試薬 |
US5902731A (en) * | 1998-09-28 | 1999-05-11 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
JPWO2002021142A1 (ja) * | 2000-09-07 | 2004-01-15 | 和光純薬工業株式会社 | 総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定方法 |
DE10054055A1 (de) * | 2000-10-31 | 2002-05-23 | Nmi Univ Tuebingen | Verfahren zur Analyse von Proteinen |
DE60234933D1 (de) * | 2001-04-26 | 2010-02-11 | Dako Denmark As | Pan-spezifischer monoklonaler antikörper der gegen glycosiliertes hämoglobin gerichtet ist |
US6562581B2 (en) | 2001-08-31 | 2003-05-13 | Portascience | Method for quantitative determination of glycated hemoglobin |
US7459127B2 (en) | 2002-02-26 | 2008-12-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Method and apparatus for precise transfer and manipulation of fluids by centrifugal and/or capillary forces |
US7460960B2 (en) * | 2002-05-10 | 2008-12-02 | Epitome Biosystems, Inc. | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
US7618788B2 (en) * | 2002-05-10 | 2009-11-17 | Millipore Corporation | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
US7094354B2 (en) | 2002-12-19 | 2006-08-22 | Bayer Healthcare Llc | Method and apparatus for separation of particles in a microfluidic device |
US7125711B2 (en) | 2002-12-19 | 2006-10-24 | Bayer Healthcare Llc | Method and apparatus for splitting of specimens into multiple channels of a microfluidic device |
DE10305050A1 (de) * | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Roche Diagnostics Gmbh | Analytisches Testelement und Verfahren für Blutuntersuchungen |
US7347617B2 (en) | 2003-08-19 | 2008-03-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Mixing in microfluidic devices |
US20050227370A1 (en) * | 2004-03-08 | 2005-10-13 | Ramel Urs A | Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays |
EP1873522B1 (de) * | 2005-04-14 | 2014-08-13 | Panasonic Healthcare Co., Ltd. | Verfahren zur bestimmung eines hämoglobinderivats sowie reagenszusammensetzung, testkit, analysevorrichtung und analysesystem zur verwendung in dem verfahren |
WO2007077579A1 (en) * | 2006-01-04 | 2007-07-12 | Jawaharlal Nehru University | A novelprocess for detecting human haemoglobin variants |
US7855057B2 (en) * | 2006-03-23 | 2010-12-21 | Millipore Corporation | Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof |
EP3001190B1 (de) * | 2007-01-30 | 2019-04-10 | ARKRAY, Inc. | Verfahren zum nachweis der farbe von phenothiazinderivaten und verfahren zum nachweis einer zielkomponente |
EP2210113B1 (de) | 2007-11-20 | 2015-05-27 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Verfahren zur erkennung von glykiertem hämoglobin |
CN102246036B (zh) * | 2008-12-11 | 2016-01-20 | 积水医疗株式会社 | 含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法 |
CN102893147B (zh) | 2010-03-31 | 2015-10-21 | 积水医疗株式会社 | 血红蛋白类的分析方法 |
WO2016054033A1 (en) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Processes, systems, and devices for hemolysis detection via measurement of methemoglobin |
EP3528950A4 (de) | 2016-10-24 | 2020-05-27 | Biomatrica, INC. | Stabilisierung von nukleinsäuren auf papier |
JP6600123B1 (ja) * | 2018-04-18 | 2019-10-30 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビン分析方法 |
CN112113955B (zh) * | 2020-09-15 | 2022-03-18 | 四川行之智汇知识产权运营有限公司 | 血红蛋白检测卡 |
CN113866406B (zh) * | 2021-10-18 | 2022-09-27 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4247533A (en) * | 1978-05-01 | 1981-01-27 | The Rockefeller University | Hemoglobin A1c radioimmunoassay |
US4255385A (en) * | 1979-10-23 | 1981-03-10 | Abbott Laboratories | Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin |
US4260516A (en) * | 1979-12-07 | 1981-04-07 | Abbott Laboratories | Glycosylated hemoglobin standards |
US4649122A (en) * | 1980-09-02 | 1987-03-10 | Leeco Diagnostics, Inc. | Means for determining percentage of glycohemoglobin in whole blood |
US4407961A (en) * | 1981-03-16 | 1983-10-04 | Sanders James L | Ion-exchange system and method for isolation and determination of glycosylated hemoglobin in human blood |
DE3141146A1 (de) * | 1981-10-16 | 1983-04-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin |
US4880749A (en) * | 1984-06-05 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and its use in a whole blood hemoglobin assay |
US4658022A (en) * | 1985-08-08 | 1987-04-14 | Molecular Diagnostics, Inc. | Binding of antibody reagents to denatured protein analytes |
CA1339952C (en) * | 1984-10-29 | 1998-07-14 | William J. Knowles | Immunoassays for denatured protein analytes, particularly hb alc, and monoclonal antibodies thereto |
US4647654A (en) * | 1984-10-29 | 1987-03-03 | Molecular Diagnostics, Inc. | Peptides useful in preparing hemoglobin A1c immunogens |
DK145385D0 (da) * | 1985-03-29 | 1985-04-01 | Novo Industri As | Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse |
US4800167A (en) * | 1987-04-10 | 1989-01-24 | Abbott Laboratories | Reagent and process for the determination of hemoglobin in blood |
-
1987
- 1987-11-09 US US07/118,476 patent/US4970171A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-09-06 IL IL87682A patent/IL87682A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-09-08 CA CA000576787A patent/CA1340220C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 EP EP88118104A patent/EP0315864B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 ES ES88118104T patent/ES2043762T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 AT AT88118104T patent/ATE83561T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 DE DE8888118104T patent/DE3876761T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-03 AU AU24655/88A patent/AU601086B2/en not_active Ceased
- 1988-11-08 DK DK198806227A patent/DK174495B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-11-08 IE IE335688A patent/IE62086B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-11-08 JP JP63280552A patent/JP2683572B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL87682A0 (en) | 1989-02-28 |
AU601086B2 (en) | 1990-08-30 |
DK622788A (da) | 1989-05-10 |
ATE83561T1 (de) | 1993-01-15 |
IE62086B1 (en) | 1994-12-14 |
DE3876761D1 (de) | 1993-01-28 |
JPH01155268A (ja) | 1989-06-19 |
CA1340220C (en) | 1998-12-15 |
AU2465588A (en) | 1989-05-11 |
DK622788D0 (da) | 1988-11-08 |
DK174495B1 (da) | 2003-04-22 |
EP0315864B1 (de) | 1992-12-16 |
IL87682A (en) | 1992-08-18 |
JP2683572B2 (ja) | 1997-12-03 |
IE883356L (en) | 1989-05-09 |
EP0315864A1 (de) | 1989-05-17 |
ES2043762T3 (es) | 1994-01-01 |
US4970171A (en) | 1990-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3876761T2 (de) | Denaturierende reagenzien zur bestimmung von haemoglobinderivaten im blut. | |
DE3883351T2 (de) | Latex-Agglutinations-Immuntest in Gegenwart von Hämoglobin. | |
DE68921650T2 (de) | Immunoassays. | |
DE69016423T2 (de) | Bestimmungsmethode für glykosyliertes hämoglobin. | |
JP3523878B2 (ja) | ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 | |
DE69817794T2 (de) | Verfahren zur bestimmung des prozentualen anteils von glykosiliertem hämoglobin | |
DE69032422T2 (de) | Reagenzzusammensetzung, Verfahren und Kits zur Quantifizierung von Magnesium oder Calcium und Magnesium | |
DE69419192T2 (de) | Methode zur Bestimmung von Hämoglobinaddukten | |
EP2390664B1 (de) | Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Bindungsreaktionen | |
DE3021208C2 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes und Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten Mittels zur Durchführung des Verfahrens | |
EP0077515B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin | |
Külpmann et al. | Relationship between ionized and total magnesium in serum | |
DE69523027T2 (de) | Kalibrierung und Prüfung von Immunoassays zur Verminderung von Störungen | |
DE69029291T2 (de) | Verwendung von Lithiumsalzen zur Lysis von Erythrozyten und zur Denaturierung von Hämoglobin | |
EP0097472B1 (de) | Methode zur Bestimmung von Calcium in einer flüssigen Probe | |
DE69119399T2 (de) | Reagens und verfahren für serum eisenproben | |
JP3780599B2 (ja) | 抗原抗体反応物質の測定方法 | |
EP0227921B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch bindefähigen Substanz | |
DE68907365T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins leichter Ketten in Urinproben, Komplex von Vorbereitungen zur Erledigung des Verfahrens und damit verbundenes Reagenz. | |
DE69021159T2 (de) | Verfahren zum immunochemischen Bestimmen von Haptenen. | |
Van den Berg et al. | Automating the quantification of heme in feces. | |
Stewart et al. | Characterization of arsenite-complexed xanthine oxidase at room temperature. Spectral properties and pH-dependent redox behavior of the molybdenum-arsenite center. | |
JP3220378B2 (ja) | 総蛋白質の定量方法および定量用試薬 | |
DE69635971T2 (de) | Verfahren zur Messung von Amadori-Verbindungen durch Lichtstreuung | |
Klein et al. | Fluorometry of plasma amino nitrogen, with use of fluorescamine. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |