CN113866406B - 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物检测技术领域，提供了一种糖缺失性转铁蛋白的特异性检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中第一试剂包括：第一缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白复合体和促凝剂，第二试剂包括：第二缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物和保护剂。该试剂盒，能精准的检测人血清、血浆或脑脊液中的糖缺失性转铁蛋白，该试剂盒特异性强；只需一步测试可得出结果，免去样本层析分离的步骤。

Description

一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种糖缺失性转铁蛋白的特异性检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

嗜酒是一个全球问题，可导致无法逆转生理损伤。酒精性肝病(alcoholic liverdisease，ALD)是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。2001年美国食品和药品管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准糖缺失性转铁蛋白(carbohydrate-deficient transferrin,CDT)作为一项用于评估饮酒状况的标志物应用于临床。CDT作为评价饮酒状态的标志物，有较为理想的特异性。尤其是相对于其他肝脏酶类标志物，CDT在肝脏疾病存在时对于酒精摄入表现出更好的特异性和抗干扰能力，更优于其他传统饮酒标志物且特异性更佳。对于由酒精引发的肝脏疾病检测有较好的特异性和敏感性。

转铁蛋白(Transferrin,TRF)主要由肝脏细胞合成，相对分子质量为795,000Da，含有3部分结构域，即1条由679个氨基酸组成的多肽链和2条糖链，2个糖链结合位点分别位于肽链的413号位和611号位，可结合不同的糖链分子。CDT是转铁蛋白的异构体，主要是TRF上的唾液酸(Sialic acid，SA)残基缺失。正常人血清中不同转铁蛋白亚型所占转铁蛋白总量的比例也各不相同，含量最多的是四唾液酸分子亚型，饮酒后体内转铁蛋白所含的唾液酸分子减少，使三唾液酸、双唾液酸、单唾液酸和无唾液酸的转铁蛋白亚型水平升高。有研究表明，占CDT主体部分的无唾液酸转铁蛋白是由于缺失2条糖链所致，临床中将无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白亚型并称为CDT。CDT含量增高多见于嗜酒者体内，并在禁酒一段时间后又会消失，半衰期14天。研究表明，与CDT的绝对定量水平相比，CDT与转铁蛋白总量的比值对于饮酒状态的诊断特异性更高。

目前CDT的检测方法主要有等电聚焦电泳法、色谱法及免疫法等。等电聚焦电泳法为：在具有pH梯度的凝胶上根据不同亚型等电点的不同将其分离，在免疫固定和染色步骤之后可见各类转铁蛋白亚型的条带，最后进行密度计量得到CDT检测结果。这种方法可根据定标曲线，计算出CDT的绝对浓度。色谱法中常用的有阴离子交换色谱分析法，但其敏感性较低；高效液相色谱法也可检测健康人群血样中的遗传性TRF，但柱交换费时且昂贵，限制了其在大规模CDT检测中的应用。近年，通过植物凝集素亲和色谱可从血浆中分离出CDT，随后加入抗人转铁蛋白血清进行定量检测。这种方法相对来说操作简便，在实验室广泛应用。但该方法不能排除TRF的遗传变异和先天糖基化障碍的干扰。TRF的遗传变异可能在除白种人以外的其他人种中较常见，用层析法从TRF中分离的CDT检测，可能会使结果偏高或偏低，导致检测结果不够准确。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒及其制备方法，该试剂盒可以定量检测糖缺失性转铁蛋白，旨在弥补现有技术中检测手段的不足，并且降低了检测成本。

本发明实施例是这样实现的，提供了一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中所述第一试剂包括：第一缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白复合体和促凝剂，所述第二试剂包括：第二缓冲剂和糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物。

优选地，所述第一缓冲剂和第二缓冲剂组分相同，且均为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液和MES缓冲液中的一种。

优选地，所述第一试剂还包括无机盐、表面活性剂、保护剂和防腐剂中的至少一种。

优选地，所述第二试剂还包括保护剂和/或防腐剂。

优选地，所述糖缺失性转铁蛋白复合体包括糖缺失性转铁蛋白和载体，所述糖缺失性转铁蛋白和载体通过物理吸附或共价偶联结合在一起，且一个载体连接2-4个糖缺失性转铁蛋白。

优选地，所述载体为生物大分子，高分子聚合物，亲和素-生物素***或链霉亲和素-生物素***，其中所述生物大分子为牛血清白蛋白、酪蛋白或卵清白蛋白；所述高分子聚合物为多聚氨基酸。

优选地，所述糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物包括糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球，且所述糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球通过共价交联结合在一起，且所述糖缺失性转铁蛋白抗体是特异性结合TRF非糖基化位点的单克隆抗体。

优选地，所述聚苯乙烯微球粒径为50-500nm，且表面带有羧基、氨基、醛基和氯甲基中的一种或多种官能团。

优选地，所述糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球通过碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法或马来酰亚胺法进行共价交联。

优选地，所述促凝剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和葡聚糖20000中的至少一种。

优选地，所述保护剂为BSA、酪蛋白和明胶中的至少一种。

本发明实施例的另一目的在于提供一种制备糖缺失性转铁蛋白的特异性检测试剂盒的方法，包括：

S1制备第一试剂，包括：将载体与糖缺失性转铁蛋白共价偶联制得糖缺失性转铁蛋白复合体，所述载体为生物大分子，高分子聚合物，亲和素-生物素***或链霉亲和素-生物素***，其中所述生物大分子为牛血清白蛋白、酪蛋白或卵清白蛋白；所述高分子聚合物为多聚氨基酸，所述第一试剂还包括第一缓冲剂和促凝剂；

S2制备第二试剂，包括：将糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球通过碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法或马来酰亚胺法进行共价交联制得糖缺失性转铁蛋白抗体微球偶联物，其中所述聚苯乙烯微球粒径为50-500nm，且表面带有羧基、氨基、醛基和氯甲基官能团中的一种或多种，所述第二试剂还包括第二缓冲剂；

S3取待测样品和第一试剂混匀，孵育1-5分钟，加入第二试剂，在340-800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，继续孵育1-5分钟，在340-800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，记录并计算加入所述第二试剂前后的光信号差值，带入标准曲线，获得待测样品中糖缺失性转铁蛋白的含量。

优选地，所述步骤S2中，所述共价交联中含羧基的聚苯乙烯微球的操作包括：用MES或HEPES pH6.0缓冲液将带有官能团的聚苯乙烯微球清洗2-3次，然后用所述缓冲液定容，向其中加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌进行活化，用所述缓冲液清洗定容，将清洗后的微球悬液加入等体积的糖缺失性转铁蛋白抗体溶液中，于搅拌条件加入封闭剂。

本发明提供的检测试剂盒有以下有益效果：

1.本发明提供的特异性糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法检测试剂盒，通过使用特异性结合TRF非糖基化位点的糖缺失性转铁蛋白抗体，能精准的检测人血清、血浆或脑脊液中的糖缺失性转铁蛋白，不检测其他形式的转铁蛋白如遗传变异型及先天性糖基化障碍型(CDG)，该试剂盒特异性强，可准确评价酒精性肝病的状态。

2.本发明提供的特异性糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法检测试剂盒，应用于生化分析仪或特定蛋白分析仪中，只需一步测试可得出结果，免去样本层析分离的步骤，并能实现样本大批量和高通量测试，满足临床需求。

3.本发明提供的特异性糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法检测试剂盒，检测灵敏度高、重复性好，大批量生产工艺稳定。

附图说明

图1是本发明实施例中根据校准品浓度与测得的反应度拟合得到的校准曲线；

图2是本发明实施例5中各稀释浓度与测试均值的线性范围曲线；

图3显示了实施例5中参照试剂盒测试值与本发明实施例的试剂组合测试值的线性回归分析曲线。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种利用免疫比浊法特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，优选还包括校准品和质控品，其中该第一试剂包括：第一缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白复合体和促凝剂，优选还包括无机盐、表面活性剂、保护剂和防腐剂等，所述第二试剂包括：第二缓冲剂和糖缺失性转铁蛋白抗体微球偶联物，优选还包括保护剂和防腐剂等。优选地，所述校准品和质控品分别同时包括：第三缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白抗原、保护剂和防腐剂等。

本发明实施例提供的试剂盒，是利用胶乳增强免疫比浊法，配套全自动生化分析仪或特定蛋白分析仪进行检测，可测试血清、血浆或脑脊液等样本中糖缺失性转铁蛋白的含量，可进行高通量的测试。该试剂盒无需对样本进行预处理，直接上机测试即可得到糖缺失性转铁蛋白的含量。本发明的检测试剂盒不受TRF遗传变异影响，也不受先天性糖基化障碍(CDG)亚型的影响，而且不受TRF不同糖型铁饱和度不同的影响。样本无需层析分离CDT，直接用于检测，2-10分钟内出结果。

具体地，所述第一缓冲剂，第二缓冲剂和第三缓冲剂可以相同或者不同，都可以为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液和MES缓冲液等中的一种。所述无机盐可以是氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾和硫酸镁等的一种或几种。所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂，如曲拉通-100、吐温-20和曲拉通-308等的一种或几种，也可以是两性离子表面活性剂、阴离子或阳离子表面活性剂。所述保护剂为惰性蛋白，可以为例如BSA、酪蛋白和明胶等的一种或几种，优选还包括多元醇或多糖，例如甘油、蔗糖和山梨醇等的一种或几种。所述促凝剂可以是聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖20000等。所述防腐剂可以是叠氮钠、硫柳汞、proClin300等的一种或几种。

具体地，所述第一试剂中糖缺失性转铁蛋白复合体是指糖缺失性转铁蛋白和载体通过物理吸附或共价偶联形成的组合物，所述载体包括生物大分子及高分子聚合物载体等，所述生物大分子为不与糖缺失性转铁蛋白特异性结合的惰性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、卵清白蛋白等；所述高分子聚合物包括多聚氨基酸，如多聚赖氨酸、多聚天冬氨酸等。优选地，所述载体还可包括亲和素-生物素***或链霉亲和素-生物素***。其中，一个载体连接2-4个糖缺失性转铁蛋白。

具体地，所述第二试剂中的糖缺失性转铁蛋白抗体微球偶联物，是指糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球以共价交联形成的复合物。其中所述糖缺失性转铁蛋白抗体是特异性结合TRF非糖基化位点的单克隆抗体，是鼠、或兔抗人单克隆抗体，可以特异性结合CDT而不结合其他形式的TRF(例如完整TRF和遗传变异型及先天性糖基化障碍型(CDG)TRF)；所述的聚苯乙烯微球是表面带官能团的聚苯乙烯微球，官能团可以是羧基、氨基、醛基和氯甲基等中的一种或多种。

优选地，所述的聚苯乙烯微球粒径可以是50-500nm，优选120-300nm。

上述第二试剂中的糖缺失性转铁蛋白抗体微球偶联物制备过程中的共价交联(共价偶联)方法包括但不限于：碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法或马来酰亚胺法等。以羧基聚苯乙烯微球偶联为例，该偶联物的具体制备步骤为：用10-100mMMES pH6.0缓冲液将羧基聚苯乙烯微球清洗2-3次，然后用上述缓冲液定容至0.5-2％(w/v)，向其中加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌15-40分钟进行活化，用10-100mM MES或HEPES缓冲液清洗2-3次，定容至0.5-2％(w/v)，将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.01-0.2％的糖缺失性转铁蛋白抗体溶液中，室温搅拌2-4小时，加入封闭剂，继续室温搅拌2-4小时，用10-100mM MES或HEPES缓冲液清洗2-3次，最终分散在合适的储存液中，制得糖缺失性转铁蛋白抗体微球偶联物。

具体地，所述校准品或质控品中的糖缺失性转铁蛋白抗原，是指人的天然糖缺失性转铁蛋白或重组表达的糖缺失性转铁蛋白。

在本发明一些实施例提供的糖缺失性转铁蛋白检测试剂盒中，该第一试剂的pH为6.0-9.0，表1显示了一些实施例中的具体配方：

表1第一试剂的配方

组分	含量
		缓冲剂	10-500mM
糖缺失性转铁蛋白复合体	0.1-2g/L
		无机盐	0.2-5％(w/v)
表面活性剂	0.005-1％(w/v)
		保护剂	0.1-5％(w/v)
防腐剂	0.05-1％(w/v)
		促凝剂	0.1-3％

在本发明一些实施例提供的糖缺失性转铁蛋白检测试剂盒中，该第二试剂的pH为7.0-9.0，表2显示了第二试剂的具体配方：

表2第二试剂的配方

本发明所述的特异性的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法检测试剂盒可以应用于测定血清、血浆或脑脊液样本中的糖缺失性转铁蛋白含量。测定方法具体为：取适量的血清、血浆或脑脊液样本和第一试剂混匀，孵育1-5分钟后，加入第二试剂，仪器读点记为A1，在340-800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，继续孵育1-5分钟，仪器读点记为A2，在340-800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，记录加入第二试剂后的反应终点A2和反应起始点A1的光信号差值，即反应终点A2与反应起始点A1的透射或散射光信号变化幅度，带入标准曲线中，即可计算样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。本发明可应用于糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒，检测原理可以是透射比浊法或散射比浊法，检验仪器可适用但不限于生化分析和特定蛋白分析仪。

本发明涉及的糖缺失性转铁蛋白单克隆抗体、聚苯乙烯微球、偶联封闭剂、偶联活化剂等均可以通过购买获得。

实施例1.糖缺失性转铁蛋白检测试剂盒的制备

按照表3显示的组分制备第一试剂：

表3第一试剂的一种配方

配制方法：在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按表3加入上述各组分，搅拌全部组分完全溶解，用盐酸调pH为7.5，并用纯化水定容至1L。

按照表4显示的组分制备第二试剂：

表4第二试剂的一种配方

组分	用量
		三羟甲基氨基甲烷	12.1g
蔗糖	10g
		吐温-20	0.05mL
牛血清白蛋白	0.5g
		叠氮化钠	0.95g
糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物	1.5g

在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按表4加入上述各组分，搅拌至各组分全部溶解，用盐酸调节pH值至8.0，并用纯化水定容至1L。

实施例2糖缺失性转铁蛋白-牛血清白蛋白(BSA)复合体的制备本实施例中，糖缺失性转铁蛋白-牛血清白蛋白(BSA)组合物按如下步骤制备：

(1)向50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中加入10mg糖缺失性转铁蛋白，室温磁力搅拌混匀，然后加入10mg BSA，室温搅拌0.5小时；

(2)加入50μL 5％(w/v)戊二醛，室温搅拌2小时；

(3)用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)于4℃透析过夜，换液3次，然后移入50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，含0.09％NaN3,0.9％NaCl)中，于4℃透析过夜，换液3次；

(4)将制备好的糖缺失性转铁蛋白-牛血清白蛋白(BSA)组合物分装，于-20℃保存。

实施例3：糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素复合体的制备本实施例中，糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素组合物按如下步骤制备：

(1)用100mM硼酸盐缓冲液(pH 8.6)对糖缺失性转铁蛋白4℃透析过夜，换液3次；

(2)取1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素用1mL DMSO溶解；

(3)取1mL糖缺失性转铁蛋白溶液(5mg/mL)和200μL N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液混合，室温搅拌2小时；

(4)用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)于4℃透析过夜，换液3次；

(5)取1mg制备好的生物素化糖缺失性转铁蛋白加入0.1mg链霉亲和素，室温搅拌0.5小时；

(6)用Superdex G-200凝胶层析柱(GE公司，货号：17104301)过滤，分离糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素组合物，分装，于-20℃保存。

实施例4糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物的制备

本实施例提供糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物的制备方法，具体操作步骤如下：

用50mM MES pH6.0缓冲液将羧基聚苯乙烯微球清洗3次，然后用上述MES缓冲液定容至羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)，向其中加入过量于羧基密度的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌30分钟进行活化，用50mM MES pH6.0缓冲液清洗3次，定容至混合液中羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)，将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.05％的糖缺失性转铁蛋白抗体溶液中，室温搅拌2小时，加入十分之一体积(加入封闭剂前，封闭剂的体积为混合液体积的十分之一)的封闭剂，继续室温搅拌2小时，用50mM HEPES缓冲液(pH为7.5)清洗3次，最终分散在合适的缓冲液中，所得分散液中羧基聚苯乙烯微球的终浓度为0.13％(w/v)，所得分散液即为糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物。本实施例的糖缺失性转铁蛋白抗体为鼠抗人单克隆抗体，来源：美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院生物化学系。

本申请实施例中用于校准品和质控品中的CDT抗原可以通过原核或真核细胞表达制备，具体操作为本领域技术人员熟知。

实施例5特异性糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法检测试剂盒性能评估

本实施例选择实施例1-2和4中制备的各组分进行性能评估，具体地对线性范围、方法学比对和重复性的性能进行评估。

测试仪器：日立7180生化分析仪；

具体测试方法：取2μL血清样本和200μL实施例1制备的第一试剂混匀，孵育5分钟后，加入50μL实施例2制备的第二试剂，继续孵育5分钟，在600nm的特定波长下检测透射光信号(信号值由日立7180生化分析仪根据反应液的浊度自动检测计算得到)，记录加入第二试剂后反应终点和反应起始点幅度的差值，带入图1的标准曲线中，即可计算待测样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。图1为本实施例根据校准品浓度与测得的反应度拟合得到的校准曲线，图1中，纵坐标为反应度，具体为透射光信号值，横坐标为各个校准品的浓度。

上述操作方法十分简便。

本实施例中，质控品的缓冲液组成同校准品中的缓冲液。

校准品、质控品是由糖缺失性转铁蛋白抗原溶解在缓冲液中配制而成，缓冲液的组成如下：20mM PBS缓冲液、1％BSA，pH为7.4。

试剂评估结果如下：

1、线性范围

用低浓度糖缺失性转铁蛋白血清样本和高浓度糖缺失性转铁蛋白血清样本按下表5混合成6个稀释浓度。用上述试剂组合(试剂盒)分别对混合样本进行测试，每个浓度测试3次，计算相关系数和偏差。

表5两种样本的配比

稀释梯度

浓度1

浓度2

浓度3

浓度4

浓度5

浓度6

低浓度样本体积

1mL

0.8mL

0.6mL

0.4mL

0.2mL

0

高浓度样本体积

0

0.2mL

0.4mL

0.6mL

0.8mL

1mL

其中低浓度样本的浓度为20mg/L，高浓度样本的浓度为660mg/L。

测试结果如下表6所示：

表6测试结果

其中绝对偏差＝|均值-回归值|；相对偏差＝[(均值-回归值)/回归值]×100％。“/”表示不统计，稀释浓度小于100mg/L时考察绝对偏差，大于100mg/L时考察相对偏差。

图2显示了各稀释浓度与测试均值的线性范围曲线，试剂盒在[20.0，660.0]mg/L区间内，k为0.9608，b为12.1379，线性相关系数R为0.9996，在[20.0，100.0]mg/L区间内，线性绝对偏差未超过±10mg/L，在(100.0，660.0]mg/L范围内，线性相对偏差未超过±5％，结果表明本申请的试剂盒在20-660mg/L范围内线性关系非常好。

2、方法学比对

取40例新鲜血清，用糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒(该试剂盒使用乳胶增强散射比浊法，测试方法与本申请不同)测试，该试剂盒购自德国西门子医学诊断产品有限公司(简称西门子公司)(参照试剂盒)，同时用本发明实施例1-4法配制的试剂组合(试剂盒)测试，用线性回归法计算两组测试值的相关系数，检测结果如表7所示。

表7检测结果

图3显示了参照试剂盒测试值与本发明实施例的试剂组合测试值的线性回归分析结果，其中R²＝0.9935，相关性R＝0.9967。

3、重复性实验

使用实施例1的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒分别对低、中、高3个浓度的血清样本重复测试10次，计算变异系数，结果如表8所示。

表8变异系数检测结果

可见，低、中、高浓度血清测试10次的变异系数分别为1.99％、1.54％、2.63％。

以上结果表明，应用本发明实施例制备的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒性能良好，线性相关系数R＝0.9996；其中40例样本与参照试剂盒比对的相关性R＝0.9967；重复测试样品10次，变异系数在5％以内。本申请提供的试剂盒相对于参照试剂盒操作简便，且制备成本大幅降低。

实施例6检测试剂盒性能评估

对实施例1和3-4中的试剂组合(将第二试剂中的糖缺失性转铁蛋白-牛血清白蛋白复合体替换为糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素复合体)进行评估检测，操作步骤同实施例5，结果与实施例5基本相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中所述第一试剂配方如下:

组分 用量 三羟甲基氨基甲烷 12.1 g 糖缺失性转铁蛋白复合体 1 g 氯化钠 2 g 曲拉通X-100 0.1 mL 乙二胺四乙酸二钠 0.5 g 叠氮化钠 0.95 g 聚乙二醇-8000 1.5 g

所述第二试剂配方如下:

组分 用量 三羟甲基氨基甲烷 12.1g 蔗糖 10g 吐温-20 0.05 mL 牛血清白蛋白 0.5 g 叠氮化钠 0.95 g 糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物 1.5 g

所述糖缺失性转铁蛋白复合体为糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素复合体，按如下步骤制备：

（1）用100mM硼酸盐缓冲液，pH 8.6，对糖缺失性转铁蛋白4°C透析过夜，换液3次；

（2）取1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素用1mL DMSO溶解；

（3）取1mL糖缺失性转铁蛋白溶液，浓度5mg/mL，和200μL N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液混合，室温搅拌2小时；

（4）用50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，于4℃透析过夜，换液3次；

（5）取1mg制备好的生物素化糖缺失性转铁蛋白加入0.1mg链霉亲和素，室温搅拌0.5小时；

（6）用Superdex G-200凝胶层析柱过滤，分离糖缺失性转铁蛋白-生物素-链霉亲和素组合物，

其中所述糖缺失性转铁蛋白抗体偶联物包括糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球，且所述糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球通过共价交联，且所述糖缺失性转铁蛋白抗体是特异性结合转铁蛋白非糖基化位点的单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯微球粒径为50-500nm，且表面带有羧基、氨基、醛基和氯甲基中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述糖缺失性转铁蛋白抗体与聚苯乙烯微球通过碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法或马来酰亚胺法进行共价交联。

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