DE3874961T2 - Verfahren zur herstellung von endo-alpha-n-acetylgalactosaminidase durch mikroorganismen. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase durch Mikroorganismen.
• In den letzten Jahren ist gefunden worden, daß die Anteile der Zuckerketten an komplexen Kohlenhydraten bei lebenden Organismen eine wichtige Rolle spielen bei der Zelldifferenzierung, dem Zellwachstum, der Zellerkennung sowie bei der Entstehung vieler Krankheiten, die mit malignen Tumoren zusammenhängen.
• Bei komplexen Kohlenhydraten wie Glykoproteinen sind die Zuckerketten der Glykoproteine oder dergleichen entweder über N-glykosidische Bindungen oder O-glykosidische Bindungen an die Peptidkette gebunden. Von diesen zwei Arten von Zuckerketten existieren die Zuckerketten mit O-glykosidischen Bindungen hauptsächlich in Blutgruppensubstanzen, wobei derartige Zuckerketten mit O-glykosidischen Bindungen eine Vielzahl von wichtigen physiologischen Funktionen ausüben. Um diese Funktionen weiter zu identifizieren, ist die strukturelle Untersuchung der Zuckerketten unerläßlich. Für die Analyse der Struktur der Zuckerketten stellt die Verwendung von Glukosidasen mit hoher Substratspezifität für die Zuckerkettenstruktur von komplexen Kohlenhydraten ein wichtiges Hilfsmittel dar.
• Von derartigen Glykosidasen kann Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase (Endo-α-GalNAcase) als Enzym eingesetzt werden, welches an Zuckerketten mit einer Gal β 1 -> 3GalNAc-Struktur arbeitet, in welcher das GalNac an die Serin- oder Threoninreste von Proteinen gebunden ist, um die O-glykosidischen Bindungen zu spalten; somit setzt das Enzym die Zuckerketten der Proteine frei. Der Wirkmechanismus des Enzyms ist in der folgenden Formel dargestellt: Endo-α-GalNAcase
• in der Gal Galaktose, GalNAc N-Acetylgalaktosamin, Ser Serin, Thr Threonin bedeuten, und X und Y Peptidketten sind. In dieser Weise ist dieses Enzym wichtig für die strukturelle Analyse der Zuckerketten von Glykoproteinen, da Endo-α-GalNAcase Zuckerketten mit O-glykosidischen Bindungen aus Proteinen freisetzen kann.
• Zuvor ist die Aktivität der Endo-α-GalNAcase lediglich in dem Kulturmedium von Clostridium perfringens oder Diplococcus pneumoniae gefunden worden. Ferner ist die Aufreinigung und Charakterisierung dieses Enzyms bislang nicht zufriedenstellend, was seinen praktischen Wert verringert.
• En Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Endo-α-N-Actylgalaktosaminidase, das die oben genannten und zahlreiche andere Nachteile und Mängel des Standes der Technik überwindet. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es das Kultivieren eines Mikroorganismus, der der Gattung Alcaligenes angehört und Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase produziert, und das Isolieren von Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase aus der Kultur dieses Mikroorganismus umfaßt.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der zur Gattung Alcaligenes gehörende Mikroorganismus vorzugsweise Alcaligenes sp. F-1906 (FERM BP-1857).
• Demgemäß ermöglicht die hier beschriebene Erfindung die Ziele des (1) Bereitstellens einer Endo-α-GalNAcase, die bei der strukturellen und funktionellen Analyse von Zuckerketten des Mucin-Typs von Glykoproteinen sehr geeignet ist, sowie des (2) Bereitstellens eines einfachen Verfahrens zur kostengünstigen Herstellung großer Mengen Endo-α-GalNAcase.
• Es wurden Mikroorganismem, die in der Natur gefunden wurden, auf ihre Fähigkeit untersucht, Endo-α-GalNAcase, die an Zuckerketten mit O-glykosidischen Bindungen wirkt, zu produzieren.
• Der am meisten geeignete Mikroorganismus, Alcaligenes, wurde aus dem Boden isoliert. Dieser Mikroorgansmus zeigte Eigenschaften, die für die oben genannten Zwecke geeignet sind.
• Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stammes sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Bakteriologische Eigenschaften Morphologie Zellform Zellgröße Mobilität Flagellation Sporen Gram-Färbung Wachstum auf verschiedenen Medien (a) Fleischbrühe-Agarplatten Kolonieform Wachstumsanstieg Rand Oberfläche kurze Stäbchen keine negativ kleine Kreise konvexe Kurve vollständig glänzend (b) Fleishbrühe-Schrägagarmedium Wachstumsqualität Oberfläche Wachstumszustand Farbe Glanz Transparenz (c) Fleischbrühe-Flüssigmedium Oberflächerwachstum Trübung Präzipitat (d) Fleischbrühe-Gelatine-Stichkultur Wachstumsverlauf Verflüssigung von Gelatine (e) Litmusmilch Gerinnung pH-Wert (3) Physiologische Eigenschaften Nitratreduktion Denitrifizierung MR-Test VP-Test Indolbildung Schwefelwasserstoffbildung Stärkehydrolyse Verwertung von Zitronensäure moderat glänzend gürtelähnlich gelblich-weiß bei Wachstum an dunkler Stelle, und gelb bei Wachstum an heller Stelle vorhanden semi-transparent keins Wachstum lediglich auf der Oberfläche schwach positiv negativ neutral Verwertung von anorganischem Stickstoff Natriumnitrat Ammoniumnitrat Pigmentbildung Urease Oxidase Katalase Wachstumsgrenzen PH-Wert Temperatur Sauerstoffbedarf Säure- und Gasbildung aus Zuckern: Zucker L-Arabinose D-Xylose D-Glukose D-Mannose D-Fruktose D-Galaktose Maltose Saccharose Laktose Wachstum auf Medium, welches 5 % NaCl enthält Bildung von 3-Ketolaktose aus Laktose Abbau von Protocatechusäure (Spaltung an Ortho- oder Meta-Stellung) Fähigkeit zur Oxidation von Glukonsäure aerob Säure Gas schwach
• Dieser Stamm mit den obigen bakteriologischen Eigenschaften wurde klassifiziert und identifiziert als ein Stamm der Gattung Alcaligenes unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Systematic Determinative Bacteriology (8te Auflage). Es war jedoch nicht möglich, irgendeine bekannte Spezies zu finden, die dieselben Eigenschaften wie diese Spezies aufweist. Daher wurde dieser Stamm als eine neue Spezies identifiziert und als Alcaligenes sp. F-1906 bezeichnet. Dieser Stamm ist bei dem Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, 1- 3 Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Iboraki-kenl 305, Japan, unter FERM BP-1857 hinterlegt worden.
• Die von diesein Stamm gebildete Endo-α-GalNAcase weist die folgenden enzymologischen und physiochemischen Eigenschaften auf.
(1) Wirkungsweise des Enzyms
• Dieses Enzym wirkt, wie unten dargestellt, an den Zuckerketten von Glykoproteinen und dergleichen mit O-glykosidischen Bindungen, um Gal β 1 -> 3GalNAc freizusetzen: Endo-α-GalNacase
• in der X und Y Peptidketten sind.
(2) Substratspezifität
• Als Substrate können Glykopeptide oder Glykoproteine wie Asialofetuin, Asialocasein und Asialomucin, welches Zuckerketten mit O-glykosidischen Bindungen und Gal β 1 T 3GalNAc α 1 T Ser (oder Thr)-Strukturen aufweist, verwendet werden.
(3) Messung der Enzymaktivität
• Die Aktivität dieses Enzyms kann mit Asialofetuin als Substrat gemessen werden. Die Enzymreaktion wird in Citratpuffer, pH 4,5, bei 37ºC durchgeführt und durch Zugabe eines Boratpuffers, pH 9,1, zu dieser Reaktionsmischung gestoppt. Gebildetes Gal β 1 T 3GalNAc wird durch das Verfahren von Reissig gemessen. Eine Einheit Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 umol Gal β 1 T 3GalNAc in einer Minute freisetzt.
(4) Optimaler pH-Wert und Bereich der pH-Stabilität
• Der optimale pH-Wert der Enzymreaktion ist 4,5 bis 5,0. Das Enzym verhält sich im pH-Bereich von 4,2-6,5 stabil. Innerhalb dieses pH-Bereichs liegt die verbleibende Aktivität des Enzyms nach einer Stunde bei 30ºC bei etwa 90 % oder mehr.
(5) Optimale Temperatur für die Enzymreaktion und Temperaturbereich der Stabilität
• Die optimale Temperatur für die Enzymreaktion beträgt 40-45ºC. Die Temperatur, bei welcher das Enzym 10 Minuten lang stabil bleibt, wenn es in einem Phosphatpuffer, pH 6,0, gehalten wird, beträgt 30ºC oder weniger. Bei 40ºC verbleibt nach einer derartigen Behandlung eine Aktivität von etwa 70 %.
(6) Wirkungen von Inhibitoren
• Das Enzym wurde hinsichtlich der Wirkungen zahlreicher Arten von Substanzen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Tabelle zeigt, daß das Enzym vollständig durch Quecksilber inhibiert wird. Ferner wird es zu etwa 26-35 % durch Kupferionen oder Manganionen inhibiert. Es wird zu annähernd 30 % durch Cystein inhibiert, welches eines der SH-Reagenzien ist, während andere SH-Reagenzien wie Mercaptoethanol, N-Ethylmaleimid, p-Chlormercuribenzoesäure und Jodessigsäure die Enzymaktivität weitgehend unbeeinflußt lassen. Monosaccharide ließen die Enzymaktivität weitgehend unbeeinflußt. Tabelle 2 Zusätze Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) Keine Ethylendiamintetraessigsäure Cystein Mercaptoethanol N-Ethylmaleimid p-Chlormercuribenzoesäure Jodessigsäure Glukose Galaktose Glukosamin Galaktosamin Sialinsäure
(7) Verfahren der Aufreinigung
• Die Aufreinigung dieses Enzyms kann durch die passende Kombination von Aussalzen und verschiedenen Arten chromatographischer Verfahren erfolgen.
(8) Molekulargewicht
• Das Molekulargewicht dieses Enzyms wurde mittels Gelfiltration auf einer Sephadex G-200 (Sephadex ist ein eingetragenes Warenzeichen) auf ungefähr 160 000 und mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf ungefähr 160 000 geschätzt.
(9) Polyacrylamid-Gelelektrophorese
• Das gereinigte Enzym ergab eine einzelne Bande bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
• Wie der im Rahmen dieser Erfindung verwendete, zur Gattung Alcaligenes gehörende Mikroorganismuss, kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, der Endo-α-GalNAcase produziert. Vorzugsweise wird der durch die Erfinder aus Erde isolierte Alcaligenes sp. F-1906 (FERM BP-1857) verwendet.
• Für die Produktion von Endo-α-GalNAcase durch die Mikroorganismen kann das Kulturmedium mit Mucin aus der Magenschleimhaut von Schweinen, eine Stunde lang bei 80ºC mit 1 N Schwefelsäure behandelt, verwendet werden. Die Konzentration von Mucin beträgt 0,1-10 % und vorzugsweise 0,5-5 %. Das Enzym wird von der aeroben Kultur der Mikroorganismen in einem derartigen Medium für etwa 48 Stunden bei einem pH-Wert von 6,5 und 28ºC produziert.
• Nach Beendigung der Kultivierung kann die Endo-α-GalNAcase gesammelt und aus der Kultur mittels einer passenden Kombination bekannter Verfahren aufgereinigt werden. Da dieses Enzym in das Kulturmedium sekretiert wird, wird die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und der Überstand wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert, wonach sich Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie, usw. anschließen, um das Enzym zu reinigen. Das folgende Beispiel wird die Erfindung eingehender verdeutlichen, sie jedoch nicht beschränken.
Beispiele Beispiel 1
• Im Handel erhältliches Mucin aus der Magenschleimhaut von Schweinen wurde mit 1 N Schwefelsäure vermischt und stehengelassen für eine Stunde bei 80ºC zur Hydrolyse, die den Sialinsäurerest des Mucins entfernte. Das Hydrolysat wurde dem Medium in einer Konzentration von 1 % zugegeben. 500 ml des Mediums wurden in 40 Röhrchen mit einer Kapazität von 2 Litern überführt, wobei die Röhrchen sterilisiert waren und mit 5 ml vorkultivierter Alcaligenes sp. F-1906 inokuliert worden waren. Die Röhrchen wurden 3 Tage lang bei 28ºC kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Bakterienzellen mittels Zentrifugation entfernt und der Überstand der Kultur wurde erhalten. Diesem Überstand wurde bei 0-5ºC Ammoniumsulfat zugegeben und die Fraktionen gesammelt, die sich bei der Sättigung von 40-80 % Ammoniumsulfat niederschlugen. Dieses Präzipitat wurde in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,0, gelöst und anschließend über Nacht gegen denselben Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Sephadex (Sephadex ist ein eingetragenes Warenzeichen) A-50-Säule (5,0 x 32,5 cm) geladen, welche mit 0,01 M Phosphatpuffer equilibriert war. Nachdem die Säule mit demselben Puffer enthaltend 0,2 M NaCl gewaschen war, wurde das Enzym mit demselben Puffer enthaltend 0,4 M NaCl eluiert. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden konzentriert durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von 80% und über Nacht gegen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,0, dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend auf eine Hydroxyapatitsäule (2,0 x 20 cm) geladen, die mit demselben Puffer equilibriert war. Die Säule wurde mit demselben Puffer und mit 0,4 M Phosphatpuffer, pH 6,0, gewaschen und anschließend mit 0,5 M Phosphatpuffer, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden gesammelt, mittels Ultrafiltration konzentriert und auf einer Sephadex (Sephadex ist ein eingetragenes Warenzeichen) G-200-Säule (1,0 x 110 cm), die mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend 0,2 M NaCl, equilibriert war, gelfiltriert. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden gesammelt, konzentriert und auf eine Con-A-Sepharose-Säule (0,5 x 3 cm) geladen, die mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6,0, equilibriert war. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden als die Fraktionen eluiert, die mit demselben Puffer nicht an die Säule adsorbierten, und 3 mg Endo- α-GalNAcase wurden in gereinigte Form erhalten (relative Aktivität: 2,2 Einheiten/ mg; Ausbeute: 1,0%).
• Es wird darauf hingewiesen, daß vielfältige andere Veränderungen von auf dem Gebiet qualifizierten Fachleuten augenscheinlich sind und leicht ausgeführt werden können, ohne den Umfang und Grundgedanken dieser Erfindung zu verlassen. Demgemäß ist es nicht beabsichtigt, daß der Schutzbereich der anhängenden Ansprüche durch die hier ausgeführte Beschreibung beschränkt wird, sondern vielmehr sind die Ansprüche so gefaßt, daß sämtliche Merkmale patentierbarer Neuheit, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, umfaßt werden, einschließlich aller Merkmale, die von den durchschnittlichen Fachleuten, auf die sich diese Erfindung bezieht, als äquivalent aufgefaßt werden würden.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren eines zur Gattung Alcaligenes gehärenden Mikroorganismus, der Endo-α-N-Acetylgalaktosaminindase aus der Kultur dieses Mikroorganismus umfaßt.

   Verfahren zur Herstellung von Endo-α-N-Acetylgalaktosaminidase nach Anspruch 1, bei dem der der Gattung Alkaligenes angehörendes Mikroorganismus Alkaligenes sp. F-1906 (FERM BP- 1857) ist.