DE69532591T2

DE69532591T2 - Neuartige keratansulfat-hydrolase

Info

Publication number: DE69532591T2
Application number: DE69532591T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Morikawa; Hiroshi Maruyama; Takako Koganei-shi ISOMURA; Kiyoshi Tachikawa-shi SUZUKI; Sadao Tatebayashi
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1994-11-22
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2015-11-23
Also published as: EP0798376A1; EP0798376A4; JP3734504B2; WO1996016166A1; DE69532591D1; US5840546A; EP0798376B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Keratan-Sulfat-Hydrolase, ein Verfahren zu deren Herstellung und einen neuen Mikroorganismus, der diese herstellt.
STAND DER TECHNIK
Als von Mikroorganismen stammende Enzyme, welche Keratan-Sulfat hydrolysieren (im Weiteren als eine Keratan-Sulfat-Hydrolase bezeichnet), sind ein endo-β-galactosidase-Typ-Enzym, welches galactosidische Bindungen in der Zuckerkette des Keratan-Sulfats hydrolysiert, und ein endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typ-Enzym bekannt, welches N-acetylglucosaminidische Bindungen von dieser hydrolysiert.
Als Mikroorganismen, die das endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typ-Enzym herstellen, ist nur der Ks 36-Stamm bekannt, der zu der Gattung Bacillus gehört, der aus Bodenproben durch die vorliegenden Erfinder isoliert wurde und dessen mikrobiologischen Merkmale und enyzmologischen Eigenschaften wurden geklärt (japanische Patentanmeldung-Offenlegung Nr. 2-57182).
Das Keratan-Sulfat wird in Keratan-Sulfat I, das in der Cornea von Tieren vorkommt, und Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat gruppiert, welche in den Geweben, wie z. B. Knorpel, enthalten sind, und jedes von ihnen ist ein Copolymer, das das Disaccharid der Galactose und das N-Acetylglucosamin als eine konstitutionelle Einheit umfasst. In der Gestalt weisen die meisten der 6-Positionen des N-Acetylglucosamins eine Hydroxylgruppe auf, während ein großer Prozentsatz der Konstituenten das Disaccharid-Disulfat sind, von dem beide Hydroxylgruppen der 6-Positionen des N-Acetylglucosamins und der Galactose letztendlich sulfatiert sind.
Eine Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs wirkt auf die obigen Keratan-Sulfate und stellt als die Hydrolysate hauptsächlich sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat- Tetrasaccharid her. Das Disaccharid enthält monosulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und disulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid, dessen reduzierte Zuckerenden N-Acetylglucosamin sind.
Dementsprechend sind die hauptsächlich durch die Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs sulfatierten Hydrolysate des Keratan-Sulfats sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid, welche die N-Acetyllactosamin-Struktur aufweisen.
Das N-Acetyllactosamin ist in der Zuckerkette des Oligosaccharids in der menschlichen Milch, den Lipopolysacchariden und einer Vielfalt von als Wachstumsfaktor des Lactobacillus bifidus (Bifidusfaktor), welches ein Enterobakterium von gestillten Babys ist, bekannten Glycoproteinen und Glycolipiden enthalten, und es wird Erfolg versprechend davon ausgegangen, dass es für Lebensmittel mit hohem Nährwert, wie z. B. für Babys hergestellte Trockenmilch, verwendet wird. Und letztendlich weist das durch die sogenannte Sialyl-Le^x-Zuckerkette dargestellte Oligosaccharid, welche durch Binden der Fucose durch die α-1,3-Bindung an den N-Acetylglucosamin-Rest des N-Acetyllactosamins und der Sialinsäure durch die α-2,3-Bindung an den Galactoserest hergestellt wird, eine inhibitorische Aktivität zur Zelladhäsion auf, und es wird erwartet, dass es ein Bestandteil von antiinflammatorischen Agenzien sein wird, und es wird daher auch Erfolg versprechend davon ausgegangen, dass das N-Acetyllactosamin ein Startmaterial für die Sialyl-Le^x-Zuckerketten-Synthese ist.
Es ist bekannt, dass N-Acetyllactosamin durch ein Syntheseverfahren mit einem Enzym, einem Desulfatierungsverfahren von sulfatiertem Keratan-Disaccharid, welches ein Hydrolysat mit einer Keratan-Sulfat-Hydrolase ist, usw., hergestellt wird. Und es ist bekannt, dass sulfatiertes N-Acetyllactosamin-tetrasaccharid durch die Hydrolysierung von Keratan-Sulfat mit einer wie oben beschriebenen Keratan-Sulfat-Hydrolase hergestellt wird. Als die in der obigen Präparation verwendete Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs ist jedoch nur die wie oben beschriebene von dem Ks 36-Stamm stammende Keratan-Sulfat-Hydrolase (Keratan-Sulfat-Hydrolase II) bekannt. Dieses Enzym hat keine ausreichende Hitzestabilität, so dass es bei ungefähr 30°C oder darüber nicht stabil ist. Daher wird es nicht als ein geeignetes Enzym betrachtet, um sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid oder -Tetrasaccharid in einem großen industriellen Maßstab herzustellen. Speziell bei der Herstellung von sulfatiertem Keratan-Sulfat-Disaccharid oder -Tetrasaccharid durch ein Batch-Abbauverfahren oder einem immobilisierten Enzym-Abbauverfahren, benötigt die Keratan-Sulfat-Hydrolase eine hohe Hitzestabilität und die Entwicklung der Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs, die eine hohe Hitzestabilität aufweist, wird erwünscht.
BESCHREIEBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde in Betracht des oben beschriebenen Gesichtspunktes gemacht, dessen Ziel es ist, eine neue Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs, die eine hohe Hitzestabilität aufweist, einen diese produzierenden neuen Mikroorganismus und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Die vorliegenden Erfinder untersuchten weitgehend Bodenmikroorganismen, um einen Mikroorganismus zu erhalten, der eine Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs herstellt, welche eine hohe Hitzestabilität aufweist, und waren erfolgreich in der Isolierung eines Bacillus circulans-Stammes aus dem Boden der Saitama Präfektur in Japan, welcher die erwünschte Zielsetzung erfüllt. Obwohl die von dem Stamm hergestellte Keratan-Sulfat-Hydrolase ähnliche Funktionen zu der konventionellen Keratan-Sulfat-Hydrolase II aufweist, gibt es Unterschiede in der Hitzestabilität (sie ist bis zu 45°C stabil) und anderer enzymologischer Eigenschaften. Es wurde daher bestätigt, dass sie ein äußerst charakteristisches Enzym ist. Dadurch wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Und zwar ist eine Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung (des Weiteren manchmal als „das vorliegende Enyzm" oder „das Enzym der vorliegenden Erfindung" bezeichnet) ein neues von dem Bacillus circulans erhältliches Enzym, dass die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist:
(1) Wirkung
Das vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat und hydrolysiert dessen N-Acetylglucosaminidische Bindung,
(2) Substratspezifität
Das vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat, und erzeugt sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid als die Haupthydrolysate,
(3) pH-Reaktionsoptimum
Das vorliegende Enzym weist ein pH-Reaktionsoptimum von 4,5–6 in dem 0,1 M-Acetat-Puffer oder dem 10 mM-Tris-Acetatpuffer bei 37°C auf,
(4) pH-Stabilität
Das vorliegende Enzym weist eine pH-Stabilität von 6 bis 7 auf, wenn das vorliegende Enzym im 0,1 M-Acetatpuffer oder dem 10 mM-Tris-Acetatpuffer bei 37°C für eine Stunde stehen gelassen wird,
(5) Reaktionstemperatur-Optimum
Das vorliegende Enzym weist ein Reaktionstemperatur-Optimum von 50 bis 60°C auf, wenn das vorliegende Enzym im 0,1 M-Acetatpuffer, pH 6,0, für 10 Minuten reagiert,
(6) Hitzestabilität
Das vorliegende Enzym ist mindestens bei 45°C stabil, wenn das vorliegende Enzym im 0,1 M-Acetatpufter, pH 6,0, für eine Stunde stehengelassen wird, und
(7) Molekulargewicht
Die Hydrolase weist ein Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton auf, wenn das Molekulargewicht durch die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese in einer Gelkonzentration von 7% bestimmt wird.
Des Weiteren ist ein Verfahren zur Herstellung der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung durch das Kultivieren des Bacillus circulans gekennzeichnet, der die Fähigkeit aufweist, die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung in einem Medium herzustellen, und Gewinnen der Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Medium und/oder den mikrobiellen Zellen. Des Weiteren wird die Keratan-Sulfat-Hydrolase von den mikrobiellen Zellen bevorzugt aus dem Extrakt der mikrobiellen Zellen gewonnen, welches durch Lysieren oder Aufschließen der mikrobiellen Zellen hergestellt wird, um einen Extrakt der mikrobiellen Zellen zu erhalten, und Behandlung des Extrakts mit Deoxyribonuclease.
Ein Bacillus circulans-Stamm der vorliegenden Erfindung gehört zu der Gattung Bacillus und weist die Fähigkeit auf, die die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisende Keratan-Sulfat-Hydrolase herzustellen,. Ein Beispiel für den Stamm von Bacillus circulans enthält Bacillus circulans KsT202.
Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben werden.
(1) Der neue Stamm, der die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung herstellt
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann von Bacillus circulans erhalten werden, speziell wird Bacillus circulans KsT202 bevorzugt verwendet. Dieser Stamm ist ein neuer Stamm, der von den vorliegenden Erfindern aus dem in der Präfektur Saitama erhaltenen Boden isoliert und aufgrund seiner in den unten genannten Beispielen beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften als Bacillus circulans identifiziert wurde. Der vorliegende Stamm assimiliert Keratan-Sulfat, während von keinem der bekannten Bacillus circulans bis jetzt berichtet wurde, Keratan-Sulfat zu assimilieren, und daher ist der vorliegende Stamm ein neuer Stamm, der in dieser Hinsicht von den bekannten Stämmen unterscheidbar ist und mit KsT202 benannt ist.
Dementsprechend ist der die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung herstellende Bacillus circulans-Stamm selbst neu und die vorliegende Erfindung schließt einen Stamm von Bacillus circulans ein, der die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung herstellt, welche die oben genannten Eigenschaften aufweist, ohne auf den vorliegenden Stamm begrenzt zu sein.
Der die Keratan-Sulfat-Hydrolase herstellende Mikroorganismus kann wie folgt erhalten werden. Eine kleine Menge eines Materials zur Isolierung, wie z. B. Boden, wird in ein flüssiges Medium gegeben, welches Stickstoffquellen, anorganische Salze und Keratan-Sulfat enthält, und für einige Tage kultiviert. Dann wird der Überstand des kultivierten Mediums auf ein Filterpapier gespottet und das flüssige Medium (Kontrolle) wird dort ebenfalls auf die gleiche Weise gespottet. Nach der Lufttrocknung wird das Filterpapier in einer Toluidin-Blau-Lösung eingeweicht und ausreichend mit einer verdünnten Essigsäurelösung gewaschen und die Farbe auf der gespotteten Stelle des Überstandes des Kulturmediums wird mit der der Kontrolle verglichen. Da sich Toluidin-Blau mit Keratan-Sulfat verbindet, um eine blaue Farbe zu entwickeln, kann es bestätigt werden, dass ein Keratan-Sulfat assimilierender Mikroorganismus in der Probe existiert, die eine geringere Farbe als die Kontrolle entwickelt. Der Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus wird unter Verwendung eines Platten-Mediums (z. B. Herz-Infusions-Agar) durch ein konventionelles Verfahren von dem wässrigen Medium rein-isoliert, das den Keratan-Sulfat assimilierenden Mikroorganismus enthält. Indem eine Vielzahl von den rein-isolierten Mikroorganismen für die Assimilation von Keratan-Sulfat unter Verwendung eines wässrigen Mediums in der gleichen Weise wie oben untersucht werden, kann der gewünschte Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus erhalten werden.
Der wie oben beschrieben isolierte Bacillus circulans KsT202 wurde im National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan) am 5. September 1994 unter der Zugangsnummer FERM P-14516 hinterlegt und er wurde dann für die auf dem Budapester Abkommen vom 6. November 1995 basierende internationale Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5285 hinterlegt.
(2) Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung
Die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung wird hergestellt und akkumuliert in dem Medium oder den mikrobiellen Zellen durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, der die Fähigkeit aufweist, eine Keratan-Sulfat-Hydrolase herzustellen, z. B. der Bacillus circulans KsT202, in einem Nährstoffmedium, welches gewöhnlich für Kulturen von Mikroorganismen verwendet wird, vorzugsweise in einem Medium, welches Keratan-Sulfat oder eine dieses enthaltene Substanz enthält, um die Fähigkeit zu steigern, das Enzym herzustellen, und das Enzym kann durch eine konventionelle Methode gewonnen werden.
Das Verfahren zur Herstellung des vorliegenden Enzyms ist weiterhin als ein Beispiel unter Verwendung des Bacillus circulans KsT202 beschrieben. Der Bacillus circulans KsT202 wird in einem speziellen Nährstoffmedium kultiviert, beispielsweise in einem Medium, spezielle Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Keratan-Sulfat oder Substanzen, die diese enthalten, und dergleichen enthält, um so das vorliegende Enzym herzustellen und in dem Medium oder den mikrobiellen Zellen zu akkumulieren. Als die Kohlenstoffquelle kann jede Substanz verwendet werden, solange sie metabolisiert werden kann, z. B. D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannose, Stärke und eine Vielfalt von Peptonen. Die verwendbare Stickstoffquelle enthält organische oder anorganische Stickstoff-Zusammensetzungen oder Substanzen, die diese enthalten, z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, eine Vielfalt von Peptonen, eine Auswahl von Brühe-Extrakt, in Flüssigkeit eingeweichtes Getreide, Aminosäurelösungen, Amoniumsalze und dergleichen. Die dem Medium zugegebenen anorganischen Salze enthalten eine Vielfalt von Phosphaten, Magnesiumsalzen, Kalium, Natrium, Kalzium, etc.. Eine Vielfalt von anorganischen oder organischen Substanzen, die für das Wachstum der Mikroorganismen oder zur Herstellung des Enzyms benötigt werden, z. B. bildungshemmende Agenzien, wie z. B. Silikonöl, Sesamöl und eine Auswahl von Tensiden, und Vitamine können, wenn notwendig, dem Medium zugegeben werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Zugabe von Keratan-Sulfat oder einer Substanz, die dieses enthält, als ein Induzierer („Inducer") des vorliegenden Enzyms, das vorliegende Enzym in einer größeren Menge hergestellt werden. Der Induzierer kann beim Ansatz oder im Verlauf der Kultur zugegeben werden. Gewöhnlich wird Keratan-Sulfat zugegeben, um dessen Konzentration in dem Bereich von 0,2 bis 2% einzustellen, um erstrebenswerte Ergebnisse zu erzielen.
Die Kultur kann in der Form einer Flüssigkultur oder einer Festkultur ausgeführt werden, und gewöhnlich ist die Flüssigkultur bevorzugt. Eine Unterwasser-Belüftungs-Kultur mit Agitation ist industriell von Vorteil. Die Kulturbedingungen der vorliegenden Erfindung können geeignet ausgesucht und eingestellt werden, um so das vorliegende Enzym am vorteilhaftesten herzustellen. Die Kulturtemperatur kann von 30 bis 45°C variieren, vorzugsweise von 35 bis 45°C. Die Kulturdauer ist gewöhnlich in Abhängigkeit von den anderen Kulturbedingungen etwa 8 bis 24 Stunden, und die Kultur kann gestoppt werden, wenn die maximale Akkumulation des vorliegenden Enzyms erreicht ist. Der pH des Mediums ist beim Herstellen des Mediums in etwa neutral und es werden gewöhnlich keine speziellen Zusätze benötigt.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann zum einen aus dem Überstand des Kulturmediums und zum anderen aus den mikrobiellen Zellen, die dieses enthalten, erhalten werden. Das Enzym in den mikrobiellen Zellen kann als ein Extrakt der mikrobiellen Zellen durch Aufschluss oder Lysierung der mikrobiellen Zellen durch ein Ultraschall-Aufschluss-Verfahren, einen osmotischen Schock, ein Lysierungsverfahren unter Verwendung eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffs, wie z. B. Polyoxyethylen(23)-lauryl-alkohol-ether(Brij-35) und dergleichen, durch Einfrieren und Auftauen der mikrobiellen Zellen, ein Lysierungsverfahren unter Verwendung eines lytischen Enzyms, wie z. B. Lysozym, oder der Kombination davon erhalten werden. Des Weiteren wird der Extrakt der mikrobiellen Zellen mit Deoxyribonuclease und dergleichen behandelt, um die Ausbeute aus dem Extrakt der mikrobiellen Zellen zu erhöhen und die Menge des extrahierten Enzyms anzuheben. Dieser Effekt ist besonders in der Bakteriolyse unter Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms signifikant. Und wenn das Tensid verwendet wird, steigt die Extraktionseffizienz an, aber das nachfolgende Aussalzen wird manchmal schwierig werden.
Die Keratan-Sulfat-Hydrolase in dem Überstand des Kulturmediums oder das Extrakt der mikrobiellen Zellen kann durch Zugabe von Amoniumsulfat zu diesem bis zu einer Sättigung von 70%, dem folgenden Dialysieren des erhaltenen Niederschlages und Unterziehen des Dialysats der Chromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauschers, eines Gelfiltrationsträgers, einer hydrophobischen Trägers oder dergleichen gereinigt werden.
Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch Messen eines Anstiegs des Reduktionsendes, welches durch die Hydrolysierung des Keratan-Sulfats hergestellt wird, durch das Park-Johnson-Verfahren (J. Biol. Chem., 181, 149, (1949)) bestimmt werden. Und zwar werden 10 μl der Enzymlösung und 180 μl des 0,1 M-Acetat-Puffers (pH 6,0) zu 10 μl einer Lösung zugegeben, die Keratan-Polysulfat (10 mg/ml) enthält, welches aus dem Knorpel von Haien stammt, und der Mischung wird erlaubt, bei 37°C für 10 Minuten zu reagieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 μl der Karbonat-Zyanid-Lösung des Park-Johnson-Verfahrens gestoppt. Dann werden 200 μl der Eisen-Zyanid-Lösung zugegeben und die Reaktionslösung wird in einem kochenden Wasserbad für 15 Minuten erhitzt und in einem Wasserbad gekühlt. Und dann wird 1 ml der Eisen(III)-Lösung dazu zugegeben und gemischt. Nach 15 Minuten wird die Extinktion bei 690 nm bestimmt. Die dekadische Extinktion zu diesem Zeitpunkt wird als A definiert, die dekadische Ausgangsextinktion der gleichen Reaktionslösung (0 Minuten der Reaktionsdauer) wird als A₀ definiert, und die dekadische Extinktion wird als A_St definiert, wenn 200 μl einer Galactoselösung (10 μg/ml) als der Standard anstelle der Reaktionslösung verwendet und in der gleichen Weise behandelt wird.
Eine Einheit der Enzym-Quantität (nachstehend manchmal als Einheiten (Units) oder U bezeichnet), welche das einem μmol Galactose in einer Minute unter den obigen Bedingungen entsprechende Reduktionsende herstellt, wird durch die folgende Gleichung berechnet.
Als nächstes werden nachfolgend die physikalischen und chemischen Eigenschaften der neuen Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
(1) Wirkung
Das vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat und hydrolysiert dessen N-Acetylglucosaminidische Bindung.
(2) Substratspezifität
Das vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat, und erzeugt sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid als die Haupthydrolysate (siehe 1).
Des Weiteren ist es bestätigt, dass das vorliegende Enzym ebenfalls sulfatiertes Keratan-Sulfat-Pentasaccharid als ein Hydrolysat herstellt.
Das vorliegende Enzym wirkt nicht auf desulfatiertes Keratan und benötigt eine Sulfatgruppe in der Zuckerkette an dem Wirkungsort. Das vorliegende Enzym wirkt mit Ausnahme von Keratan-Sulfat nicht auf Glycosaminogylcan.
Das vorliegende Enzym wirkt selbst in einer hochkonzentrierten Lösung (10%) auf Keratan-Polysulfat (siehe 12).
(3) pH-Reaktionsoptimum
Das vorliegende Enzym weist ein pH-Reaktionsoptimum von 4,5 bis 6 auf, welches in dem 0,1 M-Acetat-Puffer oder in dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei 37°C bestimmt wird (siehe 3).
(4) pH-Stabilität
Das vorliegende Enzym weist eine pH-Stabilität bei etwa 6 bis 7 auf, welche während des Stehenlassens in dem 0,1 M-Acetat-Puffer oder dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei 37°C für eine Stunde bestimmt wird (siehe 4).
(5) Reaktionstemperatur-Optimum
Das vorliegende Enzym weist ein Reaktionstemperatur-Optimum von 50 bis 60°C auf, welches durch die Reaktion in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) bei von 37 bis 65°C für 10 Minuten bestimmt wird (siehe 5).
(6) Hitzestabilität
Das vorliegende Enzym wird nicht bei 45°C deaktiviert und weist 65% der Restaktivität bei 50°C auf, wenn dessen Restaktivität nach Erhitzen von 30 bis 45°C in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) für eine Stunde bestimmt wird (siehe 6).
(7) Molekulargewicht
Wenn das vorliegende Enzym durch die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (in der Gel-Konzentration von 7%) unter den reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen elektrophoriert wird, wird eine Einfachbande, die die gleiche Mobilität unter den beiden Bedingungen aufweist, beobachtet, und das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird mit ungefähr 200.000 Dalton von der Kalibrierungskurve des Standardproteins berechnet (siehe 7).
(8) Inhibition
Es ist keine Inhibition vorhanden, wenn die Aktivität des vorliegenden Enzyms in der Gegenwart von einer Vielfalt der unten beschriebenen Agenzien in einer Endkonzentration von 1 mM bestimmt wird.
Na⁺, K⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, SO₄ ^2–, PO₄ ^3–, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und PCMB (p-(Chlormercuri)-benzoesäure).
Durch den Vergleich der oben beschriebenen Ergebnisse mit der Keratan-Sulfat-Hydrolase II (japanische Patentanmeldung-Offenlegung Nr. 2-57182), welche als Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs bekannt ist, ist es bestätigt, dass das Enzym der vorliegenden Erfindung ein neues Enzym ist, welches abweichende Eigenschaften von den bekannten Enzymen aufweist, da dort Unterschiede in der Reaktivität auf das Keratan-Polysulfat bei hohen Konzentrationen, dem pH-Optimum, der pH-Stabilität, dem Temperatur-Optimum, der Hitzestabilität, dem Einfluss der Hemmung von Agenzien und dergleichen sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, welches die Substratspezifität des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches die Substratspezifität (Reaktivität) des Enzyms der vorliegenden Erfindung und der Keratanase II auf das Keratan-Polysulfat (10%) zeigt.
3 ist ein Diagramm, welches ein pH-Reaktionsoptimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
4 ist ein Diagramm, welches eine pH-Stabilität des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
5 ist ein Diagramm, welches ein Reaktionstemperatur-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
6 ist ein Diagramm, welches eine Hitzestabilität des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
7 ist ein Diagramm, welches ein Molekulargewicht des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
BEFVORZUGTE BEISPIELE ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt werden. Die Enzymaktivität wurde durch das Park-Johnson-Verfahren bestimmt.
Beispiel 1: Isolierung des Bacillus circulans KsT202
Eine kleine Menge des Bodens wurde zu 5 ml eines wässrigen Mediums zugegeben, das eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Keratan-Sulfat enthält, und unter Schütteln bei 45°C für drei Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurden jeweils 10 μl des Überstands des kultivierten Mediums und des wässrigen Mediums (Kontrolle) auf ein Filterpapier gespottet. Nach dem Lufttrocknen wurde das Filterpapier in einer Toluidin-Blau-Lösung getränkt und ausreichend mit einer verdünnten Essigsäurelösung gewaschen und die Farbe auf der gespotteten Stelle des Überstands des kultivierten Mediums wurde mit der der Kontrolle verglichen. Da sich Toluidin-Blau mit Keratan-Sulfat verbindet, um eine blaue Farbe zu entwickeln, wurde es bestätigt, dass ein Keratan-Sulfat assimilierender Mikroorganismus in der Probe existiert, die eine geringere Farbe als die Kontrolle entwickelt. Der Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus wurde durch ein konventionelles Verfahren aus der Kulturlösung unter Verwendung eines Platten-Mediums (z. B. Herz-Infusions-Agar) rein-isoliert.
Indem eine Vielfalt von rein-isolierten Mikroorganismen für die Keratan-Sulfat-Assimilation unter Verwendung eines wässrigen Mediums in der gleichen Weise wie oben untersucht wurden, wurde der gewünschte Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus erhalten. Das Folgende sind die morphologischen Eigenschaften, die Wachstumseigenschaften und die physiologischen Eigenschaften dieses Stammes.
Mikrobiologische Eigenschaften
Die taxonomische Untersuchung des die obigen mikrobiologischen Eigenschaften aufweisenden KsT202-Stammes wurde gemäß der Bergey's Anleitung der Systematischen Bakteriologie, 1. Auflage, Vol. 2 (1986) gemacht. Der vorliegende Mikroorganismus wurde als ein Stamm erkannt, der zur Gattung Bacillus gehört, basierend auf der Tatsache, dass der Mikroorganismus ein aerobischer Gram-negativer stäbchenförmiger Mikroorganismus mit Beweglichkeit und Bildung von Sporen war, dessen Hauptisoprenoid-Chinon Menachinon-7 war und er Meso-Diaminopimelinsäure in dem Peptidoglycan der Zellwand enthielt. Des Weiteren wurde als das Ergebnis der Untersuchung von dessen anderen Eigenschaften der Mikroorganismus als Bacillus circulans identifiziert. Bis heute wurde von keinem bekannten Bacillus circulans berichtet, Keratan-Sulfat zu assimilieren, und daher ist der vorliegende Stamm ein neuer Stamm und kann von den bekannten Stämmen in dieser Hinsicht unterschieden werden.
Der Bacillus circulans KsT202 wurde für die internationale Hinterlegung im National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5285 hinterlegt.
Beispiel 2 Extraktion der Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Bacillus circulans KsT202
(1) Aufschließen oder Lysieren der mikrobiellen Zellen
Der Zellextrakt von Bacillus circulans KsT202 wurde durch eine Vielfalt der unten beschriebenen Aufschluss-Verfahren oder Lysierungsverfahren für mikrobielle Zellen unter Verwendung einer mikrobiellen Zell-Suspension präpariert, die durch Suspendieren jeweils eines Gramms der gefrorenen mikrobiellen Zellen in 3 ml der Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS: 100 mM KH₂PO₄, 0,155 M NaCl, pH 7,2) erhalten wurde, und die Extraktionseffizienz des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt.
Extraktionsbedingungen

(1) Ultraschall-Auffschluss-Verfahren: Die Behandlung unter Verwendung eines Ultraschall-Generators (Insonator 201 M, Kubota Corporation.) bei einer Frequenz von 20 kHz mit 40 W Leistung für 30 Sekunden wurde in einem Eiswasserbad sechsmal in Ein-Minuten-Intervallen gemacht.
(2) Einfrier- und Auftauverfahren: Die gefrorenen mikrobiellen Zellen wurden durch Haltung bei 37°C für 30 Minuten aufgetaut.
(3) Lysierungsverfahren mit einem Tensid: Brij-35 (Nacalai Tesque) wurde zu der mikrobiellen Zellensuspension bis zu einer Endkonzentration von 5% zugegeben und sie wurde bei 37°C für 30 Minuten gehalten.
(4) Lysierungsverfahren mit dem Enzym: Das Lysozym (Seikagaku Corporation) wurde zu der mikrobiellen Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und sie wurde bei 37°C für 30 Minuten gehalten.

Die Proteinmenge und die Aktivität der Keratan-Sulfat-Hydrolase wurden in den wie oben erhaltenen aufgeschlossenen mikrobiellen Zellen oder den lysierten mikrobiellen Zellen bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Gesamtaktivität, die Aktivität pro Proteineinheit und die Enzymausbeute. Die Proteinmenge ist als durch das Lowry-Verfahren unter Verwendung eines Serum-Albumins als den Standard erhaltene Werte gezeigt. Die Ausbeute ist als relative Werte, bei Festlegung der Gesamtaktivität in den durch das Ultraschall-Aufschlussverfahren erhaltenen aufgeschlossenen mikrobiellen Zellen als 100, dargestellt. Das vorliegende Enzym wurde von den mikrobiellen Zellen durch jedes der Verfahren effizient extrahiert.
Tabelle 1
(2) Effekt der Deoxyribonuclease auf die Extraktion der Keratan-Sulfat-Hydrolase von der mit dem Enzym lysierten Lösung
Bei der Herstellung des mikrobiellen Zellextrakts durch das Lysierungsverfahren mit dem Enzym unter Verwendung von Lysozym wurde Deoxyribonuclease I (DNase I, Funakoshi) zugegeben, um die Extraktionseffizienz des vorliegenden Enzyms zu bestimmen. Zu der mikrobiellen Zellsuspension (0,2 g/ml-PBS), die durch Suspendieren der gefrorenen mikrobiellen Zellen in der Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS: 100 mM KH₂PO₄, 0,155 M NaCl, pH 7,2) erhalten wurde, wurde Lysozym mit einer Konzentration von 50 μg/ml zugegeben und die Suspension wurde bei 37°C für 30 Minuten gehalten. Zu dem Lysat wurde DNase I bis zu Konzentrationen von 0,2 bis 26 μg/ml zugegeben und wurde bei 37°C für 30 Minuten reagiert. Nach der Reaktion wurde jede der Reaktionsflüssigkeiten zentrifugiert, um den Rest der mikrobiellen Zellen zu entfernen, und die Mengen der Überstände und der Enzymaktivitäten wurden bestimmt. Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Extraktionseffizienz ist als relative Werte, bei Festlegung der Gesamtaktivität ohne Zugabe von DNase I als 100, dargestellt. Diese Ergebnisse haben die Anhebung der Extraktionseffizienz durch die Zugabe von DNase zu dem Lysat bewiesen.
Tabelle 2
(3) Re-Extraktion der Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Rest der mikrobiellen Zellen
Um die Extraktionseffizienz zu untersuchen, wurde das vorliegende Enzym aus dem Rest der mikrobiellen Zellen re-extrahiert. Der Extrakt der mikrobiellen Zellen wurde unter Verwendung der Suspension von 8 g der gefrorenen mikrobiellen Zellen in 32 ml des PBS durch das Frieren- und Auftauverfahren (siehe Beispiel (1)) oder dem Lysierungsverfahren mit dem Enzym (kombinierte Verwendung von DNase, siehe (2)) hergestellt. Der Extrakt der mikrobiellen Zellen wurde in den Überstand und den Rest der mikrobiellen Zellen durch die Zentrifugation (10.000 rpm, 40 Minuten) getrennt.
Der Rest der mikrobiellen Zellen, die durch das Frieren- und Auftauverfahren er halten wurden, wurde bei –20°C für 16 Stunden (nochmaliges Einfrieren) gehalten, und er wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben zur Re-Extraktion aufgetaut. Während der Rest der durch das Lysierungsverfahren mit dem Enzym erhaltenen mikrobiellen Zellen in der gleichen Menge PBS wie in dem obigen zur Re-Extraktion suspendiert wurde. In jedem dieser Fälle wurde die Re-Extraktion dreimal wiederholt und die Enzymaktivität der Keratan-Sulfat-Hydrolase in dem Überstand von jedem der Extrakte (von der ersten Extraktion und den drei Re-Extraktionen) wurde bestimmt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 3
Die Ausbeute erfolgte in 97% oder mehr durch dreimaliges Extrahieren mit dem Frieren- und Auftauverfahren oder mit der zweimaligen Extraktion in dem Lysierungsverfahren mit dem Enzym. Und die durch das Lysierungsverfahren mit dem Enzym erhaltene Menge des Enzyms war 27% größer als die durch das Frieren- und Auftauverfahren erhaltene Menge.
Beispiel 3
50 ml eines Mediums (pH 7,5), das 1,0% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Fischfleischextrakt (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,5% des vom Knorpel der Haie hergestellten Keratan-Polysulfats (Seikagaku Corporation), 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O und 0,1% NaCl enthält, wurde in eine Schulterflasche mit einer Kapazität von 0,5-L gegeben, bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, mit einer Platin-Öse von Bacillus circulans KsT202 aseptisch inokuliert und bei 37°C für 16 Stunden unter Schütteln (120 Takt/Minute, 7 cm Amplitude) kultiviert.
Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen mittels einer Zentrifuge geerntet und mit einem Ultraschall-Aufschließer (-Disrupter) aufgeschlossen. Die Wirksamkeit der Keratan-Sulfat-Hydrolase in der aufgeschlossenen Flüssigkeit wurde durch das oben genannte Verfahren bestimmt, um 45 Milliunits (Millieinheiten) pro Liter des Kulturmediums zu ergeben.
Beispiel 4
20 l eines Mediums (pH 7,5), das 1,0% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Fischfleischextrakt (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,5% des vom Knorpel der Haie hergestellten Keratan-Polysulfats (Seikagaku Corporation), 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,1% NaCl und 0,0015% eines anti-bildenden Agens, Adekanol LG109 (Asahi Denka Kogyo) enthält, wurde in einen Stand-Fermenter mit einer Kapazität von 30-L gegeben, bei 121°C für 25 Minuten autoklaviert, aseptisch mit 0,6 l (3%) der Kulturlösung von dem KsT202-Stamm inokuliert, welcher zuvor unter Schütteln in dem in Beispiel 3 beschriebenen Medium bei 37°C für 16 Stunden kultiviert wurde, und bei 37°C für 8 Stunden unter Belüftung (1 vvm) und Rühren (300 rpm) kultiviert. 20 l der Kulturlösung wurden mittels einer kontinuierlichen Zentrifugation behandelt, um 170 g der mikrobiellen Zellen auf Nassbasis zu erhalten.
Die Wirksamkeit der in den mikrobiellen Zellen enthaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde durch Ultraschall-Aufschluss eines Teils der mikrobiellen Zellen bestimmt, um 5,1 Einheiten (Units) pro Gramm auf Nassbasis zu ergeben. Der Rest der mikrobiellen Zellen wurde zur Konservierung gefroren.
Beispiel 5
20 l des Mediums (pH 8,0), das 1,5% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,75% des vom Knorpel der Haie hergestellten Keratan-Polysulfats (Seigakaku Corporation), 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 0,5% NaCl und 0,0015% eines anti-bildenden Agens, Adekanol LG109 (Asahi Denka Kogyo) enthält, wurde in einen Stand-Fermenter mit einer Kapazität von 30-L gegeben, bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, aseptisch mit 1 l (5%) der Kulturlösung des KsT202-Stammes inokuliert, welcher zuvor unter Schütteln in dem gleichen Medium bei 37°C für 16 Stunden kultiviert wurde, und bei 45°C für 45 Stunden unter Belüftung (1 vvm) und Rühren (300 rpm) kultiviert. 20 l der Kulturlösung wurden mit einer kontinuierlichen Zentrifugation behandelt, um die mikrobiellen Zellen zu entfernen und annähernd 20 l der extrazellulären Flüssigkeit zu ergeben.
Die Wirksamkeit der in der extrazellulären Lösung enthaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase war 11,6 Milliunits pro Milliliter.
Beispiel 6
Zu 5 g der gefrorenen und konservierten in Beispiel 4 erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden 25 ml der 10 mM Phosphat gepufferten Salzlösung (pH 7,2) zugegeben, um eine mikrobielle Zellsuspension zu ergeben, und sie wurde langsam bei 37°C für 60 Minuten gerührt, um das Enzym zu extrahieren. Nachdem der Extrakt zentrifugiert wurde, wurde Amoniumsulfat zu dem Überstand bis zu einer 30%igen Sättigung zugegeben und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation entfernt. Dann wurde weiteres Amoniumsulfat bis zu einer 60%igen Sättigung zugegeben und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation gesammelt.
Nachdem dieses Präzipitat in annäherend 20 ml eines 10-mM-Tris-Hydrochlorid-Puffers (pH 7,2) gelöst wurde, wurde es gegen 5 l desselben Puffers bei 4°C über Nacht dialysiert. Nach Bestätigung, dass die Konduktivität der Lösung nicht mehr als 1 mS/cm beträgt, wurde die Lösung durch eine DEAE-Zellulose·DE-52-(Whatman)-Säule (2,4 × 14 cm) gegeben, welche zuvor mit dem 10 mM-Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,2) equilibriert wurde, um dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren. Nachdem die Säule mit 100 ml desselben Puffers gewaschen wurde, wurde das Enzym mit einer linear ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0 bis 1 M in dem gleichen Puffer eluiert.
Zu der eluierten aktiven Fraktion wurde Natriumchlorid zugegeben, um die Konzentration auf 4 M zu bringen, und die Fraktion wurde durch eine Phenyl-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (1,5 × 14 cm) gegeben, die mit dem 4 M-Natriumchlorid enthaltenen Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,2) equilibriert wurde, um dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren, und das Enzym wurde mit einer linear absteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 4 M bis 0 in dem gleichen Puffer eluiert, und 74 ml des gereinigten Enzyms wurden erhalten. Das erhaltene Enzym war 14 Units, dessen spezifische Aktivität war 1,22 Unit/mg (berechnet in Bezug auf das Gewicht des Rinder-Serum-Albumins), dessen Re-Extraktion aus dem Extrakt der mikrobiellen Zellen war 55% und die spezifische Aktivität stieg annähernd 60-fach an. Das gereinigte Enzym enthielt keine kontaminierten Enzyme, wie z. B. Glycosidasen.
Beispiel 7
Zu der in Beispiel 5 erhaltenen extrazellulären Flüssigkeit wurde Amoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugegeben, und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation gesammelt und in 2,5 l des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Amoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 35% zugegeben, das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation entfernt, weiteres Amoniumsulfat wurde bis zu einer Sättigung von 55% zugegeben und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation gesammelt.
Das Präzipitat wurde in 2,5 l des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) aufgelöst und durch eine DEAE-Zellulose·DE52-(Whatman)-Säule (5,2 × 24 cm) gegeben, die zuvor mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde, um dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren. Nachdem die Säule mit 1,5 l des gleichen Puffers gewaschen wurde, wurde das Enzym mit einer linear ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0 bis 0,3 M in dem gleichen Puffer eluiert.
Die aktive Fraktion wurde gesammelt und Amoniumsulfat wurde dazu bis zu einer Sättigung von 55% zugegeben und dann das Präzipitat durch die Zentrifugation gesammelt und in einer kleinen Menge eines 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) gelöst. Dann wurde die Lösung auf eine Sephacryl-S-300-(Pharmacia)-Säule (3,4 × 110 cm) geladen und einer Gelfiltration mit dem 50 mM Tris-Acetat-Puffer (pH 7,5), der 0,5 M Natrium enthält, unterzogen.
Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer UK-10-Membran (Advantec Toyo) konzentriert und gegen annähernd der 100-fachen Menge des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) dialysiert. Die Innenlösung wurde durch eine DEAE-Toyopearl (Tosoh Corporation)-Säule (2,2 × 15 cm) gegeben, die zuvor mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde, um dem Enzym zu gestatten, adsorbiert zu werden. Dann wurde die Säule mit 150 ml desselben 0,1 M-Natriumchlorid enthaltenen Puffers gewaschen, und das Enzym wurde mit einer linear ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0,1 bis 0,2 M in dem gleichen Puffer eluiert.
Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert, auf eine Sephacryl-S-300-Säule (2,2 × 101 cm) geladen und einer Gelfiltration unterzogen.
Nachdem das Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 4 M zu der aktiven Fraktion zugegeben war, wurde die Lösung durch eine Phenyl-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (1,6 × 15 cm) gegeben, die mit dem 4 M-Natriumchlorid enthaltenen Tris-Acetat-Puffer (pH 7,5) equilibriert wurde, der, um dem Enzym zu gestatten, adsorbiert zu werden, und dann wurde das Enzym mit einer linear absteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 4 M bis 0 in demselben Puffer eluiert. Das erhaltene Enzym war 29 Units, dessen spezifische Aktivität war 2,09 Unit/mg (berechnet in Bezug auf das Gewicht des Rinder-Serum-Albumins), dessen Rückgewinnung von der extrazellulären Flüssigkeit war 12,5% und die spezifische Aktivität stieg annähernd auf 180-fach an. Das gereinigte Enzym enthielt keine kontaminierten Enzyme, wie z. B. Glycosidasen.
Beispiel 8
Unter Verwendung der im obigen Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurden die Substratspezifität, das pH-Reaktionsoptimum, die pH-Stabilität, das Reaktionstemperatur-Optimum, die Hitzestabilität und das Molekulargewicht der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Verfahren ausgewertet.
(1) Substratspezifität
Es wurde untersucht, dass die im obigen Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase entsprechend auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat wirken durfte. 1 zeigt ein Gelfiltrations-Chromatogramm der dabei erhaltenen Hydrolysate. Das Ergebnis zeigt an, dass das erhaltene Haupthydrolysat durch Gestatten der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat zu wirken, sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid enthält.
Ferner wurde es untersucht, dass der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase erlaubt wurde, auf desulfatiertes Keratan-Sulfat unter den gleichen Bedingungen zu wirken. Es wurde bestätigt, dass die in Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase nicht auf das desulfatierte Keratan-Sulfat wirkt und eine Sulfat-Gruppe in der Zuckerkette an dem Wirkungsort benötigt. Darüber hinaus wurde das gleiche Experiment abweichend vom Keratan-Sulfat auf Glycosaminoglycan durchgeführt, und die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung wirkte nicht auf dieses.
Zusätzlich wurde es untersucht, dass eine Vielfalt von den in 2 gezeigten Mengen der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase und der bekannten Keratan-Sulfat-Hydrolase II gestattet wurden, auf eine hochkonzentrierte Keratan-Polysulfat-Lösung (10%) bei 37°C für 24 Stunden zu wirken. 2 zeigt ein Gelfiltrations-Chromatogramm der dabei erhaltenen Lysate. Das Ergebnis macht deutlich, dass selbst eine extrem kleine Menge der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung ausreichend auf Keratan-Polysulfat in einer hochkonzentrierten Lösung (10%) wirkt.
(2) pH-Reaktionsoptimum
Die Aktivität der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde in dem 0,1 M-Acetat-Puffer und in dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei variierendem pH bei 37°C ermittelt. 3 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass das pH-Optimum der Keratan-Sulfat-Hydrolase von 4,5 bis 6 ist.
(3) pH-Stabilität
Die Restaktivität der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde nach dem Stehenlassen in dem 0,1 M-Acetat-Puffer und dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei verschiendenen pH's bei 37°C für eine Stunde bestimmt. 4 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung bei etwa 6 bis 7 stabil ist.
(4) Reaktionstemperatur-Optimum
Die Aktivität der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde bestimmt, wenn sie in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) unter verschiedenen Temperaturbedingungen von 37 bis 65°C für 10 Minuten reagiert wurde. 5 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Reaktionstemperatur-Optimum der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung von 50 bis 60°C ist.
(5) Hitzestabilität
Die Restaktivität der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde nach dem Stehenlassen in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) unter verschiedenen Temperaturbedingungen von 30 bis 50°C für eine Stunde bestimmt. 6 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung bei 45°C nicht deaktiviert wird und 65% der Restaktivität bei 50°C aufweist.
(6) Molekulargewicht
Die in Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde durch eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (mit der 7%igen Gelkonzentration) unter den reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoriert. Als das Ergebnis wurde eine Einfachbande gezeigt, die die gleiche Mobilität unter den beiden Bedingungen aufweist. 7 zeigt die mit der Eichkurve eines Standard-Proteins erhaltene Mobilität. In 7 zeigt „o" das grafische Ergebnis des bestimmten Ergebnisses der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase. Von diesem Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung auf annähernd 200.000 Dalton berechnet.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung hat eine eine hohe Hitzestabilität aufweisende neue Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs und einen diese herstellenden neuen Bacillus circulans-Stamm bereitgestellt.

Claims

Keratan-Sulfat-Hydrolase, welche von dem Bacillus circulans erhaltbar ist und die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: (1) Wirkung: Die Hydrolase wirkt auf Keratan-Sulfat und hydrolisiert dessen N-Acetylglucosaminidische Bindung, (2) Substratspezifität: Die Hydrolase wirkt auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat und erzeugt sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid als Haupthydrolysate, (3) pH-Reaktionsoptimum: Die Hydrolase weist ein pH-Reaktionsoptimum von 4,5 bis 6 im 0,1 M-Acetatpuffer oder im 10 mM-Tris-Acetatpuffer bei 37°C auf, (4) pH-Stabilität: Die Hydrolase weist eine pH-Stabilität von 6 bis 7 auf, wenn die Hydrolase im 0,1 M-Acetatpuffer oder im 10 mM-Tris-Acetatpuffer bei 37°C für eine Stunde stehen gelassen wird, (5) Reaktionstemperatur-Optimum: Die Hydrolase weist ein Reaktionstemperaturoptimum von 50 bis 60°C auf, wenn die Hydrolase im 0,1 M-Acetatpuffer, pH 6,0, für 10 Minuten reagiert, (6) Hitzestabilität: Die Hydrolase ist mindestens bei 45°C stabil, wenn die Hydrolase im 0,1 M-Acetatpuffer, pH 6,0, für eine Stunde stehen gelassen wird, und (7) Molekulargewicht: Die Hydrolase weist ein Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton auf, wenn das Molekulargewicht durch die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese in einer Gelkonzentration von 7% bestimmt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Keratan-Sulfat-Hydrolase, umfassend die Schritte: Kultivieren des Bacillus circulans, der die Fähigkeit aufweist, die in Anspruch 1 definierte Keratan-Sulfat-Hydrolase in einem Medium herzustellen, und Gewinnen der Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Medium und/oder den mikrobiellen Zellen.
Verfahren zur Herstellung einer nach Anspruch 2 beanspruchten Keratan-Sulfat-Hydrolase, wobei ein durch Lysieren oder Aufschließen der mikrobiellen Zelle erhaltener mikrobieller Zellextrakt mit Desoxyribonuklease behandelt wird und dann die Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Zellextrakt gewonnen wird.
Bacillus circulans, welcher die Fähigkeit aufweist, die in Anspruch 1 definierte Keratan-Sulfat-Hydrolase herzustellen.
Bacillus circulans nach Anspruch 4, welcher der Bacillus circulans KsT202 (Zugangsnummer: FERM BP-5285) ist.