DE69732875T2

DE69732875T2 - Herstellung und Verwendung von L-Ribose-Isomerase

Info

Publication number: DE69732875T2
Application number: DE69732875T
Authority: DE
Inventors: Ken Kita-Gun Izumori; Keiji Kurashiki-shi Tsusaki
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-05-16
Filing date: 1997-05-14
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2017-05-15
Also published as: KR970074930A; KR100512062B1; EP0807682A2; US6294369B1; US6037153A; EP0807682B1; JP4012596B2; CZ150197A3; DE69732875D1; CZ295994B6; EP0807682A3; US5846804A; TW482822B; JPH10155480A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine L-Ribose-Isomerase, deren Herstellung und Verwendungen, insbesondere bezieht diese sich auf eine L-Ribose-Isomerase, welche L-Ribose zu L-Ribulose und umgekehrt umwandelt, Herstellung hiervon, Mikroorganismen fähig zur Herstellung der L-Ribose-Isomerase und ein Verfahren zum Herstellen von Ketosen und Aldosen unter Verwendung der L-Ribose-Isomerase.
Die biochemische Industrie hat in diesen Tagen seltene Saccharide entwickelt, welche unbeachtet waren, und für die ein großer Bedarf auf dem Gebiet der Saccharidchemie besteht. Folglich wird die Etablierung dieser seltenen Saccharide stark benötigt. Obwohl solche seltenen Saccharide durch organisch-chemische Verfahren hergestellt werden können, sind die Herstellungsbedingungen im Allgemeinen entscheidend und die Ausbeuten der gewünschten Produkte sind relativ gering. Daher sind die organisch-chemischen Verfahren für eine Produktion im industriellen Maßstab nicht zufriedenstellend. Während enzymatische Saccharid-Umsetzungsverfahren als biochemische Verfahren zur Herstellung seltener Saccharide vorstellbar sind, wurde von keiner Isomerase berichtet, welche auf L-Ribose oder D-Talose als ein seltenes Saccharid einwirkt, und die Herstellungsmethode für solche seltenen Saccharide war nicht etabliert.
Ein Herstellungsverfahren für seltene Saccharide, wie bspw. L-Ribose und D-Talose, in industriellem Maßstab wurde stark benötigt.
Um die Aufgabe zu lösen, haben die vorliegenden Erfinder eine L-Ribose-Isomerase studiert und umfangreich Mikroorganismen gesichtet, wel che solch ein Enzym herstellen. Als ein Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass ein neu isolierter Mikroorganismus der Art Acinetobacter calcoaceticus LR7C-Stamm isoliert aus einer Erde in Miki-machi, Kita-gun, Kagawa, Japan eine L-Ribose-Isomerase produziert. Die Erfinder haben ebenfalls herausgefunden, dass die L-Ribose-Isomerase die Herstellung seltener Saccharide erleichtert, wenn auf Aldosen oder Ketosen als Substrate einwirkend, und die vorliegende Erfindung etabliert.
1 zeigt den Einfluss der Temperatur auf die enzymatische Aktivität einer aus Acinetobacter calcoaceticus abgeleiteten L-Ribose-Isomerase.
2 zeigt den Einfluss des pH auf die enzymatische Aktivität einer aus Acinetobacter calcoaceticus abgeleiteten L-Ribose-Isomerase.
3 zeigt die thermische Stabilität einer aus Acinetobacter calcoaceticus abgeleiteten L-Ribose-Isomerase.
4 zeigt die pH-Stabilität einer aus Acinetobacter calcoaceticus abgeleiteten L-Ribose-Isomerase.
5 ist eine Röntgenbeugungsaufnahme für ein durch die vorliegende Erfindung erhaltenes L-Ribose Kristall mit der höchsten Reinheit, bestimmt mit Pulverröntgenbeugungsanalyse unter Verwendung von CuKa-Strahlen. Die Nummern in der Figur sind die Nummern der Maxima für jedes Maximum.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine L-Ribose-Isomerase, deren Herstellung und Verwendungen, insbesondere betrifft sie eine L-Ribose-Isomerase, welche L-Ribose zu L-Ribulose und umgekehrt umwandelt, Herstellung hiervon, Mikroorganismen fähig zur Herstellung der L-Ribose-Isomerase und ein Verfahren zum Herstellen von Ketosen und Aldosen unter Verwendung von L-Ribose-Isomerase.
Nachfolgend sind die Identifikationsergebnisse der Mikroorganismen der Gattung Acinetobacter, d.h. Acinetobacter calcoaceticus LR7C-Stamm (FERM BP-5335) wiedergegeben.
Identifikationsergebnisse von Acinetobacter calcoaceticus LR7C-Stamm:
A. Morphologie

Charakteristika der Zellen, wenn bei 27°C in Agar-Nährmedium inkubiert gewöhnlich in einer einzelnen Stäbchenform von 1,0–1,5 × 1,5–2,5 μm existierend; Motilität: positiv (rotierende oder schwingende Motilität); Asporogenität: positiv; Flagellum: positiv; Gram-Färbung: negativ;

B. Kultivierungseigenschaften

(1) Charakteristika der gebildeten Kolonien, wenn bei 27°C in Nähragarplatten inkubiert Form: kreisrunde Kolonie mit einem Durchmesser von 0,1–1 mm nach 2 Tagen Inkubation; Rand: vollständig; Projektion: halbkugelförmige Form; Glanz: matt; Oberfläche: glatt; Farbe: Halbtransparenz, weiß-gelb;
(2) Charakteristika der gebildeten Kolonien, wenn bei 27°C in geneigtem Nähragar inkubiert. Wachstum: zufriedenstellend; Form: fadenartig;
(3) Charakteristika der gebildeten Kolonien, wenn bei 27°C in geneigtem Nähragar mit Trypton-Soja-Brühe inkubiert Wachstum: zufriedenstellend; Form: fadenartig; und
(4) Gelatine nicht verflüssigend, wenn bei 27°C in Nährgelatine stabkultiviert.

C. Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv;
(2) Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ;
(3) Methylrottest: negativ;
(4) VP-Test: negativ;
(5) Bildung von Indol: negativ;
(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ;
(7) Hydrolyse von Stärke: negativ;
(8) Verwertung von Zitronensäure: positiv;
(9) Bildung von Pigment: negativ;
(10) Oxidase: negativ;
(11) Katalase: positiv;
(12) Wachstumsbedingungen: wachsend bei einer Temperatur in dem Bereich von 20–37°C;
(13) Sauerstoffanforderungen: aerob;
(14) Bildung von Säure aus D-Glucose: positiv;
(15) Hämolyse: negativ;
(16) β-Xylosidase: negativ;
(17) Verwertung von Kohlenstoffquelle Glutarsäure, Malonsäure, Phenylmilchsäure, Azelainsäure, D-Äpfelsäure, Ethanol, 2,3-Butandiol, Akonitsäure, D-Ribose, D-Xylose, L-Arabinose und D-Glucose verwertend;
(18) Verwertung von Stickstoffquelle L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Asparaginsäure, L-Leucin, L-Tyrosin, β-Alanin, L-Arginin und L-Ornithin verwertend, aber kein Histamin verwertend;
(19) DNase: positiv;
(20) Bildung von 3-Ketolaktose: negativ; und
(21) Mol-% Guanin (G) plus Cytosin (C) von DNA: 42%.

Basierend auf diesen mykologischen Eigenschaften wurden die Mikroorganismen mit denen von bekannten Mikroorganismen mit Bezug auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Auflage (1994) verglichen. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass die Mikroorganismen als neuer Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter identifiziert wurden. Die vorliegenden Erfinder haben diesen Mikroorganismus basierend auf den Daten des Nicht-Wachsens bei 41°C, negativer Hämolyse und Gelatinhydrolyse, positiver Säurebildung aus Glucose und Bedingungen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellenverwertung als einen der Art Acinetobacter calcoaceticus identifiziert.
Aufgrund dieser Ergebnisse haben die vorliegenden Erfinder den Mikroorganismus "Acinetobacter calcoaceticus LR7C" genannt und am 14. Dezember 1995 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japan hinterlegt. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde am selben Tag akzeptiert und wurde durch das Institut unter der Zugangsnummer FERM BP-5335 aufrecht erhalten.
Zusätzlich zu dem zuvor identifizierten Mikroorganismus können in der vorliegenden Erfindung andere Stämme der Gattung Acinetobacter und Mutanten hiervon geeignet eingesetzt werden, solange diese die L-Ribose-Isomerase gemäß der vorliegenden Erfindung herstellen. Die obigen Mutanten können durch physikalische Behandlung von Mikroorganismen der Gattung Acinetobacter mit Ultraviolettstrahlen oder γ-Strahlen, chemisches Behandeln der Mikroorganismen mit Nitrosoguanidin oder durch sukzessives Kultivieren der Mikroorganismen in Nährkulturmedien enthaltend D-Lyxose erhalten werden, um die vorliegende L-Ribose-Isomerase stabil zu produzieren und die Enzymausbeute zu steigern. In der vorliegenden Erfindung kann jeder andere Mikroorganismus eingesetzt werden, solange dieser die vorliegende L-Ribose-Isomerase herstellt. Es ist möglich, die L-Ribose-Isomerase durch Exprimieren der Isomerase in Transformanten, in welche ein die Tsomerase kodierendes Gen eingeführt ist, hergestellt werden. Wenn nötig können Protein-Verfahrenstechniken eingesetzt werden, um die thermische Stabilität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase zu erhöhen oder den Bereich der pH-Stabilität zu verbreitern. In der Erfindung kann jedes Nährkulturmedium, wie bspw. synthetisches oder natürliches Nährkulturmedium, eingesetzt werden, solange die vorgenannten Mikroorganismen darin wachsen können und die vorliegende L-Ribose-Isomerase herstellen. Eine oder mehrere kohlenstoffhaltige Verbindungen, wie bspw. Aldosen, Ketosen und Zuckeralkohole, können in der Erfindung als Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Gewöhnlich kann D-Lyxose vorteilhaft als Kohlenstoffquelle für das Nährkulturmedium eingesetzt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Stickstoffquellen schließen anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie bspw. Ammoniumsalze und Nitrate sowie organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie bspw. Harnstoff, Maiseinweichlösung, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Rinderextrakt, ein. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten anorganischen Bestandteile umfassen Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze und -phosphate. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismen können unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von gewöhnlich ungefähr 10–40°C, vorzugsweise ungefähr 20–35°C, und bei einem pH von ungefähr 5–9, vorzugsweise ungefähr 6–8,5, kultiviert werden.
Nach Komplettierung der Mikroorganismenkultur wird die vorliegende L-Ribose-Isomerase aus der Kultur gewonnen. Die Zellen an sich können als enzymatisches Mittel eingesetzt werden, weil das Enzym hauptsächlich intrazellulär existiert. Das intrazelluläre Enzym kann aus den Zellen durch eine konventionelle Technik extrahiert werden und das extrahierte Enzym kann als ein Rohenzym intakt oder nach Aufreinigung mit herkömmlichen Methoden eingesetzt werden. Bspw. können Extrakte von homogenisierten Zellen durch zwei oder mehr Techniken, wie bspw. Fraktionierungen unter Verwendung von Polyethylenglukol, Ionenaustauschchromatographien und Gelfiltrationschromatographien aufgereinigt werden, um Enzympräparationen mit einer elektrophoretisch einzigen Proteinbande zu erhalten.
Die vorliegende L-Ribose-Isomerase-Aktivität wird folgendermaßen bestimmt: Mische 0,05 ml an 0,5 M Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,0), 0,05 ml an 0,05 M L-Ribose und ein angemessenes Volumen einer Enzymlösung, ausreichend, um ein Gesamtvolumen von 0,5 ml zu ergeben. Inkubiere die resultierende Lösung bei 30°C für eine enzymatische Reaktion und quantifiziere die Menge der gebildeten L-Ribose durch das Cystein-Carbazol-Verfahren. Eine Einheit Aktivität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase ist als die Menge Enzym definiert, welche ein μmol L-Ribose pro Minute bildet.
Zusätzlich zu L-Ribose wirkt die vorliegende L-Ribose-Isomerase auf Aldosen, wie bspw. D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose ein, um diese zu deren korrespondierenden Ketosen zu isomerieren.
Die vorliegende L-Ribose-Isomerase sollte nicht notwendigerweise zu dem höchstmöglichen Grad aufgereinigt werden. Bspw. können Mikroorganismen enthaltend die L-Ribose-Isomerase und behandelt mit Toluol geeigneterweise intakt in Saccarid-Transferierungs-Reaktionen im industriellen Maßstab eingesetzt werden. Mikroorganismen mit der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität sowie teilweise aufgereinigte Präparationen der Isomerase können mit herkömmlichen Immobilisierungsverfahren, wie bspw. Einschließen, Adsorption und kovalente Bindungsverfahren, immobilisiert werden. Das immobilisierte Enzym kann wiederholt chargenweise oder kontinuierlich nach Verpackung in Säulen eingesetzt werden.
Die so erhaltenen Reaktionsmischungen enthalten gewöhnlicherweise sowohl Aldosen als auch Ketosen. Generell können die Mischungen durch zwei oder mehrere Filtrationstechniken verwendend Filtermittel, Filter und Membranfilter, Zentrifugation, um unlösliche Verbindungen abzutrennen, Entfärben mit Aktivkohle und Entsalzen unter Verwendung von Ionenaustauschern in H- und OH-Form aufgereinigt werden. Die resultierenden Mischungen können konzentriert werden, um sirupartige Produkte zu erhalten, oder zu pulverförmigen Festprodukten getrocknet werden. Wenn nötig, können übergeordnete Kristallisationsschritte eingesetzt werden: bspw. Fraktionierungen unter Verwendung von Kationenaustauschern in alkalischer Metall- und/oder alkalischer Erdmetall-Form oder Anionenaustauschern in Bisulfit- und/oder Borsäure-Form und Säulenchromatographien unter Verwendung von Silica-Gelen produzieren leicht hochaufgereinigte Saccharide. Wenn die erhaltenen Saccharide kristallisierbar sind, können diese durch herkömmliche Kristallisationstechniken willkürlich zu kristallinen Produkten präpariert werden. Bspw. werden die obigen, entweder mit oder ohne geeignete Aufreinigungsverfahren behandelten Reaktionsmischungen oder Saccharidlösungen mit einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, generell solche wie niedrige Alkylalkohole einschließlich Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol, vermischt oder konzentriert und/oder diesen erlaubt, bei relativ geringen Temperaturen stehen zu bleiben. Diese Verfahren können kombiniert werden, um supergesättigte Lösungen der vorgenannten Saccharide zu erhalten, gefolgt vom Kristallisieren der Lösungen und Abtrennen der Kristalle, um Feststoffprodukte enthaltend Kristalle zu erhalten. Diese Saccharidprodukte können als chemische Reagenzien eingesetzt werden und in der Lebensmittelindustrie als Süßstoffe und qualitätsverbessernde Mittel und in der pharmazeutischen und chemischen Industrie als Materialien und Zwischenstoffe eingesetzt werden.
Unter diesen Sacchariden ist D-Ribose, ein Isomer von L-Ribose, eine essentielle Komponente für tief mit Zellwachstum korrelierte DNA. Daher kann L-Ribose oder Derivate hiervon als ein replikationsinhibierendes Mittel für Nukleinsäuren eingesetzt werden: Beispiele solcher Inhibierungsmittel schließen Pharmazeutika, wie bspw. Antiseptika, antivirale Mittel, Anti-AIDS-Mittel und antitumorale Mittel, ein. Wie zuvor beschrieben wird L-Ribose leicht aus L-Ribulose durch Verwenden der vorliegenden L-Ribose-Isomerase präpariert. Die L-Ribulose ist bezüglich deren Ursprungs nicht beschränkt: bspw. kann das Saccharid leicht durch Oxidationsreaktionen unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattungen Gluconobacter und Acetobacter, d.h. der Spezies Gluconobacter frateurii und Acetobacter aceti, hergestellt werden. Die nachfolgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung im Detail:
Versuch 1
Herstellung von L-Ribose-Isomerase aus Acinetobacter calcoaceticus LR7C
Ein flüssiges Nährkulturmedium bestehend aus 0,5 Gew.-% Hefeextrakt, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,5 Gew.-% Salz und Wasser wurde auf pH 7,0 eingestellt. Zwei Liter des Mediums wurden in einem 2,5-l Gefäßfermenter platziert, durch einen Autoklaven bei 120°C für 20 min. sterilisiert, abgekühlt und mit einer Impfkultur von Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335), welche für 4 Tage in einem Nährkulturmedium enthaltend D-Lyxose als Kohlenstoffquelle kultiviert wurde, inokuliert, welche dann bei 30°C für 14 Stunden unter Belüftungs-Belüftungs-Schüttel-Bedingungen kultiviert wurde. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert, um Zellen in einer Ausbeute von ungefähr 15 g Nasszellen pro ein l des Kulturmediums zu erhalten. Die nassen Zellen wurden in einer herkömmlichen Weise mit Aluminiumpulver aufgeschlossen, mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) vermischt, um das gewünschte Enzym zu extrahieren, und zentrifugiert, um einen 200 ml Überstand als eine Rohenzymlösung mit einer gesamten Enzymaktivität von 2.870 Einheiten und einer spezifischen Aktivität von 1,73 Einheiten/mg Protein zu erhalten.
Versuch 2
Aufreinigung von L-Ribose-Isomerase
Versuch 2-1
Polyethylenglykolfraktionierung
Die Rohenzymlösung aus Versuch 1 wurde eisgekühlt, mit 0,01 M Manganchlorid vermischt, dieser erlaubt, für 30 Min. zu stehen, und zentrifu giert, um unlösliche Verbindungen abzutrennen. Zu dem erhaltenen Überstand wurde Polyethylenglykolpulver zugegeben, um eine endgültige Konzentration von 15 Gew.-% zu erhalten, und darin unter rührenden Bedingungen gelöst, gefolgt vom Zentrifugieren der Mischung, um die gebildeten unlöslichen Verbindungen abzutrennen. Der resultierende Überstand wurde mit Polyethylenglykol vermischt, um eine endgültige Konzentration von 25 Gew.-% zu ergeben, und darin unter rührenden Bedingungen gelöst und die gebildeten unlöslichen Verbindungen wurden durch Zentrifugation gesammelt.
Versuch 2-2
Ionenaustauschchromatographie
Die Sedimente aus Versuch 2-1 wurde in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst und die verbliebenen unlöslichen Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt, um einen 13 ml Überstand zu erhalten, welcher dann auf eine mit "DEAE-TOYOPEARL^® 650M", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan kommerziell vertriebenen leicht alkalischen Anionenaustauscher, gepackte Säule gegeben wurde, um das gewünschte Enzym auf dem Austauscher zu adsorbieren, gefolgt vom Eluieren des Enzyms von der Säule mit einem linearen Lösungsgradienten von Kaliumchlorid, welcher von 0 M bis 0,5 M ansteigt, und Sammeln der Fraktionen mit einer L-Ribose-Isomerase-Aktivität.
Versuch 2-3
Gelfiltrationschromatographie
Die Fraktionen mit einer L-Ribose-Isomerase-Aktivität aus Versuch 2-2 wurden konzentriert und das Konzentrat wurde auf eine mit "SEPHADEX^® G-150", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Upsala, Schweden kom merziell vertriebenen perlenartigen Dextrangel, gepackte Säule aufgegeben und mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) eluiert, um Fraktionen mit einer L-Ribose-Isomerase-Aktivität zu erhalten. Tabelle 1 zeigt den Proteingehalt, die Enzymaktivität, Enzymausbeute und den Enzymaufreinigungsgrad in jedem Aufreinigungsschritt.
Tabelle 1
Eine Überprüfung der Reinheit durch Polyacrylamidgel-Disk-Elektrophorese für das als ein Eluat in der Gelfiltration unter Verwendung von "SEPHADEX^® G-150" in Tabelle 1 erhaltene, endgültig aufgereinigte Enzym zeigte, dass das Enzym so aufgereinigt war, um eine einzelne Proteinbande zu zeigen, bedeutend, dass das Enzym ein elektrophoretisch hoch aufgereinigtes Enzym war.
Versuch 3
Eigenschaften von L-Ribose-Isomerase
Unter Verwendung einer durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltenen, aufgereinigten L-Ribose-Isomerase wurden die physikalisch-chemischen Eigenschaften studiert.
Versuch 3-1
Wirkung
Die aufgereinigte L-Ribose-Isomerase bildete L-Ribulose aus L-Ribose und umgekehrt, wenn auf L-Ribose oder L-Ribulose im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität einwirkend.
Versuch 3-2
Substratspezifität
Im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität wurde die Aktivität der aufgereinigten L-Ribose-Isomerase für Aldosen als Substrate untersucht. Tabelle 2 zeigt die relativen Aktivitäten des Enzyms für die Aldosen, wenn die relative Aktivität des Enzyms für L-Ribose als 100 betrachtet wurde.
Tabelle 2
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich, zeigt die L-Ribose-Isomerase die höchste Aktivität auf L-Ribose. Die L-Ribose-Isomerase wirkte auf andere Aldosen, wie bspw. L-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose, ein. Diese enzymatischen Reaktionen waren reversible Reaktionen und das Enzym wirkte ebenfalls auf L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose als Substrate korrespondierend zu den vorgenannten Aldosen ein. Tabelle 3 zeigt die Daten der aus den vorgenannten Substraten hergestellten Ketosen und Aldosen, welche durch Ionenaustauschchromatographie, hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie etc. bestätigt wurden.
Tabelle 3
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich ist, wirkt die vorliegende L-Ribose-Isomerase auf Aldosen ein, um diese zu deren korrespondierenden Ketosen und umgekehrt zu konvertieren. Diese enzymatischen Umset zungsreaktionen teilen sich ein gemeinsames enzymatisches Reaktionsschema. Die chemische Formel 1 ist ein Beispiel für das Reaktionsschema.
Chemische Formel 1;
Die enzymatische Reaktion der vorliegenden L-Ribose-Isomerase ist eine reversible Reaktion. 4 zeigt die Ergebnisse der quantitativen Beziehung der reversiblen Gleichgewichtsreaktionen zwischen Aldosen und Ketosen unter den zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität eingesetzten Bedingungen.
Tabelle 4
Die Michaelis-Konstante Km der vorliegenden L-Ribose-Isomerase zu L-Ribose betrug 44 mM.
Versuch 3-3
Molekulargewicht

(1) Ungefähr 25.000–35.000 Daltons nach Polyacrylamidgelelekrophorese (SDS-PAGE);
(2) Ungefähr 110.000–130.000 Daltons nach Gelfiltrationsverfahren;

Das ungefähr 4 mal höhere Molekulargewicht nach Gelfiltration als nach SDS-PAGE indiziert, dass die vorliegende L-Ribose-Isomerase als Tetramer vorliegt.
Versuch 3-4
Isoelektrischer Punkt (pI)
Die vorliegende L-Ribose-Isomerase hat einen pI von ungefähr 4,0–5,5 nach Isoelektrophorese unter Verwendung einer Agarose-Platte.
Versuch 3-5
Inhibition der Aktivität
Die Aktivität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase wird durch L-Arabitol und Ribitol leicht inhibiert.
Versuch 3-6
Optimale Temperatur
Die optimale Temperatur der vorliegenden Ribose-Isomerase wurde im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität studiert. Wie in 1 gezeigt betrug die optimale Temperatur ungefähr 30°C, wenn bei pH 9,0 für 10 Min. inkubiert.
Versuch 3-7
Optimaler pH
Der optimale pH der vorliegenden L-Ribose-Isomerase wurde im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität studiert. Wie in 2 gezeigt ist betrug der optimale pH ungefähr 8–9, wenn bei 30°C für 10 Min. inkubiert. 2 zeigt die Ergebnisse des Versuchs unter Verwendung von Citratpuffer, Veronalpuffer und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, welche durch die Symbole "O", "•" bzw. "Δ" angezeigt sind.
Versuch 3-8
Thermische Stabilität
Die thermische Stabilität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase wurde im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der vorliegenden L-Ribose-Isomerase-Aktivität studiert. Wie in 3 gezeigt ist war die L-Ribose-Isomerase bis zu einer Temperatur von ungefähr 30°C stabil, wenn bei pH 9,0 für 10 Min. inkubiert.
Versuch 3-9
pH-Stabilität
Die pH-Stabilität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase wurde im Einklang mit dem Verfahren zum Untersuchen der L-Ribose-Isomerase untersucht. Wie in 4 gezeigt ist, war die Isomerase bei einem pH von ungefähr 7–9 stabil, wenn bei 4°C für 24 Stunden inkubiert. 4 zeigt die Ergebnisse des Versuchs unter Verwendung von Citratpuffer, Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, welche durch die Symbole "O", "•", "Δ" bzw. "
" indiziert sind.
Basierend auf diesen Daten sind der optimale pH und die pH-Stabilität der vorliegenden L-Ribose-Isomerase im Wesentlichen gleich, bedeutend, dass die Isomerase ein vorteilhaftes Merkmal hat, wenn in einer Produktion im industriellen Maßstab eingesetzt.
Versuch 3-10
N-terminale Aminosäuresequenz
Eine durch das Verfahren in Versuch 2-3 erhaltene, aufgereinigte Enzympräparation wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und ungefähr 80 μg des Enzyms mit Bezug zu einem Proteingehalt wurden als eine Probe zum Analysieren der N-terminalen Aminosäuresequenz eingesetzt. Ein "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", ein von Applied Biosystems Inc., Foster City, USA kommerziell vertriebener Protein-Sequenzierapparat, bestimmte vom N-Terminus die Aminosäuresequenz bis zu dem fünften Aminosäurerest die in SEQ ID NO: 1 wiedergegebene zu sein. Detailliertere Analysen der obigen Probe zeigten, dass das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 als eine N-terminale Aminosäuresequenz enthält.
Die folgenden sind die bevorzugten Beispiele gemäß der vorliegenden Erfindung:
Beispiel 1
Herstellung von Ketosen für Aldosen
Unter Verwendung einer durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltenen, aufgereinigten L-Ribose-Isomerase wurden Ketosen aus Aldosen hergestellt. L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose wurden als Aldosen eingesetzt. Unter Halten von 10 ml einer 0,05 M Aldoselösung bei pH 9 wurden 50 Einheiten der aufgereinigten L-Ribose-Isomerase zu der Aldoselösung hinzugefügt, gefolgt von der Inkubation bei 30°C für 10 Stunden. Die Reaktionsmischung wurde mit Aktivkohle behandelt und einer Deionisation und Fraktionierung durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauschers in Ca⁺⁺-Form unterworfen. Die resultierenden Fraktionen enthaltend ein gewünschtes Produkt wurden im Vakuum konzentriert, um ein aufgereinigtes Produkt zu erhalten. Analysen mit hochauflösender Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Dünnschichtchromatographie zeigten, dass das Verhältnis zwischen Aldosen als Materialien und Ketosen als Produkte im Wesentlichen dasselbe wie das von Tabelle 3 war.
Beispiel 2
Produktion von Aldosen aus Ketosen
Unter Verwenden einer durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltenen, aufgereinigten L-Ribose-Isomerase wurden Aldosen aus Ketosen hergestellt. L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose wurden als Ketosen eingesetzt. Unter Halten von 10 ml einer 0,05 M Ketoselösung bei pH 9 wurden der Ketoselösung 50 Einheiten der aufgereinigten L-Ribose-Isomerase zugefügt, gefolgt von Inkubation bei 30°C für 10 Stunden. Die Reaktionsmischung wurde mit Aktivkohle behandelt und einer Deionisation und Fraktionierung durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauschers in Na⁺-Form ausgesetzt. Die resultierenden Fraktionen enthaltend ein gewünschtes Produkt wurden im Vakuum konzentriert, um ein aufgereinigtes Produkt zu erhalten. Analysen mit hochauflösender Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Dünnschichtchromatographie zeigten, dass das Verhältnis zwischen Aldosen als Materialien und Ketosen als Produkte im Wesentlichen dasselbe wie das von Tabelle 3 war.
Beispiel 3
Herstellung von L-Ribose
Im Einklang mit dem Verfahren in Beispiel 2 wurden 10 Einheiten einer aufgereinigten L-Ribose-Isomerase zu 25 ml an 0,1 M L-Ribulose zugefügt, gefolgt von der Inkubation bei 30°C für 15 Stunden, um L-Ribulose zu L-Ribose zu konvertieren. Die Reaktionsmischung wurde in einer gewöhnlichen Weise mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern in H- und CO₃-Form aufgereinigt und durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Anionenaustauschers in Bisulfit-Form erhitzt auf 40°C fraktioniert, um eine aufgereinigte L-Ribose zu erhalten. Die Ausbeute der aufgereinigten L-Ribose zu dem L-Ribulose-Material betrug ungefähr 60%, bezogen auf eine trockene Feststoffbasis (d.s.b.). Das Produkt kann willkürlich in Lebensmittelprodukten, Kosmetika, Pharmazeutika und deren Materialien als ein Süßstoff, qualitätsverbesserndes Mittel, Anfeuchter und replikationsinhibierendes Mittel für Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Beispiel 4
Herstellung von D-Talose
Im Einklang mit dem Verfahren in Beispiel 2 wurden 10 Einheiten einer aufgereinigten L-Ribose-Isomerase zu 50 ml an 0,1 M D-Tagatose zugefügt, gefolgt von der Inkubation bei 30°C für 20 Stunden, um D-Tagatose zu D-Talose zu konvertieren. Die Reaktionsmischung wurde in gewöhnlicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern in H- und CO₃-Form aufgereinigt und durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauschers in Ca⁺⁺-Form fraktioniert, gefolgt vom Konzentrieren der Fraktionen enthaltend ein gewünschtes Produkt, um ein D-Talose-Kristall zu erhalten. Die Ausbeute der erhaltenen D-Talose zu dem D-Tagatose-Material betrug ungefähr 10%, d.s.b. Das Produkt kann willkürlich in Lebensmittelprodukten, Kosmetika, Pharmazeutika und deren Materialien als ein Süßmittel, qualitätsverbesserndes Mittel und Anfeuchter eingesetzt werden.
Beispiel 5
Herstellung von L-Ribose aus Ribitol
Einhundert ml-Teilmengen eines Nährkulturmediums bestehend aus 2 Gew.-% Trypton-Soja-Brühe, einem Gew.-% Glycerin und deionisiertem Wasser wurden auf zehn 500 ml Schüttelflaschen verteilt, gefolgt vom Autoklavieren der Flaschen bei 120°C für 20 Minuten. Daran anschließend wurden die Flaschen abgekühlt und mit einer Impfkultur von Gluconobacter frateurii (IFO 3254) unter Verwendung einer Platinschlaufe inokuliert, gefolgt von Inkubation bei 30°C für 2 Tage unter schüttelnden Bedingungen. Nach Komplettierung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und ungefähr 10 g lebende nasse Zellen wurden mit 100 ml 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) enthaltend 5 Gew.-% Ribitol vermischt. Die Mischungslösung in einem Volumen von 100 ml wurde in eine 500 ml Schüttelflasche platziert und bei 30°C für 20 Stunden unter schüttelnden Bedingungen inkubiert, um Ribitol zu L-Ribulose zu konvertieren. Daran anschließend wurde die Kultur zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und der resultierende Überstand wurde in einer gewöhnlichen Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit "DIAION SK1B (H-Form)" und "DIAION WA30 (OH-Form)", welche beide Kationenaustauscher von Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japan waren, entsalzt und im Vakuum konzentriert, um einen transparenten Sirup mit einer Konzentration von ungefähr 60 Gew.-% zu erhalten. Der Sirup wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von "DOWEX 50W-X4", einem von The Dow Chemical Corporation, Midland, Michigan, USA kommerziell vertriebenen Kationenaustauscher in Ca⁺⁺-Form, fraktioniert, um Fraktionen mit einem hohen L-Ribolose-Gehalt zu erhalten, welche dann zu einem ungefähr 70 gew.-%-igen Sirup konzentriert wurden. Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse unter Verwendung einer 8 × 300 mm-Säule, gepackt mit "MCIGEL CK-08EC", einem von Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Gel in Ca⁺⁺-Form, zeigte, dass das Produkt wenigstens 97 Gew.-%, d.s.b., L-Ribulose enthielt. Die Ausbeute an L-Ribulose zu dem Ribitol-Material betrug ungefähr 90%, d.s.b.
L-Ribose wurde unter Verwendung der erhaltenen L-Ribulose wie folgt präpariert: Gemäß dem Verfahren in Versuch 1 wurden ungefähr 50 g nasse Zellen durch Zentrifugation einer Kultur von Mikroorganismen erhalten und mit Toluol behandelt. Die resultierenden Zellen wurden mit 100 ml an 2,5 Gew.-% Natriumalginat geknetet. Die Zellen enthaltende Ausschlämmung wurde in 0,1 M CaCl₂-Lösung getropft, welche durch einen Magnetrührer gerührt wurde, um Gel mit einem Durchmesser von ungefähr 2 mm zu bilden. Die Gele wurden filtriert, um ein immobilisiertes Enzym mit einer L-Ribose-Isomerase-Aktivität von ungefähr 5.000 Einheiten zu erhalten. Ein durch das obige Verfahren erhaltener L-Ribulose-Sirup wurde mit Wasser zu einer ungefähr 1,0 M Lösung verdünnt, welche dann mit ungefähr 50 Einheiten/g L-Ribulose des immobilisierten Enzyms vermischt wurde und dieser erlaubt wurde, bei pH 8,5 und 10°C für 15 Stunden zu reagieren, um L-Ribulose zu L-Ribose zu konvertieren. Das immobilisierte Enzym wurde durch Filtration gesammelt und das Filtrat wurde gleichermaßen wie in Beispiel 3 entfärbt, entsalzt und durch Säulenchromatographie fraktioniert, um Fraktionen mit einem hohen L-Ribose-Gehalt zu erhalten, während Enternens von Fraktionen mit einem hohen L-Ribulose-Gehalt. Die Fraktionen mit hohem L-Ribose-Gehalt wurden vereinigt, konzentriert, durch die Zugabe eines Impfkristalls unter rührenden Bedingungen kristallisiert und abgetrennt, um Fraktionen mit hohem L-Ribose-Gehalt zu erhalten, während Enternens von Fraktionen mit L-Ribulose-Gehalt. Die Fraktionen mit hohem L-Ribose-Gehalt wurden vereinigt, konzentriert, mit einem Impfkristall vermischt, um L-Ribose unter rührenden Bedingungen zu kristallisieren, gefolgt vom Abtrennen der Mischung, um ein Festprodukt enthaltend L-Ribose-Kristall zu erhalten. HPLC-Analyse wie in Beispiel 5 beschrieben zeigte, dass die Reinheit des Produktes ungefähr 98 Gew.-% betrug und die Ausbeute an L-Ribose-Kristall zu dem L-Ribulose-Material ungefähr 20%, d.s.b., betrug. Das Kristall kann willkürlich in Lebensmitteln, Kosmetika, Pharmazeutika und deren Materialien als ein Süßstoff, qualitätsverbesserndes Mittel, Anfeuchter und replikationsinhibierendes Mittel für Nukleinsäuren eingesetzt werden. Das gewonnene immobilisierte Enzym kann wiederholt in der vorliegenden Umsetzungsreaktion eingesetzt werden. Ferner können die Fraktionen mit hohem L-Ribulose-Gehalt, welche fraktioniert und aus den Reaktionsmischungen entfernt wurden, vorteil haft als ein Material für L-Ribose, um die Ausbeute an L-Ribose-Kristall zu erhöhen, wiederverwertet werden.
Beispiel 6
Herstellung von L-Ribose aus Ribitol
Einhundert ml-Teilmengen eines Nährkulturmediums bestehend aus 2 Gew.-% Trypton-Soja-Brühe, einem Gew.-% Glycerin und Wasser wurden auf zwei 500 ml Schüttelflaschen verteilt, gefolgt vom Autoklavieren der Flaschen bei 120°C für 20 Minuten. Daran anschließend wurden die Flaschen abgekühlt und mit einer Saat von Acetobacter aceti (IFO 3281) verwendend eine Platinschlaufe inokuliert, gefolgt von der Inkubation bei 30°C für 2 Tage unter schüttelnden Bedingungen, um eine Impfkultur zu erhalten. 16,8 l eines Nährkulturmediums bestehend aus 1,1 Gew.-% Polypepton, 0,2 Gew.-% "HINUTE SMP", einer von Fuji Oil Corporation Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Peptid-Lösung von essbaren Sojabohnen, 1,68 Gew.-% Kaliumdihydrogenphosphat, einem Gew.-% Glycerin und Wasser wurden in einem 30 l Gefäßfermenter platziert, bei 120°C für 20 Minuten autoklaviert, auf 30°C abgekühlt und durch Zugabe wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,2 eingestellt. Zu dem Nährkulturmedium wurde ein Vol.-% der obigen Impfkultur inokuliert und bei 30°C für 22 Stunden unter Belüftungs-Schüttel-Bedingungen inkubiert, dieses dann mit 3,2 l wässriger Ribitollösung enthaltend 2 kg Ribitol, welches bei 120°C für 20 Minuten autoklaviert wurde, vermischt, und für 27 Stunden unter Belüftungs-Schüttel-Bedingungen gerührt, um Ribitol zu L-Ribulose zu konvertieren. Die Reaktionsmischung wurde membranfiltriert, um ein Filtrat zu erhalten. HPLC-Analyse, wie in Beispiel 5 beschrieben, zeigte, dass das Filtrat wenigstens 97 Gew.-% L-Ribulose, d.s.b., enthielt.
L-Ribose wurde unter Verwendung der erhaltenen L-Ribulose wie folgt präpariert: Eine Saat von Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP 5335) wurde in einem Nährkulturmedium enthaltend D-Lyxose als eine Kohlenstoffquelle inokuliert und bei 30°C für 4 Tage unter schüttelnden Bedingungen inkubiert. Ein Teil der Kultur wurde in einer frischen Präparation desselben Nährkulturmediums inokuliert und für zwei Tage inkubiert und dieser Kultivierungsschritt wurde 5 mal wiederholt. Nach Komplettierung dieser sukzessiven Kulturen wurde ein Teil der endgültigen Kultur auf der Oberfläche einer Nähragarplatte enthaltend D-Lyxose als eine Kohlenstoffquelle inkubiert und kultiviert, um homogene Kolonien zu bilden. Eine der Kolonien wurde als eine Saat in ein Nährkulturmedium bestehend aus 0,5 Gew.-% Hefeextrakt, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,5 Gew.-% Salz und Wasser, welches bei 120°C für 20 Min. autoklaviert wurde, inokuliert und bei 30°C unter schüttelnden Bedingungen kultiviert, um eine Impfkultur zu erhalten. Fünfzehn l einer frischen Präparation des für die obige Impfkultur eingesetzten Nährkulturmediums wurden in einen 30 l Gefäßfermenter platziert, bei 120°C für 20 Min. autoklaviert, auf 30°C abgekühlt, mit einem Vol.-% der Impfkultur inokuliert und bei 30°C für 20 Stunden unter Belüftungs-Bewegungs-Bedingungen kultiviert. Daran anschließend wurde die Kultur zentrifugiert, um nasse Zellen zu erhalten, und ungefähr 50 g derselben wurden mit Toluol behandelt, mit 50 mM Glycinpuffer (pH 9,0) in einem Volumen von einem ml pro g nasse Zellen vermischt, um 110 ml an Enzymlösung enthaltend 128 Einheiten/ml an L-Ribose-Isomerase zu erhalten. Das obige Filtrat enthaltend durch das vorgenannte Verfahren erhaltene L-Ribulose wurden durch die Zugabe von wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 9,0 eingestellt, mit Manganchlorid vermischt, um eine endgültige Konzentration von 0,5 mM zu erhalten, mit ungefähr 5 Einheiten/g L-Ribulose der Enzymlösung vermischt und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert, um ungefähr 70% L-Ribulose zu L-Ribose zu konvertieren.
Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde mit einem Ultrafilter filtriert, entsalzt und im Vakuum konzentriert, um 1,77 kg eines ungefähr 85 gew.-%-igen Sirups zu erhalten. Ethanol wurde zu dem Sirup hinzugefügt, um die L-Ribose zu kristallisieren, und der Kristall wurde abgetrennt, gewaschen, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein ungefähr 600 g hochreines L-Ribose-Kristall zu erhalten. HPLC-Analyse wie in Beispiel 5 beschrieben bestätigte, dass die Reinheit des L-Ribose-Kristalls ungefähr 99,9 Gew.-%, d.s.b., betrug. Die Ausbeute des L-Ribose-Kristalls zu dem Ribitol-Material betrug ungefähr 30%. "GEIGERFLEX RAD-IIB", ein von Rigaku Corporation, Tokio, Japan kommerziell vertriebener Röntgenbeugungs-Analysator unter Verwendung von CuKa-Strahlen, zeigte, dass der L-Ribose-Kristall die Difraktionswinkel (2θ) von 16,3°, 20,1°, 21,3°, 21,4° und 33,0° hatte. Der L-Ribose-Kristall kann willkürlich in Lebensmittelprodukten, Kosmetika, Pharmazeutika und deren Materialien als ein Süßmittel, qualitätsverbesserndes Agenz, Anfeuchter oder replikationsinhibierendes Mittel für Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich, wirkt die L-Ribose-Isomerase auf L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose ein, um diese zu deren korrespondierenden L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose umzusetzen bzw. zu isomerisieren. Die enzymatische Reaktion ist eine reversible Gleichgewichtsreaktion. Folglich kann die L-Ribose-Isomerase in den Isomerisierungsumsetzungsreaktionen zwischen Aldosen und Ketosen eingesetzt werden. Der L-Ribose-Isomerase sollte nicht notwendigerweise erlaubt werden, nach Aufreinigung bis zu einem relativ hohen Grad auf deren Substrate einzuwirken, und Rohpräparationen der L-Ribose-Isomerase können willkürlich eingesetzt werden, um seltene Saccharide industriell herzustellen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine leichte Herstellung von seltenen Sacchariden, welche nicht leicht erhältlich waren, und wird großen Einfluss auf den Gebieten der Lebensmittel-, Kosmetik-, pharmazeutischen und chemischen Industrie haben. Daher hat die vorliegende Erfindung eine unergründliche industrielle Bedeutung.
SEQUENZLISTE

Claims

Eine L-Ribose-Isomerase, welche L-Ribose zu L-Ribulose und umgekehrt isomerisiert.
Eine L-Ribose-Isomerase nach Anspruch 1 mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (1) Molekulargewicht Ungefähr 25.000–35.000 Daltons nach Natriumsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und ungefähr 110.000–130.000 Daltons nach Gelfiltrationsverfahren; (2) Optimale Temperatur Ungefähr 30°C, wenn bei pH 9 für 10 Min. inkubiert; (3) Optimaler pH Ein pH von 8–9, wenn bei 30°C für 10 Min. inkubiert; (4) Thermische Stabilität Stabil bis zu einer Temperatur von ungefähr 30°C, wenn bei pH 9 für 10 Min. inkubiert; und (5) pH-Stabilität Stabil bis zu einem pH von 7–9, wenn bei 4°C für 24 Stunden inkubiert.
Eine L-Ribose-Isomerase nach Anspruch 1, welche ein aus einem Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter abgeleitetes Enzym ist.
Eine L-Ribose-Isomerase nach Anspruch 3, welche eine aus der aus Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335) und Mutanten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Ribose-Isomerase gemäß Anspruch 1 umfassend Kultivieren eines zur Herstellung der L-Ribose-Isomerase fähigen Mikroorganismus in einem Nährkulturmedium, um L-Ribose-Isomerase zu bilden, und Sammeln der hergestellten L-Ribose-Isomerase aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus einer der Gattung Acinetobacter ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus ein aus der aus Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335) und Mutanten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter ist.
Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter, welcher die L-Ribose-Isomerase gemäß Anspruch 1 herstellt.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, welcher ein aus der aus Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335) und Mutanten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter ist.
Verfahren zur Herstellung einer aus der aus L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose bestehenden Gruppe ausgewählten Ketose umfassend Kontaktieren der L-Ribose-Isomerase gemäß Anspruch 1 mit einer aus der aus L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose bestehenden Gruppen ausgewählten Aldose, um eine der Ketosen, welche mit den Aldosen korrespondiert, herzustellen und Sammeln der hergestellten Ketose.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die L-Ribose-Isomerase durch Behandeln eines zur Herstellung von L-Ribose-Isomerase fähigen Mikroorganismus mit Toluol erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schritt des Sammels eine oder mehrere der aus der aus Filtration, Zentrifugation, Entfärben, Entsalzen, Konzentration, Trocknen, Säulenchromatographie, Kristallisation und Trennung bestehenden Gruppe ausgewählten Techniken ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Säulenchromatographie ein Ionenaustauschharz einsetzt.
Verfahren zur Herstellung einer aus der aus L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose bestehenden Gruppen ausgewählten Aldose umfassend Kontaktieren der L-Ribose-Isomerase gemäß Anspruch 1 mit einer aus der aus L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose bestehenden Gruppe ausgewählten Ketose, um eine der Aldosen, welche mit den Ketosen korrespondiert, herzustellen und Sammeln der hergestellten Aldose.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die L-Ribose-Isomerase durch Behandeln eines zur Herstellung von L-Ribose-Isomerase fähigen Mikroorganismus mit Toluol erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die L-Ribose-Isomerase durch Oxidieren von Ribitol unter Verwendung eines aus der aus solchen der Gattung Gluconobacter und Acetobacter bestehenden Gruppe ausgewählten Mikroorganismus erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt des Sammels eine oder mehrere der aus der aus Filtration, Zentrifugation, Entfärben, Entsalzen, Konzentration, Trocknen, Säulenchromatographie, Kristallisation und Trennung bestehenden Gruppe ausgewählten Techniken ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Säulenchromatographie ein Ionenaustauschharz einsetzt.
Verfahren zur Konvertierung zwischen Aldosen und Ketosen umfassend Kontaktieren der L-Ribose-Isomerase gemäß Anspruch 1 entweder mit einer aus der aus L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose bestehenden Gruppen ausgewählten Aldose, um die Aldose zu deren korrespondierenden, aus der aus L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose bestehenden Gruppe ausgewählten Ketose zu isomerisieren, oder mit einer aus der aus L-Ribulose, D-Xylulose, D-Tagatose, D-Fructose, L-Psicose und L-Sorbose bestehenden Gruppe ausgewählten Ketose, um die Ketose zu deren korrespondierenden, aus der aus L-Ribose, D-Lyxose, D-Talose, D-Mannose, L-Allose und L-Gulose bestehenden Gruppen ausgewählten Aldose zu isomerisieren.
Verfahren zur Konvertierung zwischen Aldosen und Ketosen nach Anspruch 19, wobei die L-Ribose-Isomerase durch Behandeln eines zur Herstellung von L-Ribose-Isomerase fähigen Mikroorganismus mit Toluol erhalten wird.