JP2782563B2 - 新規糖質加水分解酵素 - Google Patents
新規糖質加水分解酵素Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖鎖の構造解析に有用な
新規エキソ型糖質加水分解酵素に関する。
新規エキソ型糖質加水分解酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、高等動物由来の糖タンパク質、糖
脂質等の複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能が研究され
ているが、このためには、特異性の高い糖加水分解酵素
が重要な役割を果たす。従来、糖鎖の非還元末端から単
糖を遊離する酵素は種々の起源から単離され、糖鎖の構
造と機能の研究に利用されているが、糖鎖の非還元末端
から二糖を遊離する酵素は、デンプンからマルトースを
遊離するβ−アミラーゼやセルロースからセロビオース
を遊離するセロビアーゼ等が知られているものの、ヘテ
ロオリゴ糖に優先的に作用する酵素は知られていない。
脂質等の複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能が研究され
ているが、このためには、特異性の高い糖加水分解酵素
が重要な役割を果たす。従来、糖鎖の非還元末端から単
糖を遊離する酵素は種々の起源から単離され、糖鎖の構
造と機能の研究に利用されているが、糖鎖の非還元末端
から二糖を遊離する酵素は、デンプンからマルトースを
遊離するβ−アミラーゼやセルロースからセロビオース
を遊離するセロビアーゼ等が知られているものの、ヘテ
ロオリゴ糖に優先的に作用する酵素は知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】糖鎖の非還元末端に
は、しばしば、タイプ１の Galβ１−３GlcNAcβ−構造
とタイプ２の Galβ１−４GlcNAcβ−構造の２種類が見
出される。従来この糖鎖構造の解析には、メチル化分析
や核磁気共鳴スペクトル法などの分析法が用いられてき
たが、試料を大量に用いなければならないという欠点を
有していた。また微量の糖鎖試料で構造の推定を行う方
法として、タイプ１及び２の糖鎖を切断するストレプト
コッカス（ Streptococcus )６６４６Ｋ、又はナタマメ
のβ−ガラクトシダーゼと、タイプ２糖鎖のみを切断す
るディプロコッカス ニューモニエ（Diplococcus pneu
moniae )のβ−ガラクトシダーゼを併用する方法が知ら
れているが、ストレプトコッカス６６４６Ｋ及びナタマ
メのβ−ガラクトシダーゼはいずれもタイプ２糖鎖の方
を速やかに加水分解するので、タイプ１の糖鎖を完全に
加水分解するには大量の酵素を用いて長時間反応させな
ければならないなど反応条件の設定がむずかしい等、実
際にはタイプ１とタイプ２の糖鎖構造の識別は困難であ
る。したがって本発明の目的は、ヘテロオリゴ糖に作用
し、非還元末端から二糖を遊離するタイプ１及びタイプ
２糖鎖構造解析に有用なエキソ型糖質加水分解酵素を提
供することにある。
は、しばしば、タイプ１の Galβ１−３GlcNAcβ−構造
とタイプ２の Galβ１−４GlcNAcβ−構造の２種類が見
出される。従来この糖鎖構造の解析には、メチル化分析
や核磁気共鳴スペクトル法などの分析法が用いられてき
たが、試料を大量に用いなければならないという欠点を
有していた。また微量の糖鎖試料で構造の推定を行う方
法として、タイプ１及び２の糖鎖を切断するストレプト
コッカス（ Streptococcus )６６４６Ｋ、又はナタマメ
のβ−ガラクトシダーゼと、タイプ２糖鎖のみを切断す
るディプロコッカス ニューモニエ（Diplococcus pneu
moniae )のβ−ガラクトシダーゼを併用する方法が知ら
れているが、ストレプトコッカス６６４６Ｋ及びナタマ
メのβ−ガラクトシダーゼはいずれもタイプ２糖鎖の方
を速やかに加水分解するので、タイプ１の糖鎖を完全に
加水分解するには大量の酵素を用いて長時間反応させな
ければならないなど反応条件の設定がむずかしい等、実
際にはタイプ１とタイプ２の糖鎖構造の識別は困難であ
る。したがって本発明の目的は、ヘテロオリゴ糖に作用
し、非還元末端から二糖を遊離するタイプ１及びタイプ
２糖鎖構造解析に有用なエキソ型糖質加水分解酵素を提
供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とするエ
キソ型糖質加水分解酵素に関する。 （１）作用 ラクト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡ
ｃβ１−Ｒ）に作用して、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を遊離する。 （２）基質特異性 ラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用して、Ｇａｌβ１−３
ＧｌｃＮＡｃを遊離するが、Ｎ−アセチルラクトサミニ
ド結合（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）には作
用しない。また、ｐ−ニトロフェニル−β−ラクト−Ｎ
−ビオシドに作用してＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを遊
離する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜６．０ （４）至適温度：４０〜５５℃ （５）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜７．０（４℃、１６時
間処理において） （６） 分子量：約２９０００（ゲルろ過法による）
発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とするエ
キソ型糖質加水分解酵素に関する。 （１）作用 ラクト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡ
ｃβ１−Ｒ）に作用して、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を遊離する。 （２）基質特異性 ラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用して、Ｇａｌβ１−３
ＧｌｃＮＡｃを遊離するが、Ｎ−アセチルラクトサミニ
ド結合（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）には作
用しない。また、ｐ−ニトロフェニル−β−ラクト−Ｎ
−ビオシドに作用してＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを遊
離する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜６．０ （４）至適温度：４０〜５５℃ （５）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜７．０（４℃、１６時
間処理において） （６） 分子量：約２９０００（ゲルろ過法による）
【０００５】本発明者らは、上記現状にかんがみ、ラク
ト−Ｎ−ビオシド結合分解酵素を探索中の所、ある種の
放線菌がラクト−Ｎ−ビオシド結合に特異的なエキソ型
糖質加水分解酵素すなわちエキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼを産生することを見出し、本発明に到達した。
ト−Ｎ−ビオシド結合分解酵素を探索中の所、ある種の
放線菌がラクト−Ｎ−ビオシド結合に特異的なエキソ型
糖質加水分解酵素すなわちエキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼを産生することを見出し、本発明に到達した。
【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明に使用される菌株は、エキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株でも
よく、またこれらの菌株の変異株でもよい。エキソラク
ト−Ｎ−ビオヒドロラーゼ生産能を有する菌株の具体例
としては、例えば、ストレプトマイセス ＳＰ１４２が
挙げられる。本菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ
１４２と表示し、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託さ
れており、その菌学的性質は特開平３−９８５８３号公
報に記載されている。本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオ
ヒドロラーゼは、例えば上述した菌を栄養培地中で培養
し、該培養物から酵素を分離することによって得られ
る。培養に当っては、通常の微生物の培養方法が用いら
れる。培地に加える栄養源は、本菌株が利用し、エキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼを生産するものであれば
よく、炭素源としては、例えばグリセロール、グルコー
ス、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フコース
などが利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫
安、塩化アンモニウムなどが適当である。その他にリン
酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機
質及び金属塩類を加えてもよい。エキソラクト−Ｎ−ビ
オヒドロラーゼ生産菌を培養するに当り、生産量は培養
条件により大きく変動するが、一般に培養温度は２０〜
３５℃、培地のｐＨはｐＨ５〜８が良く、１日〜７日の
通気かくはん培養で、本発明によるエキソラクト−Ｎ−
ビオヒドロラーゼが生産される。培養条件は使用する菌
株、培地組成などに応じ、エキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼの生産量が最大になるように設定するのは当然
のことである。上述の放線菌によって生産されたエキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼは主に菌体内に存在する
ので、培養物を固液分離し、得られた湿菌体から通常用
いられる超音波処理、フレンチプレス、ダイノミルなど
の種々の細胞破砕手段を用いて菌体を破壊すると、ある
いはリゾチームのごとき細胞壁溶解酵素を用いて菌体細
胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られる。次いで、こ
の抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標
品を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、
イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、
ゲルろ過、凍結乾燥などにより、精製を行い、ポリアク
リルアミドゲルディスク電気泳動的に単一な精製酵素標
品を得ることができる。
発明に使用される菌株は、エキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株でも
よく、またこれらの菌株の変異株でもよい。エキソラク
ト−Ｎ−ビオヒドロラーゼ生産能を有する菌株の具体例
としては、例えば、ストレプトマイセス ＳＰ１４２が
挙げられる。本菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ
１４２と表示し、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託さ
れており、その菌学的性質は特開平３−９８５８３号公
報に記載されている。本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオ
ヒドロラーゼは、例えば上述した菌を栄養培地中で培養
し、該培養物から酵素を分離することによって得られ
る。培養に当っては、通常の微生物の培養方法が用いら
れる。培地に加える栄養源は、本菌株が利用し、エキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼを生産するものであれば
よく、炭素源としては、例えばグリセロール、グルコー
ス、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フコース
などが利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫
安、塩化アンモニウムなどが適当である。その他にリン
酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機
質及び金属塩類を加えてもよい。エキソラクト−Ｎ−ビ
オヒドロラーゼ生産菌を培養するに当り、生産量は培養
条件により大きく変動するが、一般に培養温度は２０〜
３５℃、培地のｐＨはｐＨ５〜８が良く、１日〜７日の
通気かくはん培養で、本発明によるエキソラクト−Ｎ−
ビオヒドロラーゼが生産される。培養条件は使用する菌
株、培地組成などに応じ、エキソラクト−Ｎ−ビオヒド
ロラーゼの生産量が最大になるように設定するのは当然
のことである。上述の放線菌によって生産されたエキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼは主に菌体内に存在する
ので、培養物を固液分離し、得られた湿菌体から通常用
いられる超音波処理、フレンチプレス、ダイノミルなど
の種々の細胞破砕手段を用いて菌体を破壊すると、ある
いはリゾチームのごとき細胞壁溶解酵素を用いて菌体細
胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られる。次いで、こ
の抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標
品を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、
イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、
ゲルろ過、凍結乾燥などにより、精製を行い、ポリアク
リルアミドゲルディスク電気泳動的に単一な精製酵素標
品を得ることができる。
【０００７】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラ
ーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおりであ
る。 （１）作 用：ラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用して、
ラクト−Ｎ−ビオースを遊離する。 （２）基質特異性：本酵素は、人乳由来のラクト−Ｎ−
テトラオース（ Galβ１−３GlcNAcβ１−3Galβ１−４
Glc ）に作用してその非還元末端からラクト−Ｎ−ビオ
ースを遊離させるが、人乳由来のラクト−Ｎ−ネオテト
ラオース（ Galβ１−４GlcNAcβ１−3Galβ１−４Glc
）には作用しない。また牛胎児血清タンパク質である
フェチュイン由来のラクト−Ｎ−ビオシド結合を有する
下記式（化１）：
ーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおりであ
る。 （１）作 用：ラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用して、
ラクト−Ｎ−ビオースを遊離する。 （２）基質特異性：本酵素は、人乳由来のラクト−Ｎ−
テトラオース（ Galβ１−３GlcNAcβ１−3Galβ１−４
Glc ）に作用してその非還元末端からラクト−Ｎ−ビオ
ースを遊離させるが、人乳由来のラクト−Ｎ−ネオテト
ラオース（ Galβ１−４GlcNAcβ１−3Galβ１−４Glc
）には作用しない。また牛胎児血清タンパク質である
フェチュイン由来のラクト−Ｎ−ビオシド結合を有する
下記式（化１）：
【０００８】
【化１】
【０００９】〔以下、式中Ｇは Gal、ＧＮは GlcNAc 、
Ｍは Manを示す〕で表される複合型糖鎖に作用して、ラ
クト−Ｎ−ビオースを遊離するが、ラクト−Ｎ−ビオシ
ド結合を有しない複合型糖鎖には作用しない。すなわ
ち、本酵素はラクト−Ｎ−ビオシド結合に特異的で、糖
鎖の非還元末端からラクト−Ｎ−ビオースを遊離する。 （３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：本酵素の至適ｐＨは図
１の曲線で表されるごとくｐＨ５．５〜６．０付近に高
い活性を有している。本酵素を４℃において、それぞれ
のｐＨで１６時間処理したときのｐＨ安定性を図２に表
した。図２より明らかなように本酵素はｐＨ４．０〜
７．０の間で安定である。なお、図１は本発明のエキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼのｐＨ（横軸）と相対活
性（％、縦軸）との関係を表すグラフ、図２はエキソラ
クト−Ｎ−ビオヒドロラーゼを４℃において、それぞれ
のｐＨで１６時間処理した後のｐＨ（横軸）と残存活性
（％、縦軸）との関係を表すグラフである。 （４）至適温度：本酵素の作用最適温度は図３の曲線で
表されるごとく４０〜５５℃である。なお、図３は本発
明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼの温度（℃、
縦軸）と相対活性（％、縦軸）との関係を表すグラフで
ある。 （５）分子量：分子量は約２９０００である（トヨパー
ルＨＷ−５５Ｓを用いたゲルろ過法による） （６）酵素活性の測定：エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロ
ラーゼ活性の測定は次のようにして求めた。基質として
下記式（化２）
Ｍは Manを示す〕で表される複合型糖鎖に作用して、ラ
クト−Ｎ−ビオースを遊離するが、ラクト−Ｎ−ビオシ
ド結合を有しない複合型糖鎖には作用しない。すなわ
ち、本酵素はラクト−Ｎ−ビオシド結合に特異的で、糖
鎖の非還元末端からラクト−Ｎ−ビオースを遊離する。 （３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：本酵素の至適ｐＨは図
１の曲線で表されるごとくｐＨ５．５〜６．０付近に高
い活性を有している。本酵素を４℃において、それぞれ
のｐＨで１６時間処理したときのｐＨ安定性を図２に表
した。図２より明らかなように本酵素はｐＨ４．０〜
７．０の間で安定である。なお、図１は本発明のエキソ
ラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼのｐＨ（横軸）と相対活
性（％、縦軸）との関係を表すグラフ、図２はエキソラ
クト−Ｎ−ビオヒドロラーゼを４℃において、それぞれ
のｐＨで１６時間処理した後のｐＨ（横軸）と残存活性
（％、縦軸）との関係を表すグラフである。 （４）至適温度：本酵素の作用最適温度は図３の曲線で
表されるごとく４０〜５５℃である。なお、図３は本発
明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼの温度（℃、
縦軸）と相対活性（％、縦軸）との関係を表すグラフで
ある。 （５）分子量：分子量は約２９０００である（トヨパー
ルＨＷ−５５Ｓを用いたゲルろ過法による） （６）酵素活性の測定：エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロ
ラーゼ活性の測定は次のようにして求めた。基質として
下記式（化２）
【００１０】
【化２】 Galβ１−３GlcNAcβ１−３ Galβ１−４Glc −ＰＡ
【００１１】〔以下、式中ＰＡは２−ピリジルアミノ基
を意味する〕で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖
（宝酒造社製）を用いた。本基質及びこれからラクト−
Ｎ−ビオースが遊離した酵素反応生成物は還元末端をピ
リジルアミノ基で標識してあるために、蛍光検出器を備
えた逆相系あるいはアミン系高速液体クロマトグラフィ
ーで直接定性定量分析が可能である。上記の基質２０pm
olを含む２５０mMリン酸カリウム緩衝液４μｌに酵素液
６μｌを加えて混合し、３７℃で２０分間反応させた
後、１％のトリフルオロ酢酸溶液４０μｌを加えて反応
を停止させた後、高速液体クロマトグラフィーに供し
た。この条件下で、１分間に１μmol のピリジルアミノ
化ラクトースを生じる酵素量を１単位とする。
を意味する〕で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖
（宝酒造社製）を用いた。本基質及びこれからラクト−
Ｎ−ビオースが遊離した酵素反応生成物は還元末端をピ
リジルアミノ基で標識してあるために、蛍光検出器を備
えた逆相系あるいはアミン系高速液体クロマトグラフィ
ーで直接定性定量分析が可能である。上記の基質２０pm
olを含む２５０mMリン酸カリウム緩衝液４μｌに酵素液
６μｌを加えて混合し、３７℃で２０分間反応させた
後、１％のトリフルオロ酢酸溶液４０μｌを加えて反応
を停止させた後、高速液体クロマトグラフィーに供し
た。この条件下で、１分間に１μmol のピリジルアミノ
化ラクトースを生じる酵素量を１単位とする。
【００１２】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラ
ーゼを利用して以下の事項を解明することができる。 （１）複合糖質中のラクト−Ｎ−ビオシル残基の役割を
知ることができる。 （２）本酵素を用いれば、複合糖質中のラクト−Ｎ−ビ
オシル基の有無を直接推定することができ、タイプ１糖
鎖とタイプ２糖鎖の識別が直接できる。 （３）糖鎖還元末端をあらかじめ還元ピリジルアミノ化
法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Bioc
hem.）、第９５巻、第１９７〜２０３頁（１９８４）〕
にて蛍光標識した糖鎖を用いて、上記の酵素消化法と２
次元糖鎖マップ法〔アナリティカル・バイオケミストリ
ー（ Anal. Biochem. ）第１７１巻、第７３頁（１９８
８）〕を組合せることによって、ラクト−Ｎ−ビオシル
基も含めた糖鎖構造全体を、従来の数百倍の感度で推定
することができる。 （４）還元末端を〔 3Ｈ〕標識した糖鎖、あるいは、未
標識糖鎖を用いて、本酵素で酵素消化を行い、酵素消化
物をゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマト
グラフィーなどで分析することによって、糖鎖構造を推
定することができる。
ーゼを利用して以下の事項を解明することができる。 （１）複合糖質中のラクト−Ｎ−ビオシル残基の役割を
知ることができる。 （２）本酵素を用いれば、複合糖質中のラクト−Ｎ−ビ
オシル基の有無を直接推定することができ、タイプ１糖
鎖とタイプ２糖鎖の識別が直接できる。 （３）糖鎖還元末端をあらかじめ還元ピリジルアミノ化
法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Bioc
hem.）、第９５巻、第１９７〜２０３頁（１９８４）〕
にて蛍光標識した糖鎖を用いて、上記の酵素消化法と２
次元糖鎖マップ法〔アナリティカル・バイオケミストリ
ー（ Anal. Biochem. ）第１７１巻、第７３頁（１９８
８）〕を組合せることによって、ラクト−Ｎ−ビオシル
基も含めた糖鎖構造全体を、従来の数百倍の感度で推定
することができる。 （４）還元末端を〔 3Ｈ〕標識した糖鎖、あるいは、未
標識糖鎖を用いて、本酵素で酵素消化を行い、酵素消化
物をゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマト
グラフィーなどで分析することによって、糖鎖構造を推
定することができる。
【００１３】
【実施例】次に、実施を挙げて本発明を説明するが、本
発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００１４】実施例１ （１）菌の培養と無細胞抽出液の調製 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ １４２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５６９）をペプトン０．３％、イーストエキス
０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０５％及びＬ−フコース１％を含む５
００ｍｌの液体培地（ｐＨ７．０）を用いて２５〜２７
℃で２日間培養した後、培養液を遠心分離して菌株を得
た。菌体を１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄後、同緩
衝液に懸濁して超音波処理し、遠心分離によって菌体残
渣を除いて、無細胞抽出液を得た。 （２）酵素の調製 上記に得た無細胞抽出液１００ｍｌを、１０ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナントロリン、
及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを含む
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０に対して透析
後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース Ｃ
Ｌ−６Ｂのカラム（４．０×２３ｃｍ）に供した。カラ
ムをその３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、溶出してき
た素通り画分を集めた。活性画分は限外ろ過（分画分子
量１万）にて濃縮後終濃度１．５Ｍになるように硫酸ア
ンモニウムを加え、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナント
ロリン、及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリ
ドを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて平衡化したフェニル−セファロース ＣＬ−４Ｂの
カラム（１．０×６．０ｃｍ）に供した。カラムをその
３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、次いで１０ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナントロリ
ン、及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを
含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０で溶出
し、活性画分を集めた。活性画分は限外ろ過（分画分子
量１万）にて濃縮後１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０
１％アジ化ナトリウム、及び０．１％ブリジ（Ｂｒｉ
ｊ）−５８を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
６．０で平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓのカラム
（１．５×９０ｃｍ）に供した。同緩衝液で溶出し、２
３−２８の画分から本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒ
ドロラーゼを得た。この様にして得られたエキソラクト
−Ｎ−ビオヒドロラーゼの比活性は３．５ｍ単位／ｍｇ
であり、糖鎖構造解析用試薬として十分使用可能であっ
た。なお、上記酵素の比活性は前記の測定法によって測
定した。
ＢＰ−４５６９）をペプトン０．３％、イーストエキス
０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０５％及びＬ−フコース１％を含む５
００ｍｌの液体培地（ｐＨ７．０）を用いて２５〜２７
℃で２日間培養した後、培養液を遠心分離して菌株を得
た。菌体を１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄後、同緩
衝液に懸濁して超音波処理し、遠心分離によって菌体残
渣を除いて、無細胞抽出液を得た。 （２）酵素の調製 上記に得た無細胞抽出液１００ｍｌを、１０ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナントロリン、
及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを含む
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０に対して透析
後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース Ｃ
Ｌ−６Ｂのカラム（４．０×２３ｃｍ）に供した。カラ
ムをその３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、溶出してき
た素通り画分を集めた。活性画分は限外ろ過（分画分子
量１万）にて濃縮後終濃度１．５Ｍになるように硫酸ア
ンモニウムを加え、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナント
ロリン、及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリ
ドを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を用
いて平衡化したフェニル−セファロース ＣＬ−４Ｂの
カラム（１．０×６．０ｃｍ）に供した。カラムをその
３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、次いで１０ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸、１ｍＭオルト−フェナントロリ
ン、及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを
含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０で溶出
し、活性画分を集めた。活性画分は限外ろ過（分画分子
量１万）にて濃縮後１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０
１％アジ化ナトリウム、及び０．１％ブリジ（Ｂｒｉ
ｊ）−５８を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
６．０で平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓのカラム
（１．５×９０ｃｍ）に供した。同緩衝液で溶出し、２
３−２８の画分から本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒ
ドロラーゼを得た。この様にして得られたエキソラクト
−Ｎ−ビオヒドロラーゼの比活性は３．５ｍ単位／ｍｇ
であり、糖鎖構造解析用試薬として十分使用可能であっ
た。なお、上記酵素の比活性は前記の測定法によって測
定した。
【００１５】 実施例２ ピリジルアミノ化糖鎖に対する作用 基質として下記式（化３）：
【００１６】
【化３】
【００１７】で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖
（宝酒造社製）を用いて実施例１で得た本酵素を作用さ
せた。３．３μＭの基質を含む８０mMリン酸緩衝液ｐＨ
６．０に本酵素５０μ単位を加えて３７℃、１６時間反
応を行った。反応終了後反応液をＨＰＬＣで分析し、下
記式（化４）：
（宝酒造社製）を用いて実施例１で得た本酵素を作用さ
せた。３．３μＭの基質を含む８０mMリン酸緩衝液ｐＨ
６．０に本酵素５０μ単位を加えて３７℃、１６時間反
応を行った。反応終了後反応液をＨＰＬＣで分析し、下
記式（化４）：
【００１８】
【化４】
【００１９】で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖が
生成していることを確認した。更に反応液を濃縮乾固
し、糖質ピリジルアミノ化装置・パルステーション( PA
LSTATION：宝酒造社製）にて還元ピリジルアミノ化した
後、ＨＰＬＣ分析を行い、下記式（化５）：
生成していることを確認した。更に反応液を濃縮乾固
し、糖質ピリジルアミノ化装置・パルステーション( PA
LSTATION：宝酒造社製）にて還元ピリジルアミノ化した
後、ＨＰＬＣ分析を行い、下記式（化５）：
【００２０】
【化５】Ｇ（β１→３）ＧＮ−ＰＡ
【００２１】で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖の
生成を確認した。
生成を確認した。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、複合糖質の構造の機能の
解明に有用な新規エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼ
が提供された。
解明に有用な新規エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼ
が提供された。
【図１】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼ
のｐＨと相対活性との関係を表すグラフである。
のｐＨと相対活性との関係を表すグラフである。
【図２】エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼを４℃に
おいて、それぞれのｐＨで１６時間処理した後のｐＨと
残存活性との関係を表すグラフである。
おいて、それぞれのｐＨで１６時間処理した後のｐＨと
残存活性との関係を表すグラフである。
【図３】エキソラクト−Ｎ−ビオヒドロラーゼの温度と
相対活性との関係を表すグラフである。
相対活性との関係を表すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするエキソ型糖質加水分解酵素： （１）作用 ラクト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡ
ｃβ１−Ｒ）に作用して、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を遊離する。 （２）基質特異性 ラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用して、Ｇａｌβ１−３
ＧｌｃＮＡｃを遊離するが、Ｎ−アセチルラクトサミニ
ド結合（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）には作
用しない。また、ｐ−ニトロフェニル−β−ラクト−Ｎ
−ビオシドに作用してＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを遊
離する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜６．０ （４）至適温度：４０〜５５℃ （５）ｐＨ安定性：ｐＨ４．０〜７．０（４℃、１６時
間処理において） （６） 分子量：約２９０００（ゲルろ過法による）
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138563A JP2782563B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-05-15 | 新規糖質加水分解酵素 |
| US07/879,263 US5395757A (en) | 1991-05-15 | 1992-05-07 | Method for the hydrolysis of sugar compounds and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138563A JP2782563B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-05-15 | 新規糖質加水分解酵素 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21942595A Division JP2854541B2 (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 糖化合物の水解方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05252946A JPH05252946A (ja) | 1993-10-05 |
| JP2782563B2 true JP2782563B2 (ja) | 1998-08-06 |
Family
ID=15225071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3138563A Expired - Fee Related JP2782563B2 (ja) | 1991-05-15 | 1991-05-15 | 新規糖質加水分解酵素 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5395757A (ja) |
| JP (1) | JP2782563B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69638104D1 (de) * | 1995-04-27 | 2010-02-11 | Takara Bio Inc | Für Lacto-N-biosidase kodierendes Gen |
| US20040147843A1 (en) * | 1999-11-05 | 2004-07-29 | Shabbir Bambot | System and method for determining tissue characteristics |
| WO2002088364A1 (fr) * | 2001-04-23 | 2002-11-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Beta 1,3-galactose transferase et adn codant pour cette enzyme |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE451849B (sv) * | 1985-12-11 | 1987-11-02 | Svenska Sockerfabriks Ab | Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter |
| JPH0789915B2 (ja) * | 1987-05-07 | 1995-10-04 | 生化学工業株式会社 | 微生物によるエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ−ゼの製造法 |
| US5100778A (en) * | 1989-10-03 | 1992-03-31 | Monsanto Company | Oligosaccharide sequencing |
| US5041236A (en) * | 1989-10-27 | 1991-08-20 | The Procter & Gamble Company | Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases |
-
1991
- 1991-05-15 JP JP3138563A patent/JP2782563B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-05-07 US US07/879,263 patent/US5395757A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5395757A (en) | 1995-03-07 |
| JPH05252946A (ja) | 1993-10-05 |
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