DE3855134T2 - Monoklonale menschliche antikörper gegen hiv-i - Google Patents

Monoklonale menschliche antikörper gegen hiv-i

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung liegt auf dem Gebiete der Immunologie, insbesondere der AIDS-Therapie, and des Darstellens von HIV- infizierten Zellen in vivo. Insbesondere betrifft sie einen menschlichen monoklonalen Anti-HIV-1-Antikörper und aus diesem Antikörper hergestellte Immunochemikalien sowie therapeutische Verfahren unter Anwendung dieser Immunochemikalien. Die Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper (hu mAbs) kann eine neue Quelle für in der Immuntherapie für Infektionen und andere Erkrankungen zu verwendende Antikörper darstellen. Die Anwendung von mAb menschlichen Ursprungs an Stelle von Nagetierursprung vermeidet die Auslösung einer Antikörperreaktion bei Menschen. Der Fc-Teil von Nagetier-Antikörpern muß vor dem Injizieren bei Menschen entfernt werden, um die Antikörperreaktion gegen verabreichte heterogene Proteine auf ein Minimum herabzusetzen. Menschliche monoklonale Antikörper weisen jedoch einen Teil der homologen Proteine menschlicher Individuen auf. In den Sera von mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) infizierten Menschen konnten über eine gewisse Periode nach der Infektion Antivirus-Antikörper ohne klinische Manifestationen des erworbenen Immunodefizienzsyndroms (AIDS) entdeckt werden. In diesem Zustand einer aktiven Immunreaktion wurden große Anzahlen antigenspezifischer B-Zellen im Kreislauf erwartet. Diese B-Zellen wurden als Fusionspartner zur Erzeugung menschlicher monoklonaler Anti-HIV-Antikörper verwendet. Hierin wird beschrieben:
  • - die Erzeugung menschlicher mAb gegen HIV-Antigene
  • - die bedeutende Behinderung des Wachstums von HIV-infizierten Zellen
  • - die Herstellung von Immunotoxinen, welche mit den beschriebenen menschlichen Anti-HIV-1-mAb und einem A- Ketten-Toxin konjugiert sind
  • - die selektive Abtötung von HIV-1-infizierten Zellen mit dem Immunotoxin
  • - die selektive Abtötung von HIV-1-infizierten Zellen durch von Antikörpern abhangige zelluläre Cytotoxizität
  • - die selektive Prävention von Infektionen von Zellen mittels des menschlichen monoklonalen Anti-HIV-1-Antikörpers
  • - die selektive Bestimmung von HIV-1-Antigen in menschlichem Serum
    • STAND DER TECHNIK
  • Die EP-A-0 251 612 offenbart einer Antikörper, der selektiv an ein Epitop eines Proteins von HIV-1 bindet. Dieser Antikörper zeigt gegenüber dem erfindungsgemäßen Antikörper eine unterschiedliche Bindungsspezifität.
    • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung besteht im Antikörper 3D6, der selektiv an ein von Hybridoma mit den ECACC-Akzessionsnummern 87110301 erzeugtes Hüllprotein von HIV-1 bindet.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Materialien und Verfahren der menschlichen monoklonalen Anti-HIV-Antikörper (HU Anti-HIV-1-mAb)
  • Bei der zur Zeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt der benützte hu Anti-HIV-1-mAb aus der Unterklasse 1gG&sub1;, der gemäß den bekannten Hybridisationsverfahren hergestellt wird, wie sie von R. Kenneth et al. in "Monoclonal antibodies and functional cell lines; progress and applications", Plenum Press, (New York), 1984, beschrieben wurden. Proben von Hybridoma 3D6 wurden bei ECACC, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, U.K., hinterlegt. Die ECACC-Akzessionsnummer und das Hinterlegungsdatum für das hinterlegte Hybridoma ist: 87110301, 3. November 1987.
    • Fusion
  • Die Fusion erfolgt in der beschriebenen Weise (Köhler et al., Europ. Journal of Immunology, 6 (1976):292). Vor der Zellfusion mit PEG 1500 wurden periphere Blutlymphozyten von HIV-I-positiven Spendern 3 mal mit serumfreiem Zellkulturmedium gewaschen. Die Zellen wurden unmittelbar, oder während dreier Tage vor der Fusion stimuliert mit 5 ng Mitogen von Kermesbeeren (PWM), fusioniert. Die Zellen wurden mit HAT-empfindlichen Fusionszellen im Verhältnis von 5:1 gemischt. Die Zellen wurden mit 42% PEG 1500 (Ferak, BRD) in Gegenwart von 7,5% DMSO (Serva, BRD) fusioniert. Die Zellen wurden geklont und durch Begrenzen der Verdünnung subgeklont.
    • Überprüfung der Hybridoma
  • IGG- und IGM-Isotypen wurden in bekannter Weise mittels eines mit einem Sandwichenzym verbundenen immunosorbierenden Tests (ELISA) mit peroxydasekonjugierten Antihuman-IgG-IgM- (spezifisch für schwere Ketten)-Antikörpern aus dem oben schwimmenden Material der Kultur analysiert. Die Überprüfung auf spezifische Antikörper wurden durch einen Sandwich-ELISA unter Verwendung von HIV in einer Konzentration von 10 Mikrogramm/ml durchgeführt. Das aus der Gewebekultur isolierte Virus wurde in eine Mikrotitrierplatte mit flachem Boden geschichtet, und das ungebundene Material wurde ausgewaschen. Das oben schwimmende Material der Kultur wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Materials wurde der spezifische Antikörper durch mit Peroxydase markierte Antihuman-Ig-schwerkettenspezifische Antikörper festgestellt.
    • Immunoblotten
  • Immunoblotten unter Verwendung von von natürlichen Vironen hergestellten HIV-Hüllproteinen: Das gereinigte Virus wurde denaturiert und mit 2,5% SDS und 5,0% 2-Mercaptoäthanol 5 Minuten lang bei 90ºC reduziert und auf einer Platte von Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach dem Abtrennen wurden die Proteinbänder in ein Nitrozelluloseblatt (Schleicher & Schüll, BRD) elektro-transferiert. Nach dem Blockieren des Blattes mit 5% Trockenmilch, wurden die Streifen geschnitten und in 5 ml des oben schwimmenden Materials der Kultur eingetaucht, das 1:2 verdünnt worden war. Gebundene Antikörper wurden durch Reaktion mit Antihuman-IGG-Antikörpern, die mit HRP markiert worden waren, und durch Beflecken mit Diaminobenzidin enthaltendem 0,1%iger NiCl&sub2; festgestellt.
    • Immunoblotten unter Verwendung von von geklontem Material hergestellten HIV-Hüllproteinen
  • Gemäß Laemmli (Nature 227, 1970; 680-685) wurde eine SDS- Gelelektrophorese durchgeführt. Die elektrophoretisch abgetrennten Hüll- bzw. Kernproteine, die von genetisch bearbeiteten E. coli (L.H. Gosting et al., Journal of Clinical Microbiology, 52, 1987 (845-848)) abgeleitet waren, wurden nach dem Blockieren mit 3% Rinderserumalbumin (BSA, gelöst in PBS) auf Nitrozellulose elektrogeblottet, die Streifen wurden in in PBS- Puffer (welche 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 0,5% Gelatine enthielten) verdünnten Proben über Nacht eingetaucht, 3 mal gewaschen und mit mit Peroxydase markierten Ziegen-Antihuman-GAMMA- Ketten inkubiert.
    • Immunoblotten unter Verwendung von im Handel erhältlichen Blotstreifen:
  • Blotstreifen von Dupont, Charge 7044128 wurden entsprechend den Empfehlungen der Firma verwendet.
    • Im Handel erhältliche EIA
  • Im Handel erhältliche EIA wurden dazu benutzt, die Spezifität monoklonaler Antikörper zu überprüfen. Es wurden sowohl Catch-ELISA als auch ebenfalls in Frage kommende EIA angewendet. Es wurden Tests von Labsystems (Finnland), Organon (Belgien), Pasteur (Frankreich), Biochrom (BRD), Abott (USA) und eine damit konkurrenzierende EIA von Organon benutzt.
    • Aufnahme der Peptide
  • Verschiedene Peptide wurden für die Auswertung der Antigen-Bindestellen benützt. Die Peptide A und B wurden entsprechend der Literatur synthetisiert. C und D waren von Biochrom (BRD) übergeben worden. Es wurden 4 verschiedene Peptide getestet.
  • Pedtid A: Weng et al. PNAS 118, 6159-6163 (1986)
    • RILAVERYLKDQLLGIWGCS
  • Pedtid B: Gnann et al., J. Virol. 61, 2639-2641, (1987)
    • LGIWGCSGKLIC
  • Pedtid C: eigene Resultate
    • KDQQLLGIWGCSGKLIC
  • Pedtid D: von Biochrom erhalten
    • KDQQLLGIWGCSGKLICVPWNAS
  • Die Peptide C und D reagierten mit dem durch Hybridoma Nr. 3D6 produzierten monoklonalen Antikörper.
    • Feststellung der Hybridisierung menschlicher DNA
  • 10&sup6; Zellen jeder Zellinie wurden auf eine Nitrozellulosemembrane getupft. Die Hybridisierungssonde war das mit 32p markierte Plasmid Blur8, das eine geklonte Alu-Sequenz enthält, welche für die menschliche DNA spezifisch und etwa 300 000 mal im Genom wiederholt ist (Schmid et al., Science 216, 1982; 1065). Nach Prähybridisierung und Hybridisierung über Nacht wurde die Membrane 3 x in 100 ml 2 x SSC, 0,1% SDS 5' lang bei Raumtemperatur und 2 x in 200 ml 1 x SSC, 0,1% SDS 30' lang bei 60ºC gewaschen und 80 Stunden lang autoradiographiert.
    • Immunofluoreszenz
  • ixierte, mit HIV-1 infizierte Zellen (H9-Zellen) wurden mit dem hu Anti-HIV-mAb inkubiert. Die Bindung des mAb wurde durch eine zweite Inkubation nach dem Auswaschen ungebundener mAb mit mit FITC markiertem Antihiman-IgG demonstriert.
    • Reinigung des 3D6-Antikörpers
  • Sephadex, Sepharose und Sephacyl sind Warenzeichen. Die Reinigung wurde ausbekannte Weise durchgeführt. Das obenauf schwimmende Material der geklärten Kultur wurde unter Anwendung von Gelfiltration auf einer Sephadex-G-25-Kolonne (Pharmacia) entsalzt und des weiteren auf einer CM-Sepharose-Kolonne mit rascher Strömung (Pharmacia) chromatographiert. Das Eluat der CM-Sepharose-Kolonne mit rascher Strömung wurde durch Ultrafiltration konzentriert und unter Verwendung von Phenyl-Superose (Pharmacia) neuerlich chromatographiert. Die chromatographischen Schritte wurden gemäß den Empfehlungen der Firma Pharmacia durchgeführt. Vor dem Einspeisen der Lösung in die Phenyl-Superose-Kolonne wurde die rohe mAb-Lösung mit einer 2 M-Ammoniumsulfatlösung verdünnt.
    • Herstellung von Rizin-A-Ketten-Toxin
  • Rizin wird aus Rizinusbohnen (Rizinus communis) durch bekannte Verfahren extrahiert. Rizin wird entweder aus gemahlenen ganzen Rizinusbohnen (Rizinus communis) oder aus Rizinusbohnenkuchen extrahiert und ist ein Nebenprodukt der Verarbeitung von Rizinusbohnen. Der Rizinusbohnenkuchen wird entfettet, indem 3 mal mit 5 Volumina von 40%-60%igem (Vol/Gew.) Petroläther extrahiert wird. Das luftgetrocknete Material wird dann über Nacht in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS; 0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat, pH 7,2) extrahiert. Der Extrakt wird durch Filtrieren durch eine Nylongaze geklärt, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 1500 g während einer Stunde. Das klare, obenauf schwimmende Material wird bei 4ºC mit gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt. Bei einer letztuchen Konzentration von 60% Ammoniumsulfat wird das Präzipitat gesammelt und durch Zentrifugieren (1500 g, 1 Stunde) gewonnen, neuerlich in einer minimalen Menge von PBS aufgelöst und gegen PBS dialysiert, bis der Extrakt frei von Ammoniumsulfat ist.
    • Affinitätschromatographie
  • Der geklärte und dialysierte Toxinextrakt wird mittels Lectinaffinitäts-Chromatographie weiter gereinigt. Das Gel (Sepharose 48, Fa. Pharmacia) wird mit 1 M Propionsäure wenigstens 4 Wochen bei Raumtemperatur vorbehandelt, um seine Bindungskapazität für Lectine zu erhöhen.
  • Die Kolonnenchromatographie sollte bei niedrigeren Temperaturen als 10ºC betrieben werden, um die Lectinbindung zu optimieren.
  • Der geklärte und dialysierte Extrakt wird einer mit PBS- ausgeglichenen, mit Säure vorbehandelten Sepharose-48-Kolonne zugeführt. Nach einem Probedurchlauf wird die Säule mit PBS gewaschen, bis die UV-Absorption auf die Basislinie zurückkehrt Das Toxin wird zusammen mit anderen Lectinen mit 100 mM Galaktose in PBS eluiert. Dieses Gemisch wird mittels Gelchromatographie auf Sephacryl S200 HR weiter aufgetrennt. Das Probenvolumen sollte 3-4% des gesamten Bettvolumens nicht übersteigen. Das Toxin wird unter diesen Bedingungen von den anderen Lectinen vollständig herausgelöst. Das aus der Affinitätskolonne gewonnene Toxin wird vor der Einspeisung in die Sephacryl- S200-HR-Kolonne durch Ultrafiltration (Milipore PTGC-Membrane) auf 10 mg/ml konzentriert. Die Toxinspitze wurde gesammelt und filtersterilisiert. Die sterile Toxinlösung wurde in bei -30ºC tiefgefrorenern Zustande bis zur Aufspaltung in die A- und B- Kette gelagert.
    • Aufspaltung von Rizin in die A- und B-Kette
  • Das affinitätsgereinigte und konzentrierte Toxin wird durch eine 5%-ige beta-Mercaptoäthanollösung in die A- und B- Kette aufgespalten. Das Toxin wird bei einer Konzentration von 5 mg/ml in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8,5 inkubiert, der mit beta-Mercaptoäthanol (5% Endkonzentration) und Galaktose (0,5 M Endkonzentration) über Nacht bei Raumtemperatur ergänzt wurde, gefolgt von 2-3 Stunden bei 37ºC. Das Toxin wird vom Startpuffer (PBS) in den Inkubationspuffer (Tris-Puffer) durch Gelchromatographie auf Sephadex-G25-Kolonnen überführt, die mit dem Inkubationspuffer im Gleichgewicht gehalten sind.
  • Nach der Inkubation wird die Probe in DEAE-Sepharose mit rascher Strömung gespeist, die mit 0,1 M Tris/HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 8,5 im Gleichgewicht gehalten ist. Die Kolonne wird mit 0,1 M Tris/HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8,5 gewaschen, bis das gesamte ungebundene Material ausgespült ist. Das ungebundene Material, im wesentlichen reine A-Kette, wird gesammelt und eine Asialo-Fetuin-Sepharose-4B-Kolonne hinuntergesandt, um verunreigendes Toxin zu entfernen. Die Asialo- Fetuin-Sepharose-48 wurde gemäß der Empfehlung der Firma Pharmacia präpariert. Das ungebundene Material wird gesammelt, filtersterilisiert und bei 4ºC gelagert.
  • Die DEAE-Sepharose mit rascher Strömung wird mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 8,5 regeneriert, der 0,1 M Galaktose und 1 M NaCl enthält.
    • Bestimmung des isoelektrischen Punktes
  • Der isoelektrische Punkt des hu Anti-HIV-1-mAb wurde durch ein beschriebenes Verfahren bestimmt. Pharmalyte wurden als Trägerampholyten verwendet. Der gesamte Vorgang wurde gemäß den Empfehlungen der Firma Pharmacia (Büchlein: Isoelektrisches Fokussieren, Pharmacia-Feinchemikalien) durchgeführt.
    • Bestimmung der Unterklasse und der leichten Ketten
  • Die leichten Ketten und die Unterklasse wurden durch ELISA bestimmt. Es wurden spezifische, mit alkalischer Phosphatase markierte Antihuman-KAPPA-Ketten-Antikörper oder spezifische, mit Peroxydase markierte Antihuman-G1-, -G2-, -G3- und G4-Antikörper verwendet.
    • Qualitätskontrolle der Rizin-A-Kette
  • Die Qualitäts-Kontrolltests werden an der gereinigten Rizin-A-Kette angewandt. Gradienten-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierten Bedingungen zeigen das Fehlen jedweden kontaminierenden Materials. Nur ein Band bei 33 bzw. eines bei 30 Kilodalton kann festgestellt werden.
    • Konjugation von A-Ketten-Toxin mit monoklonalem Antikörper
  • 5 mg gereinigten monoklonalen Antikörpers (1-2 mg/ml in PBS) wurden mit einem 10-fachen molaren Überschuß an SPDP (Pharmacia) umgesetzt, der 30 min lang in 1 mg/ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur aufgelöst worden war. Der PDP-substituierte Antikörper wurde durch Gelfiltration unter Benutzung von Sephadex G-25 entsalzt. Die Proteinspitze, wie sie fortlaufend bei 280 nm ermittelt worden war, wurde gesammelt und auf Eis gelegt. Fünf mg Rizin-A-Kette wurden mit 5 mM DTT 1 Stunde lang bei Raumtemperatur reduziert und auf einer Kolonne von Sephadex G-25 entsalzt. Die Kolonne wurde mit PBS im Gleichgewicht gehalten. Die Proteinspitze wurde gesammelt und unmittelbar mit dem kalten, PDP-substituierten Antikörper gemischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 4ºC geschüttelt und dann bei 4ºC gegen 0,01 M Natriumphosphatpuffer diafiltriert, der 2,0 M Natriumchlorid enthielt. Die Masse der unkonjugierten A-Kette wurde vom Immuntoxin durch Gelfiltration auf Sephacryl S200 HR separiert. Die Kolonne wurde in 0,02 M Natriumphosphat ins Gleichgewicht gebracht, das 3 M Natriumchlorid enthielt.
  • Der erste Spitzenwert, der das Immunotoxin enthielt, wurde gesammelt und auf Antihuman-IGG-Sepharose 4B affinitätsgereinigt. Das Immuntoxin wurde aus der Affinitätskolonne mit 3,5 M Magnesiumchlorid eluiert und extensiv gegen Natriumchlorid und sodann gegen PBS dialysiert.
  • Die Immunotoxine (0,2-2 mg/ml) wurden durch Ultrafiltration unter Anwendung von PTGC-Membranen auf die zum Testen erforderliche Endkonzentration konzentriert. Das letztliche Präparat wurde sterilgefiltert und in aliquoten Anteilen bei -20ºC gelagert. Die Immunotoxine wurden durch SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Die Substitution des Immunotoxins wurde durch einen Radio-Immunotest bestimmt. Es wurde eine durchschnittliche Substitution von 1-2 Mol der A-Kette pro Mol Antikörper beobachtet.
    • Konkurrenzierende EIA
  • Gereinigtes hu Anti-HIV-mAb wurde mit Peroxydase durch ein bekanntes Verfahren nach M.B. Wilson and P.K. Nakane (1978) in "Immunofluorescence and related techniques", herausg. von W. Knapp et al. Elsevier, Niederlande, konjugiert.
  • Eine Verdünnungsreihe von hu Anti-HIV-mAb (in PBS, 1% BSA und 0,1% Triton X-100) wurde in Mikrotiterbehälter mit flachem Boden verteilt, die mit gereinigten HIV-Hüllproteinen beschichtet waren, welche über Nacht bei 4ºC inkubiert wurden. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Materials wurde das gebundene Konjugat durch Reaktion mit 1,4-Phenylendiamin bestimmt. Die sich entwickelnde Farbe wurde bei 492 nm gemessen. Eine Kalibrationskurve der optischen Dichte von optischer Dichte gegen Verdünnung wurde aufgezeichnet. Die Verdünnung der halben Sättigung wird von dieser Kalibrationskurve aus errechnet.
  • Hu Anti-HIV-mAb wurde bei einer dem halben Maximum der Sättigung entsprechenden Verdünnung mit Sera von an AIDS leidenden Patienten oder mit Sera von Probanden gemischt, welche, bestimmt durch eine herkömmliche Prüfung (ELISA), seropositiv waren, gefolgt von einem Bestätigungstest (Westernblot). Das Gemisch des Konjugates (bei halber maximaler Verdünnung) und des Serums der Probanden wurden in mit HIV-Hüllprotein beschichteten Mikrotiterbehältern inkubiert, gewaschen und befleckt.
  • Die optische Dichte dieser Proben wird mit dem Anti-HIV- mAb bei halber maximaler Sättigung verglichen. Ein Wert unter der halben maximalen Sättigung deutet ein Konkurrenzverhältnis zwischen den menschlichen Sera und den menschlichen monoklonalen Anti-HIV-Antikörper an.
    • Neutralisationsaktivität auf die Infektivität von HIV-1-Virionen
  • Der Test auf Neutralisationsaktivität des hu Anti-HIV-1- mAb wurde gemäß einem bekannten Verfahren (J. Virology, 61, 2024-2028, 1987), Nature 316, 72-74, 1985; Biotechnology 5, 940-946, 1987) durchgeführt. Eine der zwanzigfachen Menge zum Hervorrufen einer Infektion entsprechende HIV-1-Dosis in 50% inokulierten Kulturen am Tage 12 (20 mal TICD2O) wurde dazu benutzt, die H9-Zellinie zu infizieren. Die Zellen wurden 3, 6, 9 und 12 Tage nach der Virusinokulation gesammelt, und es wurde der Prozentsatz der Infektion durch Immunofluoreszenz bestimmt. Zwischen dem 6. und 9. Tage wurde eine 100%-ige Infektion beobachtet. Der neutralisierende Effekt wurde auch in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers bei verschiedenen Verdünnungen getestet.
  • Die neutralisierende Aktivität des 3D6-Antikörpers wurde durch Zugabe einer einzigen Dosis des Antikörpers (letztliche Konzentration 1 µg/ml) unmittelbar nach der Virusinokulation evaluiert.
  • Die Infektionsrate wurde als Prozentsatz der infizierten Zellen ausgedrückt.
    • Zytotoxizitätstests
  • Die bei den Zytotoxizitätstests benützte Testzellinie waren HIV-1-infizierte H9-Zellen. HIV-1-infizierte H9-Zellen worden so präpariert, wie es unter "Neutralisationsaktivität auf die Infektivität von HIV-1-Virionen" beschrieben ist. Uninfizierte H9-Zellen wurden als negative Kontrollprobe benutzt. Die nach einem Zeitraum von 6-9 Tagen nach der Virusinokulation gewonnenen Zellen wurden in 1 ml Medium suspendiert. Den infizierten Zellen sowie der negativen Kontrollprobe wurden verschiedene Verdünnungen des hu mAb-Toxinkonjugats hinzugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und ein methioninfreies Medium wurde hinzugesetzt, dem ³&sup5;S-Methionin beigefügt worden war. Die Zellen wurden 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, dann wurde das Medium durch Zentrifugieren entfernt, und die Zellen wurden auf ein Glasfaserfilter überführt und dreimal mit 10%-iger Trichloressigsäure gewaschen, die 1 mg/ml Methionin enthielt. Die Zellen wurden auf dem Filter luftgetrocknet und dann in ein Scintillationsfluid verbracht. In einem Scintillationszähler wurde die Radioaktivität gezählt. Die Zytotoxizität wurde als die Inhibitionsdosis des Konjugates an der Gewebekultur ausgedrückt, die sich in 50% der Kontrollsynthese unbehandelten Proteins (TClD&sub5;&sub0;) ergab.
    • EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
  • In den folgenden Ausführungsformen werden verschiedene Versuche dargestellt, die als Beispiele zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und ihrer Anwendung dienen mögen.
  • Der menschliche Ursprung, die biochemischen Eigenschaften, die immunchemische Charakterisierung sowie das in vitro- und in vivo-Verhalten werden durch repräsentative Ergebnisse gezeigt.
  • In den Zeichnungen zeigen:
  • Fig. 1a: Immunoblot des von Hybridoma Nr. 3D6 produzierten menschlichen mAb. HIV-Hüllproteine wurden durch SDS- und 2- Mercaptoäthanol-Behandlung aus nativen Vironen hergestellt.
  • Fig. 1b: Immunoblot des von Hybridoma 3D6 produzierten menschlichen Anti-HIV-rnab. HIV-Hüllproteine wurden von genetisch veränderter E. coli (gemäß einem bekannten Vorgehen, L.H. Gosting et al.: Journal of Clinical Microbiology 25, 1987 (845- 848)) hergestellt.
  • Fig. 1c: Immunoblot des von Hybridoma 3D6 produzierten menschlichen Anti-HIV-mAb. Es wurde ein im Handel erhältlicher Blotstreifen (Du Pont Lot: 70 44 128) benützt.
  • Fig. 2 Immunofluoreszenzbild fixierter, HIV-infizierter H9-Zellen, dargestellt mit einer sandwichartigen Anordnung von 3D6-Antikörper und Antihuman-IGG, konjugiert mit FITC. Die Klonung 3D6 ist gezeigt.
  • Fig. 3: Neutralisationsaktivität des 3D6-Antikörpers, ausgedrückt in Prozent der infizierten Zellen. Die infizierten Zellen wurden durch Immunfluoreszenz unter Verwendung des 3D6- Antikörpers gezeigt.
  • Fig. 4: Durch die ³&sup5;S-Methioninaufnahme gemessene Inhibition der Proteinsynthese wurde als Maß für die Zytotoxizität genommen, wobei auf Basis der Annahme eines Molekulargewichts von 180000 Dalton die molare Konzentration des Immunotoxins berechnet wurde. Die TClD&sub5;&sub0; des Immunotoxins (3D6)-Rizin-A- Kette) ist geringer als 10 nm.
  • Fig. 5: Vergleich zwischen 3D6-Antikörper und Sera von seropositiven und an AIDS oder oder Prä-AIDS leidenden Patienten. Die Ergebnisse nach Tabelle II sind in dieser Figur dargestellt.
  • Fig. 6: Im Handel erhältliche EIA.
    • Erzeugung von Klonen und menschlicher Ursprung der monoklonalen Antikörper
  • Verschiedene Klonungen wurden durch die Fusion peripherer Blutlymphozyten und der Fusionszellinie erhalten. Die Spezifität von 11 Hybridomas ist in Tabelle I dargestellt. Tab. I: Characterisierung von 11 Hybridomas Hybridoma Nr. Spezifität des mAb Test durch Immunoblotten Isotop und Unterklasse leichte Kette n.d. = nicht bestimmt worden
  • Hybridoma Nr. 3D6 ist in der ECACC, Porton Down, Salisbury, UK, unter der Hinterlegungs-Nr. 87110301 hinterlegt (3. November 1987). Das von dieser Hybridornalinie (3D6) erzeugte hu mAb Anti-HIV-1 wird als Beispiel zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung benützt. Immunoblots des 3D6-Antikörpers sind in den Fig. 1a, b und c gezeigt.
    • Biochemische Eigenschaften und immunchemische Charakterisierung des Antikörpers
  • Der Isotyp des von Hybridorna Nr. 3D6 produzierten monoklonalen Antikörpers ist G. Die durch ELISA bestimmte Unterklasse ist G1. Der durch isoelektrisches Fokussieren unter Verwendung des Pharmacia-Immobilinesystems bestimmte isoelektrische Punkt liegt im Bereiche von pH-8,6.
  • Eine Zusammenfassung der Resultate wird auch in Tabelle I gezeigt.
    • Immunofluoreszenz
  • Fixierte, HIV-infizierte Zellen wurden mit dem 3D6-Antikörper inkubiert. Die spezifische, durch das Markierungskonjugat Anti-Human-IgG-FITC ist in Fig. 2 dargestellt.
    • in vitro-Verhalten der monoklonalen Antikörper und verwandter Immunotoxine Neutralisationsaktivität
  • In Gegenwart von bis zu 1 µg/ml konnten H9-Zellen durch die 20-fache TClD&sub5;&sub0; von HIV-Vironen nicht infiziert werden. Die Neutralisationsaktivität ist in Fig. 3 gezeigt.
  • 9 Tage nach der Virusinokulation mit der 20-fachen TClD&sub5;&sub0; konnten 0,1 µg/ml 3D6-Antikörper eine HIV-Infektion in H9- Zellen verhindern.
    • Zytotoxizität
  • Der monoklonale Antikörper (3D6) wurde covalent mit der Rizin-A-Kette verbunden und dazu benützt, um die Zytotoxizität des Antikörperkonjugats zu zeigen. Die Zytotoxizität wurde durch die ³&sup5;S-Methionin-Aufnahme gemessen. Das aus einem Konjugat zwischen dem 3D6-Antikörper und der Rizin-A-Kette bestehende, in der unter "Materialien und Verfahren" beschriebenen Weise hergestellte Immunotoxin tötete spezifisch HIV-1- infizierte H9-Zellen. Die ³&sup5;S-Methionin-Aufnahme ist in Prozenten der Kontrollprobe ausgedrückt (Fig. 4).
    • Vergleich des hu Anti-HIV-mAb mit natürlich vorkommenden Antikörpern von seropositiven und an AIDS oder Prä-AIDS leidenden Patienten
  • Für den Vergleich der beanspruchten monoklonalen Antikörper mit natürlich vorkommenden Antikörpern in Menschen nach einer HIV-Infektion wurde eine konkurrenzierende EIA (Enzym- Immuntest) gewählt. Der 3D6 monoklonale Antikörper wurde mit Peroxydase konjugiert, und es wurde die Verdünnung der halben maximalen Sättigung bestimmt. Der 3D6-Antikörper wurde bei einer Verdünnung der halben maximalen Sättigung mit verschiedenen Sera von seropositiven Personen ohne klinische Manifestation von AIDS und mit Sera von an AIDS oder Prä-AIDS leidenden Patienten in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. Die Konkurrenz zwischen dem 3D6-Antikörper und den natürlich im Blut vorkommenden Antikörpern wird in % der halben maximalen Sättigung zum Ausdruck gebracht. Die halbe maximale Sättigung durch den 3D6 Antikörper wird als 100% angenommen. Die Tabelle II zeigt die Werte aus der konkurrenzierenden EIA unter Verwendung eines 3D6-Antikörper-Peroxydase-Konjugats und verschiedener Sera. Fig. 5 zeigt die Ergebnisse in graphisch aufbereiteter Form. Tabelle II: Vergleich zwischen dem 3D6-Antikörper und Sera von seropositiven und an AIDS oder Prä-AIDS leidenden Patienten Patient Nr. oder Proband %-satz der halben maximalen klinische Manifestation von AIDS (1) Prä-AIDS Sättigung seropositiver Proband Fortsetzung auf nächster Seite Fortsetzung von Tabelle II Fortsetzung auf nächster Seite Fortsetzung von Tabelle II Peptidanalyse
  • Peptid C und D reagierten mit dem 3D6-Antikörper. Eine ähnliche Wiederholungssequenz wird auch in gp 120 gefunden. Dies ist der Grund für die Reaktion mit gp 41 und gp 120.
    • Im Handel erhältliche EIA
  • Die Ergebnisse von im Handel erhältlichen EIA werden in Fig. 6 gezeigt. Bei allen EIA wurden positive Resultate erhalten, außer bei Verwendung des Abott-ELISA. Der Organon-(2)- Test ist eine konkurrenzierende EIA.

Claims (1)

1. Antikörper 3D6, der sich selektrv an ein Hüllprotein von HIV-I bindet und durch Hybridoma mit der ECACC-Zugriffs.Nr. 87110301 erzeugt ist.
2. Antikörper nach Anspruch 1, die sich auch selektiv an mit HIV-I (HTLV III/LAV) infizierte Zellen binden.
3. Antikörper nach Anspruch 1 der gegen mit HIV-I-infizierte H-g-Zellen eine TClD 50% von weniger als 10 nM zeigt, wenn er an eine Rizin-A-Kette konjugiert ist.
4. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der ein G-Isotop aufweist.
6. Maus x menschliches Hybridoma, das einen monoklonalen menschlichen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 produziert, sowie Abkömmling besagter Hybridomas.
6. Immunotoxin mit einem Konjugat des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einer zytotoxischen Gruppe.
7. Immunotoxin nach Anspruch 6. bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette von Rizin ist.
8. Immunotoxin nach Anspruch 6. bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette von Abrin ist.
9. Immunotoxin nach Anspruch 6 bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette des Diphterie-Toxins ist.
10. Immunotoxin mit einem konjugat des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einer zytotoxischen Gruppe.
11. Immunotoxin nach Anspruch 10, bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette von Rizin ist.
12. Immunotoxin nach Anspruch 10, bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette von Abrin ist.
13. Immunotoxin nach Anspruch 10. bei dem die zytotoxische Gruppe des Immunotoxins die A-Kette des Diphtene-Toxins ist.
14. Verfahren zur spezifischen Feststellung von mit HIV-1-infizierten Zellen in menschlichem Blut oder dem Fluid einer Gewebekultur, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper nach Anspruch 1 verwendet wird.
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