DE3587969T2

DE3587969T2 - Testverfahren zum nachweis von menschlichem lymphotropischem virus.

Info

Publication number: DE3587969T2
Application number: DE3587969T
Authority: DE
Inventors: Myron Essex; Tun-Hou Lee
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2005-11-09
Also published as: EP0201588A4; EP0201588A1; DE3587969D1; WO1986002930A1; US5731142A; EP0201588B1; US4725669A; ATE116658T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue und gereinigte Formen von Glykoproteinen, die in Zellen gefunden werden, die mit menschlichem lymphotropem T-Zell-Virus vom Typ III (HTLV- III) infiziert sind, und Tests, um in einer biologischen Probe das Vorhandensein von Antikörpern gegen die antigenen Determinanten, die auf dem Glykoprotein präsentiert werden, zu erkennen.
Es wird vermutet, daß HTLV-III eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) spielt. Es wurde gezeigt, daß menschliche Patienten, die in ihrem Körper Antikörper gegen HTLV-III-infizierte Zellen enthalten, ersichtlich latent oder manifest mit dem Virus infiziert sind.
Gemäß der EP-A-0 201 540 ist ein Glykoprotein bekannt, das ein Molekulargewicht von naherungsweise 90.000 Daltons in der nicht-glykolisierten Form und 110.000 Dalton in der glykolisierten Form aufweist. Dieses Glykoprotein kann aus einem Lysat eines lymphadenopathischen Retrovirus enthalten werden, der Antigene aufweist, die in vitro durch ein Serum von Patienten selektiv erkannt werden, die mit AIDS infiziert sind, oder mittels eines Serums eines nicht symptomatischen Trägers für das AIDS- Virus. Ferner kann dieses Glykoprotein aus Kulturen von T- Lymphozyten erhalten werden, die mit HTLV-III infiziert sind sowie aus HTLV-III Präparationen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde herausgefunden, daß spezielle Polypeptide oder Glykoproteine, die in HTLV-III Virionen oder menschlichen Zellen enthalten sind, die mit HTLV-III und verwandten Viren infiziert sind, sobald sie gereinigt und isoliert sind, eine antigene Determinante oder Determinanten enthalten, die ein hohes Maß an Sensitivität und Immunospezifität für Antikörper gegen menschliche Zellen zeigen, die mit HTLV-III und verwandten Viren infiziert sind. Wenn wir entweder den Ausdruck "HTLV-III" oder den Ausdruck "HTLV-III" verwandte Viren" verwenden, so meinen wir damit aus Vereinfachungsgründen, daß damit sämtliche Viren umfaßt sind, die infolge serologischer, biochemischer und Molekularkriterien dem HTLV-III eng verwandt sind, einschließlich lymphadenopatischer assoziierter Viren (LAV) (siehe Barre-Sinoussi (1983) in Science 220: 859), ARV (siehe Sanchez-Pescador (1985) in Science 227: 484) und Aids Retrovirus (RV) (siehe Folks, (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 82 : 4539) und andere Formen, Untertypen und Varianten einschließlich des Simian-Virus. Die Ausdrücke "human T-cell lymphotrophic virus-III" und "human T-cell leukemia virus III" werden abwechselnd benutzt, obwohl die vorherige Ausdrucksweise bevorzugt ist.
Folglich sind die im wesentlichen reinen Glykoproteine oder ihre unglykolisierten Teile als diagnostisches Werkzeug zum Testen biologischer Proben verwendbar, um zuvor oder eine laufende Infektion mit HTLV-III zu bestimmen. Andere Polypeptide, die immunologisch kreuzreagierende antigene Determinanten enthalten, sind für denselben Zweck ebenfalls verwendbar. Unter "Polypeptiden", die immunologisch querreaktive antigene Determinanten" enthalten, verstehen wir Polypeptide, die antigene Determinanten gemeinsam haben, mit denen ein gegebener Antikörper reagiert. Solche anderen Polypeptide umfassen den unglykolisierten Teil der Glykoproteine, chemisch synthetisierte Polypeptide und Polypeptide, die durch Organismen oder Zellen produziert werden, die durch rekombinante DNA-Techniken gentechnisch hergestellt sind. Sie umfassen auch Antikörper oder Fragmente hiervon, die anti-idiotypisch in Richtung auf die aktive Determinante oder Determinanten auf dem erfindungsgemäßen Glykoprotein sind. Es wurde auch gezeigt, daß anti-idiotypische Reagenzien als diagnostische Werkzeuge für die Erkennung von Antigen tragenden Stellen brauchbar sind, die mit jenen auf Antikörpern immunologisch kreuzreagieren (Potocnjak et al., Science 215 : 1637-1639 (1982)). Somit kann ein Test auf HTLV-III Infektion mit Hilfe eines an anti-idiotypischen oder immunologischen aktiven Fragments hiervon ausgeführt werden, das eine antigene Stelle oder Stellen trägt, die immunologisch ähnlich der antigenen Stelle oder den Stellen auf den erfindungsgemäßen Glykoproteinen sind. Solche anti-idiotypischen Antikörper können gegen die ersten Antikörper, die eine Spezifität gegen die antigenen Stellen auf den Glykoproteinen gemäß der Erfindung haben, eingesetzt werden (d. h. anti-idiotypische Antikörper sind Anti-Antikörper) Vorzugsweise werden monoklonale anti-idiotypische Antikörper verwendet.
Die Erfindung umfaßt deswegen mm wesentlichen reines Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von näherungsweise 160.000 Dalton, wovon näherungsweise 90.000 Dalton das Molekulargewicht des unglykolisierten Teils sind, wobei das Glykoprotein im wesentlichen gleich einem Hüll-Glykoprotein ist, das durch den größten offenen Leseraster in der 3'-Hälfte des für menschliche T-Zellen lymphotropischen Virus vom Typ III-Genom kodiert und von Zellen zu erhalten ist, die mit dem lymphotropen Virus vom Typ III für menschliche T-Zellen infiziert sind.
Ein Test auf HTLV-III-Infektion ist wichtig, da der Virus leicht von den peripheren Blutleukozyten von Antikörper-positiven Menschen auf Leukozyten von Antikörpernegativen Menschen übertragen werden, wenn beide gemeinsam kultiviert werden. Popovic et al., Science, Vol. 219, 856- 859 (1983). Folglich scheint ein großes Infektionsrisiko bei Vollbluttransfusionen zu bestehen, wenn das übertragene Blut infizierte Zellen enthält. Der Test ist wichtig, weil biologische Proben von Personen, die die erworbene Immunschwäche (AIDS) zeigen, einen positiven Test für Antikörper gegen antigene Determinanten des neuen Glykoproteins liefern und somit die Diagnose dieser Krankheit erleichtern.
Folglich umfaßt die Erfindung auch das Testverfahren von biologischen Proben auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV-III-spezifische Glykoproteine mit den Schritten: 1) Inkubieren der Proben mit einem Polypeptid, das eine antigene Determinante oder Determinanten enthält, die mit denen eines Glykoproteins immunoligisch kreuz-reagieren, das ein Molekulargewicht von näherungsweise 160.000 Dalton (gp160) hat, wobei 90.000 Dalton der unglykolisierte Teil hiervon alle antigenen Determinanten des Glykoproteins trägt, das Glykoprotein ein Hüll-Glykoprotein ist, das durch den größten offenen Leseraster in der 3'-Hälfte des HTLV-III-Genoms kodiert ist und von Zellen zu erhalten ist, die mit HTLV-III infiziert sind; und 2) bestimmen, ob zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid ein Immunokomplex gebildet wird oder nicht.
Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zum Testen einer biologischen Probe auf das Vorhandensein einer antigenen Determinante oder antigenen Determinanten, die mit den Determinanten des Glykoproteins mit einem Molekulargewicht von 160.000 Dalton immunologisch kreuzreagieren. Die zu untersuchenden Determinanten können auf dem erwähnten Glykoprotein selbst oder anderen Polypeptiden auftreten. Sie können in den Körperflüssigkeiten oder in Lymphozyten frei zirkulieren. Der Test kann durch bekannte Immunotestverfahren unter Verwendung von monoklonalen oder polyvalenten Antikörpern durchgeführt werden, die eine Immunreaktivität mit antigenen Determinanten haben, die auf den erwähnten Glykoproteinen auftreten. Beispielsweise können konkurrierende Immunotests oder immunometrische (sandwich) Tests verwendet werden. Immunoprezipitation, ELISA, oder Western Blot sind andere Beispiele für die Tests, die ausgeführt werden können.
In der Zeichnung veranschaulicht Fig. 1 ein Autoradiogramm, das die spezifische Aktivitäten von gp120 und gp160 zeigt, wie sie durch Gelelektrophorese bestimmt sind.
Fig. 2 zeigt ein Autoradiogramm, das die spezifische Aktivitäten von gp120 und gp160 zeigt, die durch Gelelektrophorese ermittelt sind.
Fig. 3 zeigt ein Autoradiogramm, das die spezifische Aktivität von gp90 zeigt, wie sie durch Gelelektrophorese bestimmt ist.
Fig. 4 zeigt ein Autoradiogramm von löslichen Zelllysaten, die mit Speichel reagiert haben.
Fig. 5 zeigt eine Nukleotidsequenz und eine vorhergesagte Aminosäuresequenz für das aminoterminale Ende von gp160 und gp120.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Das Glykoprotein der vorliegenden Erfindung weist ein Molekulargewicht von näherungsweise 160.000 Dalton auf, wie dies mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS) bestimmt ist und ist in SDS-Puffer löslich, der 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 M Tris Hydrochlorid, pH-Wert 7,2, 1% Triton X-100 (bei Triton handelt es sich um ein Warenzeichen), 1% Natriumdeoxicholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthält. Triton X-100 ist ein nicht-ionisches Detergentium (Octylphenoxypolyethoxy (9-10) Ethanol). Der unglykolisierte Teil des 160.000 Dalton Glykoproteins hat ein Molekulargewicht von näherungsweise 90.000 Dalton und enthält im wesentlichen dieselbe antigene Determinante oder Determinanten wie das Glykoprotein selbst.
Die Glykoproteine können von Zellen, die mit HTLV-III infiziert sind, erhalten werden; gp120 kann außerdem von HTLV-III-Virionen erhalten werden. Es wurde eine Varietät von Zellinien bereitet, die dauernd und fortwährend mit HTLV-III infiziert sind; unter diesen können HTLV-III infizierte H9-Zellen, NC37-Zellen, die mit dem lymphadenopathisch assoziierten Virus (LAV) infiziert sind, und Molt 3- und HUT 78-Zellen erwähnt werden, die mit frischen AIDS-Isolierungen infiziert sind.
Es kann sein, daß die exakten Größen der neuen Glykoproteine in unterschiedlichen Linien geringfügig differieren; Jedoch sind die gemeinsamen immunologischen kreuzreaktiven Teile der Glykoproteine dieselben, unabhängig von der Zellinie, da es sich um Teile handelt, die durch HTLV-III kodiert sind. Somit kann jede Zelle, die den Virus beherbergt, eine geeignete Quelle für das neue Glykoprotein sein. Um das Protein von beliebigen infizierten Zellen, die den Virus tragen, zu erhalten, werden die Zellen metabolisch markiert (z. B. mit ³&sup5;S-Cystein) und mit Antiseren immunoprezipitiert, die von HTLV-III Infizierten erhalten wurden. Die neuen Glykoproteine können durch Gelelektrophorese oder andere Chromatographieverfahren aufgefunden und isoliert werden.
Die Glykoproteine sind env-Glykoproteine und werden durch den größten offenen Leseraster in der 3'-Hälfte des HTLV-III-Genoms kodiert. Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosauresequenz, die durch den Aminoendabschnitt des Hüllgenbereichs von HTLV-III kodiert wird. Die HTLV-III-Sequenz ist von Ratner et al. (1985) Nature (London) 313 : 277 abgeleitet worden. Der dunkle Pfeil kennzeichnet die Spaltstelle zwischen der Führungssequenz und gp160. Die Sternchen bezeichnen Cystein, Leucin und Valinreste, wie sie durch Sequenzanalyse mittels radioaktiver Markierung bestimmt wurden. Das erste präsentierte Nukleotid entspricht der Nukleotidsequenz 5802 des HTLV-III-Genom.
Die Glykoproteine sind beispielsweise in HTLV-III- infizierten menschlichen T-Zellen der Linie H9, LAV-infizierten NC37-Zellen und Molt 3- sowie Hut 78-Zellen, die mit frischen AIDS-Virus-Isolaten infiziert sind, vorhanden. Die Glykoproteine können leicht von den Zellen dieser Zellinien durch Lyse und SDS-Gelelektrophorese getrennt werden.
Die gereinigten und isolierten Glykoproteine und alle damit immunologisch kreuz-reagierenden Antigene können als Standardantigen in allen üblichen Testverfahren verwendet werden, um biologische Proben auf das Vorhandensein von hiergegen spezifischen Antikörpern zu prüfen und somit für das Vorhandensein einer HTLV-III-Infektion und/oder AIDS. Die Antikörper, die gegen solche HTLV-III-Antigene spezifisch sind, werden nicht in Patienten gefunden, die unter Krankheiten wie Hepatitis leiden, die nicht von einer HTLV-III-Infektion begleitet sind.
Die Glykoproteine oder Polypeptide, die hiermit immunologisch kreuz-reagieren, können durch übliche Verfahren mit ¹&sup5;²I oder ³&sup5;S oder ³H zur Verwendung in einem Radioimmuntest markiert werden, mit Fluoirescin für einen Fluoreszenzimmunotest, mit einem Enzym für einen Enzymimmunotest oder mit Biotin für Biotin-Avidin-gekoppelte Tests. Sie können wunschgemäß markiert oder unmarkiert in kompetitiven Immunotests ebenso wie in Tests mit zweifachen Antikörpern unter Verwendung zweier Antikörper verwendet werden, die entweder von der Idiotyp: Antiidiotypvarietät oder insbesondere von dem zweiten Antikörpertyp sind, bei dem ein Anti-Fc-Antikörper verwendet wird, oder für andere Tests.
Alternativ können die neuen Glykoproteine oder die damit immunologisch kreuz-reaktiven Polypeptide in einer unlöslichen Phase immobilisiert sein, beispielsweise als unlösliches Harz, und die Erkennung der Anti-Glykoprotein- Antikörper wird durch Messung ihrer Bindung an die unlosliche Phase ausgeführt. Unlösliche Phasen umfassen auch Latexpartikel, die, wenn sie mit dem neuen Glykoprotein oder ihren damit immunologisch kreuz-reagierenden Polypeptiden beschichtet sind und Anti-Glykoprotein-Antikörpern ausgesetzt sind, agglutinieren. Noch andere unlösliche Phasen umfassen Teströhrchen, Violen, Titrationstüpfelatten u. dgl., an die das neue Glykoprotein oder ihre damit immunologisch kreuz-reagierenden Polypeptide gebunden werden können, sowie Antikörper hierfür, die durch zweifache Antikörpertechniken oder Protein-A-abhängige Techniken erkannt werden können.
Der Test auf Antikörper, die HTLV-III induzierte Antigene erkennen, kann das Glykoprotein oder Glykoproteine bzw. unglykolisierte Teile der Glykoproteine in Rohform verwenden und ist nicht darauf beschränkt, diese Proteine in im wesentlichen reiner Form zu verwenden. Beispielsweise können das Glykoprotein oder die Glykoproteine zunächst im wesentlichen gereinigt und dann miteinander gemischt werden. Alternativ können auch rohe Mischungen verwendet werden.
Die Elemente, die zum Durchführen der oben beschriebenen diagnostischen Methoden nötig sind, können in einem Set enthalten sein. Ein solches Set enthält einen Träger mit Kammern, in denen ein oder mehrere Behälter aufgenommen sind, wobei jeder Behälter ein oder mehrere der Elemente enthält, die zum Ausführen der Tests notwendig sind.
Beispielsweise kann der erste Behälter eine oder beide gereinigte Glykoproteine oder ihre immunologisch kreuz-reaktiven Polypeptide in erkennbar markierter oder unlöslich gemachter Form enthalten.
Ein zweiter Behälter kann einen Anti-IgG-Antikörper, polyklonal oder monoklonal, wie er in Doppel-Antikörperbindungstests zu verwenden ist, oder Elemente enthalten, die zur Erkennung der Markierungen auf dem Glykoprotein oder seinen immunologisch kreuz-reaktiven Polypeptiden gebraucht wird (beispielsweise chromogene Substrate)
Weitere Container können unterschiedliche Mengen von einem der Glykoproteine oder seiner immunologischer kreuzreagierenden Polypeptide enthalten, die dazu verwendet werden, eine Standardkurve herzustellen, deren die experiementellen Ergebnisse zu interpolieren sind. Die Materialien selbst können in dem Set in Lösung in gefriergetrockneter Form in Mischung mit anderen inerten Materialien, wie inerten Proteinen u. dgl. enthalten sein.
Die biologischen Proben, die testbar sind, umfassen Blut, Serum, Lymphozyten, Urin, Gewebe, Speichel, Stuhlproben u. dgl. Von besonderem Interesse ist die Durchmusterung von Blut in Blutbanken, um sicherzustellen, daß das Blut nicht mit HTLV-III kontaminiert ist. Die Durchmusterung von aus Blut hergestellten Produkten, wie Impfstoffen, kann ebenfalls durch die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden.
Die nachfolgenden speziellen Beispiele sollen genauer das Wesen der Erfindung erläutern, jedoch nicht den Schutzumfang beschränken.

Charakterisierung der Proteine

Die Reaktivität von Serumproben, die mit Antikörpern gegen Zellmembranantigene induziert durch HTLV-III (HTLV- III-MA) positiv reagieren, wurde durch RIP-SDS-PAGE bestimmt, wobei die Proteine auf einem 12,5% SDS-Polyacrylamidgel mit 3,5% Stapelgel unter Verwendung des Laemmli- Puffersystems getrennt wurden.
Nichtinfizierte H9-Zellen (a) und mit HTLV-III infizierte H9-Zellen (b) wurden auf dem Scheitel ihrer logarithmischen Wachstumsphase geerntet und [³&sup5;S]-Cystein (100 uCi/ml; spezifische Aktivität 957,5 Ci/mmole) 14 bis 16 Stunden lang ausgesetzt. Es wurde ein lösliches Zelllysat erhalten und einmal mit einem Kontrollserum als negative Referenz geklärt, das an Protein-A Sepharose CL4B (Protein-A Perlen) gebunden ist, wie dies von Essex et al., (1983) in Science 220 : 859, beschrieben ist, ehe die Teile zur Reaktion mit 8 ul der nachfolgenden Seren zur Reaktion kamen, die an Protein-A Perlen zuvor absorbiert waren, wobei die in Fig. 1 der Zeichnung gezeigten Ergebnisse zustande kamen: (A) die Seren von 8 bei Anti-HTLV- III-MA positiven AIDS-Patienten (Bahnen 1-8) , (B) die Seren von 4 Anti-HTLV-III-MA-positiven ARC-Patienten (Bahnen 1-4) und die Seren von 4 Anti-HTLV-III-MA-positiven gesunden Homosexuellen (Bahnen 5-8); (C) Seren von 2 Anti-HTLV-III-MA-negativen gesunden Homosexuellen (Bahnen 1-2), Seren von 2 Anti-HTLV-III-MA-negativen Labortechnikern (Bahnen 3-4), ein monoklonaler Mausantikörper für p24 HTLV-III (Bahn 5), ein normales Karnickelserum (Bahn 6), ein Karnickelantiserum als Referenz gegen disrupten HTLV- III (Bahn 7) und ein positiver ARC-Patient als Kontrolle (Bahn 8). Die Markierungen für das Molekulargewicht waren ¹&sup4;C-markiertes Myosin (200.000), Phosphorylase-b (92.500), Albumin-Rinderserum (69.000), Eiweiß (46.000) , Karbonatdehydrase (30.000) und Lysozym (14.300).

Herstellung von markiertem Glykoprotein

Es wurden H9-Zellen, die mit HTLV-III infiziert waren, auf dem Scheitel ihrer logarithmischen Wachstumsphase geerntet und 14 bis 16 Stunden lang [³&sup5;S]-Cystein ausgesetzt (100 uCi/ml; spezifische Aktivität 957,5 Ci/ mmole). Um die Glykoproteinfraktionen anzureichern, ließ man zunächst das lösliche Zelllysat zunächst mit Lentilsectinsepharose 4B in einem Verhältnis von 20 · 106 Zellen pro 1 ml von Lentillectin 4B bei 4ºC 3 Stunden lang reagieren. Deoxycholatfreier RIPA-Puffer in Anwesenheit von 5% Methyl α D Mannosid wurde dazu verwendet, die Glykoproteine zu eluieren. Die Glykoproteinfraktion wurde unter Verwendung von RIP-SDS-PAGE mit menschlichen Seren, die für Anti-HZLV-III-MA positiv sind, analysiert. Die [³&sup5;S] Cystein-markierten Glykoproteine ließ man mit 8 ul der folgenden Seren, min den in Fig. 2 gezeigten Ergebnis reagieren:
Vier Seren von vier für Anti-HTLV-III-MA positiven Aids-Patienten (Bahnen 1-4) , zwei Seren von zwei Anti- HTLV-III-MA positiven ARC-Patienten (Bahnen 5-6), zwei Seren von zwei Anti-HTLV-III-NA positiven gesunden Homosexuellen (Bahnen 7 bis 8), zwei Seren von Anti-HTLV-III-MA negativen gesunden Homosexuellen (Bahnen 9-10) unter zwei Seren von zwei Anti-HTLV-III-NA negativen Labortechnikern (Bahnen 11-12).

Herstellung des markierten unglykolisierten Teils des Glykoprotein

HTLV-III infizierte H9 Zellen wurden auf dem Scheitel ihrer logarithmischen Wachstumsphase geerntet und zwei Stunden lang in McCoy's 5A Medium erneut suspendiert, das mit 10% fetalem Rinderserum, 1% einer antibiotischenantimykotischen Mischung und 20 ug/ml von Tunicamycin ergänzt wurde. Nach diesem Einstellschritt wurden die Zellen mit [³&sup5;S]-Cysteine, wie oben beschrieben, in Anwesenheit von 20 ug/ml Tunicamycin drei Stunden lang markiert. Das markierte Material wurde dann denselben Lyse- und Vorklärungsverfahren wie oben beschrieben unterzogen.
Die Proteine von behandelten und unbehandelten Zellen wurde mittels Anti-HTLV-III-NA positiven menschlichen Seren unter Verwendung von RIP-SDS-PAGE, wie in Fig. 3, linke Bahn analysiert. Die löslichen Zellysate von Tunicamycin-unbehandelten (a) und -behandelten Zellen (b) ließ man mit 8 ul eines für Antikörper gegen HTLV-III negativen Referenzserums (Bahnen 1-2) und 8 ul eines für Antikörper gegen HTLV-III positiven Referenzserums eines ARC-Patienten (Bahnen 3-4) reagieren, wobei die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden.
Die nachfolgenden speziellen Beispiele betreffen den Test von Speichelproben auf Antikörper gegen HTLV-III.
Von Personen wurde Vollspeichel gesammelt und bei -70ºC gelagert. Nach einer 1 : 2 Verdünnung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Wasser wurden die Proben zentrifugiert und durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 M (Millipore Corporation, Bedford, NA) gefiltert. Sodann wurde eine Radioimmunoprezipitation von ³&sup5;S Cysteine markierten H9/HTLV-III infizierten und H9 infizierten Zellysaten durchgeführt, wie dies oben beschrieben ist, mit der Einschränkung, daß man vor der Zugabe von 150 ul der Speichelproben die Protein-A-Perlen zunächst mit 10 ul sekretorischem Anti-Mensch Schaf-IgA-Serum (Cappel Lab. Inc., Cochranville, PA) reagieren ließ. Seren eines Aids- Patienten, der bekanntermaßen für die HTLV-III Anti-Gene p24, p55, gp120 und gp160 positiv ist, wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Immunoprezipitate wurden in einem 10%igen Acrylamidauflösungsgel mit 3,5% Stapelgel entsprechend den diskontinuierlichen Puffersysteme analysiert, wie dies oben beschrieben ist. Bei -70ºC wurde fünf Tage lang eine Autoradiografie ausgeführt. Etwa zur selben Zeit wurden von denselben Patienten Serenproben genommen und wie vorher beschrieben durch Immunoprezipitation getestet.
Wie im einzelnen in Fig. 4 gezeigt, wurden aus H9- Zellen (Bahnen a, c, e, g, i, k) und H9/HTLV-III Zellen (Bahnen b, d, f, h, J, l), die ³&sup5;S-Cystein ausgesetzt waren, geerntet wurden und mit RIPA-Puffer lysiert wurden, lösliche Zellysate hergestellt. Diese Lysate ließ man sodann mit 150 ul einer 1 : 2 Verdünnung von Speichel reagieren, der an Protein A-Sepharose CL-4B (Protein A-Perlen, Sigma) mit 10 l Anti-Mensch IgA-Schaf-Seren gebunden wurde. Die Proben sahen wie folgt aus: Speichel des Aidspatienten 1 (Bahnen a, b), normaler Labortechniker (Bahnen c, d); Aidspatient 2 (Bahnen e, f) Aids-Patient 3 (Bahnen i, J) Aidspatient 4 (Bahnen k, l) . Referenzserum eines Aidspatienten, der bekanntermaßen für HTLV-III-Antigene positiv ist (Bahnen g, h) . Die angenäherten Molekulargewichte in Tausend sind an der rechten Seite angegeben.

Claims

1. Im wesentlichen reines Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von näherungsweise 160.000 Dalton, von dem näherungsweise 90.000 Dalton das Molekulargewicht des unglykolisierten Teils ist, wobei das Glykoprotein im wesentlichen gleich einem Hüllglykoprotein ist, das von dem größten offenen Leseraster in der 3'-Hälfte des lymphotropen Virus vom Typ III für menschliche T-Zellen codiert wird und von Zellen zu erhalten ist, die mit dem lymphotropen Virus vom Typ III für menschliche T-Zellen infiziert sind.

2. Protein mit 90.000 Dalton, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein der nichtglykolisierte Teil eines Glykoproteins mit einem Molekulargewicht von näherungsweise 160.000 Dalton ist, wobei das Glykoprotein im wesentlichen identisch mit dem Hüllglykoprotein ist, das durch den größten offenen Leseraster in der 3'-Hälfte des lymphotropen Virus mit dem Typ III Genom, für menschliche T-Zellen codiert wird und von Zellen zu erhalten ist, die mit dem lymphotropen Virus vom Typ III für menschliche T-Zellen infiziert sind.

3. Verfahren zum Untersuchen einer biologischen Probe nach Antikörpern, die für die Infektion mit einem lymphotropen Virus vom Typ III für menschliche T-Zellen kennzeichnend ist, wobei das Verfahren darin besteht, daß

die Probe mit einem Reagens inkubiert wird, das das Glykoprotein nach Anspruch 1 oder das Protein nach Anspruch 2 enthalt und

indem bestimmt wird, ob zwischen dem Antikörper und dem Reagens ein Immunokomplex gebildet wird oder nicht.