DE3526829A1 - Verfahren und reagenzeinheit zum bestimmen von alpha-amylase - Google Patents

Verfahren und reagenzeinheit zum bestimmen von alpha-amylase

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Description

11856 Dr.v.B/Schä/30
U.S.Ser.No. 634,873
AT: 26. Juli 1984
Genzyme Corporation,
75 Kneeland Street, Boston, Mass., V.St.v.A.
Verfahren und Reagenzeinheit zum Bestimmen von Alpha-Amyläse
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 , insbesondere zur Bestimmung des Enzyms Alpha-Amylase in biologischen Fluiden.
Die Messung von Alpha-Amylase in Urin und Serum wird in großem Umfange zur Diagnose von Pancreas-Störungen durchgeführt. In der Literatur sind eine Anzahl von Analyseverfahren beschrieben, bei denen Oligosaccharid-Alpha-Amylase-Substrate verwendet werden, welche durch Alpha-Amylase (die ein Endo-Enzym ist) in Verbindung mit einem Exo-Enzym, z.B. Alpha-Glucosidase, Beta-Glucosidase oder Gluco-Amylase in kürzere Ketten gespalten wird.
Aus der US-PS 4 102 747 (Driscoll et al) ist ein Analyseverfahren bekannt, bei dem Oligosaccharide mit einer Kettenlänge von vier bis zehn Glucoseeinheiten mit einem Chromophor (p-Nitrophenol oder "pNP") am reduzierenden Ende verwendet werden. Die Kette soll einer Spaltung durch Alpha-Glucosidase widerstehen und eine Spaltung durch Alpha-Amylase soll kleinere Fragmente erzeugen, aus denen durch Alpha-Glucosidase p-Nitrophenol
freigesetzt wird. Ein ähnliches Analyseverfahren ist aus der Broschüre der Firma Calbiochem-Behring "Pantrak E. K. Amylase" bekannt. Auch in den US-PSen 41 45 527, 41 47 860 und 42 33 403 sind ähnliche Analyseverfahren beschrieben.
Aus einer Veröffentlichung von Marshall et al, Clin. Chimica Acta (1977) 277 ist ein Analyseverfahren für Alpha-Amylase bekannt, bei dem modifizierte stärkeartige Polysaccharide verwendet werden, die Gruppen, welche die Wirkung von Glucoamylase blockieren, enthalten. Diese die Exo-Enzymwirkung blockierenden Gruppen sollen vorzugsweise durch begrenzte Periodat —Oxydation ... oder durch Substitution von Monosaccharid-Resten eingeführt werden. In Gegenwart von überschüssiger Glucoamylase soil die freigesetzte Glucosemenge direkt proportional der Menge der anwesenden Alpha-Amylase sein. Die Glucose soll durch das Glucose-Oxidase-Verfahren bestimmt werden. Ein ähnliches Verfahren ist unter der Bezeichnung "Deltatest Assay" in einem Biomedics-Katalog beschrieben.
Aus der GB-OS 20 04 646 ist ein Analyseverfahren bekannt, bei dem Maltoheptaose als Alpha-Amylase-Substrat verwendet wird.
Durch die vorliegende Erfindung soll ein neues Bestimmungs- oder Analyseverfahren für Alpha-Amylase geschaffen werden, welches schnell ist, sehr genaue Ergebnisse liefert und unempfindlich gegen Störungen durch freigesetzte Glucose ist.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 gelöst. Weitere Ansprü-
ehe betreffen Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Analyseeinheit zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens.
Bei dem vorliegenden Verfahren zum Bestimmen der Menge von Alpha-Amylase in einer flüssigen Probe wird ein Oligosaccharid-Substrat für Alpha-Amylase verwendet, welches mindestens drei Glucoseeinheiten enthält, von denen die des reduzierenden Endes über eine durch Alphaoder Beta-Glucosidase spaltbare Bindung mit einer Kennungs- oder Markierungsgruppe (Label) gebunden ist, welche bei Spaltung der Bindung eine optisch meßbare Änderung erfährt, und dessen End-Glucoseeinheit mit einem Blockierungssubstituenten gebunden ist, der Exo-Enzyme hemmt, die Bindung zwischen der End-Glucoseeinheit und der benachbarten Glucoseeinheit zu spalten; die Probe wird mit diesem Oligosaccharid-Substrat und einem ersten Exo-Enzym, das die Bindung zwischen der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende und der Markierungsgruppe zu spalten vermag, in Berührung gebracht, und die optisch meßbare Änderung wird als Maß für die in der Probe enthaltene Alpha-Amylase optisch gemessen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Markierungsgruppe oder das Label ein Chromophor, ein Fluorophor, ein chemilumineszierender Substituent oder ein biolumineszierender Substituent; das erste Exo-Enzym ist Alphaoder Beta-Glucosidase oder eine Mischung hiervon. Die Probe wird ferner vorzugsweise noch mit einem zweiten Exo-Enzym, am zweckmäßigsten Gluco-Amylase, in Berührung gebracht, dessen Wirkung unabhängig von der Kettenlänge des Substrats ist und das nicht in der Lage ist, die
Bindung zwischen der Markierungsgruppe und der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende zu spalten. Bevorzugte Markierungsgruppen oder Label sind p-Nitrophenol, o-Nitrophenol (Chromophore), Cumarin-Derivate, wie 4-Methylumbelliferon (ein Fluorophor), und Luciferin (ein chemilumineszierender Substituent). Vorzugsweise enthält das Substrat acht oder weniger Glucoseeinheiten, am meisten bevorzugt werden sechs oder sieben Glucoseeinheiten. Bevorzugte Blockierungs-Substituenten sind Acetale oder Ketale, z. B. Benzyliden. Die bei der Analyse verwendeten Reagenzien werden vorzugsweise in Form einer Reagenzeinheit geliefert bzw. verwendet, wobei die Reagenzien vorzugsweise in Mischung miteinander in einem einzigen Behälter enthalten sind.
Das Analyseverfahren gemäß der Erfindung arbeitet nach dem folgenden Prinzip:
Blockierungs-Gruppe
Oligosaccharid
Alpha-Amylase
\r
Farbmessung
Bei dem oben dargestellten Schema hemmt die Blockierungs-Gruppe die Exo-Enzyme am Aufspalten des Substrats, so daß in Abwesenheit von Alpha-Amylase keine Farbänderung auftritt. Alpha-Amylase, ein Endo-Enzym, spaltet zwischen ständige Alpha-1 ,4-Bindungen im Substrat, wodurch kleinere Fragmente gebildet werden, auf die das Exo-Enzym einwirken kann, was schließlich zur Freisetzung des Chromophors führt.
Die erfindungsgemäße Analyse ist am effektivsten, wenn zwei verschiedene Exo-Enzyme verwendet werden, insbesondere, wenn das Substrat mehr als vier Glucoseeinheiten enthält. Das folgende Schema zeigt die Wirkung von Alpha-Amylase und zwei Exo-Enzymen, Gluco-Amylase und Alpha-Glucosidase, (in diesem Schema befindet sich eine Alpha-Bindung zwischen dem Chromophor und der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende; es könnte sich jedoch ebenso gut um eine Beta-Bindung handeln, wobei dann Beta-Glucosidase verwendet werden kann, oder um Alpha- und Beta-Bindungen, wobei dann eine Mischung der beiden Enzyme verwendet werden kann):
--■!0-r
Blockierungs-Gruppe
Alpha-Amylase
Blockierungs-Gruppe
Gluco-Amyläse
Alpha-Glucosidase
Messung der
Farbänderung
Bei dem oben dargestellten Schema wirkt die AJpha-Amylase in der oben beschriebenen Weise. Die beiden Exo-Enzyme, Gluco-Amylase und Alpha- oder Beta-Glucosidase, wirken wie folgt zusammen:
Alpha- oder Beta-Glucosidase ist relativ inaktiv während der Periode unmittelbar anschließend an die anfängliche Spaltung des Substrats durch Alpha-Amylase, da ihre Aktivität von der Kettenlänge abhängt, d.h. ihre Aktivität ist umgekehrt proportional zur Kettenlänge des Substrats. Die Gluco-Amylase bewirkt jedoch ein schnelles Aufbrechen der Polysaccharid-Fragmente in einzelne Glucoseeinheiten, ihre Aktivität ist unabhängig von der Kettenlänge. Wie oben schon erwähnt wurde, kann wegen der an die End-Glucoseeinheit gebundenen Blockierungs-Gruppe keines dieser Enzyme wirken, bis die Alpha-Amylase gewirkt hat. Wenn die Glucose am reduzierenden Ende mit ihrem Chromophor von der benachbarten Glucoseeinheit abgespalten worden ist, ist die Rolle der Gluco-Amylase effektiv beendet, da'Gluco-Amylase nur Bindungen zwischen Glucoseeinheiten zu spalten vermag, nicht jedoch die Bindung zwischen der Glucose des reduzierenden Endes und dem Chromophor. An diesem Punkt spielen nun die Alphaoder die Beta-Glucosidase, die solche Bindungen zu spalten vermögen, ihre Hauptrolle, indem sie das der Messung zugängliche Chromophor freisetzen.
Das erfindungsgemäße Analysenverfahren liefert lineare Ergebnisse, d.h. die gemessenen optischen Dichtewerte sind nach einer sehr kurzen Verzögerungszeit direkt proportional der Alpha-Amylasekonzentration, so daß sich das vorliegende Verfahren in besonderem Maße für eine
:-1 2-
Automatisierung eignet. Bei dem vorliegenden Verfahren wird auch die Möglichkeit einer Hemmung durch freigesetzte Glucose verringert, da weniger freigesetzte Glucose gegenwärtig ist, weil der Teil des Oligosaccharids, der nach der Einwirkung der Alpha-Amylase noch blockiert verblieben ist, für die Exo-Enzyme inert bleibt. Außerdem können die Bestandteile der Analysereagenzien in Form einer Analyseeinheit zusammengestellt werden, die eine sehr gute Lagerfähigkeit hat, da die Blockierungs-Gruppe eine Beeinträchtigung des Substrats durch Alpha-Glucosidase verhindert, die sonst selbst langkettige Substrate mit der Zeit beeinträchtigen kann.
Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie vorteilhafte Reagenzeinheiten zu deren Durchführung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert, dabei werden auch noch weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung zur Sprache kommen.
Es zeigen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der optischen Dichte in Abhängigikeit von der Zeit für fünf Alpha-Amylase-Standardproben für ein Analyseverfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung und
Fig. 2 eine graphische Darstellung der optischen Dichte/min mal dem gesamten Analysenvolumen in Abhängigkeit vom Probenvolumen für eine Analyse gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Struktur und Synthese des Substrats
Der Oligosaccharidteil des Substrats ist im allgemeinen im Handel erhältlich oder kann durch übliche enzymatisch^ Verfahren, ausgehend von Stärke oder Cyclodextrinen, synthetisch hergestellt werden.
Der Label- oder Markierungsteil, vorzugsweise ein Chromophor, wie p-Nitrophenol oder o-Nitrophenol, oder ein Fluorophor, wie 4-Methylumbelliferon, können durch bekannte Verfahren an der Glucoseeinheit des reduzierenden Endes angebracht werden, z. B. Verfahren wie sie in der US-PS 41 02 747 (Driscol et al) beschrieben sind mit 4, 5, 6 und 7 Glucoseeinheiten, und Oligosaccharid-Substrate, die mit p-Nitrophenol markiert sind, sind im Handel erhältlich, z. B. von der Firma CaI Biochem Corporation.
Die Blockierungs-Gruppe kann irgendein Substituent sein, der Exo-Enzyme am Aufbrechen des Substrats hindert. Die Blockierungs-Gruppe wirkt dadurch, daß sie eine End-Glucoseeinheit schafft, die nicht mehr zu dem aktiven Teil des Exo-Enzyms paßt. Die Größe und chemische Zusammensetzung der Blockierungsgruppe sind daher nicht kritisch, es ist nur erforderlich, daß das Schloß- und Schlüssel-Zusammenwirken von Enzym und Substrat verhindert wird. Praktisch jeder Substituent, der mit C2, C3, C4 oder C6 der End-Glucoseeinheit gebunden ist, wird die Wirkung des Exo-Enzyms blockieren oder hemmen. Da man die Blockierungsgruppen am einfachsten synthetisch an C6 anfügen kann, wird eine C6-Blockierung (allein oder in Verbindung mit einer Blockierung an C4) bevorzugt.
Eine Klasse von Blockierungs-Gruppen kann den Wasserstoff in der HydroxyL-Gruppe von C6 der End-Glucoseeinheit
ersetzen. Gruppen, die sich hierfür eignen, sind z.B. Carboxylsaureester (z. B. Acetyl- oder Benzoyl-); Phosphatester; Sulfonatester (z. B. Toluolsulfonyl- oder Methansulfonyl-); Ether (z. B. Benzyl- Silyl- und Triphenylmethyl-) und andere Monosaccharide als Alpha-1, 4-gebundene Glucose.
Alternativ kann die Blockierungs-Gruppe eine Acetal- oder Ketal-Blockierungsgruppe sein, d.h. eine Gruppe, die die C4- und C6-Hydroxyle der End-Glucoseeinheit blockiert:
HO
HO
In dieser Formel sind:
a) R1 ein H und R„ ein niedriges Alkyl (5 oder weniger Kohlenstoffatome), ein niedriges Aryl oder Aralky] (10 oder weniger Kohlenstoffatome) oder
b) R1 ist ein niedriges Aryl oder Aralkyl oder ein niedriges Alkyl und R ist unabhängig hiervon ein niedriges Aryl oder Aralkyl, ein niedriges Alkyl oder COr-
Zusätzlich können Blockierungsmethoden verwendet werden, wie sie in der oben erwähnten Arbeit von Marshall et al beschrieben sind.
Die Synthese eines blockierten Substrats für die erfindungsgemäße Analyse kann nach einem der folgenden generellen Verfahren erfolgen, wobei als Chromophor p-Nitrophenol, als Blockierungs-Gruppe Benzyliden dargestellt sind und n+1 Glucoseeinheiten vorhanden sind; 2 < η .·£ 7 : *
Br
für
Reinigungs- ° zwecke
hier reinigen
Ph
CMe
Ein Substrat, das sechs Glucoseeinheiten, blockiert mit Benzyliden und markiert mit p-Nitrophenol, enthält, hat die Formel:
0-(4,6-0-Benzyliden-Alpha-D-Glucopyranosyl) _ (1 _4) _o- (Alpha-D-Glucopyranosyl) -(l -4) -0-(Alpha-Glucopyranosyl)-(1-4)-0-(Alpha-D-Glucopyranosyl)- (1-4)-0-(Alpha-Glucopyranosyl)-(1 -4)-0-(4-Nitrophenyl-0-Alpha-D-Glucopyranosid) und die Struktur:
(D
Die Verbindung (1) wurde gemäß dem folgenden Verfahren I synthetisiert: Zu 2 ml frisch getrocknetem und destilliertem Pyridin wurde 39 mg (0,035 mmol) Alpha-(4-NitrophenyD-Maltohexosid zugesetzt. Die Temperatur wurde auf 4O0C erhöht, und es wurde so lange (etwa 15 Minuten) gerührt, bis sich das ganze Material gelöst hatte. Das Reaktionsgefäß wurde mit Argon entgast (3 Evakuierungs-Reinigungszyklen), und dann wurde eine Portion getrockneten und destillierten Benzalbromids (4 |iL, 0,667 Äquiv.) zugesetzt. Die Temperatur wurde allmählich (im Verlaufe von 30 Minuten) auf 115°C erhöht. Nach 3 Stunden bei 115°C wurden weitere 4 μ:ΐ (0,67 Äquiv.) Benzalbromid zugesetzt. 2,5 Stunden später wurden ein letztes Mal 4 JiL (0,67 Äquiv.; 2,0 Äquiv. ingesamt) zugesetzt. Die Mischung wurde 2 weitere Stunden bei 115°C erhitzt und dann in einem Eisbad auf 00C gekühlt. Nach Hinzufügen eines Überschusses an Essigsäureanhydrid (1 mL) ließ man die Mischung sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührte, bis die Acylierung vollendet war (typischerweise 24 bis 48 Stunden), was durch analytische Dünnschicht-Chromatographie festgestellt wurde. Die Lösung wurde dann mit 15 mL gesättigtem wässrigem NaHC0„ verdünnt. Die wässrige Phase wurde 5mal mit Portionen von 10 ml CHC1„ extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigen NaHCO,, (10 ml) gewaschen und durch Absorber-Baumwolle filtriert. Nach der Entfernung des CHC1„ durch Verdampfen wurde das restliche Pyridin durch azeotrope Verdampfung mit mehreren Teilen Ethanol entfernt. Durch abschließendes Verreiben mit Ethanol (2 ml)
wurde alles noch verbleibende Pyridin entfernt und man erhielt schließlich einen rohen gelben Feststoff. Das rohe Produkt wurde durch praparative Dünnschichtchromatographie auf zwei 500 μπι Silicagel-Platten (96:4 Benzol-Methanol-Eluant) gereinigt, wobei man 24,2 mg (36%) chromatographisch homogenes Material (Rp 0,18) erhielt. Peracyliertes Alpha-(4-Nitrophenyl)Maltohexaosid (d.h. acyliertes Ausgangsmaterial) war ebenfalls vorhanden (rJo,13), wurde jedoch nicht gewonnen. Durch Rekristallisation aus wasserfreiem Ethanol erhielt man 21,2 mg analythisch reine Verbindung (2).
Das Produkt dieser Reaktion hat die Formel
0-(2,3-Di-0-Acetyl-4,6-0-Benzyliden-Alpha-D-Glucopyra-
nosyl)-(1-4)-0-(2,3-6-tri-O-Acetyl-Alpha-D-G]ucopyrano-
syl)-(1-4)-0-(2,3,6-tri-O-Acetyl-Alpha-D-Glucopyranosy] )-(1,4)-0-(2,3,6-tri-0-Acetyl-Alpha-D-Glucopyranosyl)-
(1-4)-0-(2,3,6-t ri-0-Acetyl-Alpha-D-g1ucopyrauosyJ)-
(1-4)-0-(2,3,6-tri-0-acetyl-4-Nitrophenyl-0-A]pha-D-Glu-
copyranosid) und die Struktur
(2)
TZ/
wobei η « 4 und R χ Ac sind.
Die Verbindung (1) wurde aus der Verbindung (2) wie folgt hergestellt: Die Verbindung (2) wurde in 2,0 mL CH„0H gelöst und die Lösung wurde mit 2,0 mL gesättigter Lösung von NH„ in CH,,OH behandelt. «Die resultierende Mischung wurde 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das NH„/CH„0H durch Abdampfen entfernt worden war und nach einmaligem Verreiben oder Mahlen mit Ether erhielt man 12,2 mg (100%) feste Verbindung (1). Dieses Material wurde nicht weiter gereinigt. Aus einer enzymatischen Analyse konnte geschlossen werden, daß diese Probe etwa 8% freies p-Nitrophenylmaltohexosid enthielt.
Alpha-Amylase-Analyse
Eine Substratlösung wurde durch Auflösen von 12 mg der obigen Verbindung (1) in 12 ml von 50 mM Alpha-Beta-DL-Glycerin-P04, PH 7,0 ("Gly-P04"-Puffer) gelöst. Alpha-Glucosidase in 25% Glycerin (1,975 Einheiten/ml) wurden von der Firma DuPont Company und Glucoamylase wurde von der Firma Nova Company bezogen, in üblicher Weise gereinigt und mit destilliertem Wasser wiederhergestellt, wobei man 100 Einheiten/ml Arbeitslösung erhielt. Die als Standard verwendete Amylase war Sigma Enzyme Control 2E.
In eine Anzahl von Küvetten mit einer Weglänge von 1 cm wurden jeweils 0,9 ml Substratlösung, 0,0127 ml Alpha-Glucosidase-Vorratslösung und 0,10 ml Glucoamylase Vorrat slösung eingefüllt. Die Küvetten wurden bei 370C in einem mit fortlaufender Aufzeichnung arbeitenden Spektrophotometer vorinkubiert, dann wurde der Alpha-Amylase-Standard in die jeweiligen Küvetten eingebracht und die Änderung der optischen Dichte wurde bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse vom linearen Teil (nach etwa 2,5 Minuten) sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Menge der Differenz Gesamt Differenz
zugesetzten der opt. volumen der opt.
Standard- Dichte Dichte/min
Alpha-Amylase pro Min. χ Volumen
10 μΐ 0,028 1,023 ml 0,029
25 μΐ 0,066 1,038 ml 0,069
50 μΐ 0,1 32 1,063 ml 0,140
75 μΐ 0,184 1,088 ml 0,200
1 00 μΐ 0,231 1,113 ml 0,2 57
Die Daten aus der obigen Tabelle wurden für die Herstellung der Diagramme gemäß Fig. 1 und 2 verwendet. Fig. 1 zeigt eine im wesentlichen lineare Beziehung zwischen der Menge an Alpha-Amylase und der optischen Dichte-Differenz nur 1 bis 2 Minuten nach der Einleitung der Reaktion bei 5 Volumina. Das Diagramm der Fig. 2 ist bezüglich des Volumens korrigiert und zeigt, daß ein linearer Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentration und der Änderung oder Differenz der optischen Dichte besteht.
Reagenzeinheit
Die bei dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren verwendeten Reagenzien werden vorzugsweise in Form einer Reagenzeinheit zur Verfügung gestellt, die die folgenden, in einem einzigen Behälter, z. B. einer Glasflasche gemischten Bestandteile enthält:
- Blockiertes, markiertes Substrat, vorzugsweise mit 6 oder 7 Glucoseeinheiten,
- Glucoamylase,
- Alpha- oder Beta-Glucosidase,
- Aktivator, vorzugsweise eine Quelle für Cl~-Ionen, z.B. NaCl oder KCl, in einer Konzentration von ungefähr 5OmM,
- Puffer, z.B. PIPES oder HEPES, mit einer Konzentration von etwa 50 mM,
- Ein Anti-Glucoseinterferenzmittel, vorzugsweise Hexokinase (etwa 10 Einheiten/ml); ATP (etwa 5 mg/ml) und MgCl2 (etwa 10 mM).
Substrat, Gluco-Amylase und Alpha- und/oder Beta-Glucosidase werden in Mengen verwendet, die denen bei den bekannten Alpha-Amylase-Analysen vergleichbar sind. Die übrigen der aufgeführten Bestandteile sind konventionell .
Um eine Urin- oder Serumprobe auf Alpha-Amylase zu analysieren, werden der Reagenzeinheit Wasser sowie die Probe zugesetzt und die optische Dichte oder die Fluoreszenz werden gemessen und mit einem Standard verglichen.
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Claims (22)

11856 Dr.v.B/Schä/30 U.S.Ser.No. 634,873 AT: 26. Juli 1984 Genzyme Corporation, 75 Kneeland Street, Boston, Mass., V.St.v.A. Verfahren und Reagenzeinheit zum Bestimmen von Alpha-Amylase PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Bestimmen der Menge an Alpha-Amylase in einer flüssigen Probe mittels eines Oligosaccharid-Substrats für Alpha-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat
- mindestens drei Glucoseeinheiten enthält,
- die Glucoseeinheit am reduzierenden Ende über eine durch Alpha- oder Beta-Glucosidase spaltbare Bindung mit einer Markierungsgruppe (Label) gebunden ist, welche bei Spaltung der Bindung eine optisch meßbare Veränderung erfährt, und
- an die endständige Glucoseeinheit ein Blockierungssubstituent gebunden ist, der eine Spaltung durch Exo-Enzyme der Bindung zwischen der endständigen Glucoseeinheit und
der benachbarten Glucoseeinheit hemmt;
daß die Probe mit dem Oligosaccharid-Substrat und einem ersten Exo-Enzym, das die Bindung zwischen der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende und der Markierungsgruppe zu spalten vermag, in Berührung gebracht wird und
daß die optisch meßbare Änderung als Maß für die Menge der in der Probe enthaltenen Alpha-Amylase gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Markierungsgruppe ein Chromophor, ein Fluorophor, ein chemolumineszierender Substituent oder ein bioJumineszierender Substituent ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das erste Exo-Enzym Alpha-Glucosidase enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das erste Exo-Enzym Beta-Glucosidase enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das erste Exo-Enzym eine Mischung von Alpha-Glucosidase und Beta-Glucosidase enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Probe außerdem mit einem zweiten Exo-Enzym in Berührung gebracht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Exo-Enzym unabhängig von der Substratkettenlänge sowie unfähig, die Bindung zwischen der Markierungsgruppe und der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende zu spalten, ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Exo-Enzym Glucoamylase enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Exo-Enzym gleichzeitig mit der Probe in Berührung gebracht werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das erste Exo-Enzym Alpha- oder Beta-Glucosidase enthält und das zweite Exo-Enzym Glucoamylase enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromophor p-Nitrophenol oder o-Nitrophenol enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Fluorophor ein Cumarinderivat enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß das Cumarinderivat 4-Methylumbelliferon enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,
daß die Markierungsgruppe Luciferin enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Blockierungs-Substituent eine Benzy]iden-Gruppe enthält.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat höchstens acht Glucoseeinheiten enthält.
17- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat sechs Glucoseeinheiten enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat sieben Glucoseeinheiten enthält.
19. Reagenzeinheit für die Alpha-Amylasebestimmung nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet durch ein Oligosaccharid-Substrat für Alpha-Amylase, welches mindestens drei Glucoseeinheiten enthält, mit der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende über eine durch Alpha- oder Beta-Glucosidase spaltbare Bindung mit einer Markierungsgruppe (Label) gebunden ist, welche bei Spaltung der Bindung eine optisch meßbare Änderung erfährt, und an dessen End-Glucoseeinheit ein Blockierungssubstituent gebunden ist, der eine Spaltung durch Exo-Enzyme der Bindung zwischen der End-Glucoseeinheit und der benachbarten Glucoseeinheit verhindert, und durch ein erstes Exo-Enzym, das die Bindung zwischen der Glucoseeinheit am reduzierenden Ende und der Markierungsgruppe zu spalten vermag.
20. Reagenzeinheit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie noch ein zweites Exo-Enzym enthält.
21 . Reagenzeinheit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeich net, daß das zweite Exo-Enzym Glucoamylase und das erste Exo-Enzym Alpha- oder Beta-Glucosidase oder eine Mischung hiervon ist.
22. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 19, 20 oder
21. dadurch gekennzeichnet, daß die Bestandteile in einem einzigen Reagenzbehälter in Mischung enthalten sind.
DE19853526829 1984-07-26 1985-07-26 Verfahren und reagenzeinheit zum bestimmen von alpha-amylase Ceased DE3526829A1 (de)

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EP (1) EP0171960B1 (de)
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