DE4338375C2 - Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität - Google Patents

Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestim­ mung der α-Amylaseaktivität und ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Verwendung, die als Substrat ein Maltooligosaccharidderivat mit 2 bis 4 Gluco­ seeinheiten und einer β-Galactopyranosylgruppe in 4- oder 6- Stellung der nicht-reduzierenden endständigen Glucoseeinheit aufweist und das vorzugsweise kein Hilfsenzym enthält. Zu­ sätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität unter Verwendung des Reagenzes.
Verschiedene Erkrankungen wurden üblicherweise durch Bestim­ mung der α-Amylaseaktivität in Körperflüssigkeit, wie Pankreassaft und Urin diagnostiziert. Die Verfahren zur Be­ stimmung der α-Amylaseaktivität werden beispielhaft nachste­ hend ausgeführt.
(1) Ein Verfahren unter Verwendung eines Maltooligosaccha­ rids (beispielsweise Maltotetraose, Maltopentaose, Mal­ tohexaose) als Substrat
Gemäß diesem Verfahren läßt man das Maltooligosaccharid und ein Hilfsenzym, wie α-Glucosidase mit einer α-Amylase ent­ haltenden Probe unter Freisetzung von Glucose aus dem Sub­ strat reagieren und die α-Amylaseaktivität wird durch Messen der Menge an freigesetzter Glucose ermittelt. Die Verfahren zur Messung der freigesetzten Glucose schließen beispiels­ weise ein Verfahren unter Verwendung eines Glucoseoxi­ dase/Peroxidase/Indikatorsystems, ein Verfahren unter Ver­ wendung eines Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase­ systems und ein Verfahren unter Verwendung eines Hexoki­ nase/Phosphoglucomutase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase/- NADH-Systems ein. Ein Reagens, das in einem Behälter α-Glu­ cosidase und ein Substrat enthält, zeigt jedoch eine schlechte Stabilität, da α-Glucosidase langsam mit dem Substrat reagiert und somit einen erhöhten Blindwert hervor­ ruft.
(2) Ein Verfahren unter Verwendung eines Derivats, bei dem eine Phenyl- oder Naphthylgruppe oder ein Derivat davon als Aglycongruppe an das reduzierende Ende des Maltooli­ gosaccharids gebunden ist
Gemäß diesem Verfahren werden das Maltooligosaccharidderivat und ein Hilfsenzym wie α-Glucosidase mit einer α-Amylase enthaltenden Probe unter Freisetzung des Aglycons aus dem Substrat umgesetzt und die α-Amylaseaktivität wird optisch durch Messen des freigesetzten Aglycons ermittelt.
Beispiele des bei diesem Verfahren verwendeten Substrats sind p-Nitrophenylmaltopentaosid, p-Nitrophenylmaltohexao­ sid, p-Nitrophenylmaltoheptaosid, 2,4-Dichlorphenylmaltopen­ taosid und 2-Chlor-4-nitrophenylmaltopentaosid.
Dieses Verfahren unterliegt ebenfalls dem vorstehend genann­ ten Nachteil, daß die α-Glucosidase langsam mit dem Substrat unter Erhöhen des Blindwertes reagiert.
Darüber hinaus erfordern beide Verfahren (1) und (2) die Verwendung eines Hilfsenzyms, das hohe Herstellungskosten verursacht.
(3) Ein Verfahren unter Verwendung eines Maltooligosaccha­ ridderivats als Substrat, wobei die Hydroxylgruppe(n) in 4- und/oder 6-Stellung(en) der nicht-reduzierenden end­ ständigen Glucoseeinheit davon mit einem Substituent(en) substituiert ist(sind) und die reduzierenden Enden davon mit einer Phenyl- oder Naphthylgruppe oder einem Derivat davon als Aglycon verbunden sind
Gemäß diesem Verfahren werden das Maltooligosaccharidderivat und ein Hilfsenzym wie α-Glucosidase mit einer α-Amylase enthaltenden Probe unter Freisetzung des Aglycons aus dem Substrat umgesetzt und die α-Amylaseaktivität optisch durch Messung des freigesetzten Aglycons wie in (2) ermittelt.
Spezielle Beispiele des Substrats sind ein Substrat, bei dem die Hydroxylgruppe in 6-Stellung der nicht-reduzierenden endständigen Glucoseeinheit beispielsweise mit einem Halo­ genatom oder einer Glucopyranosylgruppe substituiert wurde (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 237998/1985), ein Substrat, bei dem die Hydroxylgruppen in den 4- und 6-Stellungen mit einem Alkyl- oder Alkanoylrest oder einer Phenylgruppe substituiert wurden (US-Patent­ schriften Nr. 4 709 020, 4 818 692, 4 987 067), und ein Sub­ strat mit 4 bis 7 Glucoseeinheiten, worin die Hydroxylgruppe in 4- oder 6-Stellung mit einer β-Galactopyranosylgruppe blockiert wurde (japanische ungeprüfte Patentveröffentli­ chung Nr. 264596/1991). Der vorstehend genannte Nachteil bei den Verfahren (1) und (2), nämlich daß die α-Glucosidase sich mit dem Substrat langsam unter Erhöhung des Blindwertes umsetzt, wurde theoretisch überwunden, indem die Hydroxyl­ gruppe in 4- oder 6-Stellung der nicht-reduzierenden end­ ständigen Glucoseeinheit des Maltooligosaccharids blockiert wurde. Praktisch sind diese Substrate jedoch immer noch zu einem gewissen Ausmaß für einen erhöhten Blindwert aufgrund Zersetzung durch α-Glucosidase anfällig, da in kleinen Men­ gen Verunreinigungen mit einer nicht blockierten, nicht re­ duzierten Endgruppe enthalten sind. Das Verfahren (3) führt auch zu hohen Herstellungskosten aufgrund der Verwendung eines Hilfsenzyms.
(4) Ein Verfahren unter Verwendung von 2-Chlor-4-nitrophe­ nylmaltotriosid als Substrat (US-Patentschriften Nr. 4 963 479, 5 158 872)
Dieses Verfahren erfordert kein Hilfsenzym und ist wirt­ schaftlich. Es zeigt einen geringen Anstieg beim Blindwert. Die Empfindlichkeit ist jedoch unzureichend.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Mängel üblicher Substrate zur Bestimmung der α- Amylaseaktivität und die Mängel üblicher Reagenzien zur Be­ stimmung der α-Amylaseaktivität zu beseitigen. Die Aufgabe der Erfindung ist daher die Verwendung eines hochempfindlichen Reagenzes zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität, wobei das Reagens eine hohe Affinität zu α-Amylase aufweist und kein Hilfsenzym erfordert, wodurch die Herstel­ lungskosten niedrig gehalten werden und die Stabilität des Reagenzes aufgrund der Vermeidung von Substratzersetzung durch das Hilfsenzym ausgezeichnet ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität, das bei hoher Empfindlichkeit vorzugsweise keine Hilfsenzyme er­ fordert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Maltooligosaccha­ ridderivat der nachstehenden Formel
in der einer der Reste R1 und R2 eine β-Galactopyranosyl­ gruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom dar­ stellt, R3 eine Gruppe darstellt, die an die reduzierende endständige Glucoseeinheit über eine durch α-Amylase spalt­ bare Bindung gebunden ist und die nach Spaltung der Bindung zu einem meßbaren Stoff wird, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeutet, ohne Hilfsenzyme zur Bestim­ mung der α-Amylaseaktivität.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität in einer Probe, umfas­ send die Schritte
  • a) Versetzen der Probe mit einem Maltooligosaccharidderivat der Formel
    (in der einer der Reste R1 und R2 eine β-Galactopyrano­ sylgruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom darstellt, R3 eine Gruppe darstellt, die an die reduzie­ rende endständige Glucoseeinheit über eine durch α- Amylase spaltbare Bindung gebundene ist und die nach Spaltung der Bindung zu einem meßbaren Stoff wird, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeutet), unter Umsetzung des Maltooligosaccharidderivats mit α-Amylase und
  • b) Messung der Menge an freigesetztem meßbaren Stoff.
Das Verfahren wird in Abwesenheit eines Hilfsenzyms durchgeführt.
Der Maltooligosaccharidanteil des Maltooligosaccharidderi­ vats (I) in der vorliegenden Erfindung besteht aus 2 bis 4 Glucoseeinheiten. Spezielle Beispiele davon sind Maltose, Maltotriose und Maltotetraose. Insbesondere sind Verbindun­ gen mit zwei Glucoseeinheiten (n = 0) bevorzugt.
Die durch die Reste R1 oder R2 wiedergegebene Galactopyrano­ sylgruppe (die eine modifizierende Gruppe für die nicht-re­ duzierende endständige Glucoseeinheit des Maltooligosaccha­ rids darstellt), ist an die Hydroxylgruppe in 4- oder 6- Stellung der nicht-reduzierenden endständigen Glucoseeinheit über eine β-Bindung gebunden. Beispiele der Substrate, deren 4- oder 6-Stellung der nicht-reduzierenden endständigen Glu­ coseeinheit modifiziert wurden, sind jene, bei denen die Hy­ droxylgruppe in 6-Stellung mit einer Glucopyranosylgruppe substituiert wurde, und jene, bei denen die Hydroxylgruppe in 4- oder 6-Stellung mit einer Alkyl-, Alkanoyl- oder Phe­ nylgruppe substituiert wurde. Diese modifizierten Substrate werden unter natürlichen Substraten nicht gefunden. Die Ga­ lactopyranosylgruppe ist den vorstehend genannten modifizie­ renden Gruppen hinsichtlich der Affinität für α-Amylase überlegen.
Das reduzierende Ende des Maltooligosaccharids weist eine Gruppe R3 auf, die an die reduzierende endständige Gluco­ seeinheit über eine durch α-Amylase spaltbare Bindung gebun­ den ist, und die nach Spaltung der Bindung zu einem meßbaren Stoff wird (R3 wird daher forthin als Aglycon bezeichnet). R3 ist an die Hydroxylgruppe in 1-Stellung der reduzierenden endständigen Glucoseeinheit über eine α-glycosidische Bin­ dung gebunden. Beispiele des durch R3 dargestellten Restes sind Phenylreste mit Substituenten wie einer Nitrogruppe und/oder Halogenatomen, beispielsweise eine p-Nitrophenyl-, o-Nitrophenyl-, 2-Chlor-4-nitrophenyl- oder 2,4-Dichlorphe­ nylgruppe) und lumineszierende Gruppen, wie eine 4-Methyl­ umbelliferylgruppe. Von diesen ist die 2-Chlor-4-nitrophe­ nylgruppe hinsichtlich der Meßempfindlichkeit bei etwa pH 7, dem optimalen pH-Wert für α-Amylase, überlegen.
Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Maltooligo­ saccharidderivat der Formel (I) wird beispielhaft wiederge­ geben durch die Verbindungen der Formel
in der R1, R2 und n wie vorstehend definiert sind und R4 ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenatomen, Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, der Gruppe -OR5 und -COOR5 bedeutet (R5 stellt einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen dar).
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ein Halogenatom ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom. Alkylreste können verzweigt oder unverzweigt vorliegen und sind beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl- oder Hexylgruppen, vorzugsweise jene mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Beispiele für Maltooligosaccharidderivate der Formel (I) sind
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid,
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid,
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotrio­ sid,
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotriosid,
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotetra­ osid, und
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotetraosid. Bevorzugt sind Maltooligosaccharidderivate mit 2 Glucoseein­ heiten (n = 0), und insbesondere bevorzugt ist 2-Chlor-4- nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Maltooligo­ saccharidderivat (I) kann in üblicher Weise beispielsweise durch ein Verfahren, das in der japanischen ungeprüften Pa­ tentveröffentlichung Nr. 264596/1991 offenbart ist, herge­ stellt werden. Das Maltooligosaccharidderivat (I) kann bei­ spielsweise durch Umsetzen eines eine an die reduzierende endständige Glucoseeinheit gebundene 2-Chlor-4-nitrophenyl­ gruppe aufweisenden Maltooligosaccharidderivats (III), wie­ dergegeben durch die Formel
in der n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeutet, mit Lactose in Gegenwart von β-Galactosidase hergestellt werden, wodurch die β-Galactopyranosylgruppe am nicht-reduzierenden Ende des Maltooligosaccharidderivats (III) eingeführt wird.
Alternativ dazu kann das Galactopyranosylmaltooligosaccha­ ridderivat wie nachstehend hergestellt werden. Ein Maltooligosaccharid wie Maltose, Maltotriose oder Maltotetraose wird mit Lactose in Gegenwart von β- Galactosidase umgesetzt, wodurch eine β- Galactopyranosylgruppe am nicht-reduzierenden Ende des Maltooligosaccharids unter Bereitstellung eines Galactopyranosylmaltooligosaccharids eingeführt wird. Das Galactopyranosylmaltooligosaccharid wird anschließend in Essigsäureanhydrid in Gegenwart eines basischen Katalysators (beispielsweise Pyridin, Natriumacetat) bei Raumtemperatur unter Erwärmen acetyliert. Anschließend wird die erhaltene acetylierte Verbindung in Gegenwart oder Abwesenheit eines anorganischen Lösungsmittels zusammen mit einem alkalischen Stoff, Essigsäureanhydrid und einem Phenol wie 2-Chlor-4- nitrophenol unter Einführung der Phenylgruppe am reduzierenden Ende erwärmt. Danach wird die so erhaltene Verbindung in Methanol unter Verwendung einer katalytischen Menge Natriummethylat in bekannter Weise entacetyliert.
Das Reagens zur Bestimmung der α- Amylaseaktivität enthält das vorstehend genannte Maltooligosaccharidderivat (I) als Substrat. Die Abwesenheit eines Hilfsenzyms ist zwingend.
Das erfindungsgemäße Reagens kann zusätzlich Puffer umfassen. Beispiele der Puffer sind Good-Puffer, wie PIPES- Puffer und verschiedene andere Puffer, die Pufferkapazität bei etwa pH 7,0 aufweisen.
Das Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität gemäß vorliegender Erfindung umfaßt die Schritte
  • 1. Umsetzen einer α-Amylase enthaltenden Probe mit dem vorstehend genannten Maltooligosaccharidderivat (I) in Abwesenheit eines Hilfsenzyms unter Umsetzung des Maltooligosaccharidderivats mit α-Amylase; und
  • 2. Messen des freigesetzten meßbaren Stoffes.
Die Umsetzung des Maltooligosaccharidderivats und der α- Amylase wird unter den gleichen Bedingungen wie für eine übliche Bestimmung der α-Amylaseaktivität unter Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats als Substrat ausgeführt. Die Reaktion wird beispielsweise bei 25 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 8 für etwa 1 bis 20 Minuten durchgeführt.
Wenn das Aglycon eine Extinktionsänderung nach Aufspaltung durch α-Amylase verursacht, wird die Extinktionsänderung gemessen. Wenn das Aglycon eine Fluoreszenzänderung nach der Aufspaltung zeigt, wird die Fluoreszenzänderung gemessen. Beispielsweise, wenn das Aglycon 2-Chlor-4-nitrophenol ist, wird eine Extinktionsänderung bei etwa 400 nm gemessen.
Das Reaktionsschema der Substratspaltung bei der erfindungsgemäßen Bestimmung der α-Amylaseaktivität ist nachstehend mit Bezug auf 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D- galactopyranosyl-α-maltosid als Substrat dargestellt. Wie nachstehenden Reaktionsformeln entnehmbar, ist kein Hilfsenzym erforderlich, da das Substrat direkt durch α- Amylase gespalten wird.
Die Messung des in vorstehend ausgewiesener Umsetzung freigesetzten Aglyconanteils mit einer geeigneten Vorrichtung erlaubt die Bestimmung der α-Amylaseaktivität. In dem vorstehend angeführten Beispiel wird das Absorptionsspektrum des freigesetzten 2-Chlor-4-nitrophenols direkt gemessen. Das Verfahren zur Messung von 2-Chlor-4- nitrophenol schließt beispielsweise eine Ermittlung der Geschwindigkeit durch kontinuierliches Verfolgen der α- Amylasereaktion und die Endpunktermittlung, bei der die Messung bis zum Ablauf eines bestimmten Zeitraums der Umsetzung erfolgt, ein.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der α- Amylaseaktivität ist nicht auf die Verwendung zur Bestimmung von α-Amylase in Körperflüssigkeit beschränkt, sondern ist ebenfalls zur Bestimmung von Calciumionen oder Chloridionen in einer Probe anwendbar, und erfolgt über die Bestimmung der α-Amylaseaktivität.
Die erfindungsgemäße Verwendung erfordert kein Hilfsenzym wie α-Glucosidase, β-Glucosidase oder Glucoamylase und ist stabil, da das Substrat nicht der Spaltung durch die vorstehend genannten Hilfsenzyme ausgesetzt ist. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Substrat weist starke Affinität zu α-Amylase auf. Die Verwendung und das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen es, α-Amylaseaktivität bei hoher Empfindlichkeit zu bestimmen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Substrat weist eine Galactopyranosylgruppe als modifizierende Gruppe für das nicht-reduzierende Ende auf, was ziemlich getreu die Wirkungsweise der α-Amylase wiederspiegelt, wobei Glucoseketten von Stärke oder Amylose erkannt werden und deren Bindungen aufgespalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch erläuternde Beispiele genauer ausgeführt.
Beispiel
Die Reagenzien zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität, die die nachstehende Zusammensetzung aufweisen, wurden unter Verwendung der in nachstehend angeführter Tabelle I ausgewiesenen Substrate (Beispiel A und Beispiel B) hergestellt.
Reagenszusammensetzung:
50 mMol Goodpuffer (pH 7,0)
CaCl2: 1 mM
Substrat: 2 mM
Für Vergleichsbeispiele wurden Reagenzien ähnlich zu den vorstehend angeführten unter Verwendung der in nachstehend angeführter Tabelle I ausgewiesenen Substrate (Vergleichs­ beispiel A-1, Vergleichsbeispiel A-2, Vergleichsbeispiel B- 1, Vergleichsbeispiel B-2) hergestellt.
Tabelle I
Substrat
Beispiel A 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid
Vergleichsbeispiel A-1 3-Ketobutyliden-2-chlor-4-nitrophenyl-α-maltosid
Vergleichsbeispiel A-2 2-Chlor-4-nitrophenyl-α-maltotriosid
Beispiel B p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid
Vergleichsbeispiel B-1 3-Ketobutyliden-p-nitrophenyl-α-maltosid
Vergleichsbeispiel B-2 p-Nitrophenyl-α-maltotriosid
Versuchsbeispiel Bestimmung der α-Amylaseaktivität
Drei Serumformen, nämlich Serum 1, 2 und 3 (jeweils 0,25 ml) wurden jeweils zu 3 ml Reagens, hergestellt gemäß vorstehend genannten Beispielen und Vergleichsbeispielen, gegeben und die Gemische dann bei 37°C für 3 Minuten belassen. Die Extinktionsänderung bei 415 nm wurde dann gemessen und auf dieser Grundlage die Extinktionsänderungen pro Minuten berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt, die ebenfalls die Extinktionsänderungen pro Minute der Blindprobe ausweist.
Tabelle II
Wie in Tabelle II dargestellt, zeigt ein Vergleich der Ergebnisse von Beispiel A und Vergleichsbeispiel A-1 und ein Vergleich der Ergebnisse von Beispiel B und Vergleichsbeispiel B-1, daß die β-Galactopyranosylgruppe hinsichtlich der Affinität für α-Amylase überlegen ist und daher als Modifizierungsgruppe für das nicht-reduzierende Ende bevorzugt ist.
Darüber hinaus zeigen der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel A und Vergleichsbeispielen A-1 und A-2 und der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel B und Vergleichsbeispielen B-1 und B-2, daß das erfindungsgemäße Reagens eine hohe Bestimmungsempfindlichkeit aufweist.

Claims (8)

1. Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats der nachstehenden Formel,
in der einer der Reste R1 und R2 eine β- Galactopyranosylgruppe bedeutet und der andere ein Wasserstoffatom darstellt, R3 eine Gruppe darstellt, die an die reduzierende endständige Glucoseeinheit über eine durch α-Amylase spaltbare Bindung gebunden ist und die nach Spaltung der Bindung zu einem meßbaren Stoff wird, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeutet, ohne Hilfsenzyme zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität.
2. Verwendung nach Anspruch 1, zusätzlich einen Puffer umfassend.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Maltooligosaccharidderivat eine Verbindung der Formel
darstellt, wobei R1 und R2 wie in Anspruch 1 definiert sind, R4 ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogenatome, Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, -OR5 und -COOR5, bedeutet (R5 ist ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeutet.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei n 0 bedeutet.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Maltooligosaccharidderivat ausgewählt ist aus:
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α- maltosid,
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid,
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α- maltotriosid,
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotriosid,
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α- maltotetraosid und
p-Nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltotetraosid.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Maltooligosaccharidderivat 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β- D-galactopyranosyl-α-maltosid ist.
7. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Maltooligosaccharidderivat p-Nitrophenyl-4-O-β-D- galactopyranosyl-α-maltosid ist.
8. Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität in einer Probe, umfassend die Schritte:
  • a) Versetzen einer α-Amylase enthaltenden Probe mit einem Maltooligosaccharidderivat wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ohne Hilfsenzym und
  • b) Messen der Menge an freigesetztem meßbarem Stoff.
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