DE69023710T2

DE69023710T2 - Verfahren zur bestimmung von enzymatischer wirksamkeit.

Info

Publication number: DE69023710T2
Application number: DE69023710T
Authority: DE
Inventors: Ryuki Hisada; Hideto Shibata; Tatsuhiko Yagi
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1989-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2010-02-24
Also published as: WO1990010084A1; EP0411159B1; EP0411159A4; EP0411159A1; DE69023710D1

Description

Die Erfindung betrifft einen Test zur Bestimmung der Enzymaktivität. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität, welches die Verwendung eines Substrats mit einer 3,4-Dinitrophenoxygruppe am Ende eines Moleküls umfaßt, zur Bestimmung der Aktivität von N-Acetyl-β-D-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-D- hexosaminidase, der Aktivität einer sauren Phosphatase, von β-D-Glucuronidase oder β-D-Galctosidase. In dem Verfahren wird die Anzeige (Absorption) des 3,4-Dinitrophenols, welches aus dem Substrat gebildet wird, gemessen.
Zur Durchführung einer Aktivitätsbestimmung von N-Acetyl- β-D-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-D-hexosaminidase (nachfolgend abgekürzt als Nagase), die unverzichtbar zur frühen Diagnose von verschiedenen Nierenkrankheiten wie Störungen der Harnkanälchen und diabetische Nierenstörungen ist, ist die Verwendung von p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid mit einer p-Nitrophenoxygruppe am Ende eines Moleküls als Substrat (mit p-Nitrophenol als Aglycon bekannt), wobei die Quantifizierung durch colorimetrische Bestimmung des bei der Wirkung des Enzyms Nagase freigesetzte p-Nitrophenol (Aglycon) in einem hohen pH-Bereich bestimmt wird (method in Enzymology, Vol. 28, p. 772-776). Auch wird ein Verfahren eingesetzt in den m-Kresolsulfophthaleinyl- N-acetyl-β-D-glucosaminid als das Substrat verwendet wird (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 58-994, Rinsho Byori (Clinical Pathology) XXXI: 2179 (1993)).
Obwohl das pH-Wertoptimum für die NAGase-Enzymwirkung bei etwa 5 im sauren Bereich liegt, zeigen p-Nitrophenol und ähnliche keine erforderliche Farbbildung anders als im alkalischen Bereich eines pH-Werts von 8 oder mehr. Folglich müssen zur Bestimmung der Aktivität des Enzyms Nagase in allen Fällen die Arbeitsstufen des Vermischens des Enzyms und des Substrat zur Initiierung der Reaktion, des Abstoppens der Reaktion durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung nach einer bestimmten Zeit und der spektrophotometrischen Untersuchung des Reaktionsgemischs durchgeführt werden und somit tritt der Nachteil auf, daß eine Geschwindigkeitsanalyse durch Untersuchung bei geeigneten Bedingungen (d.h. Geschwindigkeitsbestimmung) nicht durchgeführt werden kann. Zur Durchführung von Geschwindigkeitsbestimmungen wurden folglich Versuche unternommen, ein N-Acetyl-β-D-glucusaminidsubstrat mit einer Verbindung (Aglycon) bereitzustellen, das in ein daran gebundenes p-Nitrophenol umgewandelt werden kann, welches bei etwa pH 5 im sauren Bereich einen Farbstoff bildet, wenn eine adäquate Nagase-Aktivität vorliegt. Zu diesem Zweck wurden die folgenden Nitroverbindungen als Aglycon vorgeschlagen (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61-177999):
(a) 2,4-Dinitrophenol (J. Biol. Chem., Vol. 255, p. 11861-11869, 1980);
(b) 2-Chor-4-nitrophenol (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61-112092;
(c) 2,5-Dinitrophenol;
(d) 2,6-Dichlor-4-nitrophenol;
(e) 2,6-Dibrom-4-nitrophenol;
(f) 2,3,6-Trichlor-4-nitrophenol;
(g) 2,3,5,6-Tetrachlor-4-nitrophenol;
(h) 2,3,5,6-Tetrachloro-4-Nitrophenol;
(i) 7-Sulfo-2,4-dinitro-1-naphthol (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61-177999).
Da alle oben genannten Verbindung in Nachbarstellung zur phenolischen Hydroxylgruppe durch eine sperrige elektronenziehende Gruppe substituiert sind, um die Säurestärke und Ionenbildungsneigung bei geringen pH-Wert zur Farbbildung zur verstärken, wurde von solchen Substraten, die diese (als Aglycon) am Ende eines Moleküls gebunden haben, erwartet, daß sie den oben genannten Nachteil, den das p-Nitrophenol besitzt, kompensieren.
Dennoch sind diese durch die Reaktion dieser sauren Aglyca und von N-Acetyl-β-D-glycosamin erhaltenen synthetischen Substrate insoweit problematisch, als daß sie alle in Wasser schwer löslich sind, keine befriedigende Farbbildung unter Ionisierung bei einem geringen pH-Wert zeigen, per se instabil sind und bei Enzymreaktionen Probleme wegen ihrer sperrigen Substituenten in der 2-Position verursachen. Beispielsweie ist 2-Chlor-4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D- glucosaminid in Wasser schwer zu lösen, ist deshalb als Substrat nicht ausreichend gelöst und somit ist das Verfahren zur Herstellung des Reagens und die Testgenauigkeit in erheblichein Ausmaß nachteilig beeinflußt und ein befriedigendes Testverfahren kann zur praktischen Durchführung nicht erzielt werden.
Auch kann ein 2,4-Dinitrophenyl-N-acetyl-β-D- glucosaminid-Substrat nur schwierig synthetisiert werden und seine Ausbeute beträgt meist nur 5 %, auch wenn ein Syntheseverfahren eingesetzt wird, das aufgrund einer Untersuchung der verschiedenen Reaktionsbedingungen als besonders geeignet betrachtet wird. Dies rührt her von der Instabilität dieser Substanz und äußerste Vorsicht muß angewendet werden, um die Hydrolyse auch während der Umkristallisation in der letzten Stufe zu vermeiden (supra, J. Biol. Chem., Vol. 255, p. 11861-11869, 1980).
Wie oben beschrieben wurden die Probleme bezüglich der Nagase durch die verschiedenen bisher vorgeschlagenen in p-Nitrophenol umwandelbaren Nitrophenol-Verbindungen nicht gelöst.
Die Enzyme und deren Substrate, zu denen der Stand der Technik zuvor beschrieben wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Enzyme Substrate N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (Hexosaminidase) α-D-Glucosidase β-D-Glucosidase β-D-Galactosid Phosphatase β-D-Glucuronid Esterase Allylsuphatase p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (Hexosaminid) p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid p-p-Nitrophenyl-β-D-galactosid p-Nitrophenylphosphoricsäure p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronid p-Nitrophenylaceticsäure p-Nitrophenylsulfuricsäure
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, in dem das Substrat ausreichend wasserlöslich und stabil ist, wenn es als Substrat zur Bestimmung von Nagase oder Phosphatase, β-Galactosidase und β- Glucoronidase auf der Basis deren Reaktionsgeschwindigkeit verwendet wird und ferner eine außergewöhnliche Farbbildungsfähigkeit und quantitative Umsetzung im sauren pH-Bereich zeigt und worin das aus dem eingesetzten Substrat gebildete 3,4-Dinitrophenol gemessen wird (Absorption).
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von einem der Enzyme N-Acetyl-β-D- glucosaminidase oder N-Acetyl-β-D-hexosaminidase, einer sauren Phophatase, β-D-Galactosidase oder β-D-Glucoronidase bereitgestellt, umfassend die Bestimmung der Farbbildung (Absorption) von 3,4-Dinitrophenol welches durch Wirkung eines Enzyms auf ein Substratmolekül mit einer 3,4-Dinitrophenoxy-Gruppe am Ende des Moleküls gebildet wird. Beispiele des erf indungsgemäßen Verfahrens schließen eine Bestimmung der N-Acetyl-β-D-glucosaminidase- oder N-Acetyl-β-D- hexosaminidase-Aktivität oder die Aktivität der sauren Phosphatase in einer Probe von einem lebenden Körper ein und eine Bestimmung der Aktivität von β-Galactosidase oder Phosphatase, die als geeignetes Markerenzym zu verwenden sind und macht Gebrauch von einem Substrat mit einer 3,4-Dinitrophenoxygruppe am Ende eines Moleküls. Die begleitende Zeichnung, Figur 1, ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen der Menge des Enzyms (Nagase) und der Absorptionsänderung in Beispiel 3 zeigt.
Intensive Entwicklungsarbeiten wurden im Hinblick auf den Elektronenstatus eines Benzolrings unternommen und im Hinblick auf die stereospezifische Reaktionsfähigkeit, um eine Nitrophenolverbindung anstelle des oben beschriebenen p-Nitrophenols zu erhalten, und es wurde festgestellt, daß 3,4 Dinitrophenol für den oben genannten Zweck geeignet ist, weil dieses Derivat die erforderliche Azidität aufweist und keinen sperrigen Substituenten in Nachbarstellung zur phenolischen Hydroxylgruppe besitzt, und verschiedene Substrate mit einem 3,4-Dinitrophenol am Ende des Moleküls synthetisiert und somit die Erfindung vervollständigt. Das erfindungsgemäß zu verwendende 3,4-Dinitrophenol ist eine bekannte Verbindung, die Synthese von N-Acetyl-β-D- glucosaminid mit dieser Verbindung (gebunden) am Ende eines Moleküls und auch deren Eigenschaften ist nicht bekannt. Ferner ist dessen Verwendung als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen aus einem lebenden Körper wie Nagase und Phosphatase und als Substrat zur Bestimmung der Aktiviät eines makierten Enzyms wie β-D- Galactosidase unbekannt.
Das erfindungsgemäß zu verwendende 3,4-Dinitrophenol ist nach Binden am Ende eines Substratmoleküls leicht löslich und kann als Enzymsubstrat ohne einen Lösungsvermittler eingesetzt werden. Insbesondere, wenn 3,4-Dinitrophenol am Ende von N-Acetyl-β-D-glucosaminid gebunden ist, kann eine wässrige Lösung mit einer Konzentration von 12 mM, die sehr gut anwendbar ist, hergestellt werden, wobei die Lösung bei geringen Temperaturen sehr lagerstabil ist. Demgegenüber hat beispielsweise 2-Chlor-4-nitrophenol einen pk-Wert von 5,5, aber 2-Chlor-4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamid, welches daraus hergestellt worden ist, ist schwer löslich, und wenn selbiges in einem Testkit eingesetzt wird, kann eine ausreichende Löslichkeit nur durch Zugabe von Lösungsvermittlern wie Cyclodextrin und Kronenether erreicht werden und deswegen ist dessen Einsatz als Reagens nicht befriedigend.
Durch Einführen einer 3,4-Dinitrophenylgruppe anstelle eines Substrats mit einer p-Nitrophenoxygruppe am Ende eines Moleküls, wie es Stand der Technik ist (mit beispielsweise p-Nitrophenol als Aglycon) verbessert die Erfindung (i) in einem großen Ausmaß die Löslichkeit und Stabilität (Lagerfähigkeit) des Substrats in einer wässrigen Lösung beim Wirkungs-pH-Wert des Enzyms (neutral oder sauer) und (ii) sorgt dafür, daß der Bestimmungs-pH-Wert (Absorptionsmessung) der Indikatorsubstanz (3,4-Dinitrophenol), die sich aus der Enzymreaktion ergibt, identisch oder nahe dem pH-Optimum des Enzyms liegt, und somit kann eine korrekte und präzise Geschwindigkeitsanalyse erhalten werden.

Beispiele

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele, ohne auf diese begrenzt zu sein, beschrieben.

Beispiel 1

Synthese des Substrats der NAGase, 3,4-Dinitrophenyl-N- acetyl-β-D-glucosaminid

Nach dem Verfahren von Hollemann (Redequil des Travaux) ausgehend von 20 g m-Nitrophenol über Nitrierung mit konzentrierter Salpetersäure und Trennung von den Nebenprodukten wurden 12 g reines 3,4 Dinitrophenol synthetisiert. Der Schmelzpunkt betrug 134 ºC, was dem Wert in der oben angegebenen Literatur entspricht.
Dann wurde aus 1 g des zuvor synthetisierten 3,4- Dinitrophenol ein Pulver aus Kalium-3,4-dinitrophenolat hergestellt und etwa 3 Stunden in trockenem Aceton mit 2 g 2-Acetamid-2-desoxy-3,4,6-Tri-O-acetyl-α-1-chlor-D- glucosaminid am Rückfluß gehalten, Aceton wurde abdestilliert, das kondensierte Produkt in Chloroform gelöst und nicht umgesetztes 3,4-Dinitrophenolat mit einem verdünnten Alkali entfernt, um 1,5 g des kondensierten Produkts zu erhalten, welches durch Umkristallisierung in Ethanol gereinigt wurde. Schließlich wurde das gereinigte kondensierte Produkt in Methanol gelöst und deacetyliert mit einer geringen Menge Natriuinmethylat als Katalysator, um im wesentlichen quantitativ 3,4-Dinitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamid zu erhalten, welches durch Umkristallisieren aus heißem Ethanol gereinigt wurde.
Das 3,4-Dinitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (nachfolgend auch als 3,4-DNG bezeichnet) wurde befunden, eine ausreichende Wasserlöslichkeit zur Verwendung als Substrat zu besitzen und eine wässrige Lösung einer Konzentration von 12 mM, die ausreichend für ein NAGase- Aktivitäts-bestimmungstest ist, läßt sich leicht herstellen.
Auch wurde die wässrige Lösung befunden unter Eiskühlung stabil zu sein, wobei nur etwa 1 % Zersetzung auftrat, wenn sie bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen wurde, und der Zersetzungsgrad unter Enzymreaktions- Bedingungen (pH 5, 37 ºC) über eine Stunde nur 1,5 % betrug. Das Spektrum zeigt eine starke UV-Absorption bei 290 nm, aber nahezu keine Absorption im sichtbaren Bereich von 400 nm und ist somit optisch in bemerkenswerter Weise unterscheidbar.

Beispiel 2

Synthese von 3,4-Dinitrophenyl-β-D-galactosid, 3,4- Dinitrophenyl-β-D-glucuronid und 3,4-Dinitroohenylphosphorsäure und enzymatische Reaktion

Unter Verwendung von 3,4-Dinitrophenol, hergestellt nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1, und 2,3,4,6- tetra-O-Acetyl-α-1-chlor-D-galactosid und 2,3,4-tri-O-Acetyl-α-1-chlor-D-glucuronid-6-methylester wurden 1,3 g und 0,7 g der kondensierten Produkte jeweils erhalten und nach Umkristallisieren aus Ethanol in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 deacetyliert und anschließend durch erneutes Umkristallisieren aus Ethanol gereinigt.
In gleicher Weise wurde 3,4-Dinitrophenol mit 2 g POCl&sub3; und 2 g H&sub3;PO&sub4; in Pyridin umgesetzt, um 1,5 g des kondensierten Produkts zu erhalten, welches durch Umkristallisieren als Natriumsalz gereinigt wurde.
Beide oben genannten Verbindung hatten Löslichkeiten von wenigstens 10 mM und die jeweiligen Enzymaktivitäten wurden mit Urin und Serum als Testproben untersucht, wobei die Substrate für eine Aktivitätsbestimmung von β- D-Galactosidase, β-D-Glucuronidase und Phosphatase in einem Phosphatpuffer 20 mM (pH 6,5) für Galactosidase (von E.Coli) und in einem 50 mM Acetatpuffer (pH 5,0) und in einem 40 mM Citratpuffer (pH 5,1) im Falle der Glucuronidase und sauren Phophatase verwendet wurden.

Beispiel 3

Bestimmung der NAG-Aktivität

Ein Reaktionsgemisch, enthaltend 1,5 ml eines 0,2 M Citratpuffers (pH 5) und 1,2 mM 3,4-DNG (aufgefüllt auf ein Volumen von 3 ml durch Hinzufügen einer Enzymlösung während der Reaktion) wurde bei 37 C äquilibriert, in ein Spektrophotometer eingesetzt und dann 100 ul einer NAGase-Lösung (Enzym der menschlichen Plazenta, hergestellt von Sigma, mit Aktivitätswerten entsprechend den Standarduntersuchungsverfahren, Method in Enzymology, Vol. 28, p. 772 - 776, bereitgestellt in 5 Konzentrationen von 0, und 50 U/Liter, 100 U/Liter, 200 U/Liter und 300 U/Liter) hinzugegeben und die Absorption im Laufe der Zeit bei einer Wellenlänge von 400 nm unmittelbar aufgenommen, um die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse zu erhalten. Eine proportionale Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit, korrigiert um die Kontrolle, und der Enzymmenge kann festgestellt werden, wodurch bestätigt wird, daß die Geschwindigkeitsbestimmung korrekt ermittelt wurde. Die Änderung der Absorption über die Zeit ohne Enzymzugabe (Kontrolle) zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit, und die anschließende Bestimmung wurde nach Aufnahme der Kontrolle fortgesetzt.

Beispiel 4

Bestimmungsverfahren für NAGase unter Verwendung eines Reagens, daß 3,4-DNG enhält

(1) Herstellungsverfahren 3,4-DNG 1,2 mM Citratpuffer (ph 5,0) 0,1 M
(2) Durchführung
Zu 150 ul einer Testprobe wurden 3 ml des Reagens gegeben und 5 Minuten lang bei 37 ºC erwärmt, um die Reaktion durchzuführen, und die Absorptionsänderung bei 400 nm je Zeiteinheit wurde mit einem Reaktionsleerwert als Kontrolle gemessen.

(3) Ergebnisse

Wurden die Standardprodukte verwendet, zeigte die Eichkurve Linearität bis wenigstens 200 U/Liter und die Korrelation mit dem Verfahren, welches als Substrat 2- Chlor-4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid verwendet, war ebenfalls gut.
Die Werte der Nagase-Aktivitätsbestimmung in Körperflüssigkeiten von lebenden Probanden sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Erfindungsgemäßes Verfahren 2-CNP-NAG Verfahren Bemerkung: 2-CNP-NAG-Verfahren bezieht sich auf das Verfahren mit 2-Chlor-4-nitrophenyl-N- acetyl-β-D-glucosaminid als Substrat.

Beispiel 5

Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase-Aktivität
(1) Herstellung des Reagens 3,4-Dinitrophenylphosphorsäure 10 mM Citratpuffer (pH 5,1) 40 mM
(2) Durchführung
Zu 20 ul einer Testprobe wurden 200 ul des 5 Minuten lang bei 37 ºC erwärmten Reagens gegeben, um die Reaktion durchzuführen, und die Änderung der Absorbtion bei 400 nm seit einer Zeit gemessen mit den Lehrwert als Kontrolle.

(3) Ergebnisse

Wurden die Standardprodukte eingesetzt, zeigte die Eichkurve Linearität bis wenigstens 200 U/Liter und die Korrelation mit dem Verfahren in dem p- Nitrophenylphosphorsäure als Substrat verwendet wird, war ebenfalls gut.
Die Werte der Aktivitätsbestimmung der sauren Phosphatase aus Körperflüssigkeit von lebenden Probanden sind in der Tabelle 3 gezeigt. Erfindungsgemäßes PNP-Phosphorsäure Verfahren Serum-1 3,8 U/Liter 3,5 U/Liter
Bemerkung: Das PNP-Phosphorsäure- Verfahren entspricht dem Verfahren mit p- Nitrophenylphosphorsäure als Substrat

Beispiel 6

Vergleich der Bestimmungsgenauigkeit (hergestellt als Reaaens für Autoanalyser)

(1) Verwendete Reagenzien

(A) 3,4-DNG-Verfahren (erfindungsgemäßes Verfahren)

(1) Herstellung des Reagens R-1 Citratpuffer (pH 5,0) 0,1 M R-2 0,1 M Citratpuffer (pH 5,0), enthaltend 6 mM 3,4-DNG
(2) Durchführung
Nachdem 20 ul der Testprobe und 0,4 ml von R-1 5 Minuten lang auf 37 ºC erwärmt worden waren, wurde 0,1 ml R-2 zur Durchführung der Reaktion hinzugegeben und anschließend die Änderung der Absorption bei 400 nm gemessen.

(B) 2-Chlor-4-nitrophenyl-N-acetylglucosaminid- Verfahren

Mayassay NAG-RR (verkauft durch Sanko Junyaku) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (C) Ergebnisse (Vergleich als CV-Wert) Verfahren 2 U/Liter
Ein großer Unterschied erscheint hinsichtlich der Genauigkeit der Bestimmung nahe dem normalen Wert (einige U/ml) von NAGase im Urin, und die Ergebnisse der Bestimmung zeigen den Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer hervorragenden Substratlöslichkeit.
Die Zusammensetzungen des Bestimmungsreagens in den obigen Beispielen sind allgemein und verschiedene Anwendungen sind für den einschlägigen Fachmann möglich.
So ist es beispielsweise möglich, in üblicherweise verschiedene Tenside hinzuzugeben, um die Trübung in der Testprobe zu vermeiden, antiseptische Mittel hinzuzugeben und ferner Cyclodextrin oder verschiedene Derivate davon zur Verstärkung der Farbbildungsempfindlichkeit hinzuzufügen, und um so den Leerwert relativ zu verringern, das Verschieben des pKa-Werts von 3,4- Dinitrophenol in den sauren Bereich zu verkleinern und das eingestellte S/N-Verhältnis zu erhöhen.

Beispiel 7

Erhöhung der Empfindlichkeit mit verschiedenen Cyclodextrinen (CD).
Die Cyclodextrine (CD), die nachfolgend gezeigt werden, wurden auf eine endgültige Konzentration von 2,4 mM eingestellt und die empfindlichkeitsverstärkenden Wirkungen auf 3,4-DNP in einem 0,1 M Citratpuffer (pH 5,0) gezeigt. Empfindlichkeits-Verhältnis Keine Zugabe
Bezüglich β-CD mit einer hohen die Empfindlichkeit steigernden Wirkung wurde die Nagase auf der Basis des Beispiels 3 gemessen, um eine ähnlich gute empfindlichkeitsverstärkende Wirkung zu erhalten. Insbesondere wird mit DEAE (Diethylaminoethyl)-β-CD, welches eine hohe die Wasserlöslichkeit und hohe die Empfindlichkeit steigernde Wirkung hat, eine Steigerung der Empfindlichkeit bei einer endgültigen Konzentration von 24 mM um den Faktor 2 oder mehr erreicht.
Die Essenz der Erfindung liegt in einem Test zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen wie sie in Anspruch 1 genannt sind, der Substrate verwendet, die am Ende des Moleküls eine 3,4-Dinitrophenolgruppe aufweisen, welche durch den pH-Wert und die Temperatur wenig beeinflußt werden und als Aglycon eine außergewöhnliche Löslichkeit zeigen, und liegt ferner in den oben beschriebenen Anwendungen. Das Substrat für eine Enzymreaktion in einer Probe aus einem lebenden Körper das Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität und das Reagens zur Verwendung in dem Assay nach der Erfindung sind oben beschrieben und haben eine besondere Wirkung im Hinblick auf eine erhebliche Verbesserung der Genauigkeit eines Geschwindigkeitstest der Nagase und Phosphatase, β-D-Glucuronidase und β-D-Galactosidase.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines der Enzyme N-Acetyl-β-D-glucosaminidase oder N-Acetyl-β-D- hexosaminidase, einer sauren Phosphatase, der β-D- Galactosidase oder β-D-Glucoronidase, welches das Messen der Färbung (Absorption) von 3,4-Dinitrophenol umfasst, die durch Wirkung des Enzyms auf ein Substratmolekül mit einer 3,4-Dinitrophenoxygruppe am Ende des Moleküls gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Enzymaktivität diejenige von N-Acetyl-β-D- glucosaminnidase oder N-Acetyl-β-D-hexosaminidase in einer Probe aus einem lebendem Körper ist und worin das Substrat 3,4-Dinitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid oder 3,4-Dinitrophenyl-N-acetyl-β-D-hexosaminid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Enzymaktivität die Aktivität einer sauren Phosphatase und das Substrat 3,4-Dinitrophenylphosphorsäure oder eines Salzes davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Enzymaktivität die Aktivität von β-D- Glucuronidase in einer Probe aus einem lebenden Körper und das Substrat 3,4-Dinitrophenyl-β-D-glucuronid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Enzymaktivität die Aktivität von β-D- Galaktosidase und das Substrat 3,4-Dinitrophenyl-β-D- galactosid ist.

6. Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, das sie in Gegenwart von Cyclodextrin durchgeführt wird.