DK174044B1 - Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid....... - Google Patents

Description

DK 174044 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte (human-granulocyt-kolonistimulerende faktor (hG-CSF))-polypeptidderivater, rekombinante plasmider med et DNA, der koder for et hvilket som helst af 5 nævnte polypeptidderivater, indført deri, mikroorganismer bærende ethvert af nævnte plasmider, og en fremgangsmåde til fremstilling af nævnte hidtil ukendte hG-CSF-polypeptidderivater.

Human-granulocyt-kolonistimulerende faktor 10 (hG-CSF) er en slags polypeptid, der er essentielt ved dannelsen af forskellige blodceller som resultat af hastig formering og differentiering af hæmato-poietiske stamceller. Dens hovedeffekt er at fremme forøgelsen af antallet af granulocyter, navnlig neu-15 trofiler. Neutrofiler spiller en vigtig rolle ved beskyttelsen af det levende legeme mod infektion.

Deres levetid er imidlertid kort, og konstant supplering er derfor nødvendig ved hastig formering og differentiering af precursor-celler. De i de 20 senere år i vid udstrækning anvendte terapier til proliferative tumorer inhiberer samtidigt væksten af netrofil-precursore og har derfor en alvorlig bivirkning, nemlig en reduktion af netrofilisk beskyttelse i cancer-bærende patienter, hvilket gør disse 25 mere modtagelige for infektion. hG-CSF forventes at være effektiv til at afhjælpe denne bivirkning gennem på den ene side fremme af forøgelsen af antallet af neutrofiler og på den anden side forebyggelse og behandling af infektionssygdomme. Endvidere er 30 hG-CSF aktiv i henseende til at bevirke differentiering af leukæmi-cellelinier in vitro og kan derfor muligvis være anvendelige som et terapeutisk middel for leukæmi. hG-CSF-polypeptidderivaterne ifølge opfindelsen er bedre med hensyn til hG-CSF-aktivitet end 35 det kendte hG-CSF og forventes at være anvendelige som lægemidler.

Med de nylige hurtige fremskridt inden for re-kombinant DNA-teknologi er gener for proteiner, 2 DK 174044 B1 der er involveret i proliferationen og differentieringen af blodceller, blevet isoleret successivt.

Sådanne faktorer er i produktion ved hjælp af genteknik under anvendelse af mikroorganismer eller dyreceller.

5 Et cDNA for hG-CSF blev isoleret fra den humane skælcelle-carcinomacellelinie CHU-II, dets basesekvens blev bestemt og dets ekspression i COS-celler er rapporteret af Nagata et al [Nagata et al, Nature, 319, 415 (1986)]. Souza et al har også 10 isoleret et cDNA fra den humane blærecancercellelinie 5637, bestemt dets basesekvens og rapporteret om dets ekspression i Escherichia coli (E.coli) [Souza et al, Science, 232, 61 (1986)].

Aminosyresekvensen for det af de to ovennævnte 15 cDNA'er indkodede protein er i overensstemmelse med aminosyresekvensen (Tabel I) for det protein, der indkodes af det cDNA, der af de foreliggende opfindere er isoleret fra normale humane perifere blodmakrophager.

. 3 DK 174044 B1

Tabel 1 1 10 20 30 40 50 ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG ThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeuG lu 1 60 70 80 90 100 110 CAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACC GlnYalArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLysleuCysAlaThr 120 130 140 150 160 170 TACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCC TyrlysLeuCysHisProGluGluLeuValleuLeuGlyHisSerLeiiGlyl lePro 10 180 190 200 210 220

TGGGCTCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTG

TrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCysleu 230 240 250 260 270 280

AGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGGG

SerGlnLeuHisSerGlyleuPheleuTyrGlnGlyleuleuGlnAlaleuGluGly 15 290 300 310 320 330 ATCTCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGAC IleSerProGluleuGlyProThrleuAspThrleuGlnteuAspValAlaAsp 340 350 360 370 380 390 TTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAG 20 PheAlaThrThrIleT rpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGln 400 410 420 430 440 450 CCCACCCÅGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGG ProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGly 460 470 480 490 500

25 GTCCTAGTTGCCTCCCATCTGCAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGC

ValLeuValAlaSerHisLeuGInSerPheleuGluValSerTyrArgValLeuArg 510 520 CACCTTGCCCAGCCCTGA H isLeuAlaGInPro*** 174

30 I EP 237 545 Bl beskrives rekombinant hG-CSF

protein med substitution af CYS i position 17, 36, 42, 64 eller 74. I andre positioner end 17 ændres proteinets biologiske aktivitet. Ligeledes vises, at THR kan substitueres med ALA i position 1 uden at 35 ændre den biologiske aktivitet.

EP 256 843 beskriver rekombinant hG-CSF protein, hvor 1-4 aminosyrer er slettet og samtidig er der udskiftet 1-2 aminosyrer i N-terminalen af proteinet.

4 DK 174044 B1

Den foreliggende opfindelse har haft til formål at tilvejebringe et middel til, under lave omkostninger og i store mængder, at fremstille hG-CSF-polypeptidderivater med høj specifik aktivitet 5 og høj stabilitet i blod.

De foreliggende opfindere fandt, at hG-CSF-polypeptidderivater med høj specifik aktivitet kan fremstilles ved at modificere cDNA'et for hG-CSF vist i Tabel I og dyrke en stamme af E.coli, der 10 huser et plasmid med det modificerede cDNA indført deri, eller ved begrænset polypeptid-dekomponering under anvendelse af en protease, og de har nu fuldført den foreliggende opfindelse.

I det følgende henvises til tegningerne, 15 hvor

Fig. 1 viser et konstruktionsskema for plasmidet pCfTAl,

Fig. 2 viser et konstruktionssekma for plasmidet pCfTB20, 20 Fig. 3 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfTL23, 38, 35 og 41,

Fig. 4 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfTMl4, 17 og 113, rig. o viser et Konstxuktionsskema for plasmidet 25 pCfWDl,

Fig. 6 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pC.fT95K1 9, pCfAAl og pCfAB5,

Fig. 7 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfBA3, pCfBB101, CfBC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 30 93, 95, 97, pCfBD28, 56 og 82,

Fig. 8 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfCB101, pCfCC52, 59, pCfCD28 og 56,

Fig. 9 (1) og (2) viser skematisk fremgangsmåderne involveret i Okayama-Berg-metoden til cDNA- 35 syntese og konstruktion af et rekombinant plasmid indeholdende det syntetiserede DNA,

Fig. 10 viser et konstruktionsskema for plasmidet pLA!, 5 DK 174044 B1

Pig. 11 viser et konstruktionsskema for plasmidet pLSAI,

Pig, 12 viser et konstruktionsskema for plasmidet pCfTNS501, 5 Fig. 13 viser et konstruktionsskema for plasmidet pTrS20,

Fig. 14 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfTNS7 og pCfTAArg4S,

Fig. 15 viser et konstruktionsskema for plas-10 midet pCfTN205 og pCfTAArg4,

Fig. 16 viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfTNS301 og pCfTNS401, og

Fig. 17 (1) og (2) viser konstruktionsskemaer for plasmiderne pCfBD28A17 og pCfBD28Tl7.

15 hG-CSF-polypeptidderivaterne ifølge opfindelsen afviger i en del af aminosyresekvensen fra hG-CSF-polypeptidet med den i Tabel I viste aminosyresekvens som følge af substitution og/eller deletion.

Mindst en aminosyre ud af den 1. til 6. aminosyre 20 på den N-terminale side og eventuelt den 17. aminosyre deraf adskiller sig fra aminosyren i den tilsvarende position af hG-CSF polypeptidet med et forbehold, at mere end en aminosyre af hG-CSF substitueres, hvis aminosyren Thr+Z af hG-CSF erstattes med Ala, Gly eller 25 Pro; og med det yderligere forbehold, at aminosyrerne i positionerne +1 og +2 ikke substitueres samtidigt.

Opfindelsen angår endvidere et polypeptid ifølge krav 12.

De rekombinante plasmider ifølge opfindelsen 30 vindes ved at indføre et DNA-fragment, der koder for et hvilket som helst af de ovennævnte hG-CSF-polypeptidderivater, i et passende plasmid med en DNA-ekspressionsfunktion.

Opfindelsen angår endvidere mikroorganismer 35 transformeret med de ovennævnte rekombinante plasmider.

6 DK 174044 B1

Et cDNA (hG-CSF-cDNA) vundet ved omvendt transkription af et hG-CSF-indkodende messenger-RNA ved rekombinant DNA-teknologi eller et hG-CSF-indkodende DNA vundet fra krrncsjiBlt DNA, kan for 5 eksempel anvendes som det hG-CSF-indkodende DNA vist i Fig.1.

Ethvert hG-CSF-cDNA kan anvendes, forudsat at det koder for hG-CSF. Som et specifikt eksempel kan der anvendes pCSF1-2, et plasmid fremstillet 10 af de foreliggende opfindere. Fremgangsmåden til fremstilling af pCSF1-2 er beskrevet i Referenceeksempel 1.

Det i pCSFl-2 indeholdte hG-CSF-cDNA har basesekvensen vist i Tabel i, som påvist ved dideoxy-15 sekvensbestemmelsesmetoden under anvendelse af M13-phag [J. Messing et al, Gene, J_9, 269 (1982)].

pCSF1-2 er et plasmid med det i Fig. 1 viste viste restriktionsenzymkort, og en E.coli-stamme indeholdende plasmidet, E.coli ECSF 1-2, er deponeret 20 hos the Fermentation Research Institure, Agency of Industrial Science and Technology (FRI) siden 27. november 1986 under løbenummer FERM BP—1220 i henhold til Budapest-traktaten.

Ethvert plasmid kan anvendes til insertionen 25 af et hG-CSF-polypeptidderivat-indkodende DNA deri, forudsat at nævnte DNA kan eksprimeres i E.coli.

Der kan med fordel anvendes et plasmid, der tillader fremmed DNA-insertion deri på et sted ned-strøms fra en passende promotor, for eksempel en 30 trp- eller lac-promotor, og har afstanden mellem

Shine-Dalgarono-sekvensen (i det følgende SD-sekvensen) og initieringscodon'en (ATG) indstillet til en passende afstand, for eksempel 6-18 basepar.

Som egnede eksempler på et sådant plasmid 35 kan nævnes pKYPlO (US-patentskrift nr. 4.686.191), pLSAI (Referenceeksempel 3), pGELI [Sekine et al, 7 DK 174044 B1

Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pKY26 [Japansk patentansøgning (OPI) nr. 48699/87 (angivelsen "OPI" betyder ikke-undersøgt publiceret ansøgning)] og pBR322 [Bolivar et al, Gene, 2, 95 (1977)].

5 Rekombination mellem et DNA, der koder for hG-CSF-polypeptidet eller et derivat deraf, og et vektor-DNA kan ske ved alment benyttet rekombinant DNA-teknik, der omfatter digerering af begge DNA med et eller flere restriktionsenzymer og efterfølg-10 ende ligering ved anvendelse af T4-DNA-ligase. Til ligering kan de DNA-fragmenttermini, der stammer fra restriktionsenzym-digerering, om passende, forarbejdes ved brug af indfyldnings-reaktionen, der gør brug af DNA-polymerase I-Klenowfragment, eller 15 afklipningsreaktionen, der gør brug af T4-DNA-poly-merase. DNA-linker-teknik er også anvendelig.

Eksempler på konstruktionen af rekombinante plasmider indeholdende et hG-CSF-polypeptidderivat-indkodende DNA indført deri ved anvendelse af pCSF1-2 20 som hG-CSF-cDNA’et, pGELI, pKYP10, pKYP26, pBR322 eller pLSA1 som plasmidet til inkorporering af DNA'et deri og, om nødvendigt, en kemisk syntetiseret DNA-linker eller en teknik med positions-specifik mutagenese findes i nedenstående detaljerede omtale af tegningerne.

25

Detaljeret beskrivelse af tegningerne (Rekombinations-metoder)

Som vist i Fig.1 bliver pCSF1-2 [ca. 4,5 30 kilobaser (i det følgende kb)] kløvet med Apal og BamHI, og et DNA-fragment på ca. 1,5 kb renses ved elektroforese med agarosegel med lav geleringstemperatur (LGT-metode) [L.Wieslander: Analytical Biochemistry, 98_, 305 (1979)].

35 Derefter kløves pLSAI med Banlll og BamHI, og et DNA-fragment på ca. 2,8 kb renses ved LGT- 8 DK 174044 B1 metoden. Begge de således vundne fragmenter og det syntetiske DNA vist i Fig.1. ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTAl.

Derefter kløves, som vist i Fig.2, pCfTAl 5 med BamHI, de fremspringende ender omdannes til stumpe ender ved behandling med Klenow-fragmentet, og efter yderligere kløvning med EcoRI bliver et DNA-fragment på ca. 2,5 kb renset ved LGT-metoden.'

Separat bliver pCfTAl kløvet med EcoRI og Pral, 10 og et DNA-fragment på ca. 1,0 kb renset ved LGT-metoden. De således vundne DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTB20.

Endvidere bliver, som vist i Fig.3, pCSFl-2 15 kløvet med Apal og BamHI, og et DNA-fragment på ca.

1,5 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pGELl kløvet med Hindlll, BamHI og PstI, og et DNA-fragment på ca. 1,7 kb renses ved LGT-metoden. Yderligere bliver pKYPlO kløvet med PstI og Banlll og et DNA-20 fragment på ca. 1,1 kb renses ved LGT-metoden. Ligering af disse tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i Pig. 3 giver pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 og pCfTL41, mens ligering af nævnte tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i Fig. 4 giver pCfTM14, 25 pCfTMI 7 og pCfTM113.

Endvidere bliver, som vist i Fig.5, pCfTAl kløvet med Banlll og Stul, og et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-fragment på 1,3 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pKY26 kløvet med BamHI, de fremspringende 20 ender omdannes til stumpe ender ved behandling med DNA-polymerase I-Klenowfragment, og efter yderligere kløvning med PstI bliver et DNA på ca. 1,8 kb renset ved LGT-metoden. Yderligere bliver separat pGELl kløvet med Banlll og PstI, og et DNA-fragment på 35 ca. 1,0 kb renses ved LGT-metoden. De tre således vundne DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfWDl.

9 I

DK 174044 B1

Yderligere bliver, som vist i Pig. 6, pCfTL38 kløvet med Hindlll og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 2,6 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pCfTL38 kløvet med Hindlll, BamHI og Dpnl, og et 5 DNA-fragment på ca. 300 bp (basepar) renses ved LGT-metoden. Yderligere bliver pCfTB20 separat kløvet med Aval. de fremspringende ender afklippes ved behandling med Klenow-fragmentet, og efter yderligere kløvning med Bglll bliver et DNA-fragment på ca.

10 480 bp renset ved LGT-metoden. De tre således vundne DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfT95K19. Yderligere bliver, som vist i Fig. 6, pCfT95K19 kløvet med Banlll og Bgll, og et DNA på ca. 1,0 kb renses ved 15 LGT-metoden, og separat kløves pCfT95K19 med Bgll alene, og et DNA-fragment på ca. 1,8 kb renses ved nævnte metode. Yderligere bliver separat pCfT95K19 kløvet med Bgll og Sau3A, og et DNA-fragment på ca. 350 bp renses ved LGT-metoden. De tre således 20 vundne DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i Fig. 6 i midten deraf (dvs. halvvejs nede) ligeres sammen, hvorved vindes pCfAAl. Derefter bliver, som også vist i Fig. 6, pCfAAl kløvet med Xhol og Bgll, og et DNA-fragment på ca. 3,0 kb renses ved 25 LGT-metoden. Dette fragment, det ovennævnte BglI-Sau3A-fragment (ca. 350 bp) af pCfT95K19 og det syntetiske DNA vist i Fig. 6 ved bunden deraf ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfAB5 og pCfABI 4. Yderligere bliver, som vist 20 i Fig. 7, pCfAB5 kløvet med Aval og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 2,8 kb renses ved LGT-metoden.

Separat bliver pCfWDl kløvet med Bglll og Aval, og DNA'et på ca. 1,3 kb renses ved LGT-metoden.

De to således vundne fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfBA8.

10 DK 174044 B1 På den anden side bliver pC£AB14 kløvet med Aval og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 2,8 kb renses ved LGT-metoden, og dette fragment ligeres med ovennævnte 1,3 kb DNA-fragment afledt af pCfWDl ved 5 kløvning med Bglll og Aval under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfBA32. Yderligere bliver, som også vist i Fig.7, pCfBA8 kløvet med Banlll,

Bglll og Xhol. og et DNA-fragment på ca. 1,4 kb og et DNA-fragment på ca. 2,7 kb renses ved LGT-10 metoden. Ligering af de to således vundne DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i Fig.7 under anvendelse af T4 DNA-ligase giver pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28, pCfBD56, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97 og pCfBD82.

15 Som vist i Fig.8 bliver pBR322 kløvet med

PstI, de fremspringende ender afskæres med T4 DNA-polymerase, Bglll-linkeren indføres under anvendelse af T4 DNA-ligase, og efter yderligere kløvning med EcoRI og Bglll bliver et DNA-fragment på ca. 3,6 20 kb renset ved LGT-metoden.

Plasmiderne pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 og pCfBD56 vundet på den ovenfor beskrevne måde bliver hver kløvet med EcoRI og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 1,8 kb renses ved LGT-metoden. Hvert 25 1,8 kb DNA-fragment ligeres med det pBR322-afledte 3.6 kb DNA-fragment under anvendelse af T4 DNA-ligase.

Herved vindes pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 og pCfCD56 svarende til de respektive plasmider omtalt ovenfor.

30 På den anden side bliver pCfBA8 kløvet med

Banlll, Bglll og Xhol, og et DNA-fragment på ca.

2.7 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pCfBA8 kløvet med Xhol og Bglll, og et DNA-fragment på ca.

1,4 kb renses ved LGT-metoden. Ligering af de to 35 således vundne fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i Fig. 14 giver pCfTNS7 og pCfTAArg4S.

11 DK 174044 B1

Yderligere bliver, som vist i Pig. 15, pCfTNS7 kløvet med Pvul og Xhol, og et DNA-fragment på ca. 1 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pCfBA32 kløvet med Pvul og Xhol, og et DNA-fragment på ca. 3,5 5 kb renses ved LGT-metoden. De to således vundne fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTN205. Tilsvarende bliver pCfTAArg4S kløvet med Pvul og Xhol, et fragment på ca. 1 kb renses ved LGT-metoden, og dette fragment 10 ligeres med et DNA-fragment på ca. 3 kb afledt af det ovennævnte plasmid pCfBA32 ved kløvning med Pvul og Xhol, under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTAArg4. Yderligere bliver pCfBA8 kløvet med Banlll og Bglll , og et DNA-fragment 15 på ca. 2,7 kb renses ved LGT-metoden. Separat bliver pCfBA8 kløvet med Xhol og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 1,4 kb renses ved LGT-metoden, De to således vundne fragmenter og den syntetiske linker vist i Fig. 16 ligeres sammen under anvendelse af T4 20 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTNS301 og pCfTNS401.

Yderligere bliver, som vist i Fig.12, pCfBA8 kløvet med Xhol, de fremspringende ender omdannes til stumpe ender ved Klenowfragment-behandling, og efter yderligere kløvning med Pvul bliver et DNA-fragment på ca.

25 3 kb renset ved LGT-metoden. Separat bliver ATG-vektoren pTrS20 (referenceeksempel 4) kløvet med SacI, efterfulgt af omdannelse af de fremspringende ender til stumpe ender ved Klenowfragment-behandling.

Efter yderligere kløvning med Pvul bliver et DNA-3° fragment på ca. 1 kb renset ved LGT-metoden. De således vundne to fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved vindes pCfTNS501.

I et eksempel, hvor positions-specifik mutagenese anvendes, bliver pCfBD28 kløvet med Banlll og PstI, 35 Som vist i Fig. 17, og et DNA-fragment på ca. 210 bp renses ved LGT-metoden. Separat bliver M13-phag- 12 DK 174044 B1 vektor Μ13ΐϊρ19ΗΡ-ΟΝΑ’ét kløvet med Accl og PstI, og et DNA-fragment på ca. 7,24 kb renses ved LGT-metoden. De således vundne to DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse af T4 DNA-ligase, hvorved 5 vindes pt19BD28N. Derefter bliver dette pt19BD28N anvendt til at transficere E.coli JM105, og enkelt-strenget pt19BD28N vindes fra den vundne fase. Tilsvarende bliver, som også vist i Fig. 17, M13mp19RF-DNA'et kløvet med Hindlll og EcoRI, og et DNA-fragment 10 på ca. 7,2 kb renses ved LGT-metoden. Efter af dette 7,2 kb DNA-fragment er blandet med det enkeltstrengede pt19BD28N vundet på ovennævnte måde, fremkaldes spaltet duplex-DNA-dannelse ved denatureringsbehandling efterfulgt af "annealing", og det resul-15 terende spaltede duplex-DNA renses ved LGT-metoden.

Derefter bliver dette DNA "annealet" med det syntetiske DNA vist i Fig. 17 og derefter cirkulariseret under anvendelse af Klenow-fragmentet og T4 DNA-ligase.

Dette cirkulariserede DNA anvendes til at transficere 20 E.coli JM105, hvorved der vindes pt19BD28NAl7 og pt19BD28NT17 med positions-specifik mutagenese indført deri. Endvidere bliver, som også vist i Fig. 17, pt19BD28NA17 og pt19BD28NT17 kløvet med Aval og Xhol, og hvert DNA-fragment på ca. 110 bp renses 25 ved LGT-metoden. Separat bliver pCfBD28 kløvet med Xhol og Bglll, og et DNA-fragment på ca. 2,74 kb renses ved LGT-metoden. Yderligere bliver separat pCfBD28 kløvet med Bglll og Aval, og et DNA-fragment på ca. 1,29 kb renses ved LGT-metoden. Ligering 30 af de således vundne DNA-fragmenter på ca. 110 bp, ca. 2,74 kb og 1,29 kb ved anvendelse af T4 DNA-ligase giver henholdsvis pCfBD28A17 og pCfBD28T17.

Reaktionsbetingelserne ved de ovennævnte rekombinationsmetoder er generelt følgende: 35 DNA-digereringsreaktionen i nærværelse af

et eller flere restriktionsenzymer gennemføres i almindelighed under anvendelse af 0,1-20 yg DNA

13 DK 174044 B1 i et reaktionsmedium indeholdende 2-200 mM (fortrinsvis 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinsvis 7,8-8,0), 0,200 mM NaCl og 2-20 mM (fortrinsvis 5-10 mM) MgCl2 ved 20-70°C (den optimale temperatur 5 varierer alt efter det eller de anvendte restriktionsenzymer) i 15 minutter til 24 timer. Restriktionsenzymerne anvendes hver i en mængde på 0,1-100 enheder (fortrinsvis 1-3 enheder) pr. mikrogram DNA. Reak-' tionens afslutning bevirkes sædvanligvis ved op-10 varmning ved 55-75°C i 5-30 minutter. Det er også muligt at inaktivere restriktionsenzymerne med et reagens, såsom phenol eller diethylpyrocarbonat.

De ved restriktionsenzym-di gereringen dannede DNA-fragmenter eller spaltede duplex-DNA'er kan 15 renses blandt andet ved LGT-metoden eller ved poly-acrylamidgelelektroforese [A.M. Maxam et al, Proc.

Natl.Acad.Sci. USA T±r 560 (1977)].

DNA-fragment-ligeringsreaktionen gennemføres i et reaktionsmedium indeholdende 2-200 mM (fortrins-20 vis 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,1-9,5, fortrinsvis 7,0-8,0), 2-20 mM (fortrinsvis 5-10 mM) MgCl2, 0,1-10 mM (fortrinsvis 0,5-2,0 mM) ATP og 1-50 mM (fortrinsvis 5-10 mM) dithiothreitol ved 1-37°C (fortrinsvis 3-20°C) i 15 minutter til 72 timer (fortrinsvis 2-20 timer) 25 under anvendelse af 0,3-10 enheder af T4 DNA-ligase.

Det ved ligeringsreaktionen vundne rekombinante plasmid-DNA kan, om ønsket, indføres i E.coli ved transformationsmetoden ifølge Cohen et al [S.H.Cohen et al, Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 69, 2110 (1972)).

30 De ved ligeringsreaktionen dannede rekombi nante M13 phag RF-DNA'er indføres i E.coli JM105 [J.Messing et al, Gene, 33, 103 (1985)] under anvendelse af den kendte transficeringsmetode [Yoshiyuki Kuchino et al, Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, 35 Nucleic Acid and Enzyme), 29_, 294 ( 1984)] om nødvendigt .

14 DK 174044 B1

De rekombinante plasmid-DNA'er og rekombinante M13 phag RF-DNA'er kan isoleres fra de respektive E.coli-transformanter f.eks. ved metoden ifølge Birnboim et al [H.C.Birnboim et al, Nucleic Acids 5 Res., 7, 1513 (1979)].

Isoleringen af det enkeltstrengede DNA fra den rekombinante M13 phag gennemføres ved den kendte metode [Yoshiyuki Kuchino et al, Tanpakushitsu,

Kakusan, Koso, 29^, 294 (1984)].

10 Plasmid-DNA'erne undersøges for kløvnings positioner ved agarosegelektroforese eller poly-acrylamidgelelektroforese efter kløvning med 1-10 restriktionsenzymer. Yderligere DNA-basesekvens-undersøgelse foretages, om nødvendigt, ved dideoxy-15 sekvensbestemmelsesmetoden under anvendelse af M13 phag [J. Messing et al, Gene, J_9, 269 ( 1982)].

De ønskede rekombinante plasmid-DNA'er kan frembringes under betingelser som ovenfor omtalt.

hG-CSF-Polypeptidderivaterne ifølge opfindelsen 20 kan fremstilles på følgende måde.

E.coli K-12 HB101 transformeres med et passende plasmid (f.eks. pCfBD28), og en plasmidbærende (f.eks. pCfBD28-bærende) transformant af E.coli udvælges blandt ampicillin-resistente (i det følgende Apr) 25 kolonier. Dyrkning af den plasmidbærende (f.eks.pCfBD28-bærende) stamme af E.coli i et medium kan føre til dannelse af et hG-CSF-polypeptidderivat i kulturen.

Et hvilket som helst medium, hvad enten syntetisk eller naturligt kan anvendes, forudsat at det er 30 egnet til dyrkning af E.coli og til fremstilling af hG-CSF-polypeptidderivatet.

Anvendelige carbonkilder omfatter blandt andre glucose, fructose, lactose, glycerol, mannitol og sorbitol, og anvendelige nitrogenkilder er NH4C1, 35 (nh4)2S04, casaminosyrer, gærekstrakt, polypepton, kødekstrakt, Bactotrypton, majsstøbevæske, osv., 15 DK 174044 B1 og K2HP04, KH2P04, NaCl, MgS04, vitamin B1# MgCl2 osv. kan anvendes som andre næringskilder. Dyrkningen foregår med luftning og omrøring ved et pH på 5,5- 8,5 og en temperatur på 18-40°C. Dyrkning i 5-90 5 timer fører til akkumulering af et hG-CSF-polypeptid-derivat i dyrkede celler. Cellerne indhøstes derefter fra kulturen og opbrydes ved ultralydbehandling. . Centrifugering giver cellerester. hG-CSF-Polypeptid-derivatet ekstraheres fra celleresterne, renses, 10 opløseliggøres og regenereresved metoden ifølge Marston et al, [F.A.O. Marston et al, BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)]. Muse-benmarvceller behandles med nævnte derivat, og hG-CSF-polypeptidderivatet vurderes ved metoden, der som indeks gør brug af det antal 15 kolonier, der dannes i blød agar.

Ved praktisering af den foreliggende opfindelse bestemmes hG-CSF-aktiviteten på følgende måde. Benmarv-celler indsamles aseptisk fra femur af C3H/He-hanmus på 8-12 uger (Shizuoka Laboratory Animal Center) 20 og suspenderes i α-Minimum Essential Medium (Flow

Laboratories, i det følgende omtalt som a-MEM) suppleret med 10% foetalt bovinserum (FBS). Nylonuld (0,3 g Wako Pure Chemical Industries' Nylon Fiber 145-04231) pakket i en søjle imprægneres med 1,5 ml af den 25 ovennævnte cellesuspension (ca. 5 x 107 celler), og reaktionen får lov at forløbe i en 5% C02~inkubator ved 37°C i 90 minutter. Derefter bliver a-MEM, opvarmet på forhånd til 37°C, ledt gennem søjlen, og benmarvceller, der ikke er adsorberet på nylon- 30 ulden, opsamles som en udflydende fraktion. Cellerne vaskes e'n gang med a-MEM, og cellekoncentrationen indstilles på en forud fastlagt koncentration.

Derefter bliver evnen til myelopoietisk stam-cellekolonidannelse bestemt ved metoden ifølge Okabe 35 et al [T.Okabe et al, Cancer Research £4, 4503-4506 (1986)]. Således bliver 0,2 ml af den på ovennævnte i 16 DK 174044 B1 måde fremstillede benmarvcellesuspension (2 x 10 celler/ml) blandet med en blanding af 0,2 ml a-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml af hver 2-fold fortyndet prøve.

Samme volumen (1,0 ml) 0,6% agar(Difco, Agar purified 5 0506-01)-opløsning holdt ved 42°C blandes med oven nævnte blanding, og den resulterende blanding fordeles i 0,5 ml1 s portioner på en 24-rums mikrotiterplade (Nunc1 Multidish #143982) (5 x 10^ celler/rum, n=3).

Efter 7 dages inkubation ved 37°C i en 5% CO^-inkuba-10 tor bliver kolonier indeholdende mindst 40 celler talt under et mikroskop (Olympus X40). Efter tælling bliver hver koloni forsigtigt overført på et skydeglas, fikseret dertil med en blandet acetone-formalin-opløsning i 30 minutter og underkastet esterase-15 dobbeltfarvning ved metoden ifølge Kubota et al [K. Kubota et al, Exp.Mematology, J3, 339-344 ( 1980)] med henblik på identifikation af kolonien.

Styrken af hver prøve beregnes baseret på tællingsresultatet ved koloni-dannelsestesten for 20 2-fold fortyndingen på følgende måde. Den aktivitet, der giver det halve af den maksimale kolonidannelsesværdi opnået med intakt G-CSF anvendt som standard defineres som 50 enheder. Styrken (i enheder) beregnes ifølge denne definition og ved anvendelse af faktoren 25 20 til multiplikation til omdannelse til aktiviteten pr. milliliter, ligeledes under hensyn til fortyndingsfaktoren for prøven. Den specifikke aktivitet udtrykkes som styrke (enheder/mg) pr. vægtenhed (mg) af protein.

30 De hG-CSF-polypeptidderivater, der mangler én eller flere aminosyrer på den N-terminale side af hG-CSF-polypeptidet, kan også fremstilles ved enzymatisk nedbrydning.

Derivaterne kan naturligvis fremstilles ved 35 enzymatisk nedbrydning af naturligt hG-CSF som udgangsmateriale. Da naturligt hG-CSF har lav reaktionsevne med enzymet (protease), foretrækkes imidlertid 17 DK 174044 B1 anvendelse af et modificeret hG-CSF med forøget reaktivitet over for protease til fremstilling af sådanne derivater med høj aktivitet i gode udbytter.

Som sådanne udgangsmaterialer anvendes for-5 trinsvis de modificerede hG-CSF’er (a), (b), (c) og (d) vist i Tabel II, resulterende fra substitution af en eller flere aminosyrer på den N-terminale side af hG-CSF-polypeptidet. Modifikationer (a), (b), (c) og (d) kan vindes ved at dyrke bakterie-10 stammer, der huser plasmiderne med de tilsvarende basesekvenser, nemlig henholdsvis pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (ND28), pCfBC95 (NC95) og pCfTAArg4S (Arg4S), efterfulgt af isolering og rensning ved kendte metoder.

Som enzymet anvendes passende endoproteaser, 15 såsom serinprotease og thiolprotease. Mere specifikt kan nævnes for eksempel subtilisin A, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, subtilisin nove, proteinase K, nagase, thermolysin, endoproteinase Arg-C, trypsin og α-chymotrypsin. Enzymet anvendes i en mængde 20 på 3,4 x 106 til 8,5 x 10 ^ enheder pr. milligram af udgangsmaterialet.

- Tabel II

Eksempler på N-terminalt protease-25 påvirkelige hG-CSF-derivater

Modificeret Substituerende aminosyrer Plasmid* hG-CSF_;__ a Tyr1/ Ile3, Arg4, Ser5......Ser17 NC59 30 b Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5...... Ser17 ND28 c Ile1, thr3. Arg4, Ser5......Ser17 NC95 d Arg4, ...... Ser17 Arg4£ * Aminosyrer efter substitution. Tallet foroven 35 angiver positionstallet for de relevante aminosyrer fra N-terminus.

18 DK 174044 B1

Efter opløsning af udgangsmaterialet i en vandig opløsning, såsom Tris-hydrochloridpuffer eller phosphatpuffer, og tilsætning af et enzym gennemføres den enzymatiske reaktion ved 10-37°C 5 i 30 minutter til 3 dage.

Den totale proteinmaengde og proteinmængden bestemmes ved følgende metoder:

Bestemmelsen af totalt protein foregår ved metoden ifølge M.M.Bradford [M.M.Bradford, Anal.Bio-10 chem, 72, 248 (1976)].

Proteinmængden bestemmes ved SDS-polyacryl-amidgelelektroforese ved metoden ifølge Laemmli [U.K.Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)] efterfulgt af måling på en chromatoscanner (Shimadzu CS-930).

15 Den N-terminale aminosyresekvens af peptidet vundet efter enzymatisk kløvning bestemmes ved anvendelse af en automatisk aminosyre-sekvensbestemmer "Gas-Phase Protein Sequencer Model 470A" (Applied

Biosystems) i kombination med en "Spectra Physics 2 0 high-performance liqued chromatograph".

I endnu et aspekt angår opfindelsen et farmaceutisk præparat omfattende en effektiv mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen, samt en fremgangsmåde 25 fremstilling af et sådant præparat ved anvendelse af polypeptidet ifølge opfindelsen.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

19 DK 174044 B1

Eksempel 1

Konstruktion af hG-CSF-ekspressionsplasmidet pCfTAl (jvf. Fig.1) 5 En portion på 2 ug af pCSFl-2-DNA'et vundet i Referenceeksempel t blev opløst i en total mængde på 20 μΐ af en opløsning (i det følgende betegnet "Y-100-puffer") indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 6 mM 2-mercaptoethanol og 100 10 mM NaCl, der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI (Takara Shuzo, i det følgende var, med mindre andet er angivet, alle de anvendte restriktionsenzymer fra Takara Shuzo), og reaktionen blev 15 gennemført ved 37°C i 4 timer. Fra reaktionsblandingen blev der ved LGT-metoden renset og udvundet 0,4 ug af et 1,5 kb DNA-fragment.

Separat blev 2 ug af plasmidet pLSAl, der var fremstillet ved metoden fra Referenceeksempel 3, 20 opløst i 20 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll (Toyobo) og BamHI, og reaktionen blev gennemført ved 37°C i 4 timer. Fra denne reaktionsblanding blev der ved LGT-metoden renset og udvundet 0,8 25 ug af et 2,8 kb DNA-fragment.

På den anden side blev den følgende DNA-linker syntetiseret for at tilvejebringe de codoner, der koder for den første til den femte N-terminale aminosyre af det modne hG-CSF-polypeptid [threonin1 (ACA 30 eller ACT), prolin2 (CCA eller CCT), leucin^ (CTA), glycin (GGC) og prolin (CCC)J, og den initierings-codon (ATG), der kræves til ekspressionen og til indstilling af afstanden mellem SD-sekvensen og 20 DK 174044 B1 ATG nedstrøms fra tryptophan-promotoren (Ptrp) til en passende længde mellem 6-18 bp:

BanXII Hindlll

Met Thr1 Pro2 Leu3 Gly4 Pro5 5 51 -pGATAftGCTT ATG [aC% | CC% C TA GGC 26 mer (4mix) 3TATTCGaJa TAC TG? ggT gat -5' 20 mer (4mix) Først blev det 26-mere og 20-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved phosphotriestermetoden ^ [R.Crea et al, Proc, Natl.Acad. . Sci.USA, 7j>, 5765 (1978)]. Den 26-mere og 20-mere (hver 2 pg) blev opløst i 40 yl af en puffer (i det følgende betegnet "T4 kinasepuffer") indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA ^ og 1 mM ATP, der blev tilsat 30 enheder T4 polynu-cleotidkinase (Takara Shuzo, i det følgende gælder samme), og phosphoryleringsreaktionen blev gennemført ved 37°C i 60 minutter.

I 25 pi af en puffer (i det følgende betegnet 20 .,,£4 ligase-puffer") indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 1 mM ATP, blev der opløst 0,4 μ g af det på ovennævnte måde vundne pCSF1-2-afledte Apal-BamHI-fragment (1,5 kb) ' og 2 ug af det på ovennævnte måde vundne pLSAl-afledte Banlll-25

BamHI-fragment (2,8 kb), og der blev til blandingen sat 0,1 pg af den ovennævnte DNA-linker. Til denne blandede opløsning blev der yderligere sat 6 enheder T4 DNA-ligase (fra Takara Shuzo, i det følgende gælder det samme), og ligeringsreaktionen blev gennem- 30 o . · ført ved 4 C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding blev anvendt til at transformere E.coli HB101 [Bolivar et al, Gene, 2^, 75 ( 1977)] ved metoden ifølge Cohen 35 et al [S.N.Cohen et al, Proc, Natl.Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] (i det følgende blev denne metode anvendt til at transformere E.coli), og der vandtes ,21 DK 174044 B1 en Apr-koloni. Plasmid-DNA'et udvandtes fra de dyrkede celler af denne koloni, ved den kendte metode [H.C.

Birnboim et al, Nucleic. Acids Res., T_, 151 3 ( 1979)] ( i det følgende anvendtes denne metode til plasmid-DNA-,<raskillelse). Strukturen af det vundne plasmid 5 blev bekræftet ved kløvning med BanIII, Rsal, PstI,

Hindlll og Bglll efterfulgt af agarosegelelektro-forese. Dette plasmid er betegnet pCfTAl. Basesekvensen af pCfTAl i nærheden af Banlll- og Hindlll-stederne blev bekræftet at være følgende ved dideoxy-sekvens-10 bestemmelsesmetoden under anvendelse af Ml 3 phag:

Banlll Hindlll

Met Thr Pro Leu Gly Pro CGAT AjAGCTT ATG ACT CCT CTA GGC CCT

15

Eksempel 2

Konstruktion af plasmidet pCfTB20 manglende en del af den 3'-ikke-translaterbare region af hG-CSF-cDNA*et (jvf. Fig.2) 20 I 20 pi Y-100-puffer blev der opløst 2 yg af det i Eksempel 1 vundne hG-CSF-ekspressionsplasmid pCfTAl (4,3 kb), der blev tilsat 4 enheder af restriktionsenzymet BamHI, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 4 timer. Efter ekstraktion af 25 blandingen med samme volumen phenol og chloroform (i det følgende omtalt som phenol-chloroform-ekstrak-tion) vandtes 1,8 yg af et DNA-fragment ved fældning med ethanol. Dette DNA-fragment blev opløst i 20 yl af en puffer (i det følgende betegnet som "Klenow-30 puffer") indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl^ og 6 mM mercaptoethanol, derefter blev dATP, dTTP, dCTP og dGTP tilsat hver til en koncentration på 1 mM, og efter yderligere tilsætning af 4 enheder DNA polymerase I-Klenowfragment (fra 35 22 DK 174044 B1

Takara Shuzo, i det følgende gælder samme), blev reaktionen gennemført ved rumtemperatur i 1 time, hvorved de fremspringende ender blev omdannet til stumpe ender. Efter phenol-chloroform-ekstraktion 5 udvandtes ved ethanol-faeldning 1,6 yg af et DNA-fragment. Dette DNA-fraiment blev opløst i 20 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder EcoRI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 4 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 10 1 yg af et 2,5 kb DNA-fragment [BamHI(stump)-EcoRI- fragment).

Separat blev 2 yg pCfTAl opløst i 20 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder EcoRI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 4 timer.

15 Derefter blev der tilsat NaCl til en NaCl-koncentration på 150 mM, og derefter tilsat 10 enheder Pral, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 4 timer.

Efter bekræftelse af fuldstændig kløvning ved agarose-gelelektroforese blev 0,2 yg af et hG-CSF-cDNA-holdigt 20 1,0 kb DNA-fragment ( EcoRI—Dral-fragment) renset og udvundet ved LGT-metoden.

I 25 yl T4 ligase-puffer blev der opløst 0,2 yg af BamHI(stump)-EcoRI-fragmentet (2,5 kb) og 0,2 yg af EcoRI-DraI-fragmentet (1,0 kb), hver 25 vundet på ovennævnte måde, der blev til den resulterende blanding sat 6 enheder T4 DNA-kinase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der 30 vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler vundet fra denne koloni udvandtes et plasmid-DNA. Strukturen af det vundne plasmid blev bekræftet ved agarose-gelelektroforese efter kløvning med Hindlll og PstI.

Dette plasmid er betegnet pCfTB20.

Eksempel 3

Konstruktion af plasmiderne, der koder for polypep-tider stammende fra substitution af den N-terminale 35 23 DK 174044 B1 aminosyre af hG-CSFf nemlig pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 og pCfTL41 (jvf. Fig.3) I 60 yl Y-100-puffer blev der opløst 3 yg 5 pCSF1-2 (4,5 kb) vundet ved metoden fra Referenceeksempel 1, der blev tilsat 8 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaktionsblanding vandtes 10 ca. 0,4 yg af et DNA-fragment på ca. 1,5 kb (Apal-BamHl-fragment) indeholdende det meste af hG-CSF-genet.

Separat blev 2 yg pGELI [Sekine et al, Proc.Natl,

Acad.Sci.USA, 82, 4306 (1985)] (vundet fra en kultur 15 af E.coli IGEL1 FERM BP-629 ved den konventionelle metode) (3,4 kb) opløst i 40 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 4 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll, BamHI og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktionsblandingen 20 vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et DNA-fragment på ca. 1,7 kb (PstI-BamHI-fragment) indeholdende den lipoprotein-afledte terminator.

Separat blev 3 yg pKYPlO, fremstillet ved metoden beskrevet i japansk patentansøgning (OPI) 25 nr. 110600/83, opløst i 60 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll (Toyobo) og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et DNA-30 fragment på ca. 1,1 kb (BanIII-PstI-fragment) indeholdende tryptophan-promotoren (Ptrp).

På den anden side blev der, med henblik på nødvendigheden af at erstatte den N-terminale aminosyre fra modent hG-CSF, nemlig Thr, med Ser, Cys, 35 Arg eller Gly, og tilvejebringe initieringscodonen (ATG), der kræves til ekspression, og også med henblik på at indstille afstanden mellem SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp til en passende længde på t 6-18 bp, og endvidere også af andre grunde, fremstillet følgende DNA-linker: 24 DK 174044 B1 5

Ser 26 mer (4mix) Cys

Arg

Banlll Met Gly Pro Leu Gly 5’- I CG ATAAGCTT ATgI NGT| [cCAI CTA t |gGC] C -3’ 10 --1--- 3'- TATTCGAA TAC NCA GGT GAT -5' v 20 mer (4mix) 15 I ovennævnte formel er N én af baserne G, A, T og C.

Først blev det 26-mere og 20-mere enkeltstrengede DNA-syntetiseret ved den almindelige phosphotriester-20 metode. Den 26-mere og den 20 mere (hver 20 picomol) blev opløst i 40 yl T4 kinase-puffer, der blev tilsat 6 enheder T4 polynucleotid-kinase (Takara Shuzo), og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

25 Derefter blev 0,3 μ af det pCSFl-2 afledte

Apal-BamHI-fragment (ca. 1,5 kb), 0,2 yg af det pGELI-afledte Pstl-BamHI-fragment (ca. 1,7 kb) og 0,2 yg af det e*.spressionsvektor pKY10-afleute Banlll-Pstl-fragment (ca. 1,1 kb), hver vundet på ovennævnte 30 måde, opløst i ialt 30 yl T4 ligase-puffer, og der blev til blandingsopløsningen sat ca. 1 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase til opløsningen blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 35 timer.

Den rekombinant·. plasmid-holdige reaktionsblanding anvendtes til at transformere E.coli C600SF8 (FERM BP-1070) [Cameron et al, Proc.Natl.Acad,Sci 25 DK 174044 B1 USA, 12.* 3416 ( 1975)], og der vandtes Apr-kolonier.

Fra disse transformanter blev plasmid-DNA'erne fraskilt og renset ved kendte metoder. Strukturen af hvert af plasmid-DNA'erne blev bekræftet ved kløvning 5 med PstI, EcoRI og Banlll efterfulgt af polyacryl- amidgel-elektroforese. De på denne måde vundne plasmider er betegnet pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 og pCfTL41, som vist i Fig.3. Sekvenserne i nærheden af N-terminus' en af hG-CSF-der i vat-generne i nævnte plasmider TO blev ved dideoxy-sekvensbestemmelsesmetoden under anvendelse af Ml 3 phag bekræftet at være' følgende:

Met Gly Pro Leu Gly Pro Ala pCfTL23 ATG GGT CCA CTA GGC CCT GCC

15 Met Ser Pro Leu Gly Pro Ala

pCfTL38 ATG AGT CCA CTA GGC CCT GCC

Met Cys Pro Leu Gly Pro Ala pCfTL35 ATG TGT CCA CTA GGC CCT GCC

Met Arg Pro Leu Gly Pro Ala 20 pCfTL41 ATG CGT CCA CTA GGC CCT GCC

Substitutionen af den N-terminale Thr i modendt hG-CSF blev bekræftet i det pCfTL23-indkodede hG-25 CSF-derivat, der er betegnet hG-CSF[Gly^]. Tilsvarende blev N-terminal aminosyre-substitution med Ser bekræftet i det pCfTL38-indkodede hG-CSF-derivat, der er betegnet hG-CSF[Ser^], substitution med Cys i det pCfTL35-indkodede hG-CSF-derivat, der er be-30 tegnet hG-CSF[Cys^], og substitution af med Arg i det pCfTL41-indkodede hG-CSF-derivat, der er betegnet hG-CSF[Arg^].

Eksempel 4 35 Konstruktion af plasmider, pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113, der koder for polypeptider stammende fra substitution af den N-terminale og tredie aminosyre fra hG-CSF (jvf. Fig.4) \ 26 DK 174044 B1 I 60 yl Y-100-puffer blev der opløst 3 yg pCSFl-2 (4,5 kb), vundet ved fremgangsmåden fra Referenceeksempel 1, der blev tilsat 8 enheder af hver af Apal og BamHI, og kløvningsreaktionen gennem-5 førtes ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaktionsblanding vandtes ved LGT-metoden ca. 0,4 yg af et DNA-fragment på ca. 1,5 kb (Apal-BamHI-fragment) indeholdende det meste af hG-CSF-genet.

Separat blev 2 yg pGELl (3,4 kb) opløst i 10 40 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 4 enheder af hver af restriktionsenzymerne Hindlll, BamHI og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaktionsblanding vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et DNA-fragment på ca.

15 1,7 kb (Pstl-BamHI-fragment) indeholdende lipoprotein- terminatoren.

Yderligere blev separat 3 yg pKYPlO, fremstillet ved metoden beskrevet i japansk patentansøgning (OPI) nr. 110600/83, opløst i 60 yl Y-100-puffer, 20 der blev tilsat 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaktionsblanding vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et Ptrp-holdigt DNA-fragment på ca. 1,1 kb (Banlll-25 Pstl-fragment).

Med henblik på nødvendigheden af at substituere den N-terminale aminosyre Thr fra modent hG-CSF med Ser og den tredie aminosyre Leu fra modent hG-CSF med en af Gly, Ser, Cys og Arg og tilvejebringe 30 initieringscodonen (ATG), der kræves til ekspression, og også med henblik på det nødvendige i at indstille afstanden mellem SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp på en passende længde på 6-18 bp, og også af andre grunde, blev der syntetiseret følgende DNA-35 linker: 27 DK 174044 B1 (4mix) G1^ 26-mer Ger 5 Cys

Met Ser Pro Arg Gly 5' - CG ATA AGCTT ATG AGT CCA NGT GGC C - 3' 3’ - TAT TCGAA TA C TCA GGT NCA - 5' 10 20 - mer (4mix) 15 I ovennævnte formel er N en af baserne G, A, T og C.

Først blev det 26-mere og 20-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-photriestermetode. Den 26-mere og 20-mere (hver 2o 20 picomol) blev opløst i 40 yl T4 kinase-puffer, der blev tilsat 6 enheder T4 polynucleotid-kinase, og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,3 yg af det pCSFI-2-afledte Apal-25 BamHI-fragment (ca. 1,5 kb), 0,2 yg af det pGEL1-afledte PstI-BamHI-fragment (ca. 1,7 kb) og 0,2 yg af Banlll-PstI-fragmentet (ca. 1,1 kb) fra ekspressionsvektoren pKYPlO, hver vundet på den ovennævnte måde, opløst i 30 yl T4-ligasepuffer, og 30 ca. 1 picomol af den ovennævnte DNA-linker blev sat til blandingsopløsningen. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase til opløsningen blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

35 Den rekombinant plasmid-holdige reaktions blanding anvendtes til at transformere E.coli C600SF8 (FERM BP-1070) ved metoden ifølge Cohen et al, og Apr-kolonier vandtes. Plasmid-DNA'erne blev fraskilt 28 DK 174044 B1 og renset fra disse transformanter ved kendte metoder . Strukturen af hvert af nævnte plasmid-DNA'er blev bekræftet ved kløvning med PstI, EcoRI og Banlll efterfulgt af polyacrylamidgelelektroforese. De på ovennævnte måde vundne plasmider er betegnet pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113, som vist i Fig.4.

Sekvenserne i nærheden af N-terminus1 en af de hG-CSF-derivat-indkodende gener blev ved dideoxy-sekvens-bestemmelsesmetoden ved anvendelse af Ml 3 phag be-^q kræftet at være følgende:

Met Ser Pro Cys Gly Pro Ala

pCf TM14 - ATG AGT CCA TGT GGC CCT GCC

15 -

Met Ser Pro Arg Gly Pro Ala

pCf TM17 - ATG AGT CCA CGT GGC CCT GCC

Met Ser Pro Ser Gly Pro Ala

pCfTMH3 - ATG AGT CCA AGT GGC CCT GCC

20

Substitutionen af den N-terminale Thr og 25 den tredie aminosyre Leu fra modent hG-CSF med henholdsvis Ser og Cys blev bekræftet i det pCfTM14- indkodede derivat, der er betegnet hG-CSF[Ser ,

Cys ]. Tilsvarende blev substitutionen af den N-terminale Thr og den tredie aminosyre Leu med hen-3Q holdsvis Ser og Arg bekræftet i det pCfTMI7-indkodede derivat, der er betegnet hG-CSF[Ser\ Arg3], og substitutionen af den N-terminale Thr og den tredie aminosyre Leu med henholdsvis Ser og Ser bekræftet i det pCfTM!13-indkodede derivat, der er betegnet 35 hG-CSF[Ser^, Ser3].

Eksempel 5 (1) Konstruktion af det rekombinante plasmid 29 DK 174044 B1 pCfWDI (jvf. Fiq.5) I 50 μΐ Y-100-puffer blev der opløst 5 yg pCfTAl vundet ved fremgangsmåden fra Eksempel 1, 5 der blev opløst 10 enheder af restriktionsenzymet Stul og 10 enheder af restriktionsenzymet Banlll (Toyobo), og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ca. 0,5 yg af et hG-CSF-cDNA-holdigtDNA-fragment 10 på ca. 1,3 kb (BanIII-Stul-fragment). Separat blev 3 yg pKYP26, fremstillet ved fremgangsmåden fra Referenceeksempel 2, opløst i 50 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 6 enheder BamHI, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 30°C i 1 time.

15 Hertil blev der sat samme volumen phenol mættet med 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA.

Efter kraftig omrøring blev det vandige lag indsamlet ved lavhastigheds-centrifugering (3.300 rpm, 10 minutter, i det følgende er samme betingelser anvendt).

20 Samme volumen chloroform blev tilsat, og efter kraftig omrøring blev det vandige lag indsamlet ved lavhastigheds-centrifugering. 1/10 Volumen 3 M natriumacetat blev tilsat, derefter blev der tilsat 2,5 voluminer ethanol, og blandingen blev henstillet 25 ved -20°C i 1 time. Bundfaldet blev indsamlet ved kold centrifugering (4°C, 11.000 rpm, 10 minutter).

Dette bundfald blev opløst i 30 yl Klenow-puffer, der blev tilsat dATP, dTTp, dCTP og dGTP, hver til en koncentration på 100 yM, derefter blev der tilsat 30 2 enheder DNA-polymerase I-Klenowfragment, og reak tionen gennemførtes ved 17°C i 15 minutter. DNA-polymerase I-Klenowfragmentet blev inaktiveret ved behandling ved 68°C i 10 minutter, derefter blev der tilsat NaCl til en koncentration på 100 mM, 35 der blev tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet PstI, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,6 yg af et Jlpp-terminator-holdigt 30 DK 174044 B1 DNA-fragment på ca. 1,8 kb [BamHI(stump)-PstI-fragment]. Separat blev 4 yg pGELl opløst i 40 μΐ Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af hver af restriktionsenzymerne Banlll (Toyobo) og PstI, og digererings-5 reaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time, og fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 0,4 yg tryptophan-promotorholdigt DNA-fragment på ca.

1 kb (Banlll-Pstl-fragment).

Ca. 0,2 yg af det pCfTAl-afledte Banlll-Stul-10 fragment (ca. 1,3 kb), og ca. 0,1 yg af det pKYP26-afledte BamHI(stumg^-Pstl-fragment (ca. 1,8 kb) og ca. 0,1 yg af det pGELI-afledte BanIII-Pst-fragment (ca. 1 kb) blev opløst i 30 μΐ T4 DNA ligase-puffer, der blev tilsat 4 enheder T4 DNA-ligase, og ligerirgs-15 reaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at trans-formere E.coli HB101, og en Ap -koloni vandtes, og plasmid-DNA’et udvandtes fra denne koloni ved den ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved 20 vandtes pCfWDI vist i Pig.5.

(2) Konstruktion af pCfT95K19 (jvf. Fig.6) I 50 yl Y-100-puffer blev der opløst 5 yg 25 af det ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 3 vundne pCfTL38, der blev tilsat 10 enheder af hver af restriktionsenzymerne Hindlll og BgLIII, og digererings-reaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Ca. 0,7 yg af et tryptophan-promotorholdigt DNA-fragment på ca.

30 2,6 kb (HindIII-BglII-fragment) vandtes fra reak tionsblandingen ved LGT-metoden. Separat blev 100 yg pCfTL38 opløst i 1,5 ml Y-100 puffer, der blev tilsat 80 enheder af hver af restriktionsenzymerne BamHI og Hindlll, og digereringsreaktionen gennemførtes 35 ved 37°C i 6 timer. Et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-frag- ment udvandtes fra reaktionsblandingen ved LGT-metoden

TM

og blev renset ved anvendelse af ELUTIP -d (Schleicher SSchuell). Dette DNA-f ragment blev opløst i et totalt 31 DK 174044 B1 volumen på 90 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 150 mM NaCl og 6 mM 2-mercaptoethanol (i det følgende omtalt som "Y-150-puffer”), der blev tilsat 3 enheder af restrik-5 tionsenzymet Dpnl (Boehringer Mannheim), og digere-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 15 minutter.

Ca. 1 yg af et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-fragment på ca. 300 bp (HindIII-DpnI-fragment) vandtes fra reaktionsblandingen ved polyacrylamidgelelektro-10 forese.

Separat blev 10 yg pCfTB20, vundet ved fremgangsmåden fra Eksempel 2, opløst i 100 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af restriktions-enzyme:t Aval, og digereringsreaktionen gennemførtes 15 ved 37°C i 1 time. Det fra digereringsblandingen ved phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning udvundne DNA blev opløst i 30 yl Klenow-puffer, der blev tilsat 2 enheder DNA-polymerase I-Klenow-fragment, og reaktionen gennemførtes ved 17°C i 20 30 minutter. DNA-polymerase I-Klenowfragmentet blev inaktiveret ved behandling ved 68°C i 10 minutter, der blev tilsat NaCl til 100 mM, derefter tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet Bglii, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time.

25 Ca. 0,3 yg af et £pp-terminatordelholdigt DNA-fragment på ca. 480 bp [Aval(stump)-BgllI-fragment] vandtes frå reaktionsblandingen ved LGT-metoden.

I 30 yl T4 DNA-ligasepuffer blev der opløst ca. 0,1 yg af det pCfTL38-afledte Hindlll-Bglll-30 fragment (ca. 2,6 kb), ca. 0,2 yg af det pCfTL38-afledte HindIII-DpnI-fragment (ca. 300 bp) og ca.

0,15 yg af det pCfTB20-afledte Aval(stump)-BgIII-fragment (ca. 480 bp) hvert vundet på ovennævnte måde, og efter tilsætning af 4 enheder T4 DNA-ligase 35 blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer. Reaktionsblandingen anvendtes til at transformere E.coli HB101, og en Apr-koloni vandtes. Fra denne koloni blev der udvundet plasmid-DNA'et ved 3 2 DK 174044 B1 ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfT95K19 vist i Fig.6.

(3) Konstruktion af pCfÅAl (jvf. Fig.6) 5 I 50 μΐ Y-100-puffer blev der opløst 5 ug pCfT95Kl9 vundet som beskrevet i den foregående del. Hertil blev der sat 7 enheder af restriktionsenzymet Banlll (Toyobo) og 2 enheder Bgll {Nippon 10 Gene), og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,6 ug af tryptophan-promotordelhol-digt DNA-fragment på ca. 1 kb (BanIII-BglI-fragment) og ca. 1 yg af et ί-ρρ-terminatordelholdigt DNA-frag-ment på ca. 1,8 kb (Bgll-Bgll-fragment).

Separat blev 15 ug pCfT95K19 opløst i 150 ul Y-100-puffer, der blev tilsat 6 enheder af restriktionsenzymet Bgll (Nippon Gene) og 10 enheder Sau3A, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2Q 1 time. Polyacrylamidgelelektroforese af reaktions- blandingai gav ca. 0,3 ug af et hG-CSF-cDNA-delholdigt DNA-fragment på ca. 350 bp (BglI-Sau3A-fragment).

Yderligere blev der separat syntetiseret følgende DNA-linker: 25

Banlll 39 mer (2mix) Xhol Sau3A

Met Thr Pro Leu Gly Pro Asn Ser Ser 51-CGATAAGCTT ATG ACA CCA CT£ GGC CCA AAC TCG AGT CT -3' 30 H A ‘“—I _ 3' - TATTCGAA TAC TGT GGT GA? CCG GGT TTG AGC TCA GACTAGr-5' V * Ψ i- 41 mer (2mix) 35 33 DK 174044 B1 Først blev det 39-mere og 41-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-photriestermetode. Den 39-mere og 41-mere (hver 20 picomol) blev opløst i et totalt volumen på 40 yl 5 T4 DNA-kinasepuffer, der blev tilsat 6 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara Shuzo), og phosphoryle-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfTS5K19-afledte BanIII-BglI-fragment (ca. 1 kb), 0,05 yg Bgll-10 BglI-fragmentet (ca. 1,8 kb) og 0,1 yg af BglI-Sau3A-fragmentet (ca. 350 bp), hvert vundet på ovennævnte måde, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, efterfulgt af tilsætning af ca. 2 picomol af ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder j 5 T4 DNA-ligase blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at transformere E.coli HB101, der vandtes en Apr-koloni, og plasmid-DNA*et blev udvundet fra denne koloni 20 ved ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfAAl vist i fig. 6. Bestemmelse af basesekvensen af linkerdelen af pCfAAl ved ovennævnte dideoxy-sekvensbestemmelsesmetode viste, at den tredie base af den codon, der koder for den fjerde aminor 25 syre Leu, er A. I dette pCfAAl mangler den DNA-del, der koder for de 14 aminosyrer fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys af hG-CSF. Yderligere er sådan mutation blevet indført, der ændrer den 6. aminosyre af hG-CSF fra Ala til Asn , og der er 30 nu et nyt Xhol-sted.

(4) Konstruktion af pCfAB5 (jvf. Fig, 6) I 30 yl Y-100-puffer blev der opløst 3 yg 35 pCfAAl vundet som beskrevet i den foregående del, der blev tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet Xhol, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Efter bekræftelse af fuldstændig 34 DK 174044 B1

Xhol-kløvning ved agarosegelelektroforese blev der tilsat 1 enhed af restriktionsenzymet Bgll (Nippon Gene), og partiel digerering gennemførtes ved 37°C i 25 minutter. Fra reaktionsblandingen vandtes ved 5 LGT-metoden ca. 1 yg af et tryptophan-promotordel-og Jlpp-terminatordel-holdigt DNA-fragment på ca.

3 kb (XhoI-Bgll-fragment). Separat blev følgende DNA-linker syntetiseret:

Xhot 10 Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu TCG AGT CTA CCA CAG AGC TTC CT 23 mer ^CA GAT GGT GTC TCG AAG GAAAATTT 25 mer (25)

''G ly' Sau3A

15 Leu Lys Arg Leu Glu Gin Val Arg Lys) TTTA AAA NGC TTA GAG C AA GTG AGG AAl_ 27 mer (4mix) T NCG AAT CTC GTT CAC TCC TTCTAGl 25 mer (4mix) (N er G, A, T eller C).

20 (N er G, A, T eller C).

Dette linker-DNA indeholder den DNA-del, der koder for de 14 aminosyrer fra hG-CSF fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys. En 25 sådan del mangler i hG-CSF-cDNA'et fra pCfAAl.

Først blev det 27-mere, 25-mere (to slags) og 23-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phosphotriestermetode. De med hinanden komplementære 27-mer- og 25-mer-DNA'er og 30 de med hinanden komplementære 25-mer- og 23-mer-DNA'er blev opløst parvis, og hver i en mængde på 20 picomol, i et totalt volumen på 40 yl T4 kinase-puffer. Til hver opløsning blev der sat 6 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara Shuzo), og phosphory-35 leringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfAAl-afledte XhoI-Bgll-fragment (ca. 3 kb), vundet som ovenfor 35 DK 174044 B1 beskrevet, og 0,1 yg af det pCfT95K19-afledte Bgll-Sau3A-fragment (ca. 350 bp), vundet som beskrevet i det foregående afsnit, opløst i 30 μΐ T4 DNA-ligase-puffer, og der blev til blandingsopløsningen sat 5 2 picomol af hver af de ovennævnte DNA-linkerdele.

Yderligere blev der tilsat 6 enheder T4 DNA-ligase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen blev anvendt til at trans-10 formere E.coli i HB101, og Apr-kolonier vandtes.

Fra disse kolonier blev der udvundet plasmid-DNA*erne ved ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfAB5 og pCfAB14 vist i Fig.6. Bestemmelse af basesekvensen for DNA-linkerdelen af pCfAB5 og af 15 pCfAB14 ved ovennævnte dideoxy-sekvensbestemmelses-metode viste, at den første base af den codon, der koder for den 17. aminosyre, er A i pCfAB5 og T i pCfAB14, og nævnte codon er derfor for Ser (AGC) i fiarsUmrite og for Cys (TGC) i sidstnævnte, hvilket fører til 20 substitutionen af Ser for den 17. aminosyre Cys i modent hG-CSF i pCfAB5, men ingen substitution i pCfAB14.

Eksempel 6 25 (1) Konstruktion af pCfBA8 og pCfBA32 (jvf. Fig.7) I 40 yl Y-100-puffer blev der opløst 3 yg pCfAB5 vundet som beskrevet i den foregående del, der blev tilsat 5 enheder af hver af restriktions-30 enzymerne Aval og Bgll, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 1 y af et tryptophan-promotordel- og jipp-terminatordel-holdigt DNA-frag-ment på ca. 2,8 kb (AvaI-BglII-fragment).

35 Separat blev 6 yg pCfWBI, vundet som beskrevet i del 1, opløst i 50 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet Bglll, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time.

36 DK 174044 B1

Agarosegelelektroforese bekræftede, at kløvningen med Bglll var fuldstændig. Derefter blev der tilsat 3 enheder af restriktionsenzymet Aval, og partiel kløvning blev gennemført ved 37°C i 20 minutter.

5 Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 0,4 yg af et DNA-fragment (ca. 1,3 kb) indeholdende det meste af hG-CSF’et (Bgll-Aval-fragment).

Derefter blev 0,1 yg af det pCfABs-afledte Aval-BgIII-fragment (ca. 2,8 kb) og 0,3 yg af det 10 pCfVID 1-afledte Bglll-Aval-fragment (ca. 1,3 kb), hver vundet som ovenfor beskrevet, opløst i 25 yl T4 DNA-ligase-puffer, der blev' tilsat 3 enheder T4 DNA-1 i gase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at trans-15 formere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni.

Fra denne koloni blev plasmid-DNA*et udvundet ved den ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfBA8.

Aminosyresekvensen af det af pCfBA8 indkodede 20 hG-CSF-derivat . indeholder Asn i stedet for den 6.aminosyre Ala af" modent hG-CSF og Ser i stedet for den 17.aminosyre Cys deraf. I det følgende er dette derivat betegnet hG-CSF(NA8).

På den anden side blev 3 yg pCfAB14, vundet 25 som beskrevet i den foregående del, opløst i 40 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Aval og Bglll, og digere-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time.

Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 30 ca. 1 yg af et tryptophanpromotordel- og ipp-termina-tordel-holdigt DNA-fragment på ca. 2,8 kb (Aval-BglIi-fragment).

Separat blev 6 yg pCfWDI, vundet som beskrevet i sektion 1, opløst i 50 yl Y-100-puffer, der blev 35 tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet Bglll, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Efter bekræftelse af fuldstændig Bglll-kløvning ved agarosegelelektroforese blev der tilsat 3 enheder 37 DK 174044 B1 af restriktionsenzymet Aval, og partiel kløvning gennemførtes ved 37°C i 20 minutter. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 0,4 yg af et DNA-fragment (ca. 1,3 kb) indeholdende det meste 5 af hG-CSF-cDNA'et (BglII-AvaI-fragment).

Derefter blev 0,1 yg af det pCfABI4-afledte Aval-BglII-fragment (ca. 2,8 kb) og 0,3 yg af det pCfWDI-afledte BglII-AvaI-fragrnent (ca. 1,3 kb), hver vundet som ovenfor beskrevet, opløst i 25 yl 10 T4 DNA-ligasepuffer, der blev tilsat 3 enheder T4 DNA-ligase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni, 15 og fra denne koloni blev plasmid-DNA'et udvundet ved den ovennævnte metode ifølge Birnboim et al.

Herved vandtes pCfBA32 vist i Fig.7.

Aminosyresekvensen af hG-CSF-derivatet indkodet af pCfBA32 indeholder Asn' i stedet for den 6.amino-20 syre Ala fra modent hG-CSF.

(2) Konstruktion af pCfBBIOI

I 50 yl Y-100-puffer blev der opløst 6 yg 25 pCfBA8, vundet som beskrevet i den foregående del, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet Banlll (Toyobo), 8 enheder Bglll og 8 enheder Xhol, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-30 metoden ca. 0,6 yg af et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-fragment på ca. 1,4 kb (XhoI-BglII-fragment) og ca. 0,8 yg af et tryptophanpromotordel-holdigt Defragment på ca. 2,7 kb (BanIII-BglII-fragrnent).

Separat blev følgende DNA-linker syntetiseret: 35 38 DK 174044 B1 31 mer Xhol

Banlll i Met Ala Pro Thr Arg Ser Ala 5 1 "jCGATAAGCTT ATG GCA CCA ACA AGA AGC GCC -3’ 3'- TATTCGAA TAC CGT GGT TGT TCT TCG CGG AGCTj -5'

Ψ V

33 mer 10 Først blev det 31-mere og 33-mere enkelt strengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-photriestermetode. Den 31-mere og 33-mere (hver 2yg) blev opløst i et ialt 40 yl T4 kinase-puffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara 15 Shuzo), og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte BanIIΙ-BglII-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Xhol-Bg IH-fragment (ca. 1,4 20 kb-fragment), hver vundet som ovenfor beskrevet, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, og ca. 2 pico-mol af den ovennævnte DNA-linker blev sat til blandingsopløsningen. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase blev ligeringsreaktionen gennemført 25 ved 4°C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler stammende fra denne koloni blev der udvundet plasmid-DNA'et.

30 Herved vandtes pCfBBIOI, som vist i Fig.7. Amino- syresekvensen af det af pCfBB101 indkodede hG-C SF-derivat indeholder Ala, Thr, Arg, Ser og Ser i stedet for henholdsvis den første aminosyre Thr, den tredie aminosyre Leu, den fjerde aminosyre Gly, den femte 35 aminosyre Pro og den syttende aminosyre Cys fra modent hG-CSF. I det følgende er dette derivat betegnet hG-CSF[NB101].

39 DK 174044 B1 (3) Konstruktion af pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76 , pCfBC77 , pCfBC'93 , pCfBC95, og pCfBC97 (jvf. Fiq.8) 5 Først blev den følgende DNA-linker synteti seret: 31 mer (128mix) Xhol 10 Banin Met-(16)-Pro-(8)-Arg Ser Ala 5 '-jsGATAAGCTT ATG NNT CCA g NA AGA AG C GCC -3' 31 -TATTCGAA TAC NNA GG ijNT TCT TCG CGG AGCt[ -5’

Ψ · 'V

33 mer (128mix) 15 (N er én af G, A, T og C).

I denne syntetiske DNA-linker er de tre baser, der hver er repræsenteret ved N, hver uafhængigt G, A, T og C, og én base er G eller A (i tilfælde 20 af den 31-mere) eller C eller T (i tilfælde af den 33-mere), og denne linker vindes derfor som en blanding af ialt 128 DNA-linkere. Strukturen af denne linker er følgelig en sådan, at der, i den N-terminale hG-CSF-aminosyresekvens indkodet af denne linker, 25 er mulighed for 16 forskellige aminosyrer som aminosyren næst efter Met og for 8 forskellige aminosyrer som aminosyren næst efter Pro, og dermed er 128 aminosyresekvenser ialt mulige.

Først blev det 31-mere og 33-mere enkelt-30 strengede DNA syntetiseret ved den almindelige phosphotriestermetode. Den 31-mere og 33-mere (hver 2 yg) blev opløst i et totalt volumen på 40 yl T4 kinasepuffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynu-cleotid-kinase (Takara Shuzo), og phosphorylerings-35 reaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte BanIII-BglII-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Xhol-BgIII-fragment (ca. 1,4 40 DK 174044 B1 kb-fragment), hver vundet i Eksempel 6, opløst i 25 pi T4 DNA-ligasepuffer, og der blev til blandingsopløsningen sat ca. 2 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder 5 T4 DNA-ligase blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der vandtes Apr-kolonier. Fra dyrkede celler fra disse 10 kolonier blev plasmid-DNA’erne udvundet. Der vandtes herved pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97. Bestemmelse af basesekvensen i hver DNA-linkerdel ved den ovennævnte dideoxy-sekvensbestemmelsesmetode viste, 15 at basesekvenserne på den N-terminale side af hG-CSF-derivater er følgende:

Met Thr Pro Glu Lys Ser Ala pCf BC42B1 ATG ACT CCA G AA AAA AGC GCC

20 Met Val Pro Ile Arg Ser Ala

pCfBC45 ATG GTT CCA ATA AGA AGC GCC

Met Cys Pro Ile Arg Ser Ala pCfBC52 ATG TGT CCA ATA AGA AGC GCC

s'

Met Tyr Pro Ile Arg Ser Ala 25 pCfBC59 ATG TAT CCA ATA AGA AGC GCC

Met Arg Pro Thr Arg Ser Ala pCfBC76 ATG CGT CCA ACA AGA AGC GCC

Met Thr Pro Thr Arg Ser Ala pCfBC77 ATG ACT CCA ACA AGA AGC GCC

30 Met Asn Pro Glu Arg Ser Ala

pCf BC93 ATG AAT CCA G AA AGA AGC GCC

Met Ile Pro Thr Arg Ser Ala pCfBC95 ATG ATT CCA ACA AGA AGC GCC

Met Ser Pro Thr Arg Ser Ala 35 pCfBC97 ATG AGT CCA ACA AGA AGC GCC

41 DK 174044 B1

De substituerende aminosyrerester i de af disse plasmider indkodede hG-CSF-derivater er, sammenlignet med modent hG-CSF, følgende: 5

Position af aminonyresubstitution _(aminosyre af hG-CSF) ^ ^ 10 1. - 3. 4 5, 17.·

Plasntid (Thr) (Leul (Giv) (Pro) (Cys) pCfBC42Bl -* Glu Lys Ser Ser pCfBC45 Val Ile Arg Ser Ser 15 pCfBC52 Cys Ile Arg Ser Ser pCfBC59 Tyr Ile Arg Ser Ser pCfBC76 Arg . Thr Arg Ser Ser pCfBC77 -* Thr Arg Ser Ser 20 pCfBC93 Asn Glu Arg Ser Ser pCfBC95 Ile Thr Arg Ser Ser pCfBC97 Ser Thr Arg Ser Ser 2^ * Ingen substitution 42 DK 174044 B1 hG-CSF-Derivaterne indkodet af pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97 er i det følgende betegnet som henholdsvis hG-CSF[NC42B1], hG-CSF[NC45], hG-CSF[NC52], 5 hG-CSF[NC59], hG-CSF[NC76]f hG-CSF[NC77], hG-CSF[NC93], hG-CSF[NC95] og hG-CSF[NC97].

(4) Konstruktion af pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82 10 Der blev først syntetiseret den følgende DNA-linker: 31 mer (256mix) Xhol

BajiIII Met Ala Pro (4) (4) (4) (4) 5 ' -(GGATAAGCTT ATG GCA CCA NCA NAT NGC GNC -3' 3 1 -TATTCGAA TAC CGT GGT NGT NTA NCG CNG AGCtI -5» 33 mer (256mix) 20 (N er én af G, A, T og C).

I denne DNA-linker er de fire baser repræsenteret ved N uafhængigt G, A, T eller C, og linkeren vindes følgelig som en blanding af ialt 256 forskellige DNA-linkere. Strukturen af denne DNA-linker 25 er følgelig en sådan, at der, i den N-terminale hG-CSF-aminosyresekvens indkodet af DNA-linkeren, er mulighed for fire aminosyrer i hver af de fire omhandlede positioner, og dermed er der mulighed for ialt 256 forskellige aminosyresekvenser.

30 Først blev det 31-mere og 33-mere enkelt strengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-photriestermetode. I ialt 40 yl T4 kinase-puffer blev der opløst 2 yg af hver af den 31-mere og 33-mere, der blev tilsat 30 enheder T4 polynulceotid- 35 kinase (Takara Shuzo), og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Banlll-Bglll-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg 43 DK 174044 B1 af det pCfBA8-afledte XhoI-BglII-fragment (ca. 1,4-kb-fragment), hver vundet i Eksempel 6, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, og der blev til blandingsopløsningen sat ca. 2 picomol af den ovennævnte 5 DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

Den vundne rekombinant plasmid-blanding blev anvendt til at transformere E.coli HB101, og der 10 vandtes Apr-kolonier. Fra dyrkede celler fra disse kolonier udvandtes de respektive plasmider. Herved vandtes pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82. Bestemmelse af basesekvensen i DNA-linkerdelen ved den ovennævnte dideoxy-sekvensbestemmelsesmetode viste, 15 at basesekvenserne på den N-terminale side af hG-CSF-derivaterne er følgende:

Met Ala Pro Thr Tyr Arg Ala pCfBD28 ATG GCA CCA ACA TAT CGC GCC

20 Met Ala Pro Ser Asn Ser Ala

pCfBD56 ATG GCA CCA TCA AAT AGC GCC

Met Ala Pro Pro Asn Arg Gly pCfBD82 ATG GCA CCA CCA AAT CGC GGC

25 De erstattende aminosyrerester i hG-CSF-deriva- terne indkodet af disse plasmider, sammenlignet med modent hG-CSF, er som følger:

Position af aminosyre subs ti tut ion 30 (aminosyre af Plasmid hG-CSF)_ pCf BD28 pCfBD56 pCfBD82 1st (Thr) Ala Ala Ala 3rd (Leu) Thr Ser Pro 4th (Gly) Tyr Asn Asn 5th (Pro) Arg Ser Arg 6th (Ala) -1 Gly 35 17th (Cys) Ser Ser Ser

Ingen substitution 44 DK 174044 B1 hG-CSF-derivaterne indkodet af pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82 er i det følgende betegnet henholdsvis hG-CSF[ND28], hG-CSF[ND56] og hG-CSF[ND82}. En E.coli-stamme husende pCfBD56, E.coli ECfBD56, og en E.collie stamme husende pCfBD28, E.coli ECfBD28, er deponeret i the Fermentation Research Institute under løbenumrene henholdsvis FERM BP-1221 og FERM ΒΡ-Ί479 i henhold til Budapesttraktaten.

10 (5) Konstruktion af pCfTNS7 (jvf. Fig.14)

Der blev syntetiseret følgende DNA-linker: 18 mer

Banlll xho1 15 j Met Pro Ala 5 1 -jcGATAAGCT ATG CCA GCC -3' 3 * - TATTCGA TAC GGT CGG AGCtI -5’ Ψ * 20 mer 20 Ifølge strukturen af denne DNA-linker mangler de fire aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 4.aminosyre Gly fra den N-terminale aminosyre-sekvens fra hG-CSF i den af linkeren indkodede N-terminale aminosyresekvens.

25 Først blev det 18-mere og 20-mere enkelt strengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-photriestermetode. Den 18-mere og 20-mere (hver 2 pg) blev opløst i ialt 40 μΐ T4 kinase-puffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara 30 Shuzo), og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte BanIII-BglII-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Xhol-BglII-fragment (ca. 1,4 35 kb), hver vundet i Eksempel 6, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, der blev til blandingsopløsningen sat ca. 2 picomol af den ovennævnte DNA-linker, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 45 DK 174044 B1 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler fra denne 5 koloni udvandtes plasmidet. Herved vandtes pCfTNS7.

Det af pCfTNS7 indkodede hG-CSF-derivat er i det følgende betegnet hG-CSF[Δ1-4S].

(6) Konstruktion af pCfTAArg4S (jvf. Fig.14) 10

Der blev syntetiseret følgende DNA-linker: 31 mer (4mix) /Arg\

Banlll [lylj 15 I Met Thr Pro LeuXlu'Pro Ala 5 ’-jCGATAAGCTT ATG ACA CCA CTA CCA GCC -3' 3'-TATTCGAA TAC TGT GGT GAT ££T GGT CGGAGCtI -5» 33 mer (4mix) 20 I denne DNA-linker er de to baser hver uafhængigt A eller G, og nævnte linker vindes følgelig som en blanding af ialt fire DNA-linkere. Strukturen af denne DNA-linker er følgelig en sådan, at fire 25 aminosyrer er mulige som den 4.aminosyre i den N- terminale hG-CSF-aminosyresekvens indkodet af denne linker.

Først blev det 31-mere og 33-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phos-30 photriestermetode. Den 31-mere og 33-mere (hver 2 yg) blev opløst i et totalt volumen på 40 yl T4 kinase-puffer, der blev tilsat 30 enheder T4 poly-nucleotidkinase (Takara Shuzo), og phosphorylerings-reaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

35 Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte

Banlll-BgIII-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Xhol-BgIII-fragment (ca. 1,4 kb-fragment), hver vundet som beskrevet i sektion 46 DK 174044 B1 (1), opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, og der blev til blandingsopløsningen sat ca. 2 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase blev ligerings-5 reaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-bland-ing anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler fra denne koloni udvandtes plasmidet. Herved vandtes 10 pCfTAArg4S. Bestemmelse af basesekvensen af DNA-linkerdelen ved den ovennævnte dideoxy-sekvensbe-stemmelsesmetode viste, at den N-terminale basesekvens af hG-CSF-derivatet er som følger:

Met Thr Pro Leu Arg Pro Ala 15 pCfTAArg4S ATG ACA CCA CTA AGA CCA GCC

Det af pCfTAArg4S indkodede hG-CSF-derivat er i det følgende betegnet hG-CSF[Arg^, Ser^].

20 (7) Konstruktion af pCfTN205 (jvf. Fig.15) I 40 yl K-150 puffer (sammen som Y-100-puffer bortset fra anvendelse af 150 mM KC1 i stedet for 100 mM NaCl) blev opløst 3 yg pCfTNS? vundet i sektion 5, 25 der blev tilsat 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Pvul og Xhol, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et tryptophan-promotordel-holdigt DNA-fragment på ca. 1,0 kb (Pvul-30 Xhol-fragment}.

Separat blev 3 yg pCfBA32, vundet i sektion 1, opløst i 40 yl K-150-puffer, der blev tilsat 5 enheder af hvert, af restriktionsenzymerne Pvul og Xhol, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time.

35 Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 2 yg af et ca. 3,0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) indeholdende det meste af hG-CSF-cDNA'et.

47 DK 174044 B1

Derefter blev 0,1 pg af det pCfTNS7-afledte Pvul-Xhol-fragment (ca. 1,0 kb) og 0,3 ug af det pCfBA32-af-ledte Xhol-Pvul-fragment (ca. 3,0 kb), hver vundet på ovennævnte måde, opløst i 25 pi T4 DNA-ligasepuffer, 5 der blev tilsat 3 enheder T4 DNA-ligase, og ligererings-reaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at transformere E. coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni, og plasmid-DNA’et udvandtes fra denne koloni ved den ovennævnte me-10 tode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfTB205 vist i fig. 15.

I aminosyresekvensen af det af pCfTN205 indkodede hG-CSF-derivat mangler den første til den fjerde aminosyre fra modent hG-CSF. I det følgende er dette derivat 15 betegnet hG-CSF[A1-4].

(8) Konstruktion af pCfTAArg4 (jvf. Fig. 15) I 40 yl K-150-puffer blev der opløst 3 pg 20 pCfTAArg4S vundet i sektion 6, der blev tilsat 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Pvul og Xhol, og dige-reringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen udvandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 pg af et trypthophanpromotordel-holdigt DNA-fragment på 25 ca. 1,0 kb (Pvul-Xhol-fragment).

Separat blev 3 pg pCfBA32, vundet i sektion 1, opløst i 40 pi K-150-puffer, der blev tilsat 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Pvul og Xhol, og digere-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra 30 reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 2 pg af et ca. 3,0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) indeholdende det meste af hG-CSF-cDNA'et.

Derefter blev 0,1 pg af det pCfTAArg4S-afledte Pvul-Xhol-fragment (ca. 1,0 kb) og 0,3 pg af det 35 pCfBA32-afledte Xhol-Pvul-fragment (ca. 3,0 kb), hver vundet på ovennævnte måde, opløst i 25 pi T4 DNA-ligasepuf fer, der blev tilsat 3 enheder T4 DNA-ligase, og lige- 48 DK 174044 B1 ringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at transformere E. coli HB101, der vandtes en Apr-koloni, og plasmid-DNA'et udvandtes fra denne koloni ved den ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfTAArg4 5 vist i fig. 15.

Den fjerde aminosyre i aminosyresekvensen af hG-CSF-derivatet indkodet af pCfTAArg4 er Arg i stedet for Gly i modent hG-CSF. I det følgende er dette derivat betegnet hG-CSF[Arg4].

10 (9) Konstruktion af pCfTNS301 (jvf. Fig. 16).

I 50 pi Y-100-puffer blev der opløst 6 pg pCfBA8 vundet i sektion 1, der blev tilsat 10 enheder af re- 15 striktionsenzymet Hindlll og 8 enheder af Bglll, og dige-reringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,6 pg af et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-fragment på ca. 1,4 kb (HindiII-BglII-fragment).

20 Derefter blev følgende DNA-linker syntetiseret: 27 mer

Banlll Hindlll

Met Ser Fhe Lsu Leu Lys 5»-jCGATAAGCT ATG TCA TTT CTT TTA AAA -3’ 3'- TATTCGA TAC AGT AAA G AA AAT TTT TCGA -5'

25 V

29 mer

Strukturen af denne DNA-linker er en sådan, at de 11 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 11. aminosyre Gin af hG-CSF mangler i den N-terminale amino-syresekvens indkodet af nævnte linker.

Først blev det 27-mere og 29-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phosphotriester-metode. Den 27-mere og 29-mere (hver 2 pg) blev opløst i ialt 40 μΐ T4 kinasepuffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara Shuzo), og phosphoryle-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Banlll- 49 DK 174044 B1

BglIII-fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 pg af det pCfBA8-afledte Hindlll-BgIII-fragment (ca. 1,4 kb-fragment), hver vundet som ovenfor omtalt, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, og der blev til blandingsopløsningen 5 sat ca. 2 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase gennemførtes ligeringsreaktionen ved 4°C i 18 timer.

Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E. coli HB101, og der 10 vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler fra denne koloni udvandtes plasmid-DNA'et. Herved vandtes pCfTNS3Q1. Det af pCfTNS301 indkodede hG-CSF-derivat er i det følgende omtalt som hG-CSF[A1-11S].

15 (10) Konstruktion af pCfTNS401 (jvf. Fig. 16)

Der blev syntetiseret følgende DNA-linker: 39 mer

Banlll Hindlll

t Met Ser Leu Gin Ser Phe Leu Leu Lys I

20 51 -jcGATAAGCT ATG TCA CTA CCA CAA TCA TTT CTA TTA AAA 3' 3’- JTATTCGA TAC AGT GAT GGT GTT AGT AAA GAT AAT TTTTCGa) - 5' 41 mer

Strukturen af denne DNA-linker er en sådan, at 25 de 7 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 7. aminosyre Ser fra hG-CSF mangler i den N-terminale aminosyresekvens indkodet af linkeren.

Først blev det 39-mere og 41-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phosphotriester-30 metode. Den 39-mere og 41-mere (hver 2 ug) blev opløst i ialt 40 yl T4 kinasepuffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara Shuzo),og phosphoryle-ringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte 35 BanIII-BglII--fragment (ca. 2,7 kb-fragment) og 0,1 yg af det pCfBA8-afledte Hindlll-BgIII—fragment (ca. 1,4 kb-fragment), hver vundet som ovenfor beskrevet, opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, og der blev til denne bian- 50 DK 174044 B1 dingsopløsning sat ca. 2 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase gennemførtes ligeringsreaktionen ved 4°C i 18 timer.

5 Den således vundne rekombinant plasmid-blanding anvendtes til at transformere E. coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni. Plasmid-DNA'et udvandtes fra denne koloni. Herved vandtes pCfTNS401. Det af pCfTNS401 indkodede hG-CSF-derivat er i det følgende betegnet 10 hG-CSF[Δ1 — 7 S].

(11) Konstruktion af pCfTNS501 (jvf.Fig. 12).

I 40 yl Y-puffer blev der opløst pCfBA8, vundet i sektion 1, der blev tilsat 10 enheder af 15 restriktionsenzymet Xhol, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Det ved phenol-chloro-form-ekstraktion og ethanol fældning udvundne DNA blev opløst i 30 yl Klenow-puffer, der blev tilsat 2 enheder DNA-polymerase I-Klenowfragment, og reaktionen 20 gennemførtes ved 17°C i 30 minutter. DNA-polymerase I-Klenow-fragmentet blev inaktiveret ved 10 minutters behandling ved 68°C, der blev tilsat KC1 til en koncentration på 150 mM, derefter tilsat 8 enheder af restriktionsenzymet Pvul, og digereringsreaktionen 25 gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 2 yg af et hG-CSF-cDNA-holdigt DNA-fragment på ca. 3 kb [Xhol(stump)-Pvul].

Separat blev 5 yg af ATG-vektoren pTrS20 (3,8 kb), vundet ved fremgangsmåden fra Reference-30 eksempel 4, opløst i 50yl Y-O-puffer (Y-100-puffer minus 100 mM NaCl), der blev tilsat 16 enheder af restriktionsenzymet SacI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Det ved phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning udvundne 35 DNA blev opløst i 30 yl Klenow-puffer, der blev tilsat 2 enheder DNA-polymerase I-Klenow-fragment, og reaktionen gennemførtes ved 17°C i 30 minutter. DNA-polymerase I-Klenowfragmentet blev inaktiveret 51 DK 174044 B1

ved behandling ved 68°C i 10 minutter, der blev tilsat KC1 til en koncentration på 150 mM, derefter tilsat 8 enheder af restriktionsenzymet Pvul, og I

digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 5 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et Ftrp-holdigt DNA-fragment på ca.

1 kb [Sacl(stump)-Pvul].

Derefter blev 0,1 yg af det pCfBA8-afledte

XhoI(stump)-Pvul-fragment (ca. 3 kb) og 2 yg af 10 det pTrS20-afledte SacI(stump)-Pvul-fragment (ca.

1 kb) opløst i 25 yl T4 DNA-ligasepuffer, der blev tilsat 3 enheder T4 DNA-ligase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Reaktionsblandingen anvendtes til at transformere 15 E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni, og plasmid DNA'et udvandtes ved den ovennævnte metode ifølge Birnboim et al. Herved vandtes pCfTNS501 vist i Fig.12.

I det af pCfTNS501 indkodede hG-CSF-derivat 20 mangler den 1. til den 6. N-terminale- aminosyre fra modent hG-CSF, og den 17. aminosyre er Ser i stedet for Cys. Det af pCfTNS501 indkodede hG-CSF-derivat er i det følgende betegnet hG-CSF[A 1-6S].

25 Eksempel 7 (1) Konstruktion af pCfCB101, pCfCC52,‘ pCfCC59, pCfCD28 og pCfCD56 (jvf. Fig.8) Først blev 3 yg pBR322 [Bolivar et al, Gene, 30 2, 95 (1977)] opløst i 40 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet PstI, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Det ved phenol-chloroform-ekstraktion og ethanol-fældning udvundne DNA blev opløst i 20 yl af en 35 opløsning indeholdende 33 mM Tris-eddikesyre (pH 7,9), 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 5 mM dithiothreitol og dATP, dCTP, dGTP og dTTP (hver 0,4 mM) (i det følgende betegnet "T4 DNA-poly- 52 DK 174044 B1 merasepuffer"), der blev tilsat 1 enhed T4 DNA-poly-merase (Takara Shuzo), og reaktionen gennemførtes ved 37°C i 30 minutter. Det ved phenol-chloroformekstraktion og ethanolfaeldning udvundne DNA blev 5 opløst i 20 yl T4 DNA-ligasepuffer. Hertil blev der sat ca. 8 picomol af Bglll-linker-DNA1 et [Takara Shuzo, d(pC-A-G-A-T-C-T-G)}. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase gennemførtes ligeringsreaktionen ved 4°C i 18 timer. Det ved phenol-chloro-10 formekstraktion og ethanolfældning udvundne DNA blev opløst i 40 μΐ Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet EcoRI og 8 enheder Bglll, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 1 time. Fra reaktionsblandingen vandtes ved 15 LGT-metoden ca. 0,9 yg af et {tetracyclin-resistensgen-del)-holdigt DNA-fragment på ca. 3,6 kb (EcoRI-Bglll-fragment).

Separat blev 3 yg pCfBBIOI vundet i Eksempel 6-(2), pCfBC52 eller pCfBC59, vundet i Eksempel 20 6-(3), eller pCfBD28 eller pCfBD56, vundet i Eksempel 6-(4), opløst i 10-fold koncentreret Y-100-puffer, der blev tilsat 5 enheder af restriktionsenzymet EcoRI og 6 enheder Bglll, og digereringsreaktionen gennemførtes ved 37WC i 1 time. Fra reaktionsblandingen 25 vandtes ved LGT-metoden i hvert enkelt tilfælde ca. 0,4 yg af et hG-CSF-cDNA-delholdigt DNA-fragment på ca. 1,8 kb (EcoRI-BglII-fragment).

Der blev fremstillet fem rør hver indeholdende en opløsning af ca. 0,05 yg af det pBR322-afledte 30 EcoRI-BglII-fragment (ca. 3,6 kb), vundet som beskrevet ovenfor, i 20 yl T4 DNA-ligasepuffer. Til rørene blev der sat ca. 0,1 yg af det pCfBBIOI-, pCfBC52-, pCfBD59-, pCfBD28- eller pCfBD56- afledte EcoRI-Bglll-fragment (ca. 1,8 kb-fragment), og efter yderligere 35 tilsætning af 4 enheder T4 DNA-ligase gennemførtes ligeringsreaktionen ved 4°C i 18 timer.

De vundne rekombinant plasmid-blandinger anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der 53 DK 174044 B1 vandtes Tcr-kolonier. Fra dyrkede celler fra hver af disse kolonier udvandtes plasmid-DNA'et. Herved vandtes pCfCBIOI, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD52 og pCfCD56, hver vist i Fig. 8. Aminosyresekvenserne af de af 5 disse plasmider indkodede hG-CSF-derivater er identiske med aminosyrerne fra hG-CSF-derivaterne indkodet af henholdsvis pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 og pCfBD56.

1 q Eksempel 8

Fremstilling og rensning af hG-CSF-derivater.

E.coli W3110 strA-afledte transformanter (betegnet ECfTL23, ECfTL35, ECfTL38, ECfTL41, ECfTMI4, 15 ECfTMI7, ECfTMI13, ECfBBIOI, ECfBC42Bl, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBC93, ECfBC95, ECfBC97, ECfBD28, ECfBD56, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301/ ECfTNS401, ECfTNS501, ECfBD28A17 og ECfBD28T17) husende de rekombinante plasmider (vundet 20 i eksemplerne 3, 4, 6 og 7} henholdsvis pCfTL23, pCfTL35, pCfTL38, pCfTL41, pCfTMl4, pCfTM17, pCfTMin, pCfBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTNS301, 25 pCfTN401, pCfTNS501, pCfBD28Al7 og pCfBD28T17, blev hver dyrket i LG-medium (fremstillet ved at opløse 10 g Bactotrypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl og 1 g glucose i 1 liter vand og indstille pH til 7,0 med NaOH) ved 37°C i 18 timer. En 5 ml’s portion 30 af dyrkningsvæsken blev inokuleret i 100 ml MCG-medium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,5% casaminosyrer, 1 mM MgS04, 4 yg/ml vitamin B^, pH 7,2) indeholdende 25 yg/ml tryptophan og 50 yg/ml ampicillin. Efter inkubation ved 30°C i 4-8 timer 35 blev der tilsat 10 yg/ml 38-indolacrylsyre (i det følgende IAA), et tryptophaninduceringsmiddel, og inkubation blev fortsat i yderligere 2-12 timer.

Celler blev indhøstet ved at underkaste dyrknings- 54 DK 174044 B1

væsken for centrifugering ved 8.000 rpm i 10 minutter og vasket med 30 mM NaCl-30 mM Tris-HCl-puffer (pH 7,5). De vaskede celler blev suspenderet i 30 ml af den ovennævnte puffer og derefter opbrudt ved 5 ultralydbehandling ved 0°C (BRANSON SONIC POWER

COMPANY'S SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, Output Control 2, 10 minutter). Centrifugering ved 9.000 rpm i 30 minutter gav en cellerestmasse. Ved anvendelse af metoden ifølge Marston et al [F.A.O.Marston et 10 al, BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)] blev hG-CSF-deriva-tet ekstraheret fra cellerestmassen, renset, opløselig jort og regenereret. Proteinmængden blev bestemt ved anvendelse af Nippon Bio-Rad laboratories' proteinbestemmelsesudstyr (standard-bestemmelsesmetode) 15 [M.M. Bradford, Anal. Biochem. , 12_, 248 (1976)].

G-CSF-Aktiviteten blev bestemt på følgende måde. Benmarvceller blev indsamlet aseptisk fra femur fra C3H/He-hanmus på 8-12 uger (Shizuoka Laboratory Animal Center) og suspenderet i a-MEM suppleret 20 med 10% foetalt bovinserum (FBS). Nylonuld (Wako Pure Chemical Industries, Nylon Fiber 146-04231) (0,3 g) pakket i en søjle blev imprægneret med 1,5 ml af denne cellesuspension (ca. 5 x 107 celler), og reaktionen fik lov at forløbe i en 5% C02~inkubator 25 ved 37°C i 90 minutter. Derefter blev a-MEM, der forud var opvarmet til 37°C, ledt gennem søjlen, og benmarvceller, der ikke var adsorberet af nylonulden, vandtes som en udflydende fraktion. Disse celler blev vasket én gang med a-MEM og indstillet 30 på en forud fastsat koncentration.

Derefter blev evnen til myelopoietisk stam-cellekolonidannelse bestemt ved metoden ifølge Okabe et al [Okabe, T. et al, Cancer Research, 44, 4503-4506 (1986)3. Således blev 0,2 ml af den på ovennævnte 35 måde fremstillede marvcellesuspension (2 x 10^ celler/ml) blandet med en blanding af 0,2 ml a-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml af hver 2-fold fortyndede prøve. Samme volumen (1,0 ml) 0,6% agar (Difco, Agar purified 55 DK 174044 B1 #0560-01), opvarmet til 42°C, blev blandet med blandingen, og hele blandingen blev fordelt i 0,5 ml's portioner i rum i en 24-rums plade (Nunc’s Multidish #143982) (5 x 10^ celler/rum, n = 3). Efter inkubation 5 i en 5% CC^-inkubator ved 37°C i 7 dage blev kolonier hver indeholdende mindst 40 celler talt under et mikroskop (Olympus X40). Efter kolonitælling blev celler forsigtigt udtaget på et skydeglas og fikseret i 30 sekunder med en blandet acetone-formalin-opløs-10 ning. Efter esterase-dobbeltfarvning af cellerne ved metoden ifølge Kubota et al [Kubota, K. et al,

Exp.Hematology, 8^, 339-344 ( 1980)) blev hver koloni identificeret.

Styrken af hver prøve blev beregnet på basis 15 af tællingsresultatet for 2-fold-fortyndingen ved kolonidannelsestesten som følger. Den aktivitet, der giver det halve af den maksimale kolonidannelsesværdi for intakt G-CSF anvendt som standard, blev defineret som 50 enheder. Styrken (i enheder) blev 20 beregnet ved at multiplicere med 20, inklusive fortyndingsfaktoren for hver prøve, med henblik på omdannelse til aktiviteten pr. milliliter. Den specifikke aktivitet blev udtrykt som styrke pr. vægtenhed (mg) protein, og således i enheder/mg.

25 Styrkerne af intakt G-CSF og G-CSF-derivater er vist i Tabel III.

56 DK 174044 B1

TABEL III

Plasmid-indkodet Specifik Specifik c- Stantne Båret plasmid nrnrtnlcl- _akt:ifri t-<M- — aktivitetsforhold ^ . . (erhacter/iig) ECl'TAl pCfTAl G-CSF (intakt) 2,2 X 10* 1.. o BCfTL38 pCfTUS €-CSP(Ser') 4,0x10' 18 ECfTL41 pCfTL41 · G-CSF(Arg1) 3,7x10' L 7

ECfTL23 p Gf T L 2 3 G-CSF (Gly’) 3,1X10' %T

ECf TL35 pCf TL3 5 G-CSF (Cys1) 2,9x10' l.,3 10 ECfBBlOl pCfBBlOl G-CSF (NB101) 7,9x10* 3,6 ECf BC42B1 pCf BC42B1 G-CSF (NC42B1) 5,1x10* 2,3 ECf BC45 pCf BC45 G-CSF (NC45) 7,0x10' 3,2 ECfBC52 pCfBC52 G-CSF (NC52) 6,2x10' 2,8 ECf BC59 pCfBC59 G-CSF (NC59) 5,9x10* 2,-7 ECf8C76 pCfBC76 G-CSF (MC76) €,2x10' 2,8 ECfBC77 pCfBC77 G-CSF (MC77) 7,7x10' 3,5 ECfBC93 -pCfBC93 · G-CSF (NC93) 9,2x10' 4,2 ECfBC95 · pCfBC95 . G-CSF(NC95). *9,5x10' 4,3 ECf BC97 ‘ *pCf BC97 - G-CSF (NC97) . :.'8,6xl0' 3,9 .· * ECfBD28 " pCf BD2S G-CSF (ND28) ;7,9xi0e 3,6 EC f BD56 pCf BD5 6 G-CSF C«D56) -5,1x10' 2,3 .

ECfBD82.. -- pCfBD82 .-...G-CSF (ND82) 4,6x.l0' 2,'l 20 ECfTMH pCfTMH G-CSF (Ser', Cys*) 3,1X10' 1, 4 ECfTHl? pCfTMl? · G-CSF (Ser1, Arg3) 3,7x10' 1,7 ECfTH113 pCfΤΚ1Ϊ3 G-CSF (SerSer*) 2,9X10' 1, 3 ECfTNS7 pCfTHS7 S-CSF(A1-4S) . 7,7X10' 3,5 ECfTÅArg4S PCfTAArg4S G-CSF (Arg4, Ser17) 5,7X10» 2,6 ECfTNS301 pCf TNS301 G-CSF (Δ1-X1S; 3,1 X 10" 1,4 ECf TNS401 pCf TMS401 G-CSF(A1-7S) 5,5X10* 2,5 25 ECf TiVSSOl pCf TNS 501 G-CSF(A1-6S) 4,4-Xio* 2,0 ECfBD28A17 pCfB028A17 G-CSF(N028A17) 6,8 * 10' 3,1 ECf BD2ST17 pCf BD28T17 G-CSF (ND28T17) 5,9X10' 2,7 ECfTN205 pCfTN205 G-CSF (Δ 1-4) 4>2 x *0* 1,9 DK 174044 B1 57

Eksempel 9 Måling af aktiviteter af hG-CSF-derivater over for humane benmarvceller.

5 Marvvæsken blev indsamlet fra hoftebenet på normale mennesker med en alder på 20-30 år. Samme volumen a-MEM blev sat til og blandet med marvvæsken.

En 4 ml's portion af ovennævnte benmarvvæske blev laglagt på 3 ml Ficoll-Paque-opløsning (Pharmacia TO Fine Chemicals, vægtfylde 1,077), og efter centrifugering ved 400 x g i 30 minutter blev de celler, der forelå i mellemlaget, fraskilt. Cellerne blev vasket to gange med PBS (fremstillet ved at opløse 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HPC>4 og 0,2 g KH2P04 Ί5 i vand til 1 liter opløsning) og derefter suspenderet i a-MEM suppleret med 10% foetalt bovinserum (FBS), og cellekoncentratioren blev indstillet på højst 2 x 10^ celler/ml. En 10 ml's portion af cellesuspensionen blev anbragt i en formstofskål (Fal-20 con 3003) og inkuberet i en 5% C02~inkubator ved 37°C i 90 minutter. Celler, der ikke var adsorberet i formstofskål®, udvandtes, blev vasket en gang med a-MEM og, efter indstilling af koncentrationen på et forud fastsat niveau, underkastet tests ved-25 rørende human myelopoietisk cfamcellevækstfrem-mende aktivitet og kolonidannelse. Således blev 10% FBS-suppleret a-MEM fordelt i 100 pl's portioner i rum i en flad 96-rums-mikroplade (NUNC, 167008).

Derefter blev prøver af hG-CSF’et og hG-CSF-deriva-30 terne, vundet ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 8, i 100 jri's portioner sat til rum i den første række. Efter grundig blanding blev 100 μΐ af hver blanding overført til et rum i den anden række til fremstilling af en 2-fold fortynding. Dobbeltfor-35 tyndning blev fortsat på samme måde indtil den 12. række (n = 3). I en gruppe anvendtes a-MEM alene som en negativ kontrol.

4

Derefter blev 100 μΐ (5 x 10 eukaryotiske 58 DK 174044 B1 celler) af benmarvcellesuspensionen, fremstillet som beskrevet ovenfor, sået i hvert rum. Inkubation foregik i en 5% CC^-inkubator ved 37°C i 3 dage.

Under 20 timers perioden forud for de sidste 18 3 5 timer blev der tilsat 10 μΐ af 6- H-thymidin (Amersham Japan, kode TRK61, 107 mci/mg). Celler blev udvundet på et glasfilter under anvendelse af en celle-indhøster (Labo-Science), tørret og målt for den af cellerne optagne radioaktivitet under anvendelse 10 af en /vrkescintillationstæller (Packard, Tricarb 3320).

På den anden side gennemførtes, som beskrevet i Eksempel 8, bestemmelse af human myelopoietisk stamcellekolonidannelse og koloni identifikation.

Til beregning af styrken af hver prøve blev 15 den aktivitet, der er i stand til at bevirke dannelse af en koloni, defineret som 1 enhed. Således blev halv-max-værdien (det halve af den maksimale optagnigs-værdi) bestemt baseret på dosis/respons-kurven, der viser linearitet for tællingsresultaterne ved 20 dobbeltfortyndingsrækken, og styrken af hver prøve blev beregnet.

Den specifikke aktivitet blev udtrykt som styrke pr. vægtenhed (mg) af protein, dvs. i enheder/mg.

Styrkerne af det intakte hG-CSF og hG-CSF-25 derivaterne er vist i Tabel IV.

DK 174044 B1 59

TABEL IV

Båret PI asm id-indkodet. Specifik. Specifik

Stamme_ .plasmid- produkt-aKtjyitgt „ aktivitetsforholc (enheder/mg)' · 5 ECfTAl pCfTAl G-CSF(intact) 2,8 x 1Q8 1,0 ECfBC59 pCfBC59 G-CSF(NC59) 7,7 x 10® 2,8 ECfBC93 pCfBC93 G-CSF(NC93) 7-0 x 108 2,5 ECfBC95 pCfBC95 G-CSF(NC95) 9,5 x 108 3,4 10 ECfBD28 pCfBD28 G-CSF(ND28) 10,4 x 108 3,7 ECfTAArg4 pCfTAArg4 G-CSR(Arg4) 5,3 x 108 1,9 ECfTNS501 pCfTNS501 G-CSF(ål-6S) 6,2 X 108 2,2 1 5

Eksempel 10

Fremstilling af hG-CSF-derivat manglende de N-terminale 1. til 7. aminosyrer og med serin som 17. aminosyre (i det følgende betegnet M-7S) 20

Til 50 ml 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (a) vist i Tabel II (132 yg/ml), vundet ved dyrkning af E.coli-stammen (ECfBC59) bærende det rekombinante plasmid pCfBC59, 25 vundet i eksempel 6, efterfulgt af rensning, blev der sat 0,7 yg subtilisin BPN' (8,5 enheder/mg protein) (Sigma),og inkubation gennemførtes ved 25°C i 40 timer. Efter 3-fold fortynding med 10 mM Tris- HC1 (pH 8,0) blev inkubationsblandingen overført 30 , .

til en DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda Manufacturing)- søjle (1,7 cm x 4,4 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), ved en strømningshastighed på 10 ml/time.

Derefter blev 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 5 ml/time.

35

Derefter blev der foretaget eluering med et puffersystem af 10 mM Tris-HCl visende en lineær NaCl-koncentrationsgradient fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningshastighed (totalt eluentvolumen 50 ml).

60 DK 174044 B1 M-7S-Derivatet blev elueret ved NaCl-koncentrationer på 100-150 mM (udbytte 0,7 mg, eller 10%). Renheden var mindst 90%.

5 Eksempel 11

Fremstilling af M-75

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (b) vist 10 i Tabel II (132 yg/ml), vundet ved dyrkning af E.coli-stammen (ECfBC59) bærende det rekombinante plasmid pCfBC59, vundet i Eksempel 6, efterfulgt af rensning, blev der sat 0,7 yg subtilisin BPN' (8,5 enheder/mg protein) (Sigma), og inkubation foregik ved 25°C 15 i 14 timer. Efter 3-fold fortynding med 10 mM Tris HC1 (pH 8,0) blev inkubationsblandingen overført til DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda Manufacturing)-søjle (1,7 cm x 4,4 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), ved en strømningshastighed på 10 ml/time.

20 Derefter blev 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 5 ml/time.

Derefter blev der foretaget eluering fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningshastighed (totalt eluent-volumen 50 ml). M-7S-Derivatet blev elueret ved 25 NaCl-koncentrationer på 100-150 mM (udbytte 4,2 mg, eller 63%). Renheden var mindst 90%.

Eksempel 12

Fremstilling af M-7S 30

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (d) vist i Tabel II (132 yg/ml), vundet ved dyrkning af E.coli-stammen (ECfTAArg4) bærende det rekombinante plasmid 35 pCfTAArg4, vundet i Eksempel 6, efterfulgt af rensning blev der sat 0,7 yg subtilisin BPN' (8,5 enheder/mg protein) (Sigma), og inkubation gennemførtes ved 25°C i 40 timer. Efter indstilling af NaCl-koncentra- 61 DK 174044 B1 tionen til 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en 2n-chelat-Sepharose(Pharmacia Fine Chemicals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved en strømningshastighed 1 ^ på 6 ml/time. Derefter blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5M NaCl ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter gennemførtes eluering med et totalt volumen på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-puffer på en lineær pH-gradient fra ^q 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastighed. M-7S-

Derivatet blev elueret i nærheden af pH 7,0 (udbytte 0,6 mg, eller 9%). Renheden var mindst 90%.

Eksempel 13 15 Fremstilling af hG-CSF-derivat manglende den 1. til 6. N-terminale aminosyre og med serin som den 17. aminosyre (i det følgende betegnet M-6S)

Til 50 ml af en opløsning af derivatet (a)

20 vist i Tabel II (132 yg/ml) i 10 mM Tris-HCl--100 mM NaCl (pH 8,0) blev der sat 0,7 yg subtilisin BPN' (8,5 enheder/mg protein) (Sigma), og inkubation gennemførtes ved 25°C i 2 timer. Efter 3-fold fortynding med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) blev inkubationsblandingen 25 overført til en DEAE-Toyopear1 650M(Toyo Soda)-søjle (1,7 cm x 4,4 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), ved en strømningshastighed på 10 ml/time. Derefter blev 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 5 ml/time. Derefter 30 blev der foretaget eluering med et totalt volumen på 50 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl (pH

8,0) visende en lineær NaCl-koncentrationsgradient fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningshastighed.

M-6S-derivatet blev elueret ved NaCl-koncentrationer 35 på 100-150 mM (udbytte 2,6 mg eller 40%). Renheden var mindst 90%.

62 DK 174044 B1

Eksempel 14

Fremstilling af M-6S

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-5 opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (a) vist i Tabel II (132 yg/ml) blev der sat 0,7 yg Epolozyme (4120 enheder/mg protein) (Kyowa Hakko Kogyo), og der blev inkuberet ved 25°C i 20 timer. Efter indstilling af NaCl-koncentrationen til 0,5 M blev 10 inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepharose(Pharmacia Fine Chemicals)-søjle (1,7 x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved en strømningshastighed på 6 ml/time. Derefter blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl 15 ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter gennemførtes eluering med et totalt volumen på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-puffer på en lineær pH-gradient fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastighed. M-6S-Derivatet blev 20 elueret i nærheden af pH 7,0 (udbytte 2,5 mg eller 38%). Renheden var mindst 90%.

Eksempel 15

Fremstilling af M-6S 25

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (b) vist i Tabel II (132 yg/ml) blev der sat 0,7 yg substili-sin amylosacchalyticus, og der blev inkuberet ved 30 25°C i 20 timer. Efter indstilling af NaCl-koncen- trationen på 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepharose(Pharmacia Fine Che-micals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved en strømnings-35 hastighed på 6 ml/time. Derefter blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter blev der elueret med et totalt volumen på 30 ml 63 DK 174044 B1 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl-puffer på en lineær pH-gradient fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastighed. M-6S-Derivatet blev elueret i nærheden af pH 7,0 (udbytte 2,5 mg eller 38%). Renheden 5 var mindst 90%.

Eksempel 16

Fremstilling af M-6S

10 Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl- opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (d) vist i Tabel II (132 yg/ml) blev der sat 0,7 yg subtili-sin Carlsberg (0,034 enhed/mg protein) (NOVO), og der blev inkuberet ved 25°C i 20 timer. Efter ind-15 stilling af NaCl-koncentrationen på 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepha-rose(Pharmacia Fine Chemicals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) ved en strømningshastighed på 6 ml/time. Derefter blev 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ledt gennem 20 søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time.

Derefter blev der elueret med et totalt volumen på 30 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl visende en lineær pH-gradient fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastighed. M-6S-Derivatet 25 blev elueret i nærheden af pH 7,0 (udbytte 3 mg eller 45%). Renheden var mindst 90%.

Eksempel 17

Fremstilling af M-6S 30

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (a) vist i Tabel II (132 yg/ml) blev der sat 0,7 yg proteinase K (0,027 enhed/mg protein) (Sigma), og der blev inkube-35 ret ved 25°C i 40 timer. Efter 3-fold fortynding med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) blev inkubationsblandingen overført til en DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda)-søjle (1,7 cm x 4,4 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl- 64 DK 174044 B1 (pH 8,0), ved en strømningshastighed på 10 ml/time.

Derefter blev 20 ml 10 M Tris-HCl (pH 8,0) ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 5 ml/time.

Derefter blev der elueret med et totalt volumen på 50 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl (pH 5 8,0) visende en lineær NaCl-koncentrationsgradient fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningshastighed.

M-6S-Derivatet blev elueret ved NaCl-koncentrationer på 100-150 mM (udbytte 2,6 mg eller 39%). Renheden var mindst 90%.

10

Eksempel 18

Fremstilling af hG-CSF-derivat manglende den 1 . til 5. N-terminale aminosyre og med serin som den 17. aminosyre (i det følgende betegnet M-5S) 15

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (b) vist i Tabel I (132 pg/ml) blev der sat 0,5 ug trypsin (267 enheder/mg protein) (Sigma), og der blev in-20 kuberet ved 25°C i 10 timer. Efter indstilling af NaCl-koncentrationen på 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved 25 en strømningshastighed på 6 ml/time. Derefter blev blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter blev der elueret med et totalt volumen på 30 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl 30 visende en lineær imidazol-koncentrationsgradient fra 0 M til 0,3 M ved samme strømningshastighed.

M~5S~Derivatet blev elueret ved 0,1 M imidazol (udbytte 2,7 mg eller 41%). Renheden var mindst 90%.

35 Eksempel 19

Fremstilling af hG-CSF-derivat manglende den 1. til 4. N-terminale aminosyre og med serin som den

17. aminosyre (i det følgende betegnet M-4S

65 DK 174044 B1

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (d) vist i Tabel I (132 yg/ml) blev der sat 5 yg trypsin (267 enheder/mg protein) (Sigma), og der blev inkuberet 5 ved 25°C i 20 timer. Efter indstilling af NaCl-koncen-trationen til 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepharose(Pharmacia Fine Chemi-cals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HC1 (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved en strømningshastighed 10 på 6 ml/time. Derefter blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter blev der elue-ret med et totalt volumen på 30 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl visende 15 en lineær imidazol-koncentrationsgradient på fra 0 M til 0,3 M ved samme strømningshastighed. M-4S-Derivatet blev elueret ved 0,1 M imidazol (udbytte 2,7 mg eller 41%). Renheden var mindst 90%.

20 Eksempel 20

Fremstilling af M-4S

Til 50 ml af en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-opløsning (pH 8,0) indeholdende derivatet (d) vist 25 i Tabel II (132 yg/ml) blev der sat 5 yg a-chymotryp-sin (267 enheder/mg protein) (Sigma), og der blev inkuberet ved 25°C i 20 timer. Efter indstilling af NaCl-koncentrationen på 0,5 M blev inkubationsblandingen overført til en Zn-chelat-Sepharose(Pharma-30 cia Fine Chemicals)-søjle (1,7 cm x 2,6 cm) fyldt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl, ved en strømningshastighed på 6 ml/time. Derefter blev 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ledt gennem søjlen ved en strømningshastighed på 3 ml/time. Derefter 35 blev der elueret med ialt 30 ml af et puffersystem af 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl visende en lineær imidazol-koncentrationsgradient fra 0 M til 0,3 M ved samme strømningshastighed. M-4S-Derivatet 66 DK 174044 B1 blev elueret ved 0,1 M imidazol (udbytte 2,3 g eller 35%). Renheden var mindst 90%.

Eksempel 21

Som det fremgår af eksemplerne 10-20 kan der vindes de hG-CSF-derivater, der har serin som 5 substituent for den 17. aminosyre og mangler 4 (M-4S), 5 (M-5S), 6 (M-6S) og 7 (M-7S) N-terminale aminosyrer. Anvendelsen af rekombinant DNA-teknologi resulterer generelt i addition af methionin til N-terminus*en, og dette er et af de fordelagtige 10 træk ved rekombinante produkter. Derimod er anvendelsen af den enzymatiske kløvningsteknik ifølge opfindelsen fordelagtig, fordi sådanne produkter kan fremstilles uden addition af methionin til N- terminus * en.

15

De på denne måde vundne derivater blev undersøgt for G-CSF-aktivitet med henblik på sammenligning. De opnåede resultater er vist i Tabel V.

Tabel V

Aktivitetssammenligning mellem G-CSF-derivater dan- 20 net ved den enzymatiske kløvningsteknik. hG-CSF-Derivater Relativ aktivitet (derivat/intakt)

Intakt 1,0 M-4S 4,0 25 M-5S 3,5 M-6S 3,0 M-7S 3,3

Ud fra resultaterne vist i Tabel V fandtes, 30 at ved den ovennævnte iji vi tro-vurdering har de derivater, der mangler 4-7 N-terminale aminosyrer, en 2- til 4-fold højere aktivitet sammenlignet med det intakte hG-CSF.

De derivater, der mangler aminosyrer på 35 den N-terminale side, og som kan fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, har derfor ingen methionin adderet til N-terminus * en og har 2- til 4-fold højere aktivitet end det intakte produkt.

67 - DK 174044 B1

De følgende eksempler illustrerer erhvervelsen af reaktivitet (modtagelighed) over for kløvning med hydrolytiske enzymer som et resultat af mutation i den N-terminale del.

5

Testeksempel 1

Sammenligning af reaktivitet med subtilisin Carls-berg mellem intakt hG-CSF og N-terminale mutanter af hG-CSF

10

Derivaterne vist i tabel II og intakt hG- -4 CSF blev hver inkuberet i nærværelse af 3,6 x 10 enheder/mg G-CSF af subtilisin Carlsberg (NOVO) ved 25°C i 14 timer på samme måde som i Eksempel 15 16. Mens derivaterne vist i Tabel II gav M-6S-deriva- tet, forblev det intakte hG-CSF uomsat. Yderligere viste det sig, at selvom dette enzym anvendtes i _ o en 100-fold forøget mængde (3,6 x i0 enheder/mg G-CSF), kunne det intakte produkt ikke fremstille 20 M-6S, men det undergik fortrinsvis globale dekom-poneringsreaktioner.

Testeksempel 2

Sammenligning af reaktivitet med trypsin mellem 25 intakt hG-CSF og N-terminale mutanter af hG-CSF

Derivatet (a) vist i Tabel II og intakt hG-CSF blev hver inkuberet i nærværelse af 0,22 enheder/mg G-CSF af trypsin (Sigma) ved 25°C i 20 timer. Mens 30 derivatet (a) vist i Tabel II gav M-4S-derivatet, forblev det intakte hG-CSF uomsat. Yderligere viste det sig, at selvom enzymet forelå i en 100-fold forøget mængde (22 enheder/mg G-CSF), gav det intakte hG-CSF ikke M-4S, men undergik fortrinsvis globale 35 dekomponeringsreaktioner.

68 DK 174044 B1

Testeksempel 3 Varmestabilitet af hG-CSF-derivater

En 20 yg portion af hver af de forskellige omhandlede derivater vist i Tabel VI blev opløst 5 i 1 ml phosphat-pufret fysiologisk saltopløsning (PBS) (pH 7,2) eller a-MEM suppleret med 10% foetalt bovinserum (FBS). Inkubation gennemførtes ved 56°C, og der blev med bestemte tidsintervaller taget prøver, der blev undersøgt for CSF-aktivitet ved koloni-10 dannelsestestning under anvendelse af muse-benmarv-celler (den ovennævnte metode ifølge Okabe et al).

Hver prøve blev fortyndet ved dobbeltfortyndingsteknik fra 40 ng/ml til opnåelse af 10 fortyndingsniveauer. For hvert niveau bestemtes aktivi-15 teten ved en vis koncentration, der giver en god dosis-respons-kurve. Derefter blev den resterende aktivitet beregnet, idet aktiviteten før opvarmning blev sat til 100%.

Data vedrørende resterende aktivitet (svarende 20 til termisk stabilitet )opnået i PBS og i 10% FBS-suppleret a-MEM er vrst i henholdsvis Tabel VI(A) og Tabel VI{B).

Tabel VI(A) 25 Resterende aktivitet (%)

Prøve 30 min. 60 min. 120 min.

Intakt G-CSF

G-CSF 45,2 16,4 12,7 NC93 98,0 93,3 90,6 30 ND28 68,7 52,8 33,9

Arg4 33,8 15,0 12,9 M-7S 84,8 72,0 57,0 1-4S 89,7 72,4 61,6 69 DK 174044 B1

Tabel VI(B)

Resterende aktivitet (%)

Prøve 30 min. 60 min. 120 min.

Intakt G-CSF

5 G-CSF 9,1 6,7 8,9 ND28 55,6 46,5 32,4 NC59 45,1 35,6 24,9

Eksempel 22 10 Konstruktion af pCfBD28Al7 og pC£BD28T17 ved anvendelse af sted-specifik mutagenese (jvf. Fig.17) (a) Konstruktion af enkeltstrenget template-DNA (enkeltstrenget pt19BD28N) 15 I 50 μΐ Y-100-puffer blev der opløst 3 yg pCfBD28 vundet ved fremgangsmåden fra eksempel 6- (4), der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll (Toyobo) og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Fra 20 reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca.

0,1 ug af et ca. 210 bp DNA-fragment (Banlll-Pstl-fragment), der koder for den N-terminale del af hG-CSF-derivatet (ND28).

Separat blev 1 ug af M13 phag-vektor M13mp19RF-25 DNA'et (Takara Shuzo) opløst i ialt 50 ul Y-50-puffer, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet Accl (Toyobo), og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Derefter blev der tilsat NaCl til en NaCl-koncentration på 100 mM, der blev tilsat 30 10 enheder af restriktionsenzymet PstI, og kløvnings reaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca.

0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 7,24 kb (AccI-Pstl-fragment).

35 I 50 ul T4 DNA-ligasepuffer blev der opløst 0,2 ug af Banlll-Pstl-fragmentet (ca. 210 bp) og 0,05 ug af AccI-Psti-fragmentet (ca. 7,24 kb) hver vundet som ovenfor beskrevet. T4 DNA-ligase (10 70 DK 174044 B1 enheder) blev sat til blandingesopløsningen, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 12°C i 16 timer.

Derefter anvendtes den ovennævnte reaktionsblanding til at transficere E.coli JM105 ved en 5 kendt metode. Herved vandtes en rekombinant phag.

Fra dyrkede celler af en E.coli JM105-afledt transformant inficeret med den rekombinante phag udvandtes det rekombinante Ml 3 phag RF-DNA. Strukturen af dette RF-DNA (i det følgende betegnet pt19BD28N) 10 blev bekræftet ved kløvning med PstI, EcoRI, Aval °g Xhol efterfulgt af polyacrylamidgelelektroforese.

Det enkeltstrengede pt19BD28N udvandtes derefter fra den rekombinante phag ved en kendt metode og anvendtes som en template.

15 (b) Konstruktion af spaltet duplex-DNA.

I 30 μΐ Y-100-puffer blev der opløst 3 yg af M13mp19 RF-DNA'et (Takara Shuzo), der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne EcoRI 20 og Hindlll, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 2,5 yg af et DNA-fragment på ca. 7,2 kb (EcoRI-HindIII-fragment).

Dette M13mp13 RF-DNA-afledte EcoRl-Hindlll-25 fragment (ca. 7,2 kb) og 1 yg af det enkeltstrengede template-DNA pt19BD28N, vundet som beskrevet i den foregående del, blev opløst i 27 yl Klenow-puffer, og DNA-denaturering blev bevirket ved kogning ved 100°C i 6 minutter. Derefter blev blandingen hen-30 stillet ved 65°C i 10 minutter, ved 37°C i 40 minutter, ved 4°C i 40 minutter og i is i 10 minutter for at bringe "annealing"-reaktionen til at forløbe, hvorved et spaltet duplex-DNA blev dannet, hvori G-CSF-gendelen alene i templaten var enkeltstrenget, 35 Det således vundne spaltede duplex-DNA udvandtes ved LGT-metoden.

71 DK 174044 B1 (c) Mutagenese (konstruktion af pt19BD28NAl7 og ptl9BD28NT17).

Et enkeltstrenget DNA (D-1), der kræves for 5 at substituere Ala for den 17.aminosyre (fra N-termi-nus), nemlig Ser, af hG-CSF-derivatet (ND28) vundet i Eksempel 6, og et enkeltstrenget DNA (D-2), der kræves for at substituere Thr for nævnte Ser, blev syntetiseret ved den almindelige phosphotriester-10 metode. Basesekvenserne af D-1 (33-mer) og D-2 (33-mer) er vist nedenfor: D-1 Ala t 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 c 17 Ser Phe Leu Leu Dys Ser Leu Glu Gin Val Arg

(Ser^Ala) 5'-AGC TTC CTT TTA AAG GCC ΤΤΛ GAG C AA GTG AGG

Stul -3' (33 mer)

Thr D-2 t 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 17 Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gin Val Arg

(Ser-»Thr) 5'-AGC TTC CTT TTA AAA ACT CTA GAG CAA GTG AGG

Xbal -3’ (33 mer) 25 Strukturerne af de ovennævnte DNA'er er en sådan, at mutagenese under anvendelse af D-1 bevirker dannelse af et nyt Stul-sted, og mutagenese under anvendelse af D-2 kan medføre et nyt Xbal-sted. Mutanter kan derfor identificeres ved kløvning 30 med disse restriktionsenzymer.

D-1 og D-2 blev hver især, i en mængde på 1 yg, opløst i 50 yl T4 kinasepuffer, der blev tilsat 30 enheder T4 polynucleotidkinaser og phosphory-leringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

35 Derefter blev 0,2 ug af det phosphorylerede D-1 eller D-2 og 0,1 U9 af det spaltede duplex-DNA, vundet som beskrevet i den indledende del, opløst i 34 ul puffer indeholdende 6,5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 72 DK 174044 B1 8 mM MgC^» 1 mM 2-mercaptoethanol og 100 mM NaCl, opløsningen blev henstillet ved 65°C i 60 minutter og derefter ved rumtemperatur i 30 minutter, hvorved D-1 eller D-2 blev "annealet" med det spaltede duplex-5 DNA.

Til opløsningen blev der sat dATP, dTTp, dCTP og dGTP hver til en koncentration på 0,5 mM. Efter yderligere tilsætning af 1,5 enheder DNA-polymerase I-Klenowfragment og 10 enheder T4 DNA-ligase gennem-10 førtes extensionsreaktionen ved 4°C i 16 timer.

Den således vundne reaktionsblanding anvendtes til at transficere E.coli JM105, og der vandtes mutante phager. RF-DNA'erne udvandtes fra de med mutant phag inficerede E.coli JM105-transformanter 15 og blev identificeret ved kløvning med Aval, Xhol og Stul (når D-1 anvendtes) eller med Xbal (når D-2 anvendtes), efterfulgt af polyacrylamidgelelek-troforese. RF-DNA'et med mutation indført deri ved hjælp af D-1 er betegnet ptl9BD28NA17,og RF-DNA'et 20 med mutation indført deri ved hjælp af D-2 er betegnet pt19BD28NT17. Basesekvenserne af pt19BD28NA17 og pt19BD28NT17 i nærheden af henholdsvis Stul-stedet og Xbal-stedet blev ved dedeoxy-sekvensbestemmelses-metoden under anvendelse af Ml 3 phag bekræftet af 25 vare følgende: ptl9BD28NA17 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Ser Phe Leu Leu Lys Ala Leu Glu Gin Val Arg

AGC TTC CTT TTA AAG GfcC TTA GAG CAA GTG AGG

30

Stul ptl9BD28NT17 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Ser Phe Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gin Val Arg

35 AGC TTC CTT TTA AAA ACT) CTA GAG CAA GTG AGG

Xbal 73 DK 174044 B1 d) Konstruktion af pCfBD28A17 og pCfBD28Tl7.

I 50 μΐ Y-100-puffer blev der opløst 3 ug pt19BD28NAl7 eller pt19BD28NT17, vundet som beskrevet 5 ovenfor, der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Aval og Xhol, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 0,05 ug af et ca. 110 bp DNA-fragment indeholdende mutations-10 stedet indført som beskrevet i den foregående del (Aval-Xhol-fragment).

Separat blev 2 ug pCfBD28 ,vundet i Eksempel 6-(4), opløst i 50 μΐ Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Xhol og Bglll, og kløvnings-15 reaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca.

1 ug af et tryptophanpromotordelholdigt DNA-fragment på ca. 2,74 kb (XhoI-Bglll-fragment).

Yderligere blev separat 2 ug pCfBD28 opløst 20 i 50 μΐ Y-100-puffer, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet Bglll, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Efter bekræftelse af BglIl-kløvningens fuldstændighed ved agarosegel-elektroforese blev der tilsat 5 enheder af restrik-25 tionsenzymet Aval, og partiel kløvning gennemførtes ved 37°C i 10 minutter. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden 0,4 ug af et ca. 1,29 kb DNA-fragment (Bglll-Aval-fragment) indeholdende det meste af det modne hG-CSF-cDNA med λρρ-terminator-30 delen.

Derefter blev 0,1 ug af det pCfBD28-afledte XhoI-Bglll-fragment (ca. 2,74 kb),0,05 ugaf det pCfBD28-afledte Bglll-Aval-fragment (ca. 1,29 kb) og 0,02 ug af det pt19BD28NA17- eller pt19BD28NT17-afledte 35 Aval-Xhol-fragment (ca. 110 bp) opløst i 60 μΐ T4 DNA-ligasepuffer, der blev tilsat 10 enheder T4 DNA-ligase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 12°C i 16 timer.

74 DK 174044 B1

Den således vundne reaktionsblanding anvendtes til at transformere E.coli HB101, og der vandtes en Apr-koloni- Plasmid-DNA'et udvandtes fra dyrkede celler fra denne koloni. Plasmidet konstrueret ved anvendelse af pt19BD28NA17 er beteqnet pCfBD28A17* og plasmidet konstrueret ved anvendelse af pt19BD28NT17 er betegnet pCfBD28Tl7.

Strukturen af pCfBD28A17 blev bekræftet ved kløvning med Aval, Xhol, Bglll og Stul efterfulgt af agarosegelelektroforese. Strukturen af pCfBD28T17 10 blev bekræftet ved kløvning med Aval, Xhol, Bglll og Xbal efterfulgt af agarosegelelektroforese.

De erstatteide aminosyrerester i hG-CSF-deri-vaterne indkodet af disse to plasmider sammenlignet med modent hG-CSF er følgende: 15

Position af aminosyresubstitution Plasmid_ f^nosvre .af hG-CSF)_ ECfBD28A17 pCfBD28T17 1. (Thr) Ala Ala 3. . (Leu) Thr Thr 20 4. (Gly) Tyr Tyr 5. . (Pro) Arg Arg 17. (Cys) Ala Thr 25 hG-CSF-Derivaterne indkodet af pCfBD28A17 og pCfBD28Tl7 er i det følgende betegnet henholdsvis hG-CSF[ND28A17] og hG-CSF[ND28T17 ] .

30 Referenceeksempel 1

Isolering af hG-CSF-cDNA-bærende plasmid pCSFl-2 (1) Fremstilling af poly(A)-RNA fra normal human perifer blodmakrophag.

35 Makrophager, der er vedhæftende celler, blev isoleret ved at dyrke leukocyter vundet ved centrifugering af normalt humant perifert blod i en formstof flaske og fjerne ikke-vedhaef tende celler ved vask. Et RNA med poly(A) blev fremstillet 75 DK 174044 B1 ud fra makrophagerne ved guanidinthiocyanatlithium-chlorid-metoden [Cathala et al: DNA, .2, 329 ( 1983)] som følger.

Normalt humant perifert blod (400 ml) blev 5 centrifugeret på en Hitachi RPRIO-rotor ved 1800 rpm i 20 minutter. Det resulterende blodcellebundfald blev suspenderet i 50 ml phosphat-pufret saltopløsning [8 g/liter NaCl, 0,2 g/liter KC1, 1,15 g/liter vandfrit Na^HPO^, 0,2 g/liter KH2PO4 (pH 10 7,2), i det følgende forkortet til PBS]. En 25 ml's portion af denne suspension blev laglagt på 25 ml lymfocytseparationsvæske (BIONETICS), og det hele blev centrifugeret på en Hitachi RPR10-rotor ved 1800 rpm i 30 minutter. Leukocytter i midter-15 laget blev indsamlet, vasket med samme volumen PBS (på en Hotachi RPRIO-rotor ved 1500 rpm i 10 minutter), derefter suspenderet i 20 ml RPMI 1640-medium (Nissui Seiyaku) indeholdende 5% foetalt bovinserum, og dyrket under anvendelse af en vævkul-20 turkolbe (Corning). Efter dyrkning ved 37°C i 1,5 time blev kultursupernatanten fjernet sammen med ikke-vedhæftende celler. En frisk 20 ml's portion af det samme medium og E.coli-afledt lipopoly-saccharid (LPS) (i en mængde til opnåelse af en 25 koncentration på 0,3 mg/ml) blev tilsat, og dyrkning blev fortsat ved 37°C i yderligere 4 timer. Derefter blev celler indhøstet fra kulturen ved centrifugering ved 1100 x g ved 4°C i 10 minutter, vasket med 80 ml PBS og opløst i 10 ml af en opløsning inde-30 holdende 5 M guanidinthiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) og 8 vol% 2-mercaptoethanol under anvendelse af en hvirvelblander. Dette opløsningsprodukt blev overført til et centrifugerør, der blev tilsat 80 ml 4 M LiCl, og blandingen blev 35 omrørt, derefter henstillet ved 4°C i 20 timer og centrifugeret; på en Hitachi RPRIO-rotor ved 9000 rpm i 90 minutter. Derefter udvandtes et RNA-bundfald. RNA-bundfaldet blev suspenderet i 50 76 DK 174044 B1 ml af en opløsning indeholdende 4 M urinstof og 2 M lithiumchlorid, og suspensionen blev centrifugeret på en Hitachi RPR1O-rotor ved 9000 rpm i 60 minutter, og der udvandtes igen et RNA-bund-5 fald.

RNA-bundfaldet blev opløst i 10 ml af en opløsning indeholdende 0,1% natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), og RNA'et udvandtes ved phenol-chloroform-ekstraktion og 10 ethanol fældning. Det vundne RNA (ca. 0,8 mg) blev opløst i 1 ml af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Efter inkubation ved 65°C i 5 minutter blev der tilsat 0,1 ml 5 M NaCl. Blandingen blev underkastet oligo(dT)-cellu-15 losesøjle(P-L Biochemicals)chromatografi (søjle-volumen 0,5 ml). Det adsorberede, poly(A)-holdige mRNA blev elueret med en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA, hvorved vandtes ca. 30 yg poly(A)-holdigt mRNA.

20 (2) cDNA-syntese og insertion af DNA'et i en vektor.

Okayama-Berg-metoden [Mol. Cell. Biol., 2_, 161 (1982)] anvendtes til cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruktion ved insertion af det vundne 25 cDNA. Processerne hertil er vist i Fig.9.

Til 300 yl af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl blev der sat 400 yg pCDVl [Okayama & Berg: Mol.Cell.

Biol., 3^, 280 (1983)], og efter yderligere tilsætning 30 af 500 enheder Kpnl gennemførtes reaktionen ved 37°C i 6 timer, hvorved plasmidet blev kløvet ved KpnI-stedet. DNA'et udvandtes ved phenol-chloro-formekstraktion og ethanolfaeldning. Ca. 200 yg af det KpnI-kløvede DNA blev sat til 200 yl af 35 en opløsning fremstillet ved at sætte dTTp i en koncentration på 0,25 mM til en puffer (i der følgende forkortet til TdT-puffer) indeholdende 40 mM natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl2 og 0, 1 mM dithio- 77 DK 174044 B1 threitol (i det følgende forkortet til DTT), og efter yderligere tilsætning af 81 enheder terminal deoxynucleotidyltransferase (i det følgende forkortet til TdT) (P-L Biochemicals) gennemførtes reaktionen 5 ved 37°C i 11 minutter, hvorved en poly{dT)-kæde indeholdende ca. 67 dT-rester blev adderet til hvert KgnI-kløvningssted i 3'-enden af pCDVl. Ca. 100 yg af det poly(dT)-kædeadderede pCDV1-DNA udvandtes fra den ovennævnte reaktionsblanding ved phenol-10 chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. DNA'et blev sat til 150 μΐ af en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl, der blev yderligere tilsat 360 enheder EcoRI, og reaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Reaktions-15 blandingen blev behandlet ved LGT-metoden, og der udvandtes et DNA-fragment på ca. 3,1 kb. Herved vandtes ca. 60 yg af det poly(dT)kaede-"tailede" pCDVl. DNA'et blev opløst i 500 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA, 20 opløsningen blev inkuberet ved 65°C i 5 minutter og derefter afkølet med is, og der blev tilsat 50 μΐ 5 M NaCl. Blandingen blev underkastet oligo(dA)-cellulosesøjle(Collaborative Research)chromatografi.

Molekyler med en tilstrækkelig poly(dT)-kædelængde 25 blev adsorberet på søjlen, og de blev elueret med en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Herved vandtes 27 yg af det poly(dT)-kæde-"tailedeM pCDVl (i det følgende forkortet til vektorprimer).

30 Derefter blev der syntetiseret et linker- DNA.

Til 200 μΐ af en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl blev der sat ca. 14 yg pLl [Okayama & Berg: Mol.Cell.

35 Biol., 3, 280 (1983)], der blev yderligere tilsat 50 enheder PstI, og reaktionen gennemførtes ved 37°C i 4 timer, hvorved pLl-DNA'et blev kløvet ved Pstl-stedet. Reaktionsblandingen blev underkastet 78 DK 174044 B1 phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanol-fældning hvorved der udvandtes ca. 13 yg af det PstX-kløvede pLl-DNA. DNA'et (ca. 13 yg )blev sat til 50 μΐ TdT-puffer suppleret med dGTP i en slut-5 koncentration på 0,25 mM, der blev yderligere tilsat 54 enheder TdT (P-L Biochemicals), og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 13 minutter, hvorved en (dG)-kæde indeholdende ca. 14 dG-rester blev adderet til pLl ved hver 3'-ende ved PstI-kløvnings-10 stedet. DNA'et udvandtes ved phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning. DNA'et blev sat til 100 yl af en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, der blev yderligere tilsat 80 enheder Hindlll, 15 og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 3 timer, hvorved pLl-DNA'et blev kløvet ved HindiII-stedet. Reaktionsblandingen blev fraktioneret ved agarose-gelelektroforese, og et DNA-fragment på ca. 0,5 kb udvandtes ved DEAE-papirmetoden [Dretzen et al: 20 Anal.Biochem., 112, 295 (1981)]. Herved vandtes det oligo(dG)kæde-"tailede" linker-DNA (i det følgende blot betegnet linker-DNA).

I 22,3 yl af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KC1, 25 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP og dCTP)

og 10 enheder ribonuclease-inhibitor (P-L Biochemicals) blev der opløst ca. 3 yg af poly(A)-RNA'et og ca. 1,4 yg af vektorprimeren, hver fremstillet som beskrevet ovenfor, og der blev tilsat 10 enheder 30 omvendt transcriptase (Seikagaku Kogyo), og mRNA'et blev bragt til at syntetisere et DNA komplementært dermed ved inkubation af blandingen ved 41°C i 90 minutter. Reaktionsblandingen blev underkastet phenol-chloroform-ekstraktion, og vektorprimer-35 DNA'et med RNA-DNA-dobbeltstrengen adderet dertil udvandtes ved ethanolfældning. Dette DNA blev opløst i 20 yl TdT-puffer indeholdende 66 yM dCTP og 0,2 yg poly(A), der blev tilsat 14 enheder TdT

79 DK 174044 B1 (P-L Biochemicals), og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 2 minutter, hvorved en (dC)-kæde indeholdende 20 dC-rester blev adderet til 3’-enden af cDNA'et. Reaktionsblandingen blev ekstraheret med 5 phenol-chloroform, og det {dC)-kæde-"tailede" cDNA-vektorprimer-DNA udvandtes ved ethanolfældning.

DNA'et blev opløst i 400 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, der blev tilsat 20 enheder Hindlll, 10 og inkubation gennemførtes ved 37°C i 2 timer for at bevirke kløvning ved Hind-III-stedet.. Phenol-chloro-form-ekstraktion af reaktionsblandingen og den efterfølgende ethanolfældning gav 0,5 picomol af det (dC)-kæde-"tailede'' cDNA-vektor pr imer-DNA.

15 I 100 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl og 1 mM EDTA blev der opløst 0,2 picomol af DNA'et og 0,4 picomol af det ovennævnte linker-DNA, og inkubation gennemførtes ved 65°C, 42°C og 0°C i henholdsvis 10 minut-20 ter, 25 minutter og 30 minutter. Der blev fremstillet et totalt volumen på 1000 μΐ af en reaktionsblanding, der havde følgende sammensætning: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KC1 og 0,1 mM 8-NAD. Til dette reaktions-25 medium blev der sat 25 enheder E.coli-afledt DNA- ligase (New England Bio-Labs), og inkubation gennemførtes ved 11°C i 18 timer. Reaktionsmediet blev suppleret med 40 yM af hvert dNTP og med β-NAD til en slutkoncentration få 0,15 mM, der blev tilsat 10 30 enheder E.coli-DNA-ligase, 20 enheder E.coli-DNA- polymerase I (P-L Biochemicals) og 10 enheder E.coli-ribonuclease H (P-L Biochemicals), og inkubation gennemførtes ved 12°C i 1 time og derefter ved 25°C i 1 time. Ovennævnte reaktionsmetode bevirkede 35 cirkularisering af det cDNA-holdige rekombinante DNA og substitution af RNA-delen af RNA-DNA-dobbelt-strengen med det tilsvarende DNA. Herved dannedes det rekombinante plasmid i den fuldstændigt dobbeltstrengede DNA-form.

80 DK 174044 B1 (3) Udvælgelse af det hG-CSF-cDNA-holdige rekombinante DNA.

Det rekombinante plasmid vundet som beskrevet 5 i (2) anvendtes til at transformere E.coli C600SF8 ved metoden ifølge Scott et al [Katsuya Shigesada:

Saibo Kogaku (Cell Technology}, 2, 616 (1983)].

Ca. 9.200 vundne kolonier blev fikseret på et nitrocellulosefilter. Een stamme, der var i stand til 10 ved 60°C at associere stærkt med en probe frem- 32 stillet ved med P at mærke det syntetiske 27-base DNA 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3· svarende til de 9 N-terminale aminosyrer af det modne hG-CSF-protein, som isoleret af Nagata et al [Nagata 15 et al: Nature, 319, 415 (1986)], blev udvalgt [Grunstein-Hogness-metoden: Proc.Natl.Acad.Sci.

USA, 72, 3961 (1975)]. Hele basesekvensen af cDNA'et indeholdt i plasmidet pCSF1-2 ·*: båret af denne stamme blev bestemt ved dideoxy-sekvensbestemraelsesmetoden 20 under anvendelse af M13 phag (Tabel 1). Som resultat fandtes, at cDNA'et indeholdt i pCSF1-2 koder for hG-CSF.

Denne bakteriestamme er deponeret hos FRI under betegnelsen E.coli ECQp1-2 (FERM BP-1220), 25 som ovenfor nævnt.

Referenceeksempel 2

Isolering og rensning af plasmidet pKYP26 30 En pKYP26-bærende E.coli-stamme [E.coli IKYP26 (FERM BP-863)] blev dyrket i 10 ml L-medium (1% Bacto-trypton, 0,5% gærekstrakt, 1% NaCl, pH 7,5) indeholdende 50 yg/ml ampicillin ved 37°C i 18 timer. Hele kulturen blev overført til 1 liter 35 L-medium indeholdende 50 yg/ml ampicillin og dyrket ved 37°C . Efter 4 timer blev der tilsat chloramphenicol i en koncentration på 170 yg/ml, og dyrkning blev fortsat ved 37°C i yderligere 16 timer. Celler 81 DK 174044 B1 blev indhøstet ved centrifugering (5000 rpm, 10 minutter), vasket med 0,8% NaCl og suspenderet i 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), og suspensionen blev afkølet med is. Lysozym (10 mg/ml, 8 ml) blev 5 tilsat, og efter henstand i is i 10 minutter blev der tilsat 9,6 ml 0,5 M EDTA. Efter henstand i is i 10 minutter blev der tilsat 2,3 ml 2% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) efterfulgt af yderligere henstand i is i 1 time. Ultracentri-10 fugering ved 50.000 x g ved 4°C i 1 time gav 40 ml af en supernatant. Derefter blev denne supernatant indstillet på pH 12,5 ved tilsætning af 3 M NaOH og omrørt forsigtigt ved rumtemperatur i 10 minutter. pH-Værdien blev bragt tilbage til 15 8,5 ved tilsætning af 2 M Tris-HCl (pH 7,5) efter fulgt af yderligere omrøring i 3 minutter. På dette tidspunkt var væskevoluminet ca. 55 ml. Et 1/9 volumen 5 M NaCl blev tilsat, og derefter blev der foretaget phenol-ekstraktion. Et 1/250 volumen 20 af 5 mg/ml RNase (Sigma) blev tilsat, RNA-nedbryd-ningsreaktionen gennemførtes ved 37° i 1 time, der blev derefter tilsat et 1/5 volumen 5 M NaCl, og der blev tilsat 1/3 volumen 30% PEG 6000 (Naka-rai Chemicals). Den resulterende blanding blev 25 henstillet ved -20°C i 2 timer. Det resulterende bundfald blev indsamlet ved centrifugering og opløst i 2 ml af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA, der blev tilsat natrium-dodecylsulfat (SDS) i en koncentration på 0,5&, 30 proteinase K (Sigma) blev tilsat i en koncentration på 50 yg/ml, og den proteolytiske reaktion gennemførtes ved 37°C i 1 time. Efter tre gentagne phenol-ekstraktioner udvandtes DNA'et ved chloro-form-ekstraktion og ethanolfældning og blev opløst 35 i 1 ml af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. På denne måde kunne der vindes 800 yg pKYP26. Strukturen af pKYP26 blev bekræftet ved kløvning med EcoRI, Kpnl, BamHI, 82 DK 174044 B1

Bglll og PstI efterfulgt af agarosegelelektroforese.

Referenceeksempel 3 1) Isolering af det humant LT-cDNA-bærende plasmid pLTI.

5 (1) Fremstilling af poly(A)-RNA fra Lukll-celler.

Guanidinthiocyanat-lithiumchlorid-metoden (Cathala et al: DNA, 2, 329 (1983)] fulgtes for at fremstille et poly(A)-bærende RNA fra den humane ^q lymfoblastoide cellelinie Lukll, som følger:

Humane lymfoblastoide Lukll-celler [Berish Y. Rubin et al: Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 8j2, 6637 (1985)] blev sået i 1 liter RPMI 1640-medium (Nis-sui Seiyaku) indeholdende 5% foetalt bovinserum og 1 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfon- ' .5 syre (HEPES) i en cellekoncentration på 8 x 10 celler/ml og dyrket deri. En rotations-dyrkningsflaske anvendtes til kulturen. Efter dyrkning ved 37°C i 48 timer blev cellerne indsamlet ved centri-20 fugering og overført til en frisk 1 liters portion af RPMI 1640-medium indeholdende 10 ng/ml phor- bolmyristatacetat (PMA), 5% foetalt bovinserum og 1 mM HEPES, og dyrkning blev foretaget ved 37UC i yderligere 48 timer. Derefter blev celler indhøstet fra en portion (250 ml) af denne celle-25 suspension ved centrifugering ved 1100 x g ved 4°C i 10 minutter, vasket med 80 ml phosphatpuffer og bragt til opløsning i 10 ml af en opløsning indeholdende 5 M guanidinthiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) og 8 vol% 2-mercaptoethanol ^ under anvendelse af en hvirvelblander. Det opløse-liggjorte produkt blev overført til et centrifugerør, der blev tilsat 80 ml 4 M LiCl, og blandingen blev omrørt og derefter henstillet ved 4°C i 20 timer. Efter centrifugering på en Hitachi RPR10-35 rotor ved 9000 rpm i 90 minutter udvandtes et RNA-bundfald. RNA-bundfaldetblev suspenderet i 50 ml af en opløsning indeholdende 4 M urinstof og 2 M- 83 DK 174044 B1 lithiumchlorid, og efter centrifugering på en Hitachi RPR1O-rotor ved 9000 rpm i 60 minutter blev RNA'et igen udvundet som et bundfald, dette blev opløst i 10 ml af en opløsning indeholdende 0,1% 5 natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), og RNA'et udvandtes ved phenol-chloro-form-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning.

Ca. 2,5 mg af det således vundne RNA blev opløst i 1 ml af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-10 HC1 (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Efter inkubation ved 65°C i 5 minutter blev der tilsat 0,1 ml 5 M NaCl.

Blandingen blev underkastet oligo(dT)-cellulosesøjle (P-L Biochemicals)-chromatografi (søjlevolumen 0,5 ml). Detadsorberede poly{A)-holdige mRNA blev 15 elueret med en opløsning indeholdende 10 mM Tris- HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA, hvorved vandtes ca. 100 ug af det poly(A)-holdige mRNA.

(2) cDNA-Syntese og insertion af DNA'et i en vektor.

20 Okayama-Berg-metoden [Mol.Cell.Biol., _2, 161 (1982)] anvendtes til cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruktion ved insertion af det vundne cDNA. Processerne hertil er vist i Fig.9.

Til 300 pi af en opløsning indeholdende 25 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl blev der sat 400 ug pCDV1 [Okayama & Berg: Mol.

Cell.Biol., 3, 280 (1983)], og efter yderligere tilsætning af 500 enheder Kpnl gennemførtes reaktionen ved 37°C i 6 timer, hvorved plasmidet blev kløvet 30 ved KpnI-stedet. DNA'et blev udvundet ved phenol- chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning.

. Ca. 200 pg af det Kpnl-kløvede DNA blev sat til 200 ul af en opløsning fremstillet ved at sætte dTTp i en koncentration på 0,25 mM til TdT-puffer, 35 og efter yderligere tilsætning af 81 enheder TdT (P-L Biochemicals) gennemførtes reaktionen ved 37°C i 11 minutter, hvorved en poly(dT)-kæde (ca.

67 dT-rester) blev adderet til hver 3'-ende af 84 DK 174044 B1

KgnI-kløvningsstedet i pCDVl. Ca. 100 yg af det poly(dT)kæde-"tailede” pCDVl-DNA udvandtes fra opløsningen ved ethanolfældning efter phenol-chloro-form-ekstraktion. DNA'et blev sat til 150 yl af 5 en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^ og 100 mM NaCl, og efter yderligere tilsætning af 360 enheder EcoRI gennemførtes reaktionen ved 37°C i 2 timer. Reaktionsblandingen blev behandlet ved LGT-metoden, og der udvandtes et DNA-fragment 10 på ca. 3,1 kb. Ca. 60 yg af det poly(dT)kæde-"tai-lede" pCDVl vandtes herved. DNA'et blev opløst i 500 yl af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA, opløsningen blev inkuberet ved 65°C i 5 minutter og derefter afkølet med is, 15 og der blev tilsat 50 yl 5 M NaCl. Blandingen blev underkastet oligo{dA)-cellulosesøjle(Collaborative Research)-chromatografi. Molekyler med tilstrækkelig poly(dT)-kædelængde blev adsorberet på søjlen, og de blev elueret med en opløsning indeholdende 20 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA, hvorved vandtes 27 yg af det poly(dT)kæde-"tailede" pCDVl (i det følgende betegnet som vektorprimer).

Derefter blev der fremstillet et linker- DNA.

25 Ca. 14 yg pLI [Okayama & Berg: MOl. Cell.

Biol., 2' 280 (1983)] blev sat til 200 yl af en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^ og 50 mM NaCl, og efter yderligere tilsætning af 50 enheder PstI gennemførtes reaktionen 30 ved 37°C i 4 timer med henblik på kløvning af pLI-DNA'et ved Pstl-stedet. Reaktionsblandingen blev underkastet phenol-chloroform-ekstraktion, og der vandtes ved ethanolfældning ca. 13 yg af det Pstl-kløvede pLl-DNA. Ca. 13 yg af DNA'et blev sat til 35 5 yl TdT-puffer indeholdende dGTP i en slutkoncen- tration på 0,25 mM, og efter yderligere tilsætning af 54 enheder TdT (P-L Biochemicals) blev der inkuberet ved 37°C i 13 minutter for at bevirke addi- 85 DK 174044 B1 tion af en (dG)-kæde (ca. 14 dG-rester) til pLl ved hvert 3'-ende-PstI-kløvningssted. Efter phenol-chloroform-ekstraktion udvandtes DNA'et ved ethanol-faeldning. DNA'et blev sat til 100 yl af en puffer 5 indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, og efter yderligere tilsætning af 80 enheder Bindlll gennemførtes inkubation ved 37°C i 3 timer for at bevirke kløvning af pL1-DNA'et ved Hindlll-stedet. Reaktionsblandingen blev fraktioneret ved 10 agarosegelelektroforese, og et DNA-fragment på ca. 0,5 kb udvandtes ved DEAE-papirmetoden [Dretzen et al i Anal.Biochem., 112, 295 (1981 )]. Herved vandtes det oligo(dG)kaede-"tailede"linker-DNA (i det følgende blot betegnet linker-DNA).

15 Ca. 2 yg af poly(A)-RNA'et og ca. 1,4 yg af vektorprimeren blev opløst i 22,3 yl af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KC1, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTp, dGTP og dCTP) og 10 enheder ribonuclease-20 inhibitor (P-L Biochemicals), der blev tilsat 10 enheder omvendt transkriptase (Seikagaku Kogyo), og der blev inkuberet ved 41°C i 90 minutter for at bringe mRNA'et til at syntetisere et dermed komplementært DNA. Reaktionsblandingen blev under-25 kastet phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning, hvorved udvandtes vektorprimer-DNA'et med RNA-DNA-dobbelstrengen adderet dertil.

DNA'et blev opløst i 20 yl TdT-puffer indeholdende 66 yM dCTP og 0,2 yg poly(A), der blev tilsat 14 30 enheder TdT (P-L Biochemicals), og der blev inkuberet ved 37°C i 2 minutter for at bevirke addition af en (dC)-kaede (20 dC-rester) til 3'-enden af cDNA'et . Reaktionblandingen blev underkastet phenol-chloroform-ekstraktion, og derefter udvandtes det 35 (dC)kæde-"tailede" cDNA-vektorprimer-DNA ved ethanolfældning. DNA'et blev opløst i 400ul af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, der blev tilsat 20 enheder Hindlll, 86 DK 174044 B1 og inkubation gennemførtes ved 37°C i 2 timer med henblik på kløvning med HindiIl-stedet. Phenol-chloroform-ekstraktion af reaktionsblandingen og ethanolfældning gav 0,5 picomol af det (dC)kaede-"tailede" cDNA-vektorprimer-DNA. DNA'et (0,2 pico-5 mol) blev opløst i 100 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl og 1 mM EDTA, og inkubation gennemførtes ved 65°C, 42°C og 0°C i henholdsvis 10 minutter, 25 minutter og 30 minutter i nævnte rækkefølge. Et totalt volumen 10 på 100 μΐ af et reaktionsmedium blev fremstillet med følgende sammensætning: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCl og 0,1 mM β-NAD. Til dette reaktionsmedium blev der sat 25 enheder E.coli-afledt DNA-ligase (New England 15 Bio-Labs), og inkubation gennemførtes ved 11°C i 18 timer. Reaktionsmediet blev suppleret med 40 μΜ af hvert af dNTP og med β-NAD til en slutkoncentration på 0,15 mM og efter tilsætning af 10 enheder E.coli-DNA-ligase,

20 enheder E.coli-DNA-polymerase I (P-L Biochemi-20 cals) og 10 enheder E.coli-ribonuclease H (P-L

Biochemicals) blev der inkuberet ved 12°C i 1 time og derefter ved 25°C i 1 time. Ovennævnte reaktionsmetode bevirkede cirkularisering af det cDNA-holdige rekombinante DNA og substituion af RNA-delen af 25 RNA-DNA-dobbeltstrengsn med det tilsvarende DNA.

Herved dannedes det rekombinante plasmid i form af et fuldstændigt dobbeltstrenget DNA.

(3) Udvælgelse af det humant LT-cDNA-holdige rekombinante DNA.

30 Det rekombinante plasmid vundet som beskrevet under (2) anvendtes til at transformere E.coli C600SF8 [Cameron: Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 12, 3416 (1975)] ved metoden ifølge Scott et al [Katsuya

Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 35 (1983)]. Ca. 30.000 vundne kolonier blev fikseret på et nitrocellulosefilter. Een stamme, der var i stand til ved 52°C at associere stærkt med en 32 probe fremstillet ved med P at mærke det syntetiske 17-base-DNA 5'-GATCCCCGGCCTGCCTG-3' svarende til basesekvense n af en del af den ikke-transla- 87 DK 174044 B1 terbare 5’-region af det humane LT-cDNA isoleret af Genentech [Patrick W. Gray et al: Nature, 312, 721 (1984)], blev udvalgt [Grunstein-Hogness-metode:

Proc.Natl. Acad. Sci. USA, _72, 3961 ( 1975)]. Hele 5 basesekvensen af cDNA'et af plasmidet pLT1 båret af denne stamme blev bestemt ved dideoxy-sekvens-bestemmelsesmetoden under anvendelse af M13 phag.

Som et resultat heraf fandtes, at pLT1-DNA'et koder på humant LT .

10 4) Konstruktion af det rekombinante plasmid pLA1.

I et totalt volumen på 50 μΐ af en opløsning (i det følgende betegnet "Y-O-puffer") indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 6 mM 2-mer-15 captoethanol blev der opløst 5 yg pLTI (4,7 kb) vundet ved metoden beskrevet i den foregående del, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet XhoII (Boehringer Mannheim), og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Derefter blev 20 der tilsat NaCl i en slutkoncentration på 150 mM, der blev tilsat 10 enheder af restriktionsenzymet Nsil (New England Bio-Labs), og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i yderligere 3 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca.

25 0,3 yg af et ca. 750 bp DNA-fragment (XhoII-Nsil- fragment) indeholdende det meste a det humane LT-DNA.

Separat blev 20 pg pLTI opløst i 200 pi Y-50-puffer, der blev tilsat 40 enheder af restrik-30 tionsenzymet Haelll, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 2 timer. Derefter blev der tilsat NaCl i en slutkoncentration på 150 mM, der blev tilsat 40 enheder Nsil, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i yderligere 3 timer. Poly-35 acrylamidgelelektroforese af reaktionsblandingen gav ca. 40 ng af et ca. 50 bp DNA-fragment (Haelll-NsiI-fragment) indeholdende den N-terminale del af humant LT.

88 DK 174044 B1

Yderligere blev separat 3 yg pGELI (3,4 kb) opløst i et totalt volumen på 30 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Stul og Bglll, og kløvningsreaktionen 5 gennemførtes ved 37°C i 3 timer.

Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 1,0 yg af et Apr-genholdigt DNA-fragment på ca. 2,3 kb (Stul-BglII-fragment).

Derefter blev 0,2 yg af det pLTI-afledte 10 Xholl-NsiI-fragment (ca. 750 bp), 20 ng af det pLTI-afledte HaeIII-NsiI-fragment (ca. 50 bp) og 0,6 yg af det pGELI-afledte Stul-BglII-fragment (ca. 2,3 kb) opløst i et totalt volumen på 20 yl T4 ligasepuffer, der blev yderligere tilsat 2 enheder 15 T4 DNA-ligase (Takara Shuzo) til blandingen, og reaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

Det således vundne rekombinante plasmid-DNA anvendtes til at transformere E.coli KM430 ved metoden ifølge Cohen et al, og der vandtes 20 en Apr-koloni. Plasmid-DNA'et blev isoleret og renset fra denne transformant ved en kendt metode, og strukturen af plasmidet blev analyseret ved kløvning af nævnte plasmid-DNA med restriktionsenzymer, såsom Stul. Som resultat heraf blev det 25 bekræftet, at det ønskede plasmid var vundet. Dette rekombinante plasmid er betegnet pLAI.

5) Konstruktionm af LT-ekspressionsplasmidet pLSA1.

En E.coli KM430-transformant husende pLAI 30 (3,1 kb), vundet som beskrevet i den foregående del, blev dyrket, og pLAl-DNA'et blev på konventionel måde fremstillet ud fra dyrkede celler deraf.

I 30 yl Y-100-puffer blev der opløst 3 yg af det vundne pLAl-DNA, der blev tilsat 3 enheder af hver 35 af Stul og Bglll, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et ca. 7S0 bp DNA-fragment (StuI-BglII-fragment) indeholdende 89 DK 174044 B1 det meste af det humane LT-gen.

Separat blev 3 yg pKYLlO, fremstillet ved metoden beskrevet i US-patentskrift nr. 4.686.191, opløst i 30 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 6 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-metoden et tryptophanpromotor(Ptrp)-holdigt DNA-fragment på ca. 1,1 kb (BanIII-PstI-fragment).

10 Yderligere blev 2 yg pGEL1 (3,4 kb) opløst i 20 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 4 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll, BamHI og PstI, og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktionsblandingen vandtes ved LGT-15 metoden ca. 0,7 yg af et lipoprotein-afledt terminator-holdigt DNA-fragment på ca. 1,7 kb (Pst-BamHI-fragment ) .

Separat blev der, af sådanne grunde som det nødvendige i at tilvejebringe sekvensen fra 20 N-terminus'en af det modne humane LT-polypeptid, nemlig Leu (CTA) til den anden base (GG) af den 5. aminosyre Gly (GGC) såvel som den for ekspression krævede initieringscodon (ATG) og det nødvendige i at indstille afstanden mellem SD-sekvensen ned-25 strøms fra Ptrp og ATG på en passende længde på 6-18 bp, syntetiseret følgende DNA-linker:

Banlll 27 mer blunt-end 30 Met Leu Pro Gly Val 5 ' -CGATAAGCTT ATG CTA| CCA |GGA| GTå| GG -3 ' 31 - TATTCGAA TAC GAT GGT CCT CAT CC -5' 25 mer 35 90 DK 174044 B1 Først blev det 27-mere og 25-mere enkeltstrengede DNA syntetiseret ved den almindelige phosphot ri estermetode.. Den 27-mere og 25-mere (hver 20 picomol) blev opløst i et totalt volumen på 5 40 yl T4 kinasepuffer, der blev tilsat 6 enheder T4 polynucleotidkinase (Takara Shuzo), og phosphor-ryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,3 yg af det pLAl-afledte 10 Stul-BglII-fragment (ca. 790 bp), 0,4 yg af Banlll-Pstl-fragmentet af ekspressionsvektoren pKYP10 og 0,6 yg af det pGELl-afledte Pstl-BamHI-fragment (ca. 1,7 kb), hver vundet som ovenfor beskrevet, opløst i 25 yl T4 ligasepuffer, og der blev til 15 denne blandingsopløsning sat ca. 1 picomol af den ovennævnte DNA-linker. Efter yderligere tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase til denne blanding blev ligeringsreaktionen gennemført ved 4°C i 18 timer.

Den rekombinant plasmid-holdige reaktions-20 blanding anvendtes til at transformere E.coli KM430, og der vandtes en Apr-koloni. Plasmid-DNA’et udvandtes fra dyrkede celler fra denne koloni.

Strukturen af det vundne plasmid blev bekræftet ved kløvning med restriktionsenzymerne EcoRI, Banlll, 25 Pst.I, Hindlll og Bqlll efterfulgt af agarosegel-elektroforese. Dette plasmid er betegnet pLSAl.

Basesekvensen af pLSAl i nærheden af Banlll og Hindlll blev ved Maxam-Gilbert-metoden [A.M.Maxam et al: Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 74_, 560 (1 977)] 30 bekræftet at være følgende:

Banlll Hindlll

Met Leu Pro Gly Val Gly Leu CG ATA|AGC TT ATG CTA CCA GGA GTA GGC CTC

ν' } 35 91 DK 174044 B1

Referenceeksempel 4 Konstruktion af ATG-vektoren pTrS2Q

Ved at følge fremgangsmåden vist i Fig.13 5 blev der konstrueret ATG-vektoren pTrS20, hvori afstanden mellem SD-sekvensen og initieringscodonen ATG er 14 baser, og som har et Sacl-sted umiddelbart bag ATG-codonen.

Først blev 3 yg pKYPlO, fremstillet ved 10 metoden beskrevet i US-patentskrift nr. 4.686.191, opløst i 30 yl Y-100-puffer, der blev tilsat 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Banlll og Nrul (New England Bio-Labs) og kløvningsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 3 timer. Fra reaktions-15 blandingen vandtes ved LGT-metoden ca. 0,5 yg af et Ptrp-holdigt DNA-fragment på ca. 3,8 kb (Bad II-Nrul-fragment).

Separat blev der syntetiseret følgende DNA-linker ved phosphotriestermetoden til tilveje-20 bringelse af initieringscodonen ATG nedstrøms fra Ptrp:

Banlll Hindlll SacI Nrul 25 5 1 - (cgataLgCTTATGAGCTCG -3' (19 mer) 3'- TATTCGAjATACTCGAjGC -S* (17 mer) 30 Det syntetiske 19-mere og 17-mere DNA (hvert 10 picomol) blev opløst i ialt 20 yl af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA'er og 1 mM ATP, der blev tilsat 3 enheder T4 polynucleotidkinase 35 (Takara Shuzo), og phosphoryleringsreaktionen gennemførtes ved 37°C i 60 minutter.

Derefter blev 0,1 yg af det pKYPI0-afledte Ban111-Nrul-fragment (ca. 3,8 kb), vundet som ovenfor 92 DK 174044 B1 beskrevet, og ca. 0,5 picomol af den ovennævnte DNA-linker opløst i 20 μΐ T4 ligasepuffer, der blev tilsat 2 enheder T4 DNA-ligase, og ligeringsreaktionen gennemførtes ved 4°C i 18 timer.

5 Den vundne rekombinant plasmidblanding anvend tes til at transformere E.coli HB101 [Bolivar et al: Gene, 2, 75 (1977)], og der vandtes en Apr-koloni. Fra dyrkede celler fra denne koloni blev der udvundet plasmid-DNA'et. Strukturen af det 10 vundne plasmid blev bekræftet ved kløvning med restriktionsenzymerne EcoRI, Banlll, HindiII , SacI og Nrul efterfulgt af agarosegelelektroforese.

Dette plasmid blev betegnet pTrS2Q (Fig.13). Basesekvensen af pTrS20 i nærheden af BanIII-og Hindlll-1 5 stederne blev ved dideoxy-sekvensbestemmelsesmetoden under anvendelse af M13 phag bekræftet at være følgende:

Banlll. Hindlll SacI Nrul 20 SD Sequence Met

AAGG GTAT CGATA AGCTT ATG AGCtJ CG CGA

Claims (22)

93 DK 174044 B1

1. Polypeptid med en aminosyresekvens som afledt fra aminosyresekvensen af den humane granulocytkolo-nistimulerende faktor (hG-CSF) polypeptid ved amino- 5 syresubstitution, kendtegnet ved, at mindst en aminosyre ud af den 1. til 6- aminosyre på den Ν'-terminale side og eventuelt den 17. aminosyre deraf adskiller sig fra aminosyren i den tilsvarende position af hG-CSF polypeptidet med det forbehold, at me-10 re end en aminosyre af hG-CSF substitueres, hvis aminosyren Thr+·*- af hG-CSF erstattes med Ala, Gly eller Pro; og med det yderligere forbehold, at aminosyrerne i positionerne +1 og +2 ikke substitueres samtidigt.

2. DNA kodende for et polypeptid ifølge krav 1.

3. Rekombinant plasmid omfattende et plasmid DNA og som indsat deri et DNA fragment kodende for et po- polypeptid som defineret i krav 1.

4. Rekombinant plasmid ifølge krav 3, hvori plasmid DNA'et er et tryptophanpromotorholdigt 20 plasmid DNA med nævnte DNA fragment indsat i nævnte plasmid DNA på et sted nedstrøms for tryptophanpromo-toren.

5. Rekombinant plasmid ifølge krav 3 eller 4 som udvælges fra gruppen bestående af pCfTL38, pCfTL41, 25 pCfTL35 og pCfTAArg4 omfattende en indsættelse, som koder for et hG-CSF polypeptid, der er modificeret som følger: 94 DK 174044 B1 Plasmid Position af aminosyresubstitution __(substitueret aminosyre af hG-CSF)__ 1. (Thr) \~ 4. (Glyj _____ ___ *)~ " pCfTL41 Arg _ pCfTL35 Cys __ pCfTAArg4 _ Arg *)ingen substitution 5

6. Rekombinant plasmid ifølge krav 3 eller 4, som er udvalgt fra gruppen bestående af pCfTMl4, pCfTM17, pCfTM113 og pCfTAArg4S omfattende en indsættelse, som koder for et hG-CSF polypeptid, der er modificeret 10 som følger: Plasmid Position af aminosyresubstitution (substitueret aminosyre af hG-CSF) 1. (Thr) 3. (Leuj 4. (Gly) 17. (Cys) pCfTMl4 Ser Cys *) pCfTM17 Ser Arg _ _ pCfTM113 Ser Ser _ _ pCfTAArg4S _ _ Arg Ser *) ingen substitution

7. Rekombinant plasmid ifølge krav 3 eller 4, som er udvalgt fra gruppen bestående af pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfBBlOl, pCfBD28Al7 og pCfBD28Tl7 omfattende en ind-20 sættelse, som koder for et hG-CSF polypeptid, der er modificeret som følger: 95 DK 174044 B1 Position af aminosyresubstitution Plasmid (aminosyre af hG-CSF) T. T. T. 5^ rr (Thr) (Leu) (Gly) (Pro) (Cys) (Ala) pCfBC428l Glu Lys Ser Ssr pCIBC45 Val Πθ Arg Ser Ser pCfBC52 Cys ,1θ Arg Ser Ser pCfBC59 Tyr ,|e Arg Ser Ser pCiBC76 Arg Thr Arg Ser Ser pC(BC77 -* Thr Arg Ser Ser pCfBC93 Asn G(u Arg Ser Ser pCfBC95 He Thr Arg Ser Ser PCIBC97 Ser Thr Arg Ser Ser pCfBD28 Ala Tyr Arg Ser pCfBD56 Ala Ser Asn Ser Ser pCfBD82 Ala pr0 Asn Arg Ser Gly pCIBB101 Ala Thr Arg Ser Ser pCIBD28A17 Ala -n,r Tyr Arg Ala pCfBD28T17 Ala Thr Arg Thr -* ingen substitution

8. Mikroorganisme indeholdende et rekombinant plasmid som defineret i et af kravene 5 til 7.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypep-tid ifølge krav 1, hvilken fremgangsmåde omfatter (a) dyrkning i et medium af en mikroorganisme inde- 10 holdende et rekombinant plasmid kodende for nævnte polypeptid for derved at bevirke dannelse og akkumulering af nævnte polypeptid i kulturen, og (b) indvinding af nævnte polypeptid fra nævnte kultur.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvori nævnte mi-15 kroorganisme hører til arten Escherichia coli. 96 DK 174044 B1

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvori nævnte re-kombinante plasmid er udvalgt fra plasmiderne som defineret i kravene 5 til 7.

12. Polypeptid afledt fra hG-CSF polypeptidet ved 5 deletion, hvori et peptid omfattende den 1. til 4., 1. til 5., 1. til 6., 1. til 7. eller 1. til 11. aminosyre af den N-terminale del af hG-CSF polypeptidet mangler, og eventuelt ud over aminosyredeletionen er den 17. aminosyre (Cys+^) af hG-CSF polypeptidet 10 blevet erstattet med serin (Ser) med det forbehold, at den 1. til 4. aminosyre af hG-CSF kun er delete-ret, hvis Cys+-^ af hG-CSF er erstattet med Ser.

13. DNA kodende for et polypeptid ifølge krav 12.

14. Rekombinant plasmid, som omfatter et plasmid

15. Rekombinant plasmid ifølge krav 14, som omfatter et plasmid DNA og som en indsættelse deri et DNA fragment kodende for et polypeptid som afledt fra 20 hG-CSF polypeptidet ved deletion af et peptid omfattende den 1. til 11. aminosyre af den N-terminale del deraf.

15 DNA og som en indsættelse deri et DNA fragment kodende for et polypeptid som defineret i krav 12.

16. Rekombinant plasmid ifølge krav 14 eller 15, hvori et tryptophanpromotorholdigt plasmid DNA anven- 25 des som nævnte plasmid DNA med nævnte DNA fragment indsat i plasmid DNA'et på et sted nedstrøms for t r ypt ophanpr omot o re n.

17. Rekombinant plasmid ifølge krav 16, som er udvalgt fra gruppen bestående af pCfTNS7, pCfTNS301, 30 pCfTNS401 og pCfTNS501 omfattende en indsættelse, som koder for et hG-CSF polypeptid, der er modificeret som følger: 97 DK 174044 B1 Plasmid Type af sekvensmodifikation __Deletion Substition 17. (Cys)^ pCfTNS7 1-4 Ser pCfTNS301 1-H Ser pCfTNS401 1-7 Ser pCfTNS501 1-6 Ser ^Position af deleterede aminosyrer i hG-CSF 2)Substitueret aminosyre af hG-CSF 5

18. Fremgansgmåde til fremstilling af et polypep-tid ifølge krav 12, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning i et medium af en mikroorganisme indeholdende et rekombinant plasmid omfattende et plasmid DNA 10 og som en indsættelse deri et DNA fragment kodende for nævnte polypeptid for derved at bevirke dannelse og akkumulering af nævnte polypeptid i kulturen og indvinding af nævnte polypeptid fra nævnte kultur.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18 til fremstillin-15 gen af et polypeptid med en aminosyresekvens som afledt fra nævnte aminosyresekvens af hG-CSF polypepti-det ved substitution af den 17. aminosyre (cystein) med serin og deletion af 4-7 aminosyrer fra den N-terminale side deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter 20 underkastelse af et polypeptid som afledt fra hG-CSF polypeptidet ved substitution af den 17. aminosyre (cystein) med serin og med mindst en aminosyre ud af 1. til 6. aminosyre af den N-terminale side deraf forskellig fra en aminosyre derfra til virkningen af 25 en protease i vandigt medium for derved at bevirke dannelsen af nævnte nye polypeptid i reaktionsblandingen og indvinding af nævnte nye polypeptid fra nævnte reaktionsblanding. 98 DK 174044 B1

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvori nævnte protease er udvalgt fra gruppen bestående af subtili-sin A, subtilisin BPN1, subtilisin Carlsberg, subti-lisin novo, proteinase K, nagase, thermolysin, en- 5 doproteinase Arg-C, trypsin og a-chymotrypsin.

21. Farmaceutisk præparatet omfattende en effektiv mængde af mindst et polypeptid som defineret i krav 1 og 12, eventuelt i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer eller hjælpestof.

22. Anvendelsen af et polypeptid ifølge krav 1 eller 12 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandlingen af en infektiøse sygdomme til behandlingen af leukæmi og til forøgelse af antallet af neutrofile.