DE3786200T2 - Diagnostische Verfahren zum Nachweis von Lymphomen bei Menschen. - Google Patents

Diagnostische Verfahren zum Nachweis von Lymphomen bei Menschen.

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DE3786200T2 DE87305863T DE3786200T DE3786200T2 DE 3786200 T2 DE3786200 T2 DE 3786200T2 DE 87305863 T DE87305863 T DE 87305863T DE 3786200 T DE3786200 T DE 3786200T DE 3786200 T2 DE3786200 T2 DE 3786200T2
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Description

    Stand der Technik
  • Bei der überwiegenden Zahl von bösartigen Erkrankungen des Blutbildungssystems beim Menschen werden spezifische Strukturumbauten in den Chromosomen, insbesondere Translokationen und Inversionen, beobachtet. Beim Burkitt-Lymphom führen die spezifischen chromosomalen Translokationen zur Juxtaposition eines von drei menschlichen Immunoglobulin-Loci einerseits und dem c-myc-Onkogen andererseits. Bei diffusen B-Zell- Lymphomen, multiplen Myelomen und chronischen Lymphozytenleukämien des B-Zelltyps mit t(11;14) (q13;132)-Chromosomentranslokation wird der bcl-1-Locus zum H-Kettenlocus in Chromosom 14 verlagert. In der Mehrzahl der Fälle von Follikellymphom, einer der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Blutbildungssystems beim Menschen, kommt es zur (t14;18) (q32;q21)- Chromosomenlokation. Bei dieser wird das bcl-2- Gen in eine an den H-Kettenlocus angrenzende Position gebracht. Bei einer aus einem Leukämie-Patienten erhaltenen Zellinie, sowohl mit einer t(14;8)-Translokation als auch mit einer t(14;18)-Translokation wurde verstärkte mRNA- Produktion durch das bcl-2-Gen beobachtet (siehe Tsujimoto et al. Science, B. 228, Seiten 1440-1443 (1985)). Daraus wurde der Schluß gezogen, daß die Transkriptionseinheit des bcl-1-Gens den Chromosomenbruchpunkt überbrückt und daß vermutlich auf diese Weise das Onkogenprotein in den B- Zellenneoplasmen strukturell verändert wird. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Translokation das Onkogenprotein selbst nicht verändert, da die Translokationsbruchstellen unterhalb (downstream) der tatsächlichen Protein kodierenden Sequenzen zu liegen kommen. Die Onkogenese dürfte somit ausschließlich auf der Überproduktion der normalen menschlichen Genprodukte des bcl-2-Gens beruhen.
  • Eine wirksame Tumorbehandlung hängt häufig von einer frühen und richtigen Diagnose der Malignität ab. Es besteht daher der Bedarf an einfachen und genauen diagnostischen Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung maligner Erkrankungen, wie z.B. von Follikellymphomen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines diagnostischen Verfahrens zum Nachweis von t(14;18)-Translokationen aufweisenden B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines menschlichen bcl-2-Gens, das in Bakterien exprimiert werden kann.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines praktisch reinen Proteinpräparats eines bcl-12-Gen- Produktes.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines diagnostischen Verfahrens zum Nachweis von B-Zellen- Neoplasmen unter Verwendung eines mit einem bcl-2-Gen-Produkt immunreaktiven Antikörpers.
  • Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch eine oder mehrere der nachfolgenden Ausführungsformen gelöst.
  • Eine Ausführungsform betrifft ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis von B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:
  • Isolierung von B-Zellen aus dem Menschen, Extraktion der Proteine aus den B-Zellen zur Bildung einer Testprobe,
  • Kontaktierung der Testprobe mit einem Antikörper, der mit einem Genprodukt des menschlichen bcl-2-Gens unter Bedingungen immunreaktiv ist, bei denen Antikörper-Antigen-Komplexe gebildet werden und beständig sind,
  • Quantifizierung der Menge der mit der Testprobe gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexe und
  • Vergleich der Menge der mit der Testprobe gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexe mit der mit einer Kontrollprobe von Proteinen gebildeten Menge, wobei ein Verhältnis der Testprobenkomplexe zu den Kontrollprobenkomplexen von über ca. 10 B-Zellen-Neoplasmen anzeigt und die Kontrollprobe von Proteinen extrahiert ist aus Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B-Zellen aus einem gesunden Menschen, Zellen aus einer festgelegten normalen B-Zell- oder prä-B- Zellinie und Nicht-B-Zellen aus dem betreffenden Menschen.
  • Bereitgestellt werden auch praktisch intronfreie Formen des menschlichen bcl-2-Gens. Derartige Gene können in Bakterien repliziert und exprimiert werden, um Proteine zu bilden, welche dieselbe Primärstruktur wie die im Menschen produzierten bcl-2-Proteine aufweisen.
  • Bereitgestellt werden ferner praktisch reine Präparate von Proteinen mit einem N-terminalen Ende, das durch das erste Exon des menschlichen bcl-2-Gens kodiert wurde.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis von B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:
  • Isolierung von B-Zellen aus dem Menschen;
  • Extraktion der Proteine aus den B-Zellen zur Bildung einer Testprobe;
  • Kontaktierung der Testprobe mit einer DNA-Probe, die eine Sequenz von wenigstens 15 Nucleotiden in der Länge aufweist, die aus dem menschlichen bcl-2-Gen erhalten wurden, unter Bedingungen, bei denen homologe RNA-DNA-Hybride entstehen und beständig sind;
  • Quantifizierung der Menge an in der Testprobe gebildeten RNA-DNA-Hybriden und
  • Vergleich der mit der Testprobe gebildeten Menge an RNA-DNA- Hybriden mit der mit einer Kontrollprobe von RNA gebildeten Menge, wobei ein Verhältnis der Testprobenhybriden zu den Kontrollprobenhybriden von über ca. 10 B-Zellen-Neoplasmen anzeigt und die Kontrollprobe von RNA extrahiert wird aus Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B-Zellen eines gesunden Menschen, Zellen aus einer normalen B-Zell- oder prä-B-Zellinie und Nicht-B-Zellen aus dem betreffenden Menschen.
    • Kurzbeschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt eine Genomrestriktionskarte des Chromosoms 18 und der Struktur der cDNA-Klone.
  • Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz der bcl-2-cDNA, die dem 5,5 kb-Transkript entspricht. Gezeigt sind lediglich die den offenen Leseraster (open reading frame) einschließenden Sequenzen.
  • Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz der bcl-2-cDNA, die dem 3,5 kb-Transkript entspricht. Gezeigt sind lediglich die den offenen Leseraster einschließenden Sequenzen.
    • Detaillierte Beschreibung
  • Es wurde gefunden, daß B-Zellen-Neoplasmen, die mit t(14; 18)-Chromosomentranslokationen verbunden sind, einen Anstieg in der Expression sowohl der mRNA als auch der Proteinprodukte des bcl-2-Gens bewirken. Die Expression in den neoplastischen B-Zellen übersteigt im allgemeinen die Menge, wie sie von normalen Zellen exprimiert wird, um das ca. 10fache. Diese erhöhte Expression kann als diagnostisches Mittel zum Nachweis von B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen verwendet werden. Derartige Neoplasmen umfassen sowohl Follikellymphome wie auch andere Lymphome.
  • Es wurde festgestellt, daß drei Arten von mRNA vom bcl-2-Gen transkribiert werden. Wenigstens zwei verschiedene Proteinprodukte sind bereits identifiziert worden: Ein 239 Aminosäuren umfassendes Protein, das als bcl-2-α bezeichnet wird, wird von einer 5,5 kb-mRNA übersetzt und ein aus 205 Aminosäuren bestehendes Protein, das als bcl-2-β bezeichnet wird, von einer 3,5 kb-mRNA. Außerdem wird angenommen, daß bcl-2-α auch von einer 8,5 kb-mRNA übersetzt wird. Alle drei verschieden großen Transkriptarten haben die Hauptsequenzhomologie im 5'-Anteil des Gens gemeinsam. Diese wird daher als erstes Exon oder 5'-Exon bezeichnet. Die beiden größeren Transkripte werden offensichtlich mit einem zweiten Exon verbunden, das wenigstens 50 kb distal vom ersten entfernt ist. Die Verbindungsstelle ("Splice-Site") befindet sich in der Mitte der Proteinkodierungssequenz. Das 3,5 kb-Transkript kodiert somit ein Protein mit einem anderen Carboxylterminus als die Proteine, die durch die beiden größeren Transkripte kodiert werden.
  • Der "Hotspot" für die Chromosom-Bruchstellen unter den t(14;18)-Translokationen bei der Karte der Follikellymphome verweist das 3'-Ende in die Proteinkodierungsregion. Es konnte somit festgestellt werden, daß die Translokationen die Primärstruktur der Proteinprodukte nicht verändern.
  • Für die Exprimierung des Gens für die Proteine bcl-2-α und -β in Bakterien können die von der ATCC unter der Eingangsnummer 67147 und 67148 erhältlichen Bakterienisolate verwendet werden. Die Klone des bcl-2-Gens wurden durch cDNA- Klonung erhalten und enthalten demnach keine Introne. Diese Klone können somit in Bakterien exprimiert werden, um Produkte herzustellen, welche dieselbe Primärsequenz aufweisen wie im menschlichen Körper erzeugte Produkte. Nach Züchtung der Bakterien unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können die Zellen geerntet und zerstört werden, um das gesamte Zellprotein zu extrahieren. Das Protein kann dann z.B. auf eine gelchromatographische Säule, wie z.B. auf Sepharose- oder Agarose-Perlen aufgebracht werden, wonach die Proteine des entsprechenden Molekulargewichts (z.B. zwischen 20 und 30 kD) gesammelt werden können.
  • Die weitere Reinigung kann dann mit Hilfe eines anti-bcl-2- Antikörpers durchgeführt werden. Ein derartiger Antikörper kann zur Immunpräzipitation von bcl-2-Proteinen aus der Gesamtheit der Zellproteine des entsprechenden annähernden Molekulargewichts verwendet werden. Derartige Antikörper können z.B. gegen Polypeptide gebildet werden, die entsprechend der in Fig. 2 und 3 dargestellten Sequenz synthetisiert wurden. Die Antikörper können auch gegen Fusionsproteine gebildet werden, die bcl-2-Sequenzen sowie Sequenzen eines anderen Proteins enthalten. Ein Beispiel für einen gegen ein Fusionsprotein gebildeten Antikörper wird weiter unten beschrieben. Nach der Immunpräzipitation können die Proteine aus den Antikörpern freigesetzt werden, um praktisch reine Präparate von bcl-2-Proteinen zu erhalten.
  • Soll bcl-2-α (annähernd 26 kD) von bcl-2-β (annähernd 22 kD) abgetrennt werden, kann dies unter Verwendung von Polyacrylamidgelen oder mit Hilfe zusätzlicher Gelfiltrationssäulen erfolgen. Natürlich sind auch aufgrund der Unterschiede zwischen den beiden Proteinen an ihren Carboxyl-Termini andere Trennungstechniken möglich. Die Techniken der Verwendung von Gelfiltrationssäulen sowie der Immunpräzipitation und Antikörperfreisetzung sind allgemein bekannt.
  • Für den erfindungsgemäßen diagnostischen Test kommen beliebige Quellen von B-Zellen in Frage. Die B-Zellen können aus den Lymphknoten isoliert werden. Für den diagnostischen Test kann aber auch eine Probe von periphärem Blut verwendet werden, das von einer Person gewonnen wurde, die auf das Vorhandensein eines B-Zellen-Neoplasmas untersucht wurde.
  • Mittel zur Abtrennung von B-Zellen aus dem periphären Blut sind allegemein bekannt. So z.B. können Erythrozyten und Granulozyten von den B-Zellen durch Zentrifugieren in einer Flüssigkeit abgetrennt werden, die eine Dichte aufweist, die zwischen der der zu trennenden Zellgruppen liegt.
  • Die Extraktion der Proteine aus B-Zellen kann nach einer der vielen bekannten Methoden erfolgen. So z.B. können die Zellen mit Hilfe eines Detergens oder mechanisch aufgelöst werden. Gegebenenfalls können durch enzymatische Verdauung oder durch Ausfällung mit Stoffen wie Streptomycin aus dem Zellpräparat Nucleinsäuren entfernt werden. Auch diese Methoden sind allgemein bekannt.
  • Mit den bcl-2-Proteinen immunreaktive Antikörper können durch Immunisieren von Tieren mit einem Fusionsprotein erzeugt werden, das aus einem Anteil des ß-Galactosidaseproteins von E. coli und einem Anteil der menschlichen bcl- 2-Proteine besteht. Vorzugsweise enthält der bcl-2-Anteil Sequenzen, die bcl-2-a als auch bcl-2-ß gemeinsam sind. Gegebenenfalls kan ein solches Fusionsprotein unter Ausnutzung der Eigenschaften, die es mit der β-Galactosidase gemein hat, gereinigt werden. Es wurde gefunden, daß gegen ein Fusionsprotein bei Kaninchen gebildete Antisera mit bcl- 2-α und bcl-2-β immunreaktiv sind. Außerdem ist es bei Verwendungs dieser Antisera für Immunfluoreszenztechniken möglich, in fixierten Zellen die bcl-2-Proteine zu lokalisieren.
  • Antikörper können auch durch Immunisierung von Tieren, wie Mäusen, Kaninchen und dergleichen mit bcl-2-α, bcl-2-β, Fragmenten davon oder beidem erzeugt werden. Es können aber auch unter Verwendung unsterblich gemachter Zellinien monoklonale Antikörper erzeugt werden, um gleichmäßige und kontinuierliche Atikörperquellen bereitzustellen. Die Techniken zur Erzeugung derartiger Antikörper sind allgemein bekannt. Geeignete Antikörper können unter Verwendung der natürlichen Genprodukte von bcl-2 oder des erwähnten Fusionsproteins ausgewählt werden. Obwohl die für das Diagnoseverfahren verwendeten Antikörper vorzugsweise zur Immunreaktion sowohl mit bcl-2-α als auch mit bcl-2-β befähigt sein sollten, können mit Erfolg auch Antikörper verwendet werden, die nur mit einem von ihnen immunreaktiv sind.
  • Die aus den B-Zellen gewonnenen Proteine können unter für die Bildung des Antikörper-Antigen-Komplexes geeigneten Bedingungen mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden. Im allgemeinen sind diese Bedingungen physiologische Bedingungen. Der Proteinextrakt kann mit einem festen Träger wie einem Niotrozellulosefilter oder einer Mikrotiterplatte verbunden werden.
  • Die Antikörper tragen im allgemeinen eine Markierung wie z.B. eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Enzymkonjugat, das unter entsprechenden Bedingungen ein gefärbte Reaktionsprodukt ergibt. Auch die Markierungen sind allgemein bekannt. Ein Antikörper, der nicht markiert ist, kann auch mit Hilfe eines zweiten, aus einer anderen Art stammenden Antikörpers, der mit dem ersten Antikörper umgesetzt wird, nachgewiesen werden. Natürlich sollte die immunologische Technik für das diagnostische Verfahren vorzugsweise so quantitativ empfindlich wie nur möglich sein.
  • Mittel zum Nachweis der Antikörper-Antigen-Komplexe hängen von dem zur Markierung der Antikörper verwendeten Verfahren ab. So z.B. können radioaktive Markierungen durch Autoradiographie oder Szintillationszählung nachgewiesen werden, die Produkte enzymatisch gebundener Antikörper hingegen spektrophotometrisch.
  • Für Kontrollzwecke wird neben der Testprobe eine Kontrollprobe verwendet. Diese besteht aus einer äquivalenten Menge an Proteinen, die vorzugsweise auf dieselbe Weise wie bei der Testprobe aus Zellen extrahiert wurden. Die Proteinmenge kann mit Hilfe bekannter Techniken, wie z.B. der Techniken von Lowry oder Bradford, leicht ermittelt werden. Die zur Herstellung der Kontrollprobe verwendeten Zellen können ausgewählt werden aus einer Gruppe, bestehend aus B-Zellen aus einem gesunden menschlichen Individuum, Zellen aus einer eindeutig festgestellten Zellinie von normalen B-Zellen oder prä-B-Zellen und Nicht-B-Zellen aus einem Menschen, der auf Neoplasma untersucht wurde.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wurde gefunden, daß in Fällen, in denen es zwischen den Chromosomen 14 und 18 zur Translokation kommt, die Menge an in den B-Zellen immunologisch nachgewiesenem bcl-2-Protein mindestens 10 mal so hoch ist wie die Menge an in normalen B-Zellen, prä-B-Zellen oder anderen Nicht-B-Zellen aus demselben Indididuum gefundenem.
  • Zur Prüfung auf erhöhte Mengen an vom bcl-2-Gen transkribierten mRNA müssen wiederum aus dem zu untersuchenden Individuum B-Zellen isoliert werden. Dafür kommen viele bekannte Verfahren in Frage. Es kann dabei die gesamte aus den B-Zellen gewonnene RNA verwendet werden, es kann aber auch die mRNA aus der gesamten Zell-RNA isoliert werden. Die mRNA wird dann z.B. durch Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-Zellulose gereinigt, die sich mit dem Poly(A)- Abschnitt am 3'-Ende des Hauptanteils der mRNA verbindet. Dem Fachmann ist wohlbekannt, daß es entscheidend ist, daß die Ribonukleaseaktivität während der Herstellung und des Tests auf ein Minimum beschränkt wird.
  • Die DNA-Sonde kann unter beliebigen proteinkodierenden Sequenzen des bcl-2-Gens ausgewählt werden. Vorzugsweise wird sie jedoch unter den Sequenzen des 5'-Endes bzw. des ersten Exons des Gens ausgewählt, so daß alle drei Arten von RNA nachgewiesen werden können. Die Sonde kann jedoch auch unter Sequenzen ausgewählt werden, die ausschließlich mit dem 3,5 kb-Transkript oder nur mit dem 5,5 kb- und dem 8,5 kb-Transkript hybridisieren. Vorzugsweise enthält die Sonde wenigstens 15 Nucleotide der bcl-2-Sequenz. Geeignete Plasmidmoleküle, die als Sonden verwendet werden können, sind bei der ATCC unter den Nummern 67147 und 67148 hinterlegt. Natürlich können auch andere geeignete Sonden synthetisiert oder von diesen oder anderen bcl-2-Sequenzen abgeleitet werden. Für die Durchführung der Hybridisierung ist es wünschenswert, daß die Sonde einsträngig ist. Ist sie doppelsträngig, ist sie zur Erzielung der einsträngigen Form zu denaturieren. Die Denaturierungsmethoden einschließlich der Alkali- oder Wärmebehandlung sind allgemein bekannt. Die Sonde kann dann mit der aus den B-Zellen gewonnenen RNA unter Bedingungen gewonnen werden, unter denen homogene RNA-DNA-Hybride entstehen und beständig sind. Diese Bedingungen sind allgemein bekannt. Die Methoden zum Nachweis der Hybride sind zahlreich und allgemein bekannt, umfassen jedoch häufig die Verwendung radioaktiv markierter Sonden und Nucleasen, welche die einsträngige DNA abbauen, es können aber auch andere Verfahren verwendet werden.
  • Die Kontrollproben können aus beliebigen Zellquellen gewonnen werden, wie sie oben für die Verwendung beim Antikörperdiagnosetest beschrieben wurden. Die Test- und Kontrollproben sind parallel unter ähnlichen Bedingungen herzustellen. Zeigt der Vergleich der Hybridisierung mit der Testprobe einerseits und der Kontrollprobe andererseits, daß in der Testprobe ein ca. 10facher Überschuß vorliegt, ist dies ein Beweis für das Vorliegen eines B-Zellen-Neoplasmas.
  • Die nachfolgenden Beispiele grenzen den Erfindungsumfang nicht ein und haben lediglich illustrierenden Charakter.
    • Beispiel 1
  • Aus der Poly-A&spplus;-mRNA der prä-B-Zellen-Leukämiezellinie 380 wurde eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Nach dem Verfahren von ar-Rushdi et al. (1982), Smatic Cell Genetics, B. 8, Seiten 151-161, wurde cytoplasmatische RNA extrahiert. Poly- A&spplus;-RNA wurde durch Oligo(dT)-Säulenchromatographie nach Aviv and Leder, (1972), Proceedings of National Academy of Sciences, USA, B. 69, Seiten 1408-1412, selektiert. Doppelsträngige cDNA wurden aus mRNA durch reversible Transkriptase synthetisiert
  • (Life Science, Inc., Florida), wobei Oligo(dT) als Primer, wie von Maniatis et al. 1982), Molecular cloning, Cold Spring Hrbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben, verwendet wurde. Nach der EcoRI-Linkerligierung wurde die doppelsträngige cDNA in λ-gt 11-Phagenvektroen geklont (s. Young and Davis (1983), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, B. 80, Seiten 1194-1198). Durch Screening von ca. 2 x 10&sup5; rekombinanten Klonen mit einer DNA-Sonde, bestehend aus einem Segment des Chromosoms 18, das den Hotspot der Bruchstellen der Translokation von Chromosom 18 zu Chromosom 14 überbrückt, erhielt man drei unabhängige, überlappende cDNA-Klone (B3, B4 und B10). Wie Fig. 1 zeigt, enthält der Klon B3 am Ende neunzehn A-Reste, was darauf hindeutet, daß er das 3'-Ende der mRNA darstellt. Die Restriktionskarten der cDNA-Klone und Genomsequenzen sind kolinear vom 3'-Ende des cDNA-Klons B3 bis unmittelbar vor den BamHI-Site der cDNA-Sequenz. Unmittelbar hinter diesem Punkt weicht die cDNA-Sequenz von der Genomsequenz ab. Die cDNA-Sequenzen bestehen somit zumindest aus zwei Genomregionen.
  • Wird der 5'-Teil des cDNA-Klons B4 (5'-Ende in Bezug auf den BamHI-Site) als Sonde für die cDNA-Bank verwendet, erhält man einen anderen Satz von Klonen, der den Klon B 15 und den Klon B16 umfaßt (siehe Fig. 1). Diese beiden cDNA-Klone haben dieselben Sequenzen in der 5'-Region wie der Klon B4, jedoch ganz andere Sequenzen in der 3'-Region als die Klone B3, B4 und B10. Die cDNA-Klonierung hat somit zwei unterschiedliche Klonsätze ergeben, was beweist, daß das bcl-2- Gen zumindest in zwei unterschiedliche mRNA transkribiert wurde.
  • Zur Erzielung von cDNA-Sequenzen weiter "flußaufwärts" ("upstream") (in Richtung des 5'-Endes) wurde unter Verwendung des Verfahrens der Primerverlängerung (primer extension method) eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Es wurde ein Oligonucleotid (15-mer) synthetisiert und als Primer für die reversible Transkriptase nach Maniatis, supra, und Gubler and Hoffmann (1983) Gene, B. 25, S. 263-269, verwendet. Die drei nach diesem Verfahren erhaltenen Klone waren B6-3, B22- 1 und B9.
    • Beispiel 2
  • Es wurden zwei unterschiedliche Sonden verwendet, um die mRNA sichtbar zu machen, die dem bcl-2-Gen bei der Northern- Blot-Hybridisierung entspricht. Die erste Sonde (Sonde A in Fig. 1) enthält die Genom-DNA des Chromosoms 18, die den Hotspot der Bruchstelle überbrückt und außerdem dem 3'-Exon entspricht. Die andere Sonde war der cDNA-Klon B22-1, der dem 5'-Exon (erstes Exon) entspricht. Die RNA wurde mit Glyoxylsäure behandelt, auf l%-Agarosegel gegeben und dann auf Nitrocellulosefilter entsprechend Thomas, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (1980), Bd. 77. 55. 5201-5205, aufgebracht. Der Nitrocellulosefilter wurde mit einer ³²p-markierten Sonde in 50 % Formamid, 4 X SSC, 0,1 % SDS bei 37ºC hybridisiert und schließlich mit 2 X SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Na-Zitrat, pH 7) bei 65ºC gewaschen.
  • Die Genom-DNA-Sonde A wies zwei Transkripte nach, mit einer Länge von jeweils 89,5 kb und 5,5 kb. Die cDNA-Sonde B22-1 wies dieselben Transkripte wie Sonde A nach, sowie ein zusätzliches Transkript von 3,5 kb Länge.
  • Die 8,5 kb- mRNA hybridisierte ebenfalls mit einer Genom- DNA-Sonde am Chromosom 18, welches das 3'-Ende in Bezug auf die Genomsonde A ist (angegeben in Fig. 1 als Sonde B).
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß das bcl-2-Gen in drei mRNA verschiedener Größen transkribiert wurde. Dabei ist die Möglichkeit, daß diese mRNA von unterschiedlichen, jedoch miteinander verwandten Genen abstammen, aufgrund der Tatsache ausgeschlossen, daß bei denselben Hybridisierungsbedingungen, die für die Northern-Blot-Hybridisierung angewandt wurden, diese Sonden lediglich ein Zellgen nachweisen konnten.
    • Beispiel 3
  • Die Nucleotidsequenz der überlappenden cDNA-Klone wurde nach dem chemischen Abbauverfahren von Maxam und Gilbert (s. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, B. 74, S. 560-564 (1977)) oder nach dem Kettenabbruchverfahren nach Sanger (s. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, B. 74, S. 5463-5467 (1977)) ermittelt. Beide DNA-Stränge wurden dann sequenziert. Die vom 5,5 kb-Transkript erhaltene Nukleotidsequenz ist in Fig. 2 dargestellt. Die DNA- Sequenz aus 5105 Basenpaaren (bp) läßt einen möglichen offenen Leserahmen erkennen, bestehend aus 239 Aminsäureresten (bcl-2-α). Die dem 3,5 kb-Transkript entsprechende Nucleotidsequenz ist in Fig. 3 dargestellt. Das Transkript kodiert ein Protein, bestehend aus 205 Aminosäureresten (bcl-2-β), das sich vom bcl-2-α-Protein am Carboxylterminus unterscheidet.

Claims (21)

1. Diagnostisches Verfahren zum Nachweis von t(14;18)-Translokationen aufweisenden B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen, das folgende Stufen umfaßt:
Isolierung der B-Zellen aus dem Menschen, Extraktion der Proteine aus den B-Zellen zur Bildung einer Testprobe, Kontaktierung der Testprobe mit einem Antikörper, der mit einem Genprodukt des menschlichen bcl-2-Gens unter Bedingungen immunreaktiv ist, bei denen Antikörper-Antigen-Komplexe gebildet werden und gegenüber der Bildung von Antikörper- Antigen-Komplexen beständig sind, Quantifizierung der Menge der mit der Testprobe gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexe und Vergleich der Menge der mit der Testprobe gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexe mit der mit einer Kontrollprobe von Proteinen gebildeten Menge, wobei ein Verhältnis der Testprobenkomplexe zu den Kontrollprobenkomplexen von über ca. 10 B-Zellen-Neoplasmen anzeigt und die Kontrollprobe von Proteinen extrahiert wird aus Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B-Zellen aus einem gesunden Menschen, Zellen aus einer festgelegten normalen B-Zell- oder prä-B- Zellinie und Nicht-B-Zellen aus dem betreffenden Menschen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper radioaktiv markiert wird und die Stufe der Quantifizierung durch Messung der Menge der Radioaktivität in den Antikörper- Antigen-Komplexen erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper mit einem fluoreszierenden Molekül konjugiert wird und die Stufe der Quantifizierung durch Messung der Menge der von den Antikörper-Antigen-Komplexen abgegebenen Fluoreszenz erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Stufe der Quantifizierung mit Hilfe eines zweiten Antikörpers durchgeführt wird, der gegenüber dem ersten Antikörper immunreaktiv ist, der mit einem Genprodukt des bcl-2-Gens immunreaktiv ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper gegenüber bcl-2-α immunreaktiv ist.
6. verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper gegenüber bcl-2-β immunreaktiv ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper sowohl gegenüber bcl-2-α als auch gegenüber bcl-2-β immunreaktiv ist.
8. Ein im wesentlichen intronfreies menschliches bcl-2-Gen.
9. Das Gen nach Anspruch 8, das in Bakterien repliziert wird.
10. Das Gen nach Anspruch 9, worin das Gen in Bakterien exprimiert wird.
11. Ein im wesentlichen reines Proteinpräparat mit einem N- Terminus, der durch das erste Exon des menschlichen bcl-2- Gens kodiert wird.
12. Proteinpräparat nach Anspruch 11, worin das Protein 239 Aminosäurereste aufweisendes bcl-2-α ist.
13. Proteinpräparat nach Anspruch 11, worin das Protein 205 Aminosäurereste aufweisendes bcl-2-β ist.
14. Diagnostisches Verfahren zum Nachweis von t(14;18)- Translokationen aufweisenden B-Zellen-Neoplasmen beim Menschen, das folgende Stufen umfaßt:
Isolierung von B-Zellen aus dem Menschen,
Extraktion der RNA aus den B-Zellen zur Bildung einer Testprobe,
Kontaktierung der Testprobe mit einer DNA-Probe, die eine Sequenz von wenigstens 15 Nukleotiden in der Länge aufweist, die aus dem menschlichen bcl-2-Gen erhalten wurden, unter Bedingungen, bei denen homologe RNA-DNA-Hybride entstehen und beständig sind,
Quantifizierung der Menge an in der Testprobe gebildeten RNA-DNA-Hybriden und Vergleich der mit der Testprobe gebildeten Menge an RNA-DNA-Hybriden mit der mit einer Kontrollprobe von RNA gebildeten Menge, wobei ein Verhältnis der Testprobenhybriden zu den Kontrollprobenhybriden von über ca. 10 B-Zellen-Neoplasmen anzeigt und die Kontrollprobe von RNS extrahiert wird aus Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B-Zellen eines gesunden Menschen, Zellen aus einer normalen B-Zell- oder prä-B-Zellinie und Nicht-B- Zellen aus dem betreffenden Menschen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die DNA-Sonde mit dem 8,5 kb-, 5,5 kb- und 3,5 kb-bcl-2-Transkript hybridisiert.
16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die DNA-Sonde mit dem 8,5 kb- und 5,5 kb-bcl-2-Transkript hybridisiert.
17. Verfahren nach Anspruch 14, worin die DNA-Sonde ausschließlich mit dem 3,5 kb-bcl-2-Transkript hybridisiert.
18. Präparat eines Antikörpers, der (a) gegenüber einem menschlichen bcl-2-Protein immunreaktiv ist, ausgewählt aus der Gruppe bcl-2-α und bcl-2-β, und (b) gegenüber anderen menschlichen Proteinen nicht immunreaktiv ist.
19. Präparat nach Anspruch 18, das sowohl gegenüber bcl-2-α als auch gegenüber bcl-2-β immunreaktiv ist.
20. Präparat nach Anspruch 18 oder 19, das durch Reinigung aus einem tierischen Antiserum gewonnen wurde.
21. Präparat nach Anspruch 18, 19 oder 20, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
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