DE69117949T2

DE69117949T2 - Mit akuter pankreatitis assoziiertes protein, mittel zur diagnose von akuter pankreatitis

Info

Publication number: DE69117949T2
Application number: DE69117949T
Authority: DE
Inventors: Jean-Charles Dagorn; Juan-Lucio Iovanna; Volker Keim
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 1996-08-08
Anticipated expiration: 2011-04-19
Also published as: WO1991016428A1; CA2081013A1; FR2661187A1; ATE135371T1; ES2085993T3; JPH05506783A; EP0528932A1; US5959086A; DK0528932T3; FR2661187B1; GR3019849T3; US5436169A; EP0528932B1; JP3452567B2; DE69117949D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Proteine, die der akuten Pankreatitis zugeordnet sind, und auf Mittel zur Diagnose dieser Krankheit.
Akute Pankreatitis ist ein entzündlicher Infekt der Bauchspeicheldrüse, der anatomisch betrachtet in einfacher ödemartiger Form bis hin zur vollständigen hämorrhagisclien Nekrose der Drüse auftreten kann. Die nekro-hämorrhagische Pankreatitis ist ein sehr schwerwiegender Infekt, da seine Mortalität je nach Autor zwischen 30 % und 70 % liegt. in gewissen Fällen ist es sehr schwierig, die Diagnose akuter Pankreatitis mit Gewißheit zu erstellen (Sarner, M. et al, Gastroenterol. (1984), 13 : 865-870). Diese Diagnose betuht vor allem auf der klinischen Untersuchung (akuter abdominaler Schmerz) an einem Assay einer gewissen Anzahl von Substanzen im Plasma oder in der Bauchfellflüssigkeit (Immunoassay) (Bradley, J. et al, Br. J. Surg. (1981), 68 : 245-246; und Dubick, M. et al, Dig. Dis. Sci. (1987), 32 : 305-312). Bei den verwendeten Assays findet man diejenigen von Amylase, Lipase, Trypsin, Elastase, Ribonuklease, Phospholipase A2, α2-Makroglobulin, Kalzium, LDH, Proteasen- Inhibitoren und andere. Keiner von ihnen erweist sich jedoch als spezifisch, praktisch und vor allem unterscheidungskräftig. Somit begnügt man sich im allgemeinen mit der Durchführung von Amylasemie-Assays. Erst neulich schien es so, als ob Echotomographie und Tomodensitometrie in gewissen Fällen die Diagnose akuter Pankreatitis erleichtern können, ohne daß es sich dabei jedoch um einen entscheidenden Fortschritt handelte (Silverstein, W et al, Am. J. Roentgenol, (1981), 137 : 497-502).
Keim et al veröffentlichten 1984 (Digestion, (1984); 29 : 242-249) Ergebnisse über die Folgen einer Kanülierung des pankreatischen Kanals und der Induktion einer Pankreatitis auf die Proteinzusammensetzung des Bauchspeichels von Ratten, die als Versuchsinodell verwendet wurden. Nach der Kanülierungsoperation (1 bis 2 Tage später) beobachteten die Autoren einen Abfall des Amylasespiegels im Bauchspeichel und 3 bis 4 Tage nach der Operation eine Rückkehr zu dem normalen Amylasepegel.
Eine Trennung der Proteine des Bauchspeichels während dieser Remissionsperiode durch Polyakrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) zeigte ein zusätzliches Proteinband, und zwar anscheinend fruhestens 12 Stunden nach der Operation und spätestens 3 bis 4 Tage nach der Operation. Dieses Proteinband trat bei der nicht-behandelten Kontrollratte nicht auf Dieses Sekretprotein nannte man PAP ("pancreatitis associated protein").
Daraufhin führten Keim et al mit Hilfe von Tests zur Erfassung der Komplementbindung Messungen der Menge an PAP durch, die im pankreatischen Gewebe der Ratte nach Induktion einer Pankreatitis vorhanden war.
Diese Tests haben es jedoch bis zum heutigen Tage nicht erlaubt, das Vorhandensein von PAP im Serum der Ratte nachzuweisen, bei der man eine Pankreatitis induziert hatte.
Die im Stand der Technik bisher vorgeschlagenen Mittel konnten somit nicht zu einer ausreichenden Identifikation des PAP-Proteins bei der Ratte führen, damit sich das Problem eines interesses an der Untersuchung beim Menschen stellt, um zu erforschen, ob ein derartiges Protein erfaßt werden könnte.
Außerdem hätten die bisher zur Verfügung stehenden Ergebnisse es nicht erlaubt, das Interesse an PAP ins Auge zu fassen, um die Diagnose einer Pankreatitis durchzuführen.
Die Erfinder haben festgestellt, daß polyklonale Ratten-Antikörper, welche das PAP-Protein von Ratten erkennen, ein Protein des menschlichen Serums nicht signifikant erkennen.
Nach dieser Feststellung haben die Erfinder nunmehr eine adäquatere Identifikation des Ratten-PAP-Proteins gesucht, mit der Absicht, Forschungswerkzeuge beim Menschen zu definieren: Die Erfinder haben nun das PAP-Protein bei der Ratte klar identifiziert, und sie haben die Aminosauresequenz erstellt. Auf der Grundlage dieser Kenntnisse haben sie Mittel erarbeitet, die es ermöglichen könnten, zu erfassen und zu identifizieren, ob es beim Menschen ein dem PAP-Protein der Ratte entsprechendes Protein gibt.
Die Klonierung und die Sequenzierung der PAP-Boten-RNA ausgehend von einer Genbank pankreatischer cDNA der Ratte ermöglichte es auch zweifelsfrei aufzuzeigen, daß das PAP wirklich durch die Bauchspeicheldrüse synthetisiert wird. Die Erfinder haben auch gezeigt, daß das Protein bei nicht vorliegender pankreatischer Entzündung sehr schwach exprimiert wurde und im Verlauf der Pankreatitis stark exprimiert wurde.
Unter Berücksichtigung der Gebrechlichkeit der von Pankreatitis befallenen Kranken konnte man nicht ins Auge fassen, den Bauchspeichel dieser Kranken zu gewinnen, um dort nach dem eventuell vorhandenen menschlichen PAP-Protein (PAP- H) zu suchen.
Die Erfinder haben eine Genbank pankreatischer cDNA des Menschen mit Hilfe eines zuvor gewonnenen und dem PAP der Ratte entsprechenden cDNA-Klons durchmustert.
Es gelang den Erfindern, unterschiedliche Klone zu isolieren, welche cDNA- Fragmente enthielten, die mit der cDNA des Ratten-PAP hybridisieren können, wie weiter unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf cDNA-Fragmente, die für Ratten-PAP-Protein kodieren können, sowie auf cDNA-Fragmente, die für Proteine der Familie von Menschen-PAP kodieren können. Die Erfindung betrifft auch die durch diese cDNA-Fragmente kodierten Proteine.
Sie bezieht sich auch auf Vektoren, die durch Integration der oben genannten cDNA-Fragmente modifiziert sind, insbesondere zur Expression dieser Fragmente.
Die Erfindung bezieht sich auch auf polyklonale oder monoklonale Antikörper, die gegen das PAP-Protein, insbesondere das Menschen-PAP, gerichtet sind, sowie ihre Verwendung in Verfahren, die auf medizinische Abbildungsverfahren zurückgreifen, oder als Mittel zur Diagnose akuter Pankreatitis in Kits und in vitro-Diagnoseverfahren.
Eine erste erfindungsgemäße Familie von DNA-Fragmenten umfaßt somit cDNA-Fragmente, die für das Ratten-PAP kodieren.
Dieser Familie gehören cDNA-Fragmente an, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Nukleotidsequenz S1 entsprechen, die für das PAP-Protein von Ratten kodiert, oder einem Teil oder einer Variante dieser Sequenz, sobald dieser Teil oder diese Variante ftir ein Protein oder ein Peptid kodiert, das von Antikörpern erkannt wird, die gegen das PAP-Protein von Ratten gerichtet sind, oder daß sie mit der Sequenz S1 in einer Hybridisierungslösung hybridisieren, die 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA enthält, und zwar über 18 Stunden hinweg bei 68 ºC und nach einem Spülen unter den folgenden Bedingungen: 6 x SSC, 0,1 % SDS, 2 mal 15 Minuten bei 65 ºC. Sequenz S1:
Die untenstehenden Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: 1 x SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat; 50 x Denhart = 5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g Rinder-Albuminserum in 500 ml Wasser; SDS = Natriumdodecylsulfat; EDTA = Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure.
Die gegen das Ratten-PAP gerichteten polyklonalen Antikörper werden nach klassischen Verfahren hergestellt; derartige Antikörper wurden z.B. von Keim et al beschrieben (Clin. Physiol. Biochem., 4 : 136-142 (1986)).
Ein der ersten Familie erfindungsgemäßer Nukleinsäuren angehörendes cDNA- Fragment ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es Pür ein Protein kodiert, daß einer der folgenden Aminosäure-Sequenzen A1 (Aminosäuresequenz des Proteins, welches das Signalpeptid enthält) oder A2 (Aminosäuresequenz des gereiften Proteins) entspricht, oder für eine Aminosäure-Sequenz kodiert, die eine Homologie von 40 bis 80 %, vorzugsweise 50 bis 60 %, mit mindestens einer Kette von etwa 25 Aminosäuren der Sequenzen A1 oder A2 hat. Sequenz A1: Sequenz A2:
Eine zweite Familie erfindungsgemäßer DNA-Fragmente umfaßt cDNA- Fragmente eines Menschen-PAP-Proteins, das man durch die folgenden Schritte erhält: - erstes Durchmustern einer Genbank pankreatischer cDNA des Menschen, wobei die cDNA des Menschen in einen geeigneten Klonierungsvektor eingeführt wird und eine Hybridisierung mit Sonden stattfindet, die aus der cDNA des PAP-Proteins von Ratten bestehen, wie sie durch die folgenden Sequenzen S1 oder S2 dargestellt sind, und zwar in einer Lösung, welche besteht aus: 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 ml EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA, über 18 Stunden hinweg bei 68 ºC, mit nachfolgender Spülung unter den folgenden Bedingungen: 6 x SSC, 0,1 % SDS, 2 mal 15 Minuten bei 65 ºC,
- Auswählen der positiven cDNA-Klone des Menschen, welche während der Durchmusterung mit der cDNA des PAP-Proteins von Ratten hybridisierten, wobei diese Klone als positiv bezeichnet werden,
- zweites Durchmustern mit einer cDNA-Sequenz eines PSP-Proteins ("Pancreatic Stone Protein") unter den obigen Hybridisierungsbedingungen mit Spülung in Gegenwart von 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, über 2 Stunden hinweg bei 65 ºC, um die nicht- spezifischen Klone der cDNA von Menschen-PAP zu entfernen, die dennoch mit der cDNA von
Ratten-PAP hybridisierten, und
- Rückgewinnen der Klone, die nicht mit der PSP-cDNA hybridisierten,
- Rückgewinnen der cDNA-Fragmente der erhaltenen positiven Klone.
Ein besonders vorteilhafter Klonierungsvektor, der durch die menschliche cDNA zur Herstellung der Genbank pankreatischer cDNA des Menschen modifiziert werden kann, ist der Vektor λgt10.
Das PSP oder "Pancreatic Stone Proteine" ist ein Protein, das gewisse strukturelle Analogien zu dem Ratten-PAP hat. Dieses Protein wurde durch Giorgi et al, J. Clin. Invest. (1989), 84 : 100-106, beschrieben.
Die so definierten cDNA-Fragmente sind für die Familie der Proteine charakteristisch, welche das PAP-Protein des Menschen aufweist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die bevorzugten cDNA-Fragmente diejenigen, die man durch die vorherigen Schritte erhält, denen man vor dem Rückgewinnen der erhaltenen positiven Klone den folgenden Schritt hinzufügt: Durchmustern mit der PAP-cDNA von Ratten unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen mit einer Spülung über 2 Stunden hinweg bei 65 ºC.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entspricht ein cDNA- Fragment, das für Menschen-PAP kodiert, der folgenden Kette S3;
Die Erfindung bezieht sich auch auf das cDNA-Fragment S4, welches die Sequenz S3 sowie die folgenden DNA-Ketten jeweils an seinem NH&sub2;- und COOH- terminalen Ende aufweist:
Gemäß einer weiteren Ausführungsforrn der Erfindung ist die cDNA des Menschen-PAP dadurch gekennzeichnet, daß sie für das Protein kodiert, welches der folgenden Aminosäuresequenz A3 entspricht:
Gemäß einer weiteren Definition der cDNA-Fragmente der zweiten Familie ist ein erfindungsgemäßes cDNA-Fragment dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleotidsequenz aufiveist, die eine Homologie von mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, mit mindestens einer Kette von etwa 100 Nukleotiden hat, die in der folgenden charakteristischen Sequenz 52 von cDNA von gereiftem Ratten-PAP oder in der charakteristischen Sequenz 53 eines cDNA-Fragments von Menschen-PAP enthalten sind. Sequenz S2:
Die Erfindung bezieht sich auch auf cDNA-Fragmente, die lür Menschen-PAP kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage sind, zu hybridisieren mit der folgenden für die cDNA von Ratten-PAP charakteristischen Nukleotidsequenz 51 und/oder mit der für die cDNA von gereiftem Ratten-PAP charakteristischen Nukleotidsequenz S2 in einer Hybridisierungslösung, welche 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 nM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA enthält, über 18 Stunden bei 68 ºC hinweg, und mit einer Spülung in einer Lösung, welche 6 x SSC, 0,1 % SDS enthält, 2 mal während 15 Minuten bei 65 ºC.
Ein im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugtes cDNA-Fragment der Menschen-PAP ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Nukleotidsequenz aufweist:
Die Erfinder haben festgestellt, daß die von dieser menschlichen Nukleotid sequenz abgeleitete Proteinsequenz gewisse Homologien mit der Sequenz aufweist, die für das Ratten-PAP-Protein kodiert, obwohl die bisherige bloße Kenntnis der gegen das Ratten-PAP gerichteten Antikörper es nicht ermöglichte, das Menschen-PAP-Protein in einer gegebenen biologischen Probe zu erfassen.
Die Identifikation eines cDNA-Fragments, das für das Menschen-PAP-Protein kodiert, ermöglicht es nun, die Produktion dieses Proteins, insbesondere auf gentechnischem Wege, sowie die Gewinnung von Antikörpern ins Auge zu fassen. die als Mittel zur Diagnose einer akuten Pankreatitis verwendet werden können.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Nukleinsäure-Fragment, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um das zu den oben definierten cDNA-Fragmenten komplementäre DNA-Fragment handelt, oder aber, daß es sich um das diesen cDNAs entsprechende RNA-Fragment handelt.
Die Erfindung betrifft auch jegliches Nukleotidsequenz-Fragment, das flir das Menschen-PAP kodiert und nach geeigneter Markierung des Fragments als Sonde verwendet werden kann, um die Erfassung der charakteristischen Nukleinsäure des Menschen-PAP in einer biologischen Probe zu verwirklichen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das menschliche PAP-Protein, wie man es durch die Expression eines cDNA-Fragments von Menschen-PAP erhält, wie oben definiert, mittels eines angepaßten Expressionssystems, z.B. eines durch einen Expressionsvektor transformierten Zellwirts, der seinerseits durch Einfügen des obigen cDNA-Fragrnents der Menschen-PAP modifiziert wurde.
Ein besonderes erfindungsgemäßes menschliches PAP-Protein ist ein Protein, wie es mittels der Expression eines cDNA-Fragments von Menschen-PAP erhalten wird, das phasengleich in einen pEX-Vektor eingeführt wird, und zwar in E.coli, insbesondere in E.coli Stamm pop2136.
Erfindungsgemäße PAP-Proteine des Menschen sind auch dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosaure-Sequenzen eine Homologie von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 % und besonders bevorzugt mindestens 70 % mit mindestens einer Kette von etwa 25 Aminosäuren, die in der Sequenz A2 des gereiften PAP-Proteins von Ratten enthalten ist, oder mit der Sequenz A3 des PAP-Proteins des Menschen aufweisen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung entspricht das PAP- Protein des Menschen der auf den vorhergehenden Seiten gegebenen Sequenz A3.
Die Erfindung betrifft auch jegliches Fragment der Sequenz A3, sobald es durch Antikörper erkannt wird, die diese Sequenz erkennen, insbesondere monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die Sequenz A3 gerichtet sind.
Das PAP-Protein des Menschen kann durch die Verfahren der Gentechnik oder aber durch Reindarstellung hergestellt werden, z.B. mittels Chromatographie auf der Grundlage einer es enthaltenden biologischen Probe.
Gemäß einer besonderen Definition der Erfindung umfaßt das den vorhergehenden Definitionen entsprechende PAP-Protein der Erfindung die folgende Aminosäuresequenz:
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Ratten-PAP-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es der obigen Aminosäurekette A2 oder einer Variante oder einem Teil dieser Sequenz entspricht, sobald dieser Teil oder diese Variante von Antikörpern erkannt wird, die gegen das PAP-Protein von Ratten gerichtet sind, oder daß es eine Homologie von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 %, mit der obigen PAP- Sequenz A2 von Ratten oder mit der Sequenz A3 des Menschen-PAP aufweist.
Die Erfindung betrifft auch das Ratten-PAP-Protein, welches der Sequenz A1 oder einer Variante von A1 entspricht, welche die oben definierten Merkmale gegenüber der Aminosäuresequenz A2 aufweist.
Bei der Ratte liegt das PAP in sehr kleiner Menge vor, gemessen an einer normalen menschlichen Bauchspeicheldrüse, und seine Synthese kann beachtlich erhöht werden; im Falle akuter Pankreatitis bis auf einen Pegel von etwa dem 50- bis 100- fachen zu dem in der normalen Bauchspeicheldrüse vorliegenden.
Der PAP-Proteinspiegel der Ratte nimmt im Bauchspeichel während einer akuten Pankreatitis zu, während die anderen Enzymspiegel abnehmen.
Außerdem gehen bei der Pankreatitis alle pankreatischen Sekretproteine in das Blut über. Folglich läßt der im Blut oder einer anderen biologischen Probe eines menschlichen Patienten (z.B. dem Urin oder der Bauchfellflüssigkeit) stattfindende Einsatz des Assays von PAP-Protein, dessen Synthese im Falle von Pankreatitis beachtlich erhöht ist, vermuten, daß man eine viel größere Differenz normal/pathologisch bekommt als bei den üblicherweise zur Erfassung verwendeten Tests und somit einen viel einfacheren Nachweis.
Die Erfindung bezieht sich auch angesichts dieser Zielsetzung auf Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie das zuvor definierte PAP-Protein des Menschen erkennen und es sich dabei um polyklonale oder monoklonale Antikörper handeln kann.
Monoklonale Antikörper sind z.B. Antikörper, wie sie ausgehend von einem Hybridom gewonnen werden, das vorher durch Verschmelzung einer Myelom-Zelle und einer splenischen Zelle eines Tiers gebildet wurde, das zuvor mit einem PAP-Protein des Menschen immunisiert wurde.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Hybridome, die durch die Verschmelzung von Myelom-Zellen mit splenischen Zellen eines Tiers gebildet werden, das zuvor mit dem PAP-Protein des Menschen, insbesondere mit dem der Aminosäurekette A3 entsprechenden, immunisiert wurde.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaften monoklonalen Antikörper sind diejenigen, welche den NH&sub2;-terminalen Teil des Menschen-PAP spezifisch erkennen. Spezielle Antikörper werden auch dadurch definiert, daß sie das Menschen-PAP erkennen und daß sie keine immunologische Reaktion mit den anderen Lektinen eingehen.
So ist z.B. ein insbesondere zur Erfassung von Menschen-PAP interessanter monoklonaler Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der gegen das folgende Peptid des Menschen-PAP gerichtet ist: Glu Glu Pro Gln Arg. Um dieses Peptid in Tests zur Erfassung von Menschen-PAP zu verfolgen, hat man z.B, an dem Arginin einen Tyrosinrest so angebracht, daß die Iodmarkierung mit herkömmlichen Markierungstechniken ermöglicht wurde.
Die Erfindung betrifft auch antiidiotypische Antikörper, welche gegen die Antigen-Determinanten der erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet sind, welche das Menschen-PAP erkennen.
Weitere erfindungsgemäße Antikörper sind monoklonale Antikörper, welche das Ratten-PAP-Protein erkennen.
Ein Immunisierungsprotokoll ausgewählter Tiere, insbesondere von Mäusen und Kaninchen, zur Durchführung der Erfindung ist das von Kohler und Milstein, Nature (1975), 256 : 495-497, beschriebene Protokoll.
Die Erfindung umfaßt auch einen Expressions- und/oder Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Fragment aufweist, das aus den zuvor definierten Fragmenten ausgewählt wird.
Für die Durchführung der Erfindung besonders vorteilhafte Expressionsund/oder Klonierungsvektoren umfassen das Expressionsplasmid pEX, welches die cDNA des menschlichen PAP-Proteins in einer Bakterie, z.B. E.coli., exprimieren kann.
Weitere Vektoren werden in Abhängigkeit von dem Wirt ausgewählt, bei dem man die Expression untersucht. Hierfür kann es sich für Säugetierzellen um einen Vektor vom Bakulovirustyp handeln.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Zellwirt, der mittels eines weiter oben definierten Expressionsvektors unter Bedingungen transformiert wurde, welche die Gewinnung des Proteins oder des Peptids ermöglichen, das mittels des in den Vektor eingeführten DNA-Fragments kodiert wurde.
So sind z.B. Zellwirte, die ein adäquates Expressionssystem für die DNA- Fragmente der Erfindung bilden, Bakterien, wie z.B. E.coli, insbesondere der Stamm pop 2136.
Die Erfindung betrifft auch das Expressionsprodukt des wie vorstehend transformierten Zellwirts.
Man exprimiert das erfindungsgemäße DNA-Fragment vorteilhafterweise in einem Prokaryonten- oder Eukaryontenwirt in Abhängigkeit von dem Produkt, das man haben möchte, wobei es sich insbesondere um seine Glykosylation handelt.
So sind z.B. zur Durchführung der Erfindung interessante Zellwirte Bakterien, wie z.B. E.coli., Hefen, Insekten- oder Säugetierzellen, wie z.B. CHO-Zellen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Antikörper enthält, der aus den zuvor definierten ausgewählt wurde und gegen das Menschen-PAP-Protein gerichtet ist. Eine derartige Zusammensetzung kann eine Zusammensetzung zur in vitro-Diagnose sein, und zwar zur Durchführung an einer biologischen Probe, wie Blut, Urin oder Bauchfellflüssigkeit, eines Patienten, der die Symptome akuter Pankreatitis aufweist.
Die dazu verwendeten Antikörper werden ggf. durch geeignete chemische Markierungsstoffe markiert.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit für die in vitro-Diagnose akuter Pankreatitis ausgehend von einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es aufweist:
- mindestens einen der bisher genannten Antikörper, der in der Lage ist, das Vorhandensein eines Antigens vom Typ des Menschen-PAP in der biologischen Probe zu erfassen, wobei die Antikörper markiert sind,
- je nach Markierung eine Reagentie zum Detektieren des Vorhandenseins eines spezifischen Antigen-Antikörper-Komplexes,
- einen Negativ-Anzeiger.
Vorzugsweise sind die verwendeten Antikörper für das Menschen-PAP spezifisch, sobald sie ohne eine Reaktion mit den anderen bekannten Lektinen sind.
Um die Markierung der erfindungsgemäßen Antikörper durchzuführen, kann man beispielsweise auf Radioisotope, auf chemische oder enzymatische Markierungsstoffe oder auf chemolumineszente Markierungsstoffe zurückgreifen.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur in vitro-Erfassung einer akuten Pankreatitis, ausgehend von einer biologischen Probe, mit den folgenden Schritten:
- Zusammenbringen der biologischen Probe, welche das Menschen-PAP enthalten kann, mit Antikörpern, die gegen das Menschen-PAP gerichtet sind,
- Detektieren der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen den oben genannten Antikörpern und dem Menschen-PAP.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der gegen das PAP gerichteten Antikörper, ggf. in Form einer Zusammensetzung, die mehrere markierte Antikörper umfaßt, zur Sichtbarmachung der Bauchspeicheldrüse in medizinischen Abbildungsverfahren, wobei der Antikörper zuvor mittels eines Radioisotops oder eines chemischen oder enzymatischen Markierungsstoffs markiert wurde.
Die Sichtbarmachung kann es ermöglichen, das Vorhandensein von Menschen- PAP nachzuweisen.
Hierfür betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse, gekennzeichnet durch:
- Injizieren einer oben definierten Zusammensetzung in einen Patienten unter physiologisch akzeptablen Bedingungen,
- Beobachten einer Reaktion zwischen den in der oben genannten Zusammensetzung enthaltenen Antikörpern und dem Menschen-PAP, wenn es vorhanden ist.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nun folgenden Beispielen und Figuren:
- Figur 1: Expression von PAP und Amylase im Verlaufe der experimentellen akuten Pankreatitis bei der Ratte. Analyse mittels "Northern blot" - Ladung pro Spur: 30 µg RNA gesamt, das gleiche Filter wurde nacheinander für PAP und Amylase verwendet.
Sonden: PAP-cDNA (etwa 800 bp) und Amylase (etwa 1100 bp), markiert mit 321) mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 10&sup9; cpm/mg.
- die folgenden Ereignisse wurden beobachtet: Induktion der Expression des PAP-Gens (12 Stunden - 48 Stunden) (akute Phase); Unterdrückung der Induktion während der Erholung (5 - 10 Tage); im Gegensatz hierzu nimmt die Amylase während der akuten Phase ab.
- Figur 2: Nukleotidsequenz, die für Ratten-PAP kodiert, sowie die entsprechende Aminosäuresequenz.
- Figur 3: Fragment der Nukleotidsequenz, die für Menschen-PAP kodiert, sowie die entsprechende Aminosäuresequenz.
- Figur 4: Nukleotidsequenz (S4), die für Menschen-PAP mit deren Kodierungssequenz S4 charakteristisch ist, sowie die ihr entsprechende Aminosäuresequenz (A3).

1. Aufbau einer Genbank pankreatischer Ratten-cDNA in dem Vektor λgt11.

Darstellung pankreatischer Ratten-RNA: die Darstellung erfolgte, indem man exakt die Technik von Chirgwin, J.M., et al, Biochemistry (WASH) (1979), 19: 5294- 5299, befolgte. Der Bruchteil der Boten-RNA von dieser gesamten RNA wurde durch Oligo-dT-Zellulose-Säulenchromatographie gemäß der Technik von Aviv, H. et Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1972), 69:1408-1412, abgetrennt.
Darstellung der cDNA: die pankreatische cDNA wurde mit Hilfe des durch Amersham France S.A. (Code RPN 1256) vertriebenen Kits synthetisiert, wobei die Empfehlungen des Herstellers exakt eingehalten wurden.
Aufbau der Genbank: die Genbank wurde in dem Expressionsvektor λgt11 mit Hilfe des durch Amersham France S.A. (Code RPN 1280) vertriebenen Kits aufgebaut, wobei die Empfehlungen des Herstellers exakt eingehalten wurden.

2. Aufbau einer Genbank pankreatischer Menschen-cDNA in dem Vektor λgt10.

Darstellung pankreatischer Menschen-RNA und Synthese der der Boten-RNA entsprechenden cDNA: Bruchstücke einer normalen Bauchspeicheldrüse von Organspendern im überschrittenen Koma wurden behandelt, wie weiter oben für die Bauchspeicheldrüse der Ratte beschrieben.
Aufbau der Genbank: die Genbank wurde in dem Klonierungsvektor λgt 10 mit Hilfe des durch Amersham France S.A. (Code RPN 1257) vertriebenen Kits aufgebaut, wobei die Empfehlungen des Herstellers eingehalten wurden.

3. Durchmusterung der Genbank pankreatischer cDNA des Menschen mit einem das Ratten-PAP exprimierenden Klon.

Ausgehend von der nach dem obigen Verfahren aufgebauten Genbank pankreatischer cDNA von Ratten wurde ein Klon ausgewählt, der durch die gegen das Ratten- PAP gerichteten polyklonalen Antikörper erkannt wird.
Die cDNA dieses Klons der Ratten-PAP wurde isoliert und als Sonde verwendet, um die Genbank pankreatischer cDNA des Menschen zu durchmustem, die gewonnen wurde, wie weiter oben beschrieben.
Zuerst wurde die Durchmusterung unter den folgenden strengen Bedingungen durchgeführt: 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA, 18 Stunden bei 68 ºC mit einer Spülung in 6 x SSC, 0,1 % SDS, 2 mal während 15 Minuten bei 65 ºC. Dadurch kann man etwa 80 Klone menschlicher cDNA gewinnen.
Danach führte man eine Durchmusterung mit PSP-cDNA durch, mit der Absicht, die für das Menschen-PAP nicht charakteristischen Klone zu eliminieren, die dennoch in der Lage waren, mit der cDNA des Ratten-PAP unter den oben genannten Bedingungen zu hybridisieren: Man hat etwa 50 Klone gewonnen, die somit ein cDNA- Fragment aufweisen, das für ein Protein oder ein Polypeptid kodiert, das der Familie des Menschen-PAP-Proteins angehört.
Aus diesen Klonen wurden diejenigen ausgewählt, deren cDNA die größte Homologie mit dem Ratten-PAP-Protein aufweist, indem man eine zweite Durchmusterung mittels Ratten-PAP-cDNA unter den folgenden strengen Bedingungen durchführte: 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA, 18 Stunden bei 68 ºC mit einer Spülung in 6 x SSC, 0,1 % SDS, während 2 Stunden bei 65 ºC. Dadurch wurden 9 positive Klone ausgewählt.

4. Sequenzierung der ausgewählten Klone

Die Einfügungen der interessanten Klone wurden in Phagen M13mp18- M13mpig subkloniert, wie in "Molecular Cloning, a laboratory manual", Sambrook, J., Fritsch, E.F., et Maniatis T. eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990) beschrieben. Die Sequenzierung der rekombinanten Phagen Ml 3 wurde mittels der durch Sanger, F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1977), 74 : 5463-5467, beschrieben Technik durchgeführt, indem man den von Amersham vertriebenen universellen Starter (Code N4511) verwendete.

5. Expression eines PAP-Fragments in E.coli. mit Hilfe des Expressionsplasmids pEX und Darstellung von Antikörpern gegen das Hybridprotein.

Ein auf das Plasmid pEX in E.coli. zurückgreifendes Expressionskit, das von der Gesellschaft Genofit unter der Bezugsnummer G2 104 vertrieben wird, wurde unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers verwendet. Es wurden Restriktionsfragmente, die der Kodierungssequenz des Proteins entsprechen, in das Plasmid pEX eingeführt. Die rekombinanten Plasmide dienten zum Transformieren von Bakterien (E.coli., Stamm Pop 2136). Die Proteine der rekombinanten Bakterien wurden durch Polyakrylamidgel-Elektrophorese zu 7,5 % analysiert. Das dem Hybrid-PAP entsprechende Proteinband wurde ausgeschnitten, in Freundschem Penetrationsmittel homogenisiert und Kaninchen injiziert, und zwar in einer Menge von 3 Injektionen pro Kaninchen im Abstand von 3 Wochen, wobei jede Injektion etwa 20 µg Hybridprotein enthielt. Das Blut der Kaninchen wurde dann abgezapft und die G-Immunoglobuline an einer A-Sepharose-Proteinsäule gereinigt (Pharmacia-France).

Claims

1. Fragment von cDNA, das für ein PAP-Protein des Menschen charakteristisch ist und das man durch die folgenden Schritte erhält:

- erstes Durchmustern einer Genbank pankreatischer cDNA des Menschen, wobei die cDNA des Menschen in einen geeigneten Klonierungsvektor eingeführt wird und eine Hybridisierung mit Sonden stattfindet, die aus der cDNA des PAP-Proteins von Ratten bestehen, wie sie durch die folgenden Sequenzen S1 oder S2 dargestellt sind Sequenz S 1 : Sequenz S2 :

in einer Lösung, welche besteht aus: 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA, über 18 Stunden hinweg bei 68 ºC, mit nachfolgender Spülung unter den folgenden Bedingungen: 6 x SSC, 0,1 % SDS, 2mal 15 Minuten bei 65 ºC,

- Auswählen der positiven cDNA-Klone des Menschen, welche während des Durclimusterns mit der cDNA des PAP-Proteins von Ratten hybridisierten, wobei diese Klone als positiv bezeichnet werden,

- zweites Durchmustern mit einer cDNA-Sequenz eines PSP-Proteins ("Pancreatic Stone Protein") unter den obigen Hybridisierungsbedingungen mit Spülung in Gegenwart von 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, über 2 Stunden hinweg bei 65 ºC, um die nicht-spezifischen Klone der cDNA von Menschen-PAP zu entfernen, die dennoch mit der cDNA von Ratten-PAP hybridisierten, und

- Rückgewinnen der Klone, die nicht mit der PSP-cDNA hybridisierten,

- Rückgewinnen der cDNA- Fragmente der erhaltenen positiven Klone.

2. Fragment von cDNA, das für ein PAP-Protein des Menschen charakteristisch ist, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Schritt zum Durchmustern mit der PSP-cDNA ("Pancreatic Stone Protein") ein Schritt zum Durchmustern mit cDNA von Ratten-PAP k)lgt, wie sie durch (he folgenden Sequenzen S1 oder S2 dargestellt sind Sequenz S 1 : Sequenz S2 :

in einer Hybridisierungslösung, welche 6 x SSC, 5 x Denhardt, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA enthilt, über 18 Stunden hinweg bei 68 ºC, mit nachfolgender Spülung über 2 Stunden hinweg bei 65 ºC.

3. Fragment von cDNA von Menschen-PAP nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es der folgenden Sequenz S3 entspricht:

4. Fragment von cDNA von Menschen-PAP nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Kettenbildung der folgenden Aminosäuren A3 kodiert:

5. Fragment von cDNA, das für ein PAP-Protein des Menschen charakteristisch ist, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleotidsequenz aufweist, die eine Homologie von mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, mit mindestens einer Kette von etwa 100 Nukleotiden hat, die in der folgenden für cDNA von gereiftem Ratten-PAP charakteristischen Sequenz S2 oder in der für ein cDNA-Fragment von Menschen-PAP charakteristischen Sequenz S3 enthalten sind. Sequenz S2 :

6. Fragment von cDNA, das für ein PAP-Protein des Menschen charaktenstisch ist, nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, zu hybridisieren mit der folgenden für die cDNA von Ratten-PAP charakteristischen Nukleotidsequenz S1 und/oder mit der fur die cDNA von gereiftem Ratten-PAP charakteristischen Nukleotidsequenz S2 in einer Hybridisierungslösung, welche 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 nM EDTA, 200 yg Lachssperma-DNA enthält, über 18 Stunden bei 68 ºC hinweg und mit einer Spülung in einer Lösung, welche 6 x SSC, 0,1 % SDS enthilt, 2mal während 15 Minuten bei 65 ºC. Sequenz S 1 :

7. Fragment von cDNA, die für ein PAP-Protein des Menschen charakteristisch ist, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Nukleotidsequenz aufweist:

8. Fragment von cDNA, dadurch gekennzeichnet, daß es der Nukleotidsequenz 51 entspricht, die für das PAP-Protein von Ratten kodiert, oder einem Teil oder einer Variante dieser Sequenz, sobald dieser Teil oder diese Variante für ein Protein oder ein Peptid kodiert, das von Antikörpern erkannt wird, die gegen das PAP-Protein von Ratten gerichtet sind, oder daß es mit der Sequenz S1 in einer Hybridisierungslösung hybridisiert, die 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5 % SDS, 10 mM EDTA, 200 µg Lachssperma-DNA enthält, und zwar 18 Stunden hei 68 ºC und nach einem Spülen unter den folgenden Bedingungen: 6 x SSC, 0,1 % SDS, 2mal 15 Minliten bei 65 ºC.

9. Fragment von cDNA, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein kodiert, das einer der folgenden Aminosäure-Sequenzen A1 oder A2 entspricht, oder für eine Aminosäure-Sequenz kodiert, die eine Homologie von 40 bis 80 %, vorzugsweise 50 bis 60 %, mit mindestens einer Kette von etwa 25 Aminosäuren der Sequenzen A1 oder A2 hat, oder in der Sequenz A3 des PAP-Proteins des Menschen. A1 A2

10. Nukleinsäure-Fragment, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein komplementäres DNA-Fragment der cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 handelt oder daß es sieh um das dieser cDNA entsprechende RNA-Fragment handelt.

11. PAP-Protein des Menschen, wie man es durch die Expression eines cDNA- Fragments von Menschen-PAP erhält, wie man es nach Anspruch 1 oder 2 mittels eines angepaßten Expressionssystems erhält, wie z.B. einem mittels eines Expressionsvektors transformierten Zellwirt, der seinerseits durch Einfügen dcs obigen cDNA-Fragments der Menschen-PAF modifiziert wurde.

12. PAP-Protein des Menschen nach Anspruch 11, wie es mittels der Expression eines cDNA-Fragments von Menschen-PAP erhalten wird, das phasengleich in einen pEX-Vektor eingeführt wird, und zwar in E.coli, insbesondere in E.coli Stamm pop2136.

13. PAP-Protein des Menschen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es der Aminosäurekette A3 entspricht.

14. PAP-Protein des Menschen nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurekette aufweist:

15. PAP-Protein des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß seine Aminosäure- Sequenz eine Homologie von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 % und besonders bevorzugt mindestens 70 % mit mindestens einer Kette von etwa 25 Aminosäuren, die in der Sequenz A2 des gereiften PAP-Proteins von Ratten enthalten ist, oder mit der Sequenz A3 des PAP-Proteins des Menschen aufweist.

16. Aminosäure-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Fragment des Proteins handelt, das der Aminosäure-Sequenz A3 entspricht, wobei das Fragment von Antikörpern erkannt wird, welche die Sequenz A3 erkennen.

17. Aminosäure-Sequenz nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie von monoklonalen Antikörpern erkannt wird, die spezifisch gegen die Sequenz A3 gerichtet sind.

18. PAP-Protein von Ratten, dadurch gekennzeichnet, daß es der folgenden Aminosäurekette oder einer Variante oder einem Teil dieser Kette entspricht, sobald dieser Teil oder diese Variante durch Antikörper erkannt wird, die gegen das PAP- Protein von Ratten gerichtet sind, odcr daß es eine Homologie von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 % mit der Sequenz A2 von Ratten-PAP aufweist. A1

19. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie das PAP-Protein des Menschen nach einem der Ansprüche 11 bis 16 erkennen und daß es sich um polyklonale oder monoklonale Antikörper handelt.

20. Monoklonale Antikörper, wie sie ausgehend von einem Hybridom gewonnen werden, des vorher durch Verschmelzung einer Myelom-Zelle und einer splenischen Zelle eines Tiers, das zuvor mit einem Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 16 immunisiert wurde, gebildet wurde.

21. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch den NH&sub2;-terminalen Teil der Aminosäure-Kette A3 erkennen.

22. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen das Peptid Glu Glu Pro Gln Arg gerichtet sind.

23. Hybridom, wie es ausgehend von der Verschmelzung einer Myelom-Zelle mit einer splenischen Zelle eines Tiers, das zuvor mit einem PAP-Protein des Menschen nach einem der Ansprüche 11 bis 16 immunisiert wurde, gewonnen wird.

24. Expressions- und/oder Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 aufweist.

25. Zellwirt, der mittels eines Expressionsvektors nach Anspruch 24 unter Bedingungen transformiert wurde, welche die Gewinnung des Proteins oder des Peptids ermöglichen, das durch das in den Vektor eingeführte DNA-Fragment kodiert wird, wobei der Zellwirt z.B. aus Bakterien, insbesondere E.coli, aus Hefen, Insekten- oder Säugetierzellen ausgewählt wird.

26. Expressionsprodukt des nach Anspruch 25 transformierten Zellwirts.

27. Zusammensetzung für die in vitro-Diagnose akuter Pankreatitis oder für die Beobachtung der Bauchspeicheldrüse durch medizinische Bilderfassung in einer biologischen Probe, wie z.B. Blut, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen, gegebenenfalls markierten Antikörper nach einem der Ansprüche 19 bis 21 enthält, der in der Lage ist, einen Antigen-Antikörper-Komplex mit dem PAP- Protein des Menschen zu bilden.

28. Kit für die in vitro-Diagnose akuter Pankreatitis ausgehend von einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es aufweist:

- mindestens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 19 bis 22, der in der Lage ist, das Vorhandensein von Menschen-PAP in der biologischen Probe zu detektieren, wobei die Antikörper gegebenenfalls markiert sind,

- je nach Markierung ein Reagenz zum Detektieren des Vorhandenseins eines spezifischen Antigen-Antikörper-Komplexes,

- einen Negativ-Anzeiger.

29. Verfahren zur in vitro-Erfassung einer akuten Pankreatitis, ausgehend von einer biologischen Probe, mit den folgenden Schritten:

- Zusammenbringen der biologischen Probe, welche das Menschen-PAP enthalten kann, mit Antikörpern nach einem der Ansprüche 19 bis 22,

- Detektion der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen den obengenannten Antikörpern und dem Menschen-PAP.

30. Kit nach Anspruch 28 oder Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper polyklonale Antikörper sind.

31. Verfahren zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse, gekennzeichnet durch:

- Injizieren einer Zusammensetzung nach Anspruch 27 in einen Patienten unter physiologisch akzeptablen Bedingungen,

- Beobachten, insbesondere mittels medizinischer Abbildungstechniken, einer Reaktion zwischen den in der obengenannten Zusammensetzung enthaltenen Antikörpern und dem Menschen-PAP, wenn es vorhanden ist.