ES2787475T3 - Predicción de probabilidad de recurrencia del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para predecir la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de una paciente con cáncer de mama con nódulo negativo, ER positivo, invasivo ductal, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de la transcripción de ARN de MELK en una célula o una muestra de tejido de cáncer de mama, obtenido de la paciente, normalizado contra el nivel de expresión de una serie de referencia de transcripciones de ARN, comparando el nivel de expresión normalizado de MELK de la paciente, con un nivel de expresión normalizado de MELK en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama, comprendiendo pacientes que estaban (a) vivas sin recurrencia de cáncer de mama local, regional o distante, (b) vivas con recurrencia contralateral de cáncer de mama, (c) vivas con segundo cáncer primario no de mama, o (d) fallecieron antes de la recurrencia del cáncer de mama, donde un nivel aumentado de expresión normalizado de MELK en la paciente indica una menor probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

Description

DESCRIPCIÓN

Predicción de probabilidad de recurrencia del cáncer

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente divulgación presenta series de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y/o el pronóstico del cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

Los oncólogos disponen de diversas opciones de tratamiento, incluyendo distintas combinaciones de fármacos quimioterapéuticos caracterizados como "protocolo de tratamiento", y diversos fármacos que no tienen indicación establecida para un cáncer en particular, pero para los que existe evidencia de eficacia en ese cáncer. Una mayor probabilidad de un buen resultado del tratamiento requiere que los pacientes sean asignados a un tratamiento del cáncer disponible óptimo, y que esa asignación se efectúe lo antes posible tras el diagnóstico.

Actualmente, los test de diagnóstico utilizados en la práctica clínica son de un solo analito, y por consiguiente no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de marcadores diferentes. Además, frecuentemente los tests de diagnóstico no son cuantitativos, basándose en la inmunohistoquímica. Este método a menudo aporta distintos resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están estandarizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no fácilmente cuantificadas. Los tests basados en ARN con frecuencia no se usan debido al problema de degradación del ARN con el paso del tiempo, y el hecho de que resulte difícil obtener muestras de tejido frescas de los pacientes para su análisis. El tejido embebido en parafina fijado es más fácilmente obtenible, y se han establecido métodos para detectar el ARN en tejido fijado. No obstante, típicamente estos métodos no permiten el estudio de grandes cifras de genes (ADN o ARN) de pequeñas cantidades de material. Por tanto, tradicionalmente se ha utilizado poco el tejido fijado, aparte de para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

En los últimos años, varios grupos han publicado estudios sobre la clasificación de ciertos tipos de cáncer por análisis de expresión génica por microarrays (ver, p.ej., Golub et al., Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Suppl. 1):S316-S322 (2001);

Ramaswamy etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001)). Se ha informado también de algunas clasificaciones de cánceres de mama humanos, basados en patrones de expresión génica (Martin et al, Cancer Res. 60:2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:11462-11467 (2001); Sorlie etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001)). No obstante, esos estudios se enfocan principalmente en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama, y en general no proporcionan nueva información sobre las relaciones de los genes expresados diferencialmente, y no relacionan los hallazgos con estrategias de tratamiento, para mejorar los resultados clínicos de la terapia del cáncer. Aunque la biología y bioquímica molecular modernas han revelado cientos de genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de las células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a determinados fármacos terapéuticos, con contadas excepciones, el estado de esos genes no ha sido explotado a efectos de la toma rutinaria de decisiones clínicas sobre tratamientos con fármacos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína del receptor de estrógenos (ER) en los carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con fármacos antiestrogénicos, como tamoxifen. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama, para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Her-ceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento del cáncer sigue siendo objetivar pautas de tratamiento específicas para tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento del tumor para maximizar los resultados. Por consiguiente, se necesitan tests que proporcionen simultáneamente información predictiva acerca de la respuesta del paciente a las diversas opciones de tratamiento. Esto es especialmente cierto en el cáncer de mama, cuya biología es poco conocida. Es evidente que la clasificación del cáncer de mama en algunos subgrupos, como el subgrupo ErbB2+, y subgrupos caracterizados por una baja o ausente expresión génica del receptor de estrógenos (ER), y algunos factores transcripcionales adicionales (Perou et. al., Nature 406:747-752 (2000)) no refleja la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no facilita el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente.

En particular, cuando a una paciente se le diagnostica un cáncer, como cáncer de mama u ovario, se necesitan en gran medida métodos que permitan al médico predecir el curso esperado de la enfermedad, incluyendo la probabilidad de recurrencia del cáncer, la supervivencia a largo plazo de la paciente, y similares, y seleccionar en consecuencia la opción de tratamiento más apropiada.

Bos et al. (Cáncer, Vol. 97, No 6, 1573-1518, 2003) divulgan el uso de ARN HIF-a para predecir la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de una paciente con cáncer de mama nódulo negativo ductal invasivo. US2002/156263 divulga MELK (KIAA0175) como uno de un gran número de genes que se ha observado que se expresan diferencialmente en el cáncer de mama.

Resumen de la invención

La presente invención viene definida por las reivindicaciones adjuntas 1 a 8.

La presente invención considera el uso de material de biopsia embebido en parafina guardado, para el ensayo de todos los marcadores de la serie, y por consiguiente es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible. También es compatible con otros métodos distintos de obtención de tejido tumoral, por ejemplo, por biopsia con aguja gruesa, o aspiración con aguja fina. Además, para cada miembro de la serie de genes, la invención especifica las secuencias de oligonucleótidos que se pueden utilizar en el test.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para predecir la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de una paciente con cáncer de mama nódulo negativo, ER positivo, ductal invasivo, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de la transcripción de ARN de MELK en una célula o una muestra de tejido del cáncer de mama obtenidos de la paciente, normalizado contra el nivel de expresión de una serie de referencia de transcripciones de ARN, comparando el nivel de expresión normalizado de MELK de la paciente, con un nivel normalizado de expresión de MELK en una serie de referencia de tejido de cáncer de mama, comprendiendo pacientes que estaban (a) vivas sin recurrencia del cáncer de mama local, regional o distante, (b) vivas con recurrencia contralateral de cáncer de mama, (c) vivas con segundo cáncer primario no de mama, o (d) fallecieron antes de la recurrencia del cáncer de mama, donde un nivel aumentado de la expresión normalizada de MELK en la paciente indica una menor probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

En varias realizaciones, se determina el nivel de expresión de al menos 2, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20 o al menos 25 transcripciones de ARN de pronóstico o sus productos de expresión.

En otra realización, el cáncer es cáncer de mama o cáncer de ovario.

El cáncer es cáncer de mama nódulo negativo, ER positivo. En otra realización, el ARN comprende ARN intrónico, Se determina el nivel de expresión de la transcripción de ARN de MELK, donde la expresión de MELK indica una menor probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer.

La invención consiste en un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de una paciente con cáncer, sin recurrencia del cáncer, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de transcripciones de ARN de MELK, en una célula cancerosa obtenida de dicha paciente, normalizado contra el nivel de expresión de todas las transcripciones de ARN o sus productos en la célula cancerosa, o de una serie de referencia de transcripciones de ARN o sus productos de expresión, donde el incremento en la expresión de MELK indica una menor probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer.

En una realización de este método, el ARN se aísla de una muestra de tejido del cáncer de mama de la paciente, se embebe en cera y se fija.

En otra realización, el ARN se aísla del tejido biopsiado con aguja gruesa, o células aspiradas con aguja fina.

En un aspecto diferente, la divulgación se refiere a un array que comprende la hibridación de polinucleótidos con dos o más de los siguientes genes: B_Catenina; BAG1; BIN1; BUB1; C20_orf1; CCNB1; CCNE2; CDC20; CDH1; CEGP1; CIAP1; cMYC; CTSL2; DKFZp586M07; DR5; EpCAM; EstR1; FOXM1; GRB7; GSTM1; GSTM3; HER2; HNRPAB; ID1; IGF1R; ITGA7; Ki_67; KNSL2; LMNB1; MCM2; MELK; MMP12; MMP9; MYBL2; NEK2; NME1; NPD009; PCNA; PR; PREP; PTTG1; RPLPO; Src; STK15; STMY3; SURV; TFRC; TOP2A; y TS, inmovilizado en una superficie sólida.

En un aspecto de la divulgación, el array comprende la hibridación de polinucleótidos en dos o más de los siguientes genes: MMP9, GSTM1, MELK, PR, DKFZp586M07, GSTM3, CDC20, CCNB1, STMY3, GRB7, MYBL2, CEGP1, SURV, LMNB1, CTSL2, PTTG1, BAG1, KNSL2, CIAP1, PREP, NEK2, EpCAM, PCNA, C20_orf1, ITGA7, ID1 B_Catenina, EstR1, CDH1, TS HER2, y cMYC.

En otro aspecto, el array comprende la hibridación de polinucleótidos en dos o más de los siguientes genes: GRB7, 40 SURV, PR, LMNB1, MYBL2, HER2, GSTM1, MELK, S20_orf1, PTTG1, BUB1, CDC20, CCNB1, STMY3, KNSL2, CTSL2, MCM2, NEK2, DR5, Ki_67, CCNE2, TOP2A, PCNA, PREP, FOXM1, NME1, CEGP1, BAG1, STK15, HNRPAB, EstR1, MMP9, DKFZp586M07, TS, Src, BIN1, NP009, RPLPO, GSTM3, MMP12, TFRC, e IGF1R.

En otro aspecto, los arrays comprenden la hibridación de polinucleótidos en al menos 3, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25 de los genes listados.

En otro aspecto más, los arrays comprenden la hibridación de polinucleótidos en todos los genes listados.

Y aún en otro aspecto más, los arrays comprenden más de una hibridación de polinucleótidos en el mismo gen.

En un aspecto adicional, os arrays comprenden secuencias basadas en intrones.

En otro aspecto, los polinucleótidos son ADNc (ADN complementario), que pueden, por ejemplo, tener aproximadamente una longitud de 500 a 5000 bases.

En otro aspecto más, los polinucleótidos son oligonucleótidos, que pueden, por ejemplo, tener aproximadamente una longitud de 20 a 80 bases.

Los arrays pueden, por ejemplo, inmovilizarse sobre vidrio, y pueden contener cientos de miles, por ej., 330.000 oligonucleótidos.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de una paciente diagnosticada de cáncer de mama invasivo, sin recurrencia del cáncer de mama, comprendiendo los pasos de

(a) determinar los niveles de expresión de las transcripciones de ARN, o los productos de expresión de genes de una serie de genes seleccionado del grupo compuesto por B_Catenina; BAG1; BIN1; BUB1; C20_orfl; CCNB1; CCNE2; CDC20; CDH1; CEGP1; CIAP1; cMYC; CTSL2; DKFZp586M07; DR5; EpCAM; EstR1; FOXM1; GRB7; GSTM1; GSTM3; HER2; HNRPAB; ID1; IGF1R; ITGA7; Ki_67; KNSL2; LMNB1; MCM2; MELK; MMP12; MMP9; MYBL2; NEK2; NME1; N-PD009; PCNA; PR; PREP; PTTG1; RPLPO; Src; STK15; STMY3; SURV; TFRC; TOP2A; y TS en una célula de cáncer de mama obtenida de la paciente, normalizado contra los niveles de expresión de todas las transcripciones de ARN o sus productos de expresión en dicha célula de cáncer de mama, o de una serie de referencia de transcripciones de ARN o sus productos;

(b) someter los datos obtenidos en el paso (a) a análisis estadístico; y;

(c) determinar si la probabilidad de dicha supervivencia a largo plazo ha aumentado o disminuido.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método de preparación de un perfil genómico personalizado para una paciente, comprendiendo los pasos de

(a) someter ARN extraído de un tejido de mama obtenido de la paciente al análisis de expresión génica;

(b) determinar el nivel de expresión en el tejido de uno o más genes seleccionados de la serie de genes del cáncer de mama listados en cualquiera de las Tablas 1 y 2, donde el nivel de expresión está normalizado con respecto a un gen o genes de control, y opcionalmente se compara con la cantidad hallada en un conjunto de tejidos de referencia del cáncer de mama; y

(c) crear un informe resumiendo los datos obtenidos en dicho análisis de expresión génica. El tejido mamario puede comprender células de cáncer de mama.

En otra realización, el tejido mamario se obtiene de una muestra de biopsia embebida en parafina y fijada, en la que el ARN puede estar fragmentado.

El informe puede incluir la predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de la paciente, y/o una recomendación para una modalidad de tratamiento de dicha paciente.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para medir los niveles de productos de RNAm de los genes listados en las Tablas 1 y 2 por reacción de la cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR), utilizando un amplicón listado en la Tabla, y un conjunto y un conjunto de sonda-cebador indicado en las Tablas 4A - 4D. 25

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un conjunto de sonda-cebador de PCR listado en las Tablas 4A - 4D, y un amplicón de PCR listado en la Tabla 3.

A. Definiciones

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992), proporcionan a los expertos en la técnica una guía general sobre muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica conocerá muchos métodos y materiales similares a los que se describen aquí, que podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. A efectos de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.

El término "microarray" se refiere a una disposición ordenada de elementos de array hibridables, de preferencia sondas de polinucleótidos, sobre un sustrato.

El término "polinucleótido", utilizado en singular o plural, se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Así, por ejemplo, los polinucleótidos, como se definen aquí, incluyen entre otros, ADN de cadena simple y doble, ADN incluyendo regiones de cadena simple y doble, ARN de cadena simple y doble y ARN incluyendo regiones de cadena simple y doble, moléculas híbridas comprendiendo ADN y ARN que pueden ser de cadena simple o, más típicamente, de cadena doble, o incluir regiones de cadena simple y doble. Además, el término "polinucleótido", como se utiliza aquí, se refiere a regiones de cadena triple comprendiendo ARN o ADN, o ARN y ADN. Las cadenas de tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas distintas. Las regiones pueden incluir todas las de una o más de las moléculas, pero más típicamente incluyen solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es frecuentemente un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente ADNcs. El término incluye ADNs (incluyendo ADNcs) y ARNs que contienen una o más bases modificadas. Así, tal como se aplica el término aquí, ADNs o ARNs con cadenas principales modificadas, por razones de estabilidad u otros motivos, son "polinucleótidos". Además, ADNs o ARNs comprendiendo bases inusuales, como la inosina, o bases modificadas, como bases tritiadas, se incluyen en el término "polinucleótidos", como se define aquí. En general, el término "polinucleótidos" comprende todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, incluyendo las células simples y complejas.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, entre otros, desoxirribonucleótidos de cadena simple, ribonucleótidos de cadena simple o doble, híbridos de ARN:ADN y ADNs de cadena doble. Los oligonucleótidos, como los oligonucleótidos sonda de ADN de cadena simple, son frecuentemente sintetizados por métodos químicos, por ejemplo, sintetizadores de oligonucleótidos automáticos usmg, disponibles comercialmente. No obstante, los oligonucleótidos pueden hacerse por otros varios métodos, incluyendo técnicas in vitro mediadas por ADN recombinante, y por expresión de ADNs en células y organismos.

Los términos "gen expresado diferencialmente", "expresión génica diferencial" y sus sinónimos, que se utilizan intercambiablemente, se refieren a un gen cuya expresión es activada a un nivel superior o inferior, en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente cáncer, como cáncer de mama, en relación con su expresión en un sujeto normal o de control. Los términos incluyen también genes cuya expresión es activada a un nivel superior o inferior en distintos estadios de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado diferencialmente puede ser activado o inhibido a nivel del ácido nucleico o a nivel de proteína, o puede ser sujeto a un empalme alternativo para dar un producto de polipéptido distinto. Tales diferencias pueden ponerse de manifiesto, por ejemplo, por un cambio en los niveles de ARNm, expresión de superficie, secreción u otro fraccionamiento de un polipéptido. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de expresión entre dos o más genes, o sus productos génicos, o una comparación de los cocientes de la expresión entre dos o más genes, o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos procesados diferentemente del mismo gen, que difieran entre sujetos normales y sujetos con una enfermedad, específicamente cáncer, o entre varios estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias cuantitativas y cualitativas en el patrón de expresión temporal o celular de un gen, o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales o enfermas, o entre células que han pasado por distintos episodios de la enfermedad, o estadios de la misma. A los efectos de esta invención, la "expresión génica diferencial" se considera presente cuando hay una diferencia aproximada de al menos el doble, preferiblemente de al menos unas cuatro veces, más preferiblemente de al menos unas seis veces, y aún más preferiblemente de al menos unas diez veces entre la expresión de un gen determinado en sujetos normales y enfermos, o en varios estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo. El término "sobreexpresión" con respecto a una transcripción de ARN, se utiliza para referirse al nivel de la transcripción determinado por normalización respecto al nivel de referencia de ARNms, que pueden ser todas las transcripciones medidas en la muestra, o una serie de referencia de ARNms particular.

La frase "amplificación génica" se refiere a un proceso por el que se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina habitualmente "amplicón". Habitualmente, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producida, es decir, el nivel de expresión génica, aumenta también en proporción al número de copias hecho del gen particular expresado.

El término "pronóstico" se utiliza aquí con referencia a la predicción de probabilidad de progresión o muerte atribuible al cáncer, incluyendo recurrencia, diseminación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, como el cáncer de mama. El término "predicción" se usa aquí para referirse a la probabilidad de que un paciente responda de forma favorable o desfavorable a un fármaco o serie de fármacos, y también a la amplitud de esas respuestas, o de que un paciente sobreviva, tras la extracción quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia, durante determinado periodo de tiempo, sin recurrencia del cáncer. Los métodos predictivos de la presente invención pueden ser utilizados clínicamente para adoptar decisiones de tratamiento, eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente en particular. Los métodos predictivos de la presente invención son valiosos instrumentos para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a una pauta de tratamiento, como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco o combinación de fármacos determinados, y/o terapia de radiación, o si es probable una supervivencia a largo plazo del paciente, tras la cirugía y/o conclusión de la quimioterapia u otras modalidades de tratamiento.

El término "a largo plazo" se utiliza aquí para referirse a una supervivencia de al menos 3 años, más preferiblemente de al menos 8 años, aún más preferiblemente de al menos 10 años tras la cirugía u otro tratamiento.

El término "tumor", como se utiliza aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, maligna o benigna, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer cerebral.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que afectan al bienestar del paciente. Esto incluye, entre otros, el crecimiento celular anormal o incontrolable, la metástasis, la interferencia con el normal funcionamiento de las células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos de secreción a niveles anormales, la supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos vecinos o distantes, como nódulos linfáticos, etc.

El "rigor" de las reacciones de hibridación puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica, y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas superiores para una adecuada apareación, mientras que las sondas más cortas requieren temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para la apareación cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea de grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, tanto más alta es la temperatura relativa que puede utilizarse. La consecuencia es que temperaturas relativas superiores tenderán a hacer más estrictas las condiciones de reacción, mientras que temperaturas más bajas lo harán menos. Para detalles y explicaciones adicionales del rigor de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones muy rigurosas", como se definen aquí, típicamente: (1) emplean baja potencia iónica y alta temperatura para lavar, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/ citrato sódico 0,0015 /dodecil sulfato sódico 0,1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con albúmina de suero bovino 0,1% /Ficoll 01% /polivinilpirrolidona 0,1% /tampón fosfato sódico 50mM a pH 6.5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6.8), pirofosfato sódico 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 |jg/ml), SDS 0,1%, y sulfato de dextrano 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x Ss C (cloruro sódico / citrato sódico) y formamida 50% a 55°C, seguido de un lavado muy riguroso consistente en 0,1 x SSC conteniendo EDTA a 55°C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden ser identificadas como las describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ej. temperatura, potencia iónica y % SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C, en una solución comprendiendo: formamida 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano 10%, y ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. El experto sabrá cómo ajustar la temperatura, la potencia iónica, etc., lo necesario para ajustarlo a factores tales como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de la presente invención, la referencia a "al menos uno", "al menos dos", "al menos cinco", etc., de los genes listados en cualquier serie de genes particular significa cualquiera o cualquiera y todas las combinaciones de los genes listados.

El término cáncer "nódulo negativo", como en cáncer de mama "nódulo negativo", se utiliza aquí en referencia a un cáncer que no se ha diseminado a los nódulos linfáticos.

Los términos "empalme" y "empalme de ARN" son utilizados de forma intercambiable, y se refieren al procesado de ARN que elimina intrones y une exones, para producir ARNm maduro con secuencia de codificación continua que pasa al citoplasma de una célula eucariota.

En teoría, el término "exón" se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). En teoría, el término "intrón" se refiere a cualquier segmento de ADN transcrito pero eliminado de dentro de la transcripción empalmando juntos los exones de ambos lados. Operativamente, las secuencias de exón aparecen en la secuencia de ARNm de un gen como se define en los números de la Ref. SEC ID. Operativamente, 30 secuencias de intrón son las secuencias que intervienen en el ADN genómico de un gen, delimitadas por secuencias de exón, y con secuencias de consenso de empalme GT y AG en sus límites 5' y 3'.

B. Descripción detallada

En la práctica de la presente invención se emplearán, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas se explican en detalle en la literatura, como en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (r.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4th edition (D.M. Weir& C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

1. Perfil de expresión génica

Los métodos de perfilado de expresión génica incluyen métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos y métodos basados en proteómica. Los métodos utilizados más comúnmente conocidos en la técnica de cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen la hibridación northern blotting e in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques so 13:852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, como la reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteínas de ADN. Los métodos representativos de análisis de expresión génica basados en secuenciación incluyen el Análisis en Serie de Expresión Génica (SAGE), y el análisis de expresión génica por secuenciación de firma paralela masiva (MPSS)

2. Métodos de perfilado de expresión génica basados en PCR

a PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)

De las técnicas indicadas más arriba, el método cuantitativo más sensible y más flexible es RT-PCR, que puede utilizarse para comparar niveles de ARNm en poblaciones de muestras distintas, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNms estrechamente relacionados, y para analizar la estructura del ARN.

El primer paso es aislar el ARNm de una muestra diana. El material de inicio es típicamente ARN total aislado de tumores humanos o líneas celulares tumorales, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes, respectivamente. Por tanto, se puede aislar ARN de diversos tumores primarios, incluyendo tumores de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, útero, etc., o líneas de células tumorales, con ADN agrupado de donantes sanos. Si la fuente del ARNm es un tumor primario, se puede extraer ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congelado o guardadas y embebidas en parafina y fijadas (por ej. fijadas en formalina).

Los métodos generales de extracción de ARNm son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se divulgan en libros de texto estándar de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los métodos para la extracción de ARN de tejidos embebidos en parafina se divulgan, por ejemplo, en Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), y De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, se puede aislar ARN utilizando un kit de purificación, conjunto de tampón y proteasa de fabricantes comerciales, como Qiagen, conforme con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, se puede aislar ARN total de células en cultivo utilizando minicolumnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen MasterPure™ Complete DNA y RNA Purification Kit (EPICENTRE®, Madison, Wl), y Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). Se puede aislar ArN total de muestras de tejido utilizando RNA Stat-60 (Tel-Test). Se puede aislar ARN de un tumor preparado, por ejemplo, por centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Como el ARN no puede servir como plantilla para la PCR, el primer paso en el perfilado de expresión génica por RT-PCR es la transcripción inversa de la plantilla de ARN en ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más utilizadas comúnmente son la transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). El paso de la transcripción inversa se ceba típicamente utilizando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo.dT, dependiendo de las circunstancias y el objetivo del perfilado de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído pueden ser transcrito inversamente utilizando un kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado puede ser utilizado entonces como plantilla en la posterior reacción de PCR.

Aunque en el paso de la PCR se puede utilizar diversas ADN polimerasas dependientes de ADN termoestable, se emplea típicamente la ADN polimerasa Taq, que tiene una actividad de nucleasa 5'-3', pero carece de actividad de endonucleasa correctora 3'-5'. Así, TaqMan® PCR utiliza típicamente la actividad de nucleasa 5' de polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación ligada a su amplicón diana, pero se puede utilizar cualquier enzima con actividad de nucleasa 5' equivalente. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda es no extensible por el enzima de la polimerasa ADN Taq, y está marcada con un colorante fluorescente reporter y un colorante fluorescente inhibidor. Cualquier emisión inducida por láser del colorante reporter es inhibida por el colorante inhibidor, cuando los dos colorantes están ubicados juntos como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, el enzima de la polimerasa de ADN Taq divide la sonda de una forma que depende de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante reporter liberado queda libre del efecto de inhibición del segundo fluoróforo. Por cada nueva molécula sintetizada se libera una molécula de colorante reporter, y la detección del colorante reporter no inhibido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

Se puede realizar la ET-PCR TaqMan© utilizando los equipos disponibles comercialmente, como, por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferente, el procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa de tiempo real, como ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema está compuesto por un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recogida en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos, y detectada en el CCD. El sistema incluye software para la ejecución del instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de 5'-nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha comentado más arriba, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo, y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto de la reacción de amplificación. El punto donde se registra primero la señal fluorescente como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de variación entre muestras, la RT-PCR se realiza habitualmente utilizando un estándar interno. El estándar interno ideal se expresa a un nivel constante entre distintos tejidos, y no es afectado por el tratamiento experimental. Los ARNs utilizados más frecuentemente para normalizar patrones de expresión génica son ARNms para los genes constitutivos gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y p-actina.

Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de la PCR mediante una sonda fluorigénica con marcaje dual (es decir, sonda TaqMan®). La PCR de tiempo real es compatible tanto con la PCR cuantitativa competitiva, donde se emplea para la normalización un competidor interno para cada secuencia diana, como con la PCR cuantitativa comparativa, utilizando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen constitutivo RT-PCR. Para más detalles ver, por ejemplo, Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996).

Los pasos de un protocolo representativo para el perfilado de la expresión génica, utilizando tejidos embebidos en parafina fijados como fuente de ARN, incluyen el aislamiento de ARNm, purificación, extensión y amplificación de cebador, se aportan en diversos artículos publicados en revistas (por ejemplo: T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-29 [2001]}. Resumiendo, un proceso representativo se inicia cortando secciones de un grosor de 10 ^m aproximadamente de muestras de tejido tumoral embebidas en parafina. Se extrae entonces el ARN, y se elimina la proteína y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir pasos de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y se transcribe inversamente el ARN utilizando promotores específicos de gen seguido de RT-PCR.

b. Sistema MassARRAY

En el método de perfilado de expresión génica basado en MasARRAY, desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA), tras el aislamiento del ARN y la transcripción inversa, al ADNc obtenido se añade una molécula de ADN sintético (competidor), que coincide con la región diana de ADNc en todas las posiciones, excepto una base simple, y sirve como estándar interno. La mezcla de ADNc/competidor se amplifica por PCR y se somete a un tratamiento de enzima fosfatasa alcalina de camarón (SAP) post PCR, que produce la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos de la PCR del competidor del ADNc se someten a la extensión del cebador, que genera señales de masa distintas para los productos de la PCR derivados del competidor y el ADNc. Tras la purificación, esos productos se disponen en un array de chips, precargado con los componentes necesarios para el análisis con espectrometría de masas de tiempo de vuelo tipo desorción/ionización por láser asistido por matriz (MALDI-TOF MS). Se cuantifica entonces el ADNc presente en la reacción analizando los cocientes de las áreas de pico en el espectro de masa generado. Para más detalles ver, ej. Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003).

c. Otros métodos basados en PCR

Otras técnicas basadas en PCR incluyen, por ejemplo, el display diferencial (Liang and Pardee, Science 257:967-971 (1992)); el polimorfismo de longitud de segmentos amplificados (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305-1312 (1999)); tecnología BeadArray™ (lllumina, San Diego, CA; Oliphantetal., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray para la detección de la expresión gen 35 (BADGE), utilizando el sistema LuminexlOO LabMAP disponible comercialmente y múltiples microesferas codificadas por colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido de expresión génica (Yang et al., Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y análisis de perfilado de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16)e94 (2003)).

3. Microarrays

La expresión génica diferencial puede ser también identificada, o confirmada utilizando la técnica de microarray. Por tanto, el perfil de expresión de los genes asociados al cáncer de mama puede ser medido en tejido tumoral fresco o embebido en parafina, utilizando la tecnología de microarray. En este método, secuencias de polinucleótidos de interés (incluyendo ADNcs y oligonucleótidos) son laminadas o dispuestas sobre un sustrato de microchip. Las secuencias dispuestas son entonces hibridadas con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Igual que en el método RT-PCR, la fuente de ARNm es típicamente ARN total aislado de tumores humanos o líneas celulares tumorales, y tejidos o líneas celulares correspondientes. Por tanto, el ARN puede aislarse de diversos tumores primarios o líneas celulares tumorales. Si la fuente del ARNm es un tumor primario, se puede extraer ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o embebidas en parafina archivadas y fijadas (por ej. fijadas en formalina), preparadas de forma rutinaria y conservadas en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de microarray, se aplican insertos amplificados de PCR de clones de ADNc a un sustrato en un array denso. De preferencia, se aplican al sustrato al menos 10.000 secuencias de nucleótidos. Los genes micrordenados, inmovilizados en el microchip en 10.000 elementos cada uno, son aptos para la hibridación en condiciones rigurosas. Se pueden generar sondas de ADNc marcadas mediante incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas sobre el chip se hibridan con especificidad para cada punto de ADN en el array. Tras un lavado estricto para eliminar las sondas no ligadas específicamente, el chip es escaneado por microscopía de láser confocal u otro método de detección, como cámara CCD. La cuantificación o hibridación de cada elemento ordenado permite la evaluación de la abundancia de ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas de forma separada, generadas de dos fuentes de ARN, se hibridan por pares con el array. La abundancia relativa de las transcripciones de las dos fuentes correspondiendo a cada gen especificado se determina así simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite la evaluación cómoda y rápida del patrón de expresión de grandes números de genes. Tales métodos han demostrado tener la sensibilidad requerida para detectar transcripciones raras, expresadas en unas pocas copias por célula, y detectar de forma reproducible, al menos aproximadamente, diferencias dobles en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)). El análisis de microarray puede realizarse con los equipos disponibles comercialmente, siguiendo los protocolos del fabricante, como usar la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de microarray de Incyte.

El desarrollo de métodos de microarray, para el análisis a gran escala de expresión génica, hace posible la búsqueda sistemática de marcadores moleculares de clasificación del cáncer y predicción de resultados en diversos tipos de tumores.

4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcripciones génicas, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcripción. Primero se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 bp) que contiene suficiente información para identificar de forma inequívoca una transcripción, siempre que la etiqueta se obtenga de una posición única dentro de cada transcripción. A continuación se enlazan juntas muchas transcripciones para formar largas moléculas en serie, que pueden ser secuenciadas, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcripciones puede ser evaluado cuantitativamente determinando la abundancia de etiquetas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles ver, p.ej., Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

5. Análisis de expresión génica por secuenciación de firma paralela masiva (MPSS)

Este método, descrito por Brenner etal., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000), es un enfoque de secuenciación que combina la secuenciación de firma no basada en gel, con la clonación in vitro de millones de plantillas sobre microperlas separadas de diámetro 5 |jm. Primero se construye una biblioteca de microperlas de plantillas de ADN por clonación in vitro. A esto le sigue la creación de un array planar de la plantilla conteniendo microperlas en una celda de flujo a alta densidad (típicamente superior a 3 x 106 microperlas/cm2). Los extremos libres de las plantillas clonadas en cada microperla se analizan simultáneamente, utilizando un método de secuenciación de firma basado en fluorescencia que no requiere la separación de fragmentos de ADN. Este método ha demostrado proporcionar de forma simultánea y precisa, en una sola operación, cientos de miles de secuencias de firma génica de una biblioteca de ADNc de levaduras.

6. Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son también adecuados para detectar los niveles de expresión de los marcadores de pronóstico de la presente invención. Así, para detectar la expresión se utilizan anticuerpos o antisueros, de preferencia antisueros policlonales, y aún mejor anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador. Los anticuerpos pueden ser detectados por marcaje directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores haptenos, como la biotina, o una enzima como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo primario no marcado junto con un anticuerpo secundario marcado, comprendiendo antisueros, antisueros policlonales, o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits de inmunohistoquímica son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

7. Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ej. tejido, organismo o cultivo celular) en un momento determinado. La proteómica incluye, entre otros, el estudio de los cambios globales de la expresión proteica en una muestra (denominada también "proteómica de expresión"). La proteómica incluye típicamente los siguientes pasos: (1) separación de las proteínas individuales en una muestra por electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ej., por espectrometría de masas o secuenciación de terminal-N, y (3) análisis de los datos utilizando la bioinformática. Los métodos proteómicos son valiosos suplementos de otros métodos de perfilado de expresión génica, y se pueden usar solos o en combinación con otros métodos, para detectar los productos de los marcadores de pronóstico de la presente invención.

8. Descripción general del aislamiento, purificación y amplificación del ARNm

Los pasos de un protocolo representativo para el perfilado de la expresión génica, utilizando tejidos embebidos en parafina fijados, como fuente de ARN, incluyendo el aislamiento de ARNm, purificación, extensión y amplificación del cebador, se indican en diversos artículos publicados en revistas (por ejemplo: T.E. Godfrey et al,. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-29 [2001]). Resumiendo, un proceso representativo se inicia cortando secciones de un grosor de 10 ^m aproximadamente de muestras de tejido tumoral embebidas en parafina. Se extrae entonces el ARN, y se elimina la proteína y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir pasos de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y se transcribe inversamente el ARN utilizando promotores específicos de gen seguido de RT-PCR. Finalmente, los datos son analizados para identificar la mejor opción(es) de tratamiento disponible para el paciente, en base al patrón de expresión génica característico identificado en la muestra tumoral examinada, dependiendo de la probabilidad prevista de recurrencia del cáncer.

9. Serie de genes de cáncer de mama, subsecuencias génicas ensayadas y aplicación clínica de los datos de expresión génica

Un aspecto importante de la presente invención es el uso de la expresión medida de determinados genes mediante tejido de cáncer de mama, para obtener información de pronóstico. Para este fin es necesario corregir (normalizar) diferencias en la cantidad de ARN ensayado y la variabilidad en la calidad de ARN usado. Por consiguiente, el ensayo típicamente mide e incorpora la expresión de determinados genes normalizadores, incluyendo genes constitutivos bien conocidos, como GAPDH y Cyp1. Alternativamente, la normalización puede basarse en la señal media o mediana (Ct) de todos los genes ensayados, o un amplio subconjunto de ellos (enfoque de normalización global). Sobre una base de gen-por-gen, la cantidad medida normalizada de ARNm de tumor de un paciente, se compara con la cantidad hallada en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama. El número (N) de tejidos de cáncer de mama en esta serie de referencia debe ser suficientemente grande como para asegurar que series de referencia distintas (globalmente) se comporten esencialmente del mismo modo. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos de cáncer de mama individuales presentes en una serie particular no tendrá un impacto significativo sobre las cantidades relativas de los genes ensayados. Habitualmente, la serie de referencia de tejido de cáncer de mama está compuesta como mínimo por unas 30 muestras FPE de tejido de cáncer de mama distintas, y preferiblemente al menos de unas 40. Salvo que se indique lo contrario, los niveles de expresión normalizada de cada ARNm/tumor estudiado/paciente, se expresarán como porcentaje del nivel de expresión medido en la serie de referencia. Más específicamente, la serie de referencia de un número de tumores suficientemente elevado (por ej., 40) proporciona una distribución de niveles normalizados de cada especie de ARNm El nivel medido en una muestra particular de tumor a analizar cae en algún percentil dentro de este rango, que puede ser determinado por métodos bien conocidos en la técnica. Más abajo, salvo que se indique lo contrario, la referencia a los niveles de expresión de un gen supone expresión normalizada en relación con la serie de referencia, aunque esto no se indique siempre explícitamente.

10. Diseño de cebadores y sondas de PCR basados en intrones

Según un aspecto de la presente invención, los cebadores y las sondas de PCR se diseñan basados en secuencias de intrones presentes en el gen a amplificar. En consecuencia, el primer paso en el diseño de cebadores/sondas es la delineación de las secuencias de intrones en los genes. Esto puede hacerse mediante software de dominio público, como el software DNA BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002), o el software BLAST, incluyendo sus variaciones. Los posteriores pasos siguen unos métodos bien establecidos de diseño de cebadores y sondas de PCR. Para evitar señales no específicas, es importante enmascarar secuencias repetitivas en los intrones, al diseñar los cebadores y las sondas. Esto puede conseguirse fácilmente utilizando el programa Repeat Masker, obtenible online a través del Baylor College of Medicine, que criba secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos, y devuelve una secuencia de consulta en la que se enmascaran los elementos repetitivos. Las secuencias enmascaradas de intrones pueden ser usadas entonces para diseñar secuencias de cebador y sonda, utilizando cualquier paquete de diseño de cebadores/sondas disponibles comercialmente o de otro modo, como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. En: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)

Los factores más importantes a considerar en el diseño de cebadores de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusión (Tm), y el contenido G/C, la especificidad, las secuencias de cebador complementarias y la secuencia de extremo 3'. En general, los cebadores de PCR óptimos son de 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente un 20-80% de bases G+C, como por ejemplo, aproximadamente un 50-60%. Típicamente son preferibles temperaturas entre 50 y 80°C, p.ej., aproximadamente de 50 a 70°C.

Para más directrices para el diseño de cebadores y sondas de PCR ver, p.ej. Dieffenbach, C.W. et al., "General Concepts 50 for PCR Primer Design" in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, "Optimization of PCRs" in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; y Plasterer, T.N. Primer select: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997).

Se dan más detalles de la invención en el siguiente Ejemplo no limitativo.

Ejemplo

Un estudio de Fase II de expresión génica en 242 tumores de mama malignos

Se diseñó y llevó a cabo un estudio de expresión génica, con el objetivo primario de caracterizar molecularmente la expresión génica en muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas, de carcinoma de mama ductal invasivo, y explorar la correlación entre tales perfiles moleculares y la supervivencia libre de enfermedad.

Diseño del estudio

Se realizaron ensayos moleculares en tejidos de tumor de mama primario, embebidos en parafina y fijados con formalina, obtenidos de 252 pacientes individuales diagnosticadas con cáncer de mama invasivo. Todas las pacientes que presentaban nódulos linfáticos negativos, eran ER positivas y estaban tratadas con Tamoxifen. La media de edad era de 52 años, y el tamaño medio del tumor clínico era de 2 cm. La media de seguimiento era de 10,9 años. A 1 de enero de 2003, 41 pacientes presentaban recurrencia local o distante de la enfermedad, o fallecimiento por cáncer de mama. Las pacientes eran incluidas en el estudio solo si la evaluación histopatológica, realizada como se describe en la sección Materiales y Métodos, indicaba cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Materiales y métodos

Cada bloque de tumor representativo se caracterizaba por histopatología estándar para el diagnóstico, evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor y grado del tumor. Si el área tumoral era inferior al 70% de la sección, el área tumoral se diseccionaba aproximadamente y se tomaba tejido de 6 secciones (10 micrones). De lo contrario se preparaba un total de 3 secciones (también de un grosor de 10 micrones cada una). Las secciones se colocaron en dos Tubos Costar Brand Microcentrifuge (polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparentes). Si se obtenía más de un bloque tumoral como parte del procedimiento quirúrgico, se utilizaba para el análisis el bloque más representativo de la patología.

Análisis de la expresión génica

Se extrajo y se purificó ARNm de muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas, y se prepararon para el análisis de expresión génica como se describe en el anterior capítulo 6.

Se realizaron ensayos moleculares de expresión génica cuantitativa por RT-PCR, utilizando el ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). El ABI PRISM 7900™ consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recogida en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 384 pocillos, y detectada en el CCD. El sistema incluye software para la ejecución del instrumento y para analizar los datos.

Análisis y resultados

Se analizó tejido tumoral de187 genes relacionados con cáncer y 5 genes de referencia. Se obtuvieron perfiles adecuados de RT-PCR de 242 de las 252 pacientes. Los valores de ciclo umbral (CT) de cada paciente se normalizaron en base a la media de los 7 genes de referencia para esa paciente particular. Se disponía de los datos del resultado clínico de todas las pacientes, de una revisión de los datos de registro y gráficos de las pacientes seleccionadas. Los resultados fueron clasificados como:

Evento: Viva con recurrencia local, regional o distante de cáncer de mama, o fallecimiento por cáncer de mama. Sin evento: Viva sin recurrencia local, regional o distante de cáncer de mama, o viva con recurrencia de cáncer de mama contralateral, o viva con segundo cáncer primario no de mama, o fallecida antes de la recurrencia del cáncer de mama.

El análisis se realizó por:

A. Determinación de la relación entre la expresión génica normalizada y los resultados binarios de 0 o 1;

B. Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el resultado (0 o 1 como se define más arriba), donde se descartaban las pacientes vivas sin recurrencia de cáncer de mama, o que habían fallecido debido a una causa distinta del cáncer de mama. Se utilizó este enfoque para evaluar el impacto en el pronóstico de genes individuales y también de series de genes múltiples.

Análisis de las pacientes con carcinoma de mama invasivo por enfoque binario

En el primer enfoque (binario), se realizó el análisis en las 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó un test t en los grupos de pacientes clasificadas como sin recurrencia y fallecimiento no relacionado con cáncer de mama a los 10 años, versus recurrencia o muerte relacionada con cáncer de mama a los 10 años, y se calcularon los valores p para las diferencias entre grupos para cada gen.

En la Tabla 1 aparecen los 33 genes para los que el valor p para las diferencias entre los grupos era <0,05. La primera columna de valores de expresión medios corresponde a pacientes que presentaron recurrencia metastásica o fallecieron por cáncer de mama. La segunda columna de valores de expresión medios corresponde a pacientes que no tenían recurrencia metastásica o no fallecieron por cáncer de mama.

Tabla 1

Media grupo A Media grupo B

Gen Evento Sin evento Estadística T Valor p

MMP9 -3,15 -4,27 3,75 0,00

GSTM1 -5,02 -4,03 -3,56 0,00

MELK -3,89 -4,66 3,34 0,00

PR -4,56 -3,18 -3,27 0,00

DKFZp586M07 -3,83 -2,94 -3,09 0,00

GSTM3 -2,56 -1,69 -3,06 0,00

MCM2 -3,51 -4,08 3,03 0,00

CDC20 -3,01 -3,75 3,01 0,00

CCNB1 -4,48 -5,17 3,02 0,00

STMY3 -0,58 -1,20 2,95 0,00

GRB7 -1,93 -3,01 2,98 0,00

MYBL2 -3,91 -4,78 2,91 0,01

CEGP1 -3,00 -1,85 -2,89 0,01

SURV -4,23 -5,06 2,88 0,01

LMNB1 -2,40 -2,91 2,81 0,01

CTSL2 -5,74 -6,39 2,83 0,01

PTTG1 -3,49 -4,14 2,72 0,01

BAG1 -1,76 -1,30 -2,58 0,01

KNSL2 -3,35 -4,06 2,60 0,01

CIAP1 -4,44 -4,02 -2,58 0,01

PREP -3,34 -3,74 2,56 0,01

NEK2 -5,25 -5,80 2,53 0,01

EpCAM -1,95 -2,31 2,50 0,01

PCNA -2,79 -3,13 2,42 0,02

C20_orf1 -2,43 -3,09 2,39 0,02

ITGA7 -4,53 -3,87 -2,37 0,02

ID1 -2,58 -2,17 -2,30 0,02

B_Catenina -1,32 -1,08 -2,28 0,03

EstR1 -0,78 -0,12 -2,28 0,03

CDH1 -2,76 -3,27 2,20 0,03

TS -2,86 -3,29 2,18 0,03

HER2 0,53 -0,22 2,18 0,03

cMYC -3,22 -2,85 -2,16 0,04

En la T abla 1 anterior, los valores t negativos indican una mayor expresión, asociada a mejores resultados, y a la inversa, valores superiores (positivos) de t indican una mayor expresión asociada a peores resultados. Así, por ejemplo, una expresión elevada del gen CCNB1 (valor t = 3,02, CT media viva <CT media fallecida) indica una menor probabilidad de supervivencia libre de enfermedad. De forma similar, una expresión elevada del gen GSTM1 (valor t = -3,56, CT media viva >CT media fallecida) indica una mayor probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

Así, en base a la serie de datos indicada en la T abla 1, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica una menor probabilidad de supervivencia sin recurrencia del cáncer: C20_orf1; CCNB1; CDC20; CDH1; CTSL2; EpCAM; GRB7; HER2; KNSL2; LMNB1; MCM2; MMP9; MYBL2; NEK2; PCNA; PREP; PTTG1; STMY3; SURV; TS; MELK.

En base a la serie de datos indicada en la Tabla 1, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica un mejor pronóstico de supervivencia sin recurrencia del cáncer: BAG1; BCatenin; CEGP1; CIAP1; cMYC; DKFZp586M07; EstR1; GSTM1; GSTM3; ID1; ITGA7; PR.

Análisis de genes múltiples e indicadores de resultados

Se adoptaron dos enfoques para determinar si el uso de genes múltiples proporcionaría una mejor discriminación entre resultados. Primero se realizó un análisis de discriminación utilizando un enfoque de avance progresivo Se generaron modelos que clasificaron el resultado con mayor discriminación de la obtenida con cualquier gen individual solo. Según un segundo enfoque (enfoque de tiempo-hasta-el evento), se definió para cada gen un modelo Cox Proportiona1Hazards (ver, p.ej., Cox, D. R., and Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, London, New York), con el tiempo hasta la recurrencia o la muerte como variable dependiente, y el nivel de expresión del gen como variable independiente. Se identificaron los genes con un valor p < 0,05 en el modelo Cox. Para cada gen, el modelo Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recurrencia o muerte para el cambio de una unidad en la expresión del gen. Se puede optar por dividir las pacientes en subgrupos por cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala CT), donde todas las pacientes con valores de expresión superiores al umbral tienen un riesgo superior, y todas las pacientes con valores de expresión inferiores al umbral tienen menor riesgo, o al revés, dependiendo de si el gen es un indicador de mal (RR> 1,01) o buen (RR<1,01) pronóstico. Así, cualquier valor umbral definirá los subgrupos de pacientes con riesgo aumentado o disminuido respectivamente. Los resultados se resumen en la Tabla 2 , que muestra los 42 genes para los que el valor p para las diferencias entre los grupos era <0,05.

Tabla 2

Gen Riesgo Relativo valor p

GRB7 1,52 0,000011

SURV 1,57 0,000090

PR 0,74 0,000129

LMNB1 1,92 0,000227

MYBL2 1,46 0,000264

HER2 1,46 0,000505

GSTM1 0,68 0,000543

MELK 1,59 0,000684

C20_orf1 1,59 0,000735

PTTG1 1,63 0,001135

BUB1 1,58 0,001425

CDC20 1,54 0,001443

CCNB1 1,60 0,001975

STMY3 1,47 0,002337

KNSL2 1,48 0,002910

CTSL2 1,43 0,003877

MCM2 1,59 0,005203

NEK2 1,48 0,006533

DR5 0,62 0,006660

Ki_67 1,46 0,008188

CCNE2 1,38 0,009505

TOP2A 1,38 0,009551

PCNA 1,67 0,010237

PREP 1,69 0,012308

FOXM1 1,52 0,012837

NME1 1,46 0,013622

CEGP1 0,84 0,013754

BAG1 0,68 0,015422

STK15 1,46 0,017013

(continuación)

Gen Riesgo Relativo valor p

HNRPAB 1,96 0,017942

EstR1 0,80 0,018877

MMP9 1,19 0,019591

DKFZp586M07 0,79 0,020073

TS 1,44 0,025186

Src 1,70 0,037398

BIN1 0,75 0,038979

NPD009 0,80 0,039020

RPLPO 0,52 0,041575

GSTM3 0,84 0,041848

MMP12 1,27 0,042074

TFRC 1,57 0,046145

IGF1R 0,78 0,046745

En base a la serie de datos indicada en la Tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica una menor probabilidad de supervivencia sin recurrencia del cáncer: GRB7; SURV; LMNB1; MYBL2; HER2; MELK; C20_orf1; PTTG1; BUB1; CDC20; CCNB1; STMY3; KNSL2; CTSL2; MCM2; NEK2; Ki_67; CCNE2; TOP2A-4; PCNA; PREP; FOXM1; NME1; STK15; HNRPAB; MMP9; TS; Src; MMP12; TFRC.

En base a la serie de datos indicada en la Tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica un mejor pronóstico de supervivencia sin recurrencia del cáncer: PR; GSTM1; DR5; CEGP1; BAG1; EstR1; DKFZp586M07; BIN1; NPD009; RPLPO; GSTM3; IGF1R.

El análisis binario y de tiempo-hasta-el evento, con contadas excepciones, identificaron los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las Tablas 1 y 2 muestra que 10 genes estaban representados en los 15 genes superiores en ambas listas. Además, cuando ambos análisis identificaron el mismo gen a [p<0,10], lo que ocurrió para 26 genes, fueron siempre concordantes con respecto a la dirección (signo positivo o negativo) de la correlación con la supervivencia/recurrencia. Globalmente, estos resultados confirman la conclusión de que los marcadores identificados tienen un valor de pronóstico significativo.

Análisis génico multivariado de 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo

En los modelos Cox comprendiendo más de dos genes (modelos multivariados), se procede a la entrada gradual de cada gen individual en el modelo, donde el primer gen entrado se preselecciona entre los genes con valores p univariados significativos, y el gen seleccionado para la entrada en el modelo en cada paso posterior es el gen que mejora más el encaje del modelo con los datos. Este análisis puede ser realizado con cualquier número total de genes. En el análisis cuyos resultados se muestran más abajo, se llevó a cabo la entrada progresiva de hasta 10 genes.

Se realizó el análisis multivariado utilizando la siguiente ecuación:

Se realizó el análisis multivariado utilizando la siguiente ecuación:

R=exp[coef(genA) x Ct(genA) coef(genB) x Ct(genB) coef(genC) x Ct(genC) .........

En esta ecuación, los coeficientes para genes que son predictores de resultado beneficioso son números positivos, y los coeficientes para genes que son predictores de resultado desfavorable son números negativos. Los valores "Ct" de la ecuación son ^A Cts, es decir, reflejan la diferencia entre el valor Ct normalizado de una población, y el valor Ct normalizado medido para la paciente en cuestión. La convención utilizada en el presente análisis ha sido que ^A Cts por debajo y por encima de la media de la población tienen signos positivos y signos negativos, respectivamente (reflejando una mayor o menor abundancia de ARNm). El riesgo relativo (RR) calculado resolviendo esta ecuación indicará si la paciente tiene una probabilidad aumentada o reducida de supervivencia a largo plazo sin recurrencia del cáncer.

Se llevó a cabo un análisis gradual multivariado, utilizando el Cox Proportiona1Hazards Model, de los datos de expresión génica obtenidos de las 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. En este análisis se ha determinado que la siguiente serie de diez genes tiene un valor predictivo particularmente sólido de la supervivencia de las pacientes: GRB7; LMNB1; ER; STMY3; KLK10; PR; KRT5; FGFR1; MCM6; SNRPF. En esta serie de genes, ER, PR, KRT5 y MCM6 contribuyen a un buen pronóstico, mientras que GRB7, LMNB1, STMY3, KLK10, FGFR1 y SNRPF contribuyen a un mal pronóstico.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a lo que se considera que son realizaciones específicas, hay que entender que la invención no se limita a tales realizaciones. Por el contrario, se pretende que la invención cubra diversas modificaciones incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ċ

TABLA 3

TABLA 4

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de una paciente con cáncer de mama con nódulo negativo, ER positivo, invasivo ductal, comprendiendo la determinación del nivel de expresión de la transcripción de ARN de MELK en una célula o una muestra de tejido de cáncer de mama, obtenido de la paciente, normalizado contra el nivel de expresión de una serie de referencia de transcripciones de ARN, comparando el nivel de expresión normalizado de MELK de la paciente, con un nivel de expresión normalizado de MELK en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama, comprendiendo pacientes que estaban (a) vivas sin recurrencia de cáncer de mama local, regional o distante, (b) vivas con recurrencia contralateral de cáncer de mama, (c) vivas con segundo cáncer primario no de mama, o (d) fallecieron antes de la recurrencia del cáncer de mama, donde un nivel aumentado de expresión normalizado de MELK en la paciente indica una menor probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde dicho ARN comprende ARN intrónico.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, donde dicho ARN es aislado de una muestra de tejido de cáncer de mama embebido en cera y fijado, de dicha paciente.

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 1,2 o 3, donde dicho ARN es aislado de tejido de biopsia de aguja gruesa.

5. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, donde dicho ARN es aislado de células de aspirado de aguja fina.

6. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, donde el nivel de expresión de dicha transcripción de ARN se determina utilizando un array que comprende un polinucleótido hibridando en el gen inmovilizado sobre una superficie sólida.

7. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, donde el nivel de expresión de dicha transcripción de ARN se determina por reacción de la cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).

8. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, donde el ARN está fragmentado.