DE3718621C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE3718621C2 DE3718621C2 DE3718621A DE3718621A DE3718621C2 DE 3718621 C2 DE3718621 C2 DE 3718621C2 DE 3718621 A DE3718621 A DE 3718621A DE 3718621 A DE3718621 A DE 3718621A DE 3718621 C2 DE3718621 C2 DE 3718621C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antibodies
- class
- antigen
- bound
- zone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54391—Immunochromatographic test strips based on vertical flow
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/819—Multifunctional antigen or antibody
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/828—Protein A
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Antigens
in einer Prüfprobe.
Die Immunanalyse bzw. Immunitätsanalyse (nachfolgend
als Immunanalyse bezeichnet) mit gekennzeichneten
Enzymen unter Verwendung von Antikörpern, die mit
unterschiedlichen Bereichen auf dem gleichen Antigen
reagieren, wurde in der wissenschaftlichen Literatur
beschrieben. Im allgemeinen werden alle diese "Doppel
stellen"-Immunanalysen wie folgt durchgeführt:
Ein Teil des Antikörperpaares wird auf einem festen Träger, wie die Wand eines Plastikrohres oder die Oberfläche eines Plastikstabes befestigt. Der zweite Antikörper wird mit einem Enzymkennzeichen konjugiert bzw. zusammengesetzt (nachfolgend als konjugiert be zeichnet). Die Antigen-haltige Probe und das zweite Antikörper-Konjugat bzw. Antikörperpaar (nachfolgend als Konjugat bezeichnet) werden zusammen mit den ersten an den festen Träger gebundenen Antikörpern vermischt. In Gegenwart des Antigens wird der konjugierte Antikörper über den entgegengesetzten Teil des Antikörperpaares an den festen Träger verbunden.
Ein Teil des Antikörperpaares wird auf einem festen Träger, wie die Wand eines Plastikrohres oder die Oberfläche eines Plastikstabes befestigt. Der zweite Antikörper wird mit einem Enzymkennzeichen konjugiert bzw. zusammengesetzt (nachfolgend als konjugiert be zeichnet). Die Antigen-haltige Probe und das zweite Antikörper-Konjugat bzw. Antikörperpaar (nachfolgend als Konjugat bezeichnet) werden zusammen mit den ersten an den festen Träger gebundenen Antikörpern vermischt. In Gegenwart des Antigens wird der konjugierte Antikörper über den entgegengesetzten Teil des Antikörperpaares an den festen Träger verbunden.
Der feste Träger wird dann gründlich gewaschen, um
jegliches ungebundene Konjugat zu entfernen. Abschließend
wird der feste Träger mit einem farbbildenden Enzym
substrat inkubiert. Die Farbreaktion kann danach
sichtbar oder mit einem Instrument abgelesen werden,
um das Vorhandensein und die Menge des Antigens anzu
zeigen. Solche Doppelstellen-Immunanalysen können
spezifisch und schnell sein, erfordern jedoch eine
Vielzahl von Schritten des Waschens und der Farb
bildungs-Inkubation.
Im Gegensatz dazu ist die vorliegende Erfindung eine Doppelstellen-
Immunanalyse, die keinen Wasch- oder getrennten Farb
reaktionsschritt aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein
Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Prüf
probe wie es im Anspruch 1 angegeben ist. Bevorzugte
Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens erge
ben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 6.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird demnach
die Antigen-haltige Probe mit den beiden Anti
körperreagenzien vermischt und diese Mischung wird
auf die Oberfläche eines Doppelschicht-Prüfgerätes
angewendet. Die Bodenschicht enthält das farbbildende
Substrat. In Gegenwart des Antigens wird das Konjugat
zur Bodenschicht befördert und erzeugt die Farbreaktion.
In Abwesenheit dieses Antigens wird das gesamte Kon
jugat in der festen Phase der oberen Auffangschicht
aufgefangen und erreicht die untere farbbildende
Schicht nicht. Das Prinzp der Erfindung ist genau
das Gegenteil der früheren Doppelstellen-Immunanaly
sen, da das Konjugat, das das Antigen nicht bindet,
auf der festen Phase aufgefangen wird. Das Konjugat,
das sich an das Antigen bindet, spült durch die
Zone der festen Phase zur farbbildenden Schicht.
Die Probe wird somit mit den beiden Klassen der Antikörper
in Kontakt gebracht, die für das zu prüfende Anti
gen spezifisch sind, worin jede Klasse der Antikörper
jedoch mit einem unterschiedlichen Bereich im Anti
gen reagiert, um einen Komplex zu erzeugen, der in
der Lage ist, durch die Auffangschicht zu strömen,
um in der Substratschicht eine Reakion hervorzu
rufen, die das Vorhandensein des zu prüfenden Anti
gens anzeigt.
Die Zeichnungen zeigen
Fig. 1 eine Darstellung der verwendeten Vor
richtung A,
Fig. 2 eine Darstellung des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung
A aus Fig. 1,
Fig. 3 eine Darstellung des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung
A aus Fig. 1, die die erhaltenen Ergeb
nisse zeigt, wenn das Prüffluid ohne Antigen
ist.
Fig. 4 zeigt das Auffangen des freien Enzym-Anti
körper-Konjugats unter Verwendung eines
Molekularsiebmaterials als Auffangschicht.
Fig. 5 zeigt das Auffangen des freien Enzym-Anti
körper-Konjugats unter Verwendung von
Nitrozellulose Protein A als Auffang
schicht.
Fig. 6 zeigt das Auffangen des freien Enzym-
Antikörper-Konjugats unter Verwendung
eines kationischen Austauscherharzes
als Auffangschicht.
Fig. 1 ist eine zeichnerische Darstellung der
Vorrichtung A. Sie umfaßt zwei unterschied
liche Schichten, nämlich eine Auffangzone 18
und eine Substratzone 20. Antikörper 10 der Klasse
1 und Antikörper 12 der Klasse 2 sind in enger Nach
barschaft zur Vorrichtung A angeordnet. Die Anti
körper 10 der Klasse 1 sind an die Oberfläche von
Transportpartikeln 14 fixiert und die Antikörper
12 der Klasse 2 sind an Enzyme 16 konjugiert.
Die Auffangzone 18 ist aus einem porösen Material
gestaltet, das die Antikörper 12 der Klasse 2 ab
fängt, die mit dem Enzym 16 konjugiert sind, je
doch die Transportpartikel 14 nicht abfängt, die
an die Antikörper 10 der Klasse 1 gebunden sind.
Ähnlich ist die Substratzone 20 aus einem porösen
Material gefertigt und enthält ein gebundenes farb
bildendes Reagenz 22, und zwar ein Material, das mit
dem Enzym 16 reagiert, das mit den Antikörpern
12 der Klasse 2 konjugiert ist, um eine Farbe zu
erzeugen. Die Vorrichtung A ist auf einem Träger
teil 24 gezeigt.
Fig. 2 ist eine Darstellung des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung A aus
Fig. 1. Ein Fluid, im allgemeinen durch die Bezugs
ziffer 26 gekennzeichnet, das das freie Antigen 28
enthält, wird mit den Antikörpern 10 der Klasse 1,
die an die Transportartikel 14 verbunden sind und
den Antikörpern 12 der Klasse 2 vermischt, die mit
dem Enzym 16 konjugiert sind. Die Antikörper 10 der
Klasse 1, die an die Transportartikel 14 verbunden
sind, verbinden sich mit spezifischen Erkennungs
stellen auf den Antigenen 28. Ähnlich verbinden sich
die Antikörper 12 der Klasse 2, die mit dem Enzym
16 konjugiert sind, mit alternativen spezifischen
Rezeptorstellen auf den Antigenen 28, die an die
Antikörper 10 der Klasse 1 angefügt sind, die wiederum
an die Transportartikel 14 verbunden sind, um dadurch
resultierende Komplexe 32 zu bilden. Sowie das Fluid
durch die Auffangzone 18 diffundiert, werden alle
Antikörper 12 der Klasse 2, die mit dem Enzym 16
konjugiert sind, die keine resultierenden Komplexe
32 gebildet haben, in der Auffangzone 18 abgefangen,
während alle Antikörper 12 der Klasse 2, die mit dem
Enzym 16 konjugiert sind, die resultierende Komplexe
32 gebildet haben, durch die Auffangzone 18 in die
Substratzone 22 strömen, wo das konjugierte Enzym
16 mit dem farbbildenden Reagenz 22 reagiert, um
eine Unterscheidungsfarbe zu erzeugen, die das Vor
handensein des Antigens 28 im angewendeten Fluid 26
aufzeigt.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung des erfindungs
gemäßen Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung A
aus Fig. 1, die die erhaltenen Ergebnisse zeigt, wenn
das Prüffluid 26 ohne Antigen 28 ist. Ein Fluid, all
gemein mit 26 gekennzeichnet, wird auf die Oberfläche
30 der Auffangzone 18 angewendet. Sowie das Fluid
durch die Auffangzone 18 diffundiert, werden alle
Antikörper 12 der Klasse 2, die mit dem Enzym 16 kon
jugiert sind, durch die Auffangzone 18 abgefangen.
Folglich erreichen keine mit Enzym verbundenen Anti
körper das farbbildende Reagenz 22 in der Substrat
zone 20, und es wird keine Substratveränderung be
obachtet, wodurch die Abwesenheit des Antigens 28
im Prüffluid 32 angezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung der
folgenden Elemente:
Antikörper der Klasse 1 und Klasse 2, die verschie dene Stellen auf dem selben Antigen erkennen,
ein Transportpartikel auf dem Antikörper der Klasse 1 fixiert wird,
Enzyme, die mit den Antikörpern der Klasse 2 konju giert werden und eine Immunanalysevorrichtung, die aus einer Auffangzone, die die Antikörper der Klasse 2, jedoch nicht die Antikörper der Klasse 1 bindet und einer Susbstratzone besteht, die mit dem Enzym reagiert, das mit den Antikörpern der Klasse 2 kon jugiert ist, um eine Unterscheidungsfarbe zu erzeugen (siehe Fig. 1).
Antikörper der Klasse 1 und Klasse 2, die verschie dene Stellen auf dem selben Antigen erkennen,
ein Transportpartikel auf dem Antikörper der Klasse 1 fixiert wird,
Enzyme, die mit den Antikörpern der Klasse 2 konju giert werden und eine Immunanalysevorrichtung, die aus einer Auffangzone, die die Antikörper der Klasse 2, jedoch nicht die Antikörper der Klasse 1 bindet und einer Susbstratzone besteht, die mit dem Enzym reagiert, das mit den Antikörpern der Klasse 2 kon jugiert ist, um eine Unterscheidungsfarbe zu erzeugen (siehe Fig. 1).
Die Antikörper bestehen aus den Antikörpern der
Klasse 1, die an das Transportpartikel angefügt sind
und Antikörpern der Klasse 2, die mit einem Kenn
zeichen, wie einem Enzym konjugiert sind. Während
beide Antikörperklassen für das gleiche Antigen
spezifisch sind, werden durch jede Antikörperklasse
unterschiedliche Epitope oder Bindungsstellen er
kannt. Folglich kann sich jede Antikörperklasse an das
selbe Antigen verbinden, was die Verwendung der
Doppelstellen-Immunanalyse möglich macht.
Das Grundkonzept der vorliegenden Erfindung beruht
auf dem Wechselverhältnis der Transportpartikel, der
Antikörper der beiden Klassen und der Immunanalyse
vorrichtung, die aus geschichteten Auffang- und
Substratzonen besteht. Die Auffangzone ist für das
freie Antikörper-Konjugat, das aus den Antikörpern
der Klasse 2 besteht, äußerst spezifisch, wohin
gegen das Transportpartikel zwischen den beiden
Schichten frei hindurch geht. Die Substratzone
bewirkt in Gegenwart des Enzyms die Farbbildungs
reaktion.
Wenn diese beiden Antikörperklassen mit einer Antigen-
freien Probe vermischt werden und diese Mischung mit
den geschichteten Auffang- und Substratzonen in
Kontakt gebracht wird, wird keine Farbveränderung
beobachtet (siehe Fig. 3). Als Ergebnis der Abwe
senheit des Antigens kann keine Doppelstellen-
Erkennung auftreten und das gesamte indizierbare
freie Konjugat des Antikörpers der Klasse 2 wird
durch die Auffangzone abgefangen. Folglich findet
keine Reaktion von Enzym und Substrat statt und
keine Farbveränderung wird beobachtet.
In Gegenwart einer Antigen-haltigen Probe wird das
Konjugat der Antikörper der Klasse 2 jedoch durch das
Antigen an das Transportpartikel verbunden (siehe
Fig. 2). Als Ergebnis der Doppelstellen-Erkennung
kann das Konjugat Antikörper-Enzym nicht in der Auf
fangzone abgefangen werden, da das Transportpartikel
das Konjugat davor schützt, durch die Auffangschicht
abgefangen zu werden. Folglich trägt das Transport
partikel dieses Konjugat nur dann zur farbbildenden
Schicht, wenn das Antigen vorhanden ist.
Erfindungsgemäß werden Antikörper zweier Klassen
verwendet, die für das zu prüfende Antigen
spezifisch sind. Jede Klasse der Antikörper ist
jedoch für verschiedene Erkennungsstellen oder
Epitope auf dem zu prüfenden Antigen spezifisch,
so daß keine Querreaktivität oder Überlappung auf
treten kann. Darüber hinaus können beide Antikörper
klassen, die für das zu prüfende Antigen spezi
fisch sind, in der Auffangzone der Vorrichtung
gefunden werden, wodurch die Notwendigkeit irgend
einer Vermischung vor der Anwendung beseitigt wird.
Die Auffangschicht der verwendeten Vorrichtung
kann ein in der Technik allgemein bekanntes Mole
kularsiebmaterial sein, das das Konjugat mit geringem
Molekulargewicht abfängt, jedoch die Transportpartikel
nicht.
Der Auffangmechanismus kann auf den folgenden Kri
terien beruhen, jedoch nicht darauf begrenzt sein:
Größe, und zwar durch die Verwendung von Molekular siebpartikel, die kleine Durchlässe bzw. Spalten enthalten, die nur die kleinen Konjugate von Anti körper-Enzym auffangen und die Transportpartikel komplexe nicht, die zu groß sind, um die Spalten des Molekularsiebmaterials zu betreten,
Ladung, und zwar verbindet sich das Konjugat Anti körper-Enzym an entgegengesetzt geladene Gruppen, die in der Auffangzone gefunden werden, an die sich das Transportpartikel nicht bindet, da dessen Durchschnittsladung von der des Materials ver schieden ist, das in der Auffangzone oder der Prüf lösung gefunden wurde und da die Masse des Transport partikels viel größer als die der anderen Proteine ist, und
durch die den Proteinen eigene natürliche Affinität gegenüber ihren Bindungsstellen, und zwar wird Pro tein A nur den Fc-Anteil der Antikörper binden;
wenn die Fc-Anteile der Antikörper an die Oberfläche der Transportpartikel gebunden werden, wird es folg lich für das Protein A physikalisch unmöglich, an diese Antikörper gebunden zu werden, folglich kann der Transportpartikelkomplex durch die Auffangzone strömen, wohingegen die freiströmenden Antikörper abgefangen werden.
Größe, und zwar durch die Verwendung von Molekular siebpartikel, die kleine Durchlässe bzw. Spalten enthalten, die nur die kleinen Konjugate von Anti körper-Enzym auffangen und die Transportpartikel komplexe nicht, die zu groß sind, um die Spalten des Molekularsiebmaterials zu betreten,
Ladung, und zwar verbindet sich das Konjugat Anti körper-Enzym an entgegengesetzt geladene Gruppen, die in der Auffangzone gefunden werden, an die sich das Transportpartikel nicht bindet, da dessen Durchschnittsladung von der des Materials ver schieden ist, das in der Auffangzone oder der Prüf lösung gefunden wurde und da die Masse des Transport partikels viel größer als die der anderen Proteine ist, und
durch die den Proteinen eigene natürliche Affinität gegenüber ihren Bindungsstellen, und zwar wird Pro tein A nur den Fc-Anteil der Antikörper binden;
wenn die Fc-Anteile der Antikörper an die Oberfläche der Transportpartikel gebunden werden, wird es folg lich für das Protein A physikalisch unmöglich, an diese Antikörper gebunden zu werden, folglich kann der Transportpartikelkomplex durch die Auffangzone strömen, wohingegen die freiströmenden Antikörper abgefangen werden.
Beispiele eines geeigneten Materials für die feste
Phase für den Aufbau der Auffangzone umfassen Harz
und faserartige Materialien, Agarose Gele und jedes
andere Material, das ausreichende Volumina der
Zwischenräume enthält, um die freiströmenden Anti
körper, jedoch nicht die Transportpartikel abzu
fangen.
Geeignete Substrate oder farbbildende Reagenzien,
die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ver
wendet werden, sind in der Technik ebenfalls bekannt. In diesem
Zusammenhang kann ebenfalls eine Anzahl unter
schiedlicher Art gereinigter Enzyme verwendet werden,
die direkt oder indirekt mit dem im Substrat gefun
denen farbbildenden Mittel wirken. Ein Beispiel
eines solchen Enzyms und seines korrespondierenden
Substrats ist Meerrettich-Peroxidase und p-Nitro
phenylphosphat. Die Antikörper können ebenfalls mit
radioaktiven oder fluoreszenten Markierungsstoffen
gekennzeichnet werden. Die physikalische Bindung
des Konjugats an das Transportpartikel
kann dieses vor der Bindung an das Protein A
schützen, das auf der Oberfläche der Auf
fangschicht fixiert ist. Andere alternative Maß
nahmen wie die Bildung eines Biotin-Avidin-Komplexes
können ebenfalls verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die
Verwendung dieses Enzyms und seines korrespondierenden
Substrat begrenzt.
Andere aus der Technik allgemein bekannte Enzym-
Substrat-Kombinationen können ebenfalls verwendet
werden.
Das Transportpartikel kann ebenfalls auf einer Viel
zahl von Wegen hergestellt werden. Zum Beispiel
kann das Transportpartikel eine Koloidsubstanz mit
hohem Molekulargewicht wie Dextran, feste Partikel,
die aus Plastik, Glas, Harz oder Metallmaterialien
zusammengesetzt sind oder ein Polymer mit hohem
Molekulargewicht sein. Zusätzlich kann das Transport
partikel ebenfalls eine anionische Gesamtladung der
Oberfläche ausdrücken, die das Konjugat davor schützt,
durch eine kationische Ladung auf der Auffangschicht
abgefangen zu werden.
Zur Bestimmung der Verwendbarkeit der vorliegenden Er
findung zur prägnanten Kennzeichnung durch das Auf
zeigen eines Chloriongonadotropin (HCG)-Antigens.
A. Antigen:
Chloriongonadotropin (HCG) von einer positiven Urinkontrolle Pregnospia Kit 150 mI.E./ml.
B. Antikörper:
Chloriongonadotropin (HCG) von einer positiven Urinkontrolle Pregnospia Kit 150 mI.E./ml.
B. Antikörper:
- (i) Antikörper der Klasse 1, die an Transportpartikel verbunden waren; Monoklonale Maus-Antikörper gegenüber HCG (zugeführte Lotio: Lypholisierte Lot 4284148) an koloidale Pregnospia- Goldpartikel gebunden.
- (ii) Antikörper der Klasse 2, mit Enzym kon jugiert: Anti HCG Miles Yeda Inc. (lotio 1064 Beta Untereinheit, spezifische Quelle von PC-2 ascites klon).
Peroxidase-Konzentration: 0,53 mg/ml
Immunglobulin G der Maus 1,01 mg/ml
Affinität 5,3 × 1010 Liter/Mol
C. Auffangzonen
Immunglobulin G der Maus 1,01 mg/ml
Affinität 5,3 × 1010 Liter/Mol
C. Auffangzonen
- A. Vorgequollenes Sephadex G-100 M in eine konische Kammer mit 0,4 cm Oberseite, 0,4 cm Höhe, 0,1 cm Bodenseite, 75 µl Volumen gepackt,
- B. Nitrozellulose Porengröße 5 µm, Millipore, 4 Schichten in einer Immunschachtschablone (immunowell template) gestapelt, mit Protein A über zogen (S. aureus, Cowan Strain, Vector Labs) 10 mg/ml mit Benzolsulfonsäure (BSA) blockiert,
- C. Kationisches Harz (Beckman FPLC Mono C) herge stellt wie unter A. oben.
- D. Farbbildendes Enzymsubstrat: Glukose-Oxidase 2,0 mg/ml + Tetramethylbenzidin (TMB) 20,0 mg/ml in wasserfreiem Methanol gelöst, auf Whatman-Papier Nr. 5 luftgetrocknet.
Schritt 1:
Antikörper der Klasse 1, die aus mono klonalen Antikörpern gegenüber einer spezifischen Rezeptorstelle auf dem HCG- Antigen bestehen, werden an Transport partikel angefügt, die aus koloidalen Preg nospia-Goldpartikel bestehen.
Antikörper der Klasse 2, die aus mono klonalen Antikörpern Beta einer spezi fischen Untereinheit bestehen, die einen anderen Bereich auf dem HCG-Antigen erkennen, als die Antikörper der Klasse 1, die an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert sind.
Schritt 2:
Herstellung verschiedener Immunanalysegeräte. Drei Arten der Immunanalyse wurden angewen det (von dem Typ, der vorher unter dem Thema "Auffangzonen" beschrieben wurde). Jedes verwendete einen verschiedenen Typ der Auffangzone, der nach in der Technik bekannten Verfahren auf die Oberseite der Substrat schicht angeordnet wurde.
Schritt 3:
Die Prüflösung wird mit den beiden Klassen der Antikörper vermischt. Diese Mischung wird danach mit der Oberflächenschicht der verschiedenen Immunanalysegeräte in Kon takt gebracht.
Antikörper der Klasse 1, die aus mono klonalen Antikörpern gegenüber einer spezifischen Rezeptorstelle auf dem HCG- Antigen bestehen, werden an Transport partikel angefügt, die aus koloidalen Preg nospia-Goldpartikel bestehen.
Antikörper der Klasse 2, die aus mono klonalen Antikörpern Beta einer spezi fischen Untereinheit bestehen, die einen anderen Bereich auf dem HCG-Antigen erkennen, als die Antikörper der Klasse 1, die an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert sind.
Schritt 2:
Herstellung verschiedener Immunanalysegeräte. Drei Arten der Immunanalyse wurden angewen det (von dem Typ, der vorher unter dem Thema "Auffangzonen" beschrieben wurde). Jedes verwendete einen verschiedenen Typ der Auffangzone, der nach in der Technik bekannten Verfahren auf die Oberseite der Substrat schicht angeordnet wurde.
Schritt 3:
Die Prüflösung wird mit den beiden Klassen der Antikörper vermischt. Diese Mischung wird danach mit der Oberflächenschicht der verschiedenen Immunanalysegeräte in Kon takt gebracht.
Fig. 4 zeigt das Auffangen des freien Konjugats durch
die Molekularsiebzone. Ohne das Antigen wurde für eine
Verdünnung von 1/1000 und ein Volumen von 100 µl keine
merkliche Farbbildung beobachtet. Bei direkter Anwendung
auf die Substratschicht wurde eine Farbdichte von
0,47 du innerhalb von 2 min unzulässig. In Gegen
wart einer Vorinkubation während 2 Minuten mit dem
Antigen wurde eine signifikante Farbreaktion von
0,31 du unzulässig.
Fig. 5 zeigt eine in dem Verfahren verwendete Ausführungsform,
die eine Auffangschicht von Nitrozellulose-Protein A verwendet.
Diese Auffangschicht war mittelmäßig wirksam. Bei
Abwesenheit des Antigens war nur eine Farbe von 0,13
du über dem Hintergrund unzulässig. In Gegenwart
des Antigens betrug das Farbsignal 0,25 du, wodurch
angezeigt wird, daß die Bindung des Konjugats an
das Transportpartikel dieses deutlich davor schützt,
durch das Protein A abgefangen zu werden.
Fig. 6 zeigt die Verwendung eines kationischen Aus
tauscherharzes als Auffangschicht. Diese Ausfüh
rungsform war weniger wirksam als die anderen oben
genannten, sie diente jedoch dazu, das Vorhandensein
oder die Abwesenheit des Antigens zu bestimmen. Bei
Abwesenheit des Antigens wurde bei allen Antikörper-
Verdünnungen eine signifikante Farbe erzeugt. Bei
Anwesenheit des Antigens wurde eine quantitative Farb
erhöhung beobachtet, die anzeigt, daß das Transport
partikel einen gewissen Schutz vor der Bindung an
das Harz liefert.
Aus der vorangegangenen Beschreibung wird deutlich, daß
das erfindungsgemäße Verfahren bei der Bestimmung ziemlich
effektiv ist, ob ein spezifisches Antigen in einer
gegebenen Prüfprobe vorhanden ist.
Claims (6)
1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines
Antigens in einer Prüfprobe, gekenn
zeichnet durch die Schritte:
- (a) Kontakt der Prüfprobe mit einer Mischung von Antikör pern der Klasse 1 und Klasse 2, die beide für das Antigen spezifisch sind, die jedoch verschiedene Bereiche auf dem Antigen erkennen, wobei die Antikörper der Klasse 1 an ein Transportpartikel gebunden sind und die Antikörper der Klasse 2 an ein Enzym gebunden sind, wodurch in Ge genwart des Antigens innerhalb dieser Mischung Komplexe gebildet werden, die Antikörper der Klasse 1, die an ein Transport partikel gebunden sind, das Antigen und Antikörper der Klasse 2, die an ein Enzym gebunden sind, ein schließen.
- (b) Kontakt dieser Mischung mit einer Vorrich tung, die eine Auffangzone und eine Substratzone umfaßt, wobei die Auffangzone ein Material ent hält, das freie Antikörper einschließlich ungebun dener Antikörper der Klasse 2, die mit einem Enzym verbunden sind, jedoch keine Antikörper der Klasse 1, die an das Transportpartikel gebunden sind, einschließlich der Komplexe abfangen kann und worin die Substratzone Material enthält, das mit dem Enzym reagieren kann, um das Vorhandensein der Antikörper der Klasse 2, die an das Enzym gebunden sind anzuzeigen,
- (c) Durchdringen dieser Mischung durch die Auffangzone, worin alle Antikörper, die an die Trans portpartikel gebunden sind, einschließlich der Kom plexe, frei durch die Auffangzone in die Substrat zone strömen, während alle Antikörper, die nicht direkt oder indirekt an die Transportpartikel ge bunden sind, einschließlich der freiströmenden Antikörper der Klasse 2, die an das Enzym gebunden sind, durch die Auffangzone abgefangen werden und
- (d) Beobachten des Vorhandenseins oder der Abwesenheit irgend einer Veränderung in der Substrat zone, um dadurch das Vorhandensein oder die Abwesen heit des zu prüfenden Antigens in dieser Probe zu bestimmen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Veränderung in der Substratzone
zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit
des zu prüfenden Antigens in der Probe durch
Farbveränderung hervorgerufen wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Auffangzone aus
Nitrozellulose besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu bestimmende
Antigen Chloriongonadotropin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß Antikörper der Klasse 1, welche an
ein Transportpartikel gebunden sind, in der Auffangzone
der Vorrichtung anwesend sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die enzym-gebundenen Antikörper der
Klasse 2 in der Auffangzone der Vorrichtung vorhanden
sind.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/871,857 US4837145A (en) | 1986-06-09 | 1986-06-09 | Layered immunoassay using antibodies bound to transport particles to determine the presence of an antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3718621A1 DE3718621A1 (de) | 1987-12-10 |
DE3718621C2 true DE3718621C2 (de) | 1990-06-21 |
Family
ID=25358311
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19873718621 Granted DE3718621A1 (de) | 1986-06-09 | 1987-06-03 | Immunanalyse in schichten zur bestimmung des vorhandenseins eines antigens unter verwendung von antikoerpern, die an transportpartikel gebunden sind |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4837145A (de) |
JP (1) | JPS6340859A (de) |
AU (1) | AU604020B2 (de) |
BE (1) | BE1001736A4 (de) |
CA (1) | CA1293442C (de) |
DE (1) | DE3718621A1 (de) |
DK (1) | DK282987A (de) |
ES (1) | ES2006484A6 (de) |
FR (1) | FR2599845B1 (de) |
GB (1) | GB2191577B (de) |
GR (1) | GR870872B (de) |
IT (1) | IT1205137B (de) |
LU (1) | LU86909A1 (de) |
NL (1) | NL8701324A (de) |
NZ (1) | NZ220560A (de) |
SE (1) | SE463894B (de) |
ZA (1) | ZA873748B (de) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622871A (en) | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
EP1248112A3 (de) * | 1987-04-27 | 2004-08-25 | Inverness Medical Switzerland GmbH | Immunochromatographische Spezifischebindungsassayvorrichtung |
US5073344A (en) * | 1987-07-17 | 1991-12-17 | Porex Technologies Corp. | Diagnostic system employing a unitary substrate to immobilize microspheres |
US5024238A (en) * | 1989-01-10 | 1991-06-18 | Cancer Diagnostics, Inc. | Blood withdrawing apparatus and antigen testing method |
US6352862B1 (en) * | 1989-02-17 | 2002-03-05 | Unilever Patent Holdings B.V. | Analytical test device for imuno assays and methods of using same |
US5877028A (en) | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
US6168956B1 (en) | 1991-05-29 | 2001-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Multiple component chromatographic assay device |
US5998220A (en) | 1991-05-29 | 1999-12-07 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them |
IL102486A (en) * | 1991-10-04 | 1997-11-20 | Orgenics Ltd | Method and apparatus for detection of nucleic acid sequences with a nucleic acid probe |
US5324634A (en) * | 1992-03-31 | 1994-06-28 | The Research Foundation Of State University Of New York | Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer |
US5597532A (en) * | 1994-10-20 | 1997-01-28 | Connolly; James | Apparatus for determining substances contained in a body fluid |
US5874216A (en) * | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
AU740812B2 (en) * | 1996-03-20 | 2001-11-15 | Serex, Inc. | Chromatographic immunoassay device and method utilizing particle valency for quantitation |
US5942407A (en) * | 1996-06-25 | 1999-08-24 | Immunomatrix, Inc. | Light-emitting immunoassay |
US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
US5970782A (en) * | 1997-05-16 | 1999-10-26 | Life Technologies, Inc. | Gradient filtration apparatus |
US20050266499A1 (en) * | 2001-04-25 | 2005-12-01 | Rockeby Biomed Corporation, Ltd. | Method and apparatus for testing for presence or absence of select biological substances |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0073593A1 (de) * | 1981-09-01 | 1983-03-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Grössendiskriminierende heterogene Immunzusammensetzung |
US4446232A (en) * | 1981-10-13 | 1984-05-01 | Liotta Lance A | Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens |
EP0092344A1 (de) * | 1982-04-15 | 1983-10-26 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Testverfahren |
US4459361A (en) * | 1982-06-04 | 1984-07-10 | Angenics, Inc. | Ligand assay with one or two particulate reagents and filter |
WO1984002193A1 (en) * | 1982-12-03 | 1984-06-07 | Du Pont | Chromogenic support immunoassay |
US4459358A (en) * | 1982-12-29 | 1984-07-10 | Polaroid Corporation | Multilayer element for analysis |
GB8305197D0 (en) * | 1983-02-24 | 1983-03-30 | Amersham Int Plc | Assay methods |
GB8331514D0 (en) * | 1983-11-25 | 1984-01-04 | Janssen Pharmaceutica Nv | Visualization method |
DE3342627A1 (de) * | 1983-11-25 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemischer schnelltest |
US4703017C1 (en) * | 1984-02-14 | 2001-12-04 | Becton Dickinson Co | Solid phase assay with visual readout |
JPS6295463A (ja) * | 1985-10-22 | 1987-05-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 生物学的反応生成物の分離方法 |
EP0248892A1 (de) * | 1985-12-10 | 1987-12-16 | Murex Corporation | Immunotestverfahren der an teilchen gebundenen bindungskomponenten |
-
1986
- 1986-06-09 US US06/871,857 patent/US4837145A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-05-25 ZA ZA873748A patent/ZA873748B/xx unknown
- 1987-05-26 CA CA000538005A patent/CA1293442C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-27 AU AU73454/87A patent/AU604020B2/en not_active Ceased
- 1987-05-29 JP JP62134817A patent/JPS6340859A/ja active Pending
- 1987-06-01 GB GB8712777A patent/GB2191577B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-03 DK DK282987A patent/DK282987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-06-03 DE DE19873718621 patent/DE3718621A1/de active Granted
- 1987-06-04 SE SE8702334A patent/SE463894B/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-06-04 GR GR870872A patent/GR870872B/el unknown
- 1987-06-04 NZ NZ220560A patent/NZ220560A/xx unknown
- 1987-06-05 NL NL8701324A patent/NL8701324A/nl not_active Application Discontinuation
- 1987-06-05 BE BE8700633A patent/BE1001736A4/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 LU LU86909A patent/LU86909A1/fr unknown
- 1987-06-08 ES ES8701677A patent/ES2006484A6/es not_active Expired
- 1987-06-09 IT IT20842/87A patent/IT1205137B/it active
- 1987-06-09 FR FR878708007A patent/FR2599845B1/fr not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BE1001736A4 (nl) | 1990-02-20 |
DE3718621A1 (de) | 1987-12-10 |
DK282987D0 (da) | 1987-06-03 |
GB2191577B (en) | 1990-08-01 |
GB8712777D0 (en) | 1987-07-08 |
NL8701324A (nl) | 1988-01-04 |
FR2599845B1 (fr) | 1990-08-24 |
ZA873748B (en) | 1988-01-27 |
DK282987A (da) | 1987-12-10 |
FR2599845A1 (fr) | 1987-12-11 |
CA1293442C (en) | 1991-12-24 |
IT8720842A0 (it) | 1987-06-09 |
SE463894B (sv) | 1991-02-04 |
US4837145A (en) | 1989-06-06 |
SE8702334D0 (sv) | 1987-06-04 |
SE8702334L (sv) | 1987-12-10 |
AU604020B2 (en) | 1990-12-06 |
GR870872B (en) | 1987-10-06 |
IT1205137B (it) | 1989-03-15 |
NZ220560A (en) | 1989-01-06 |
JPS6340859A (ja) | 1988-02-22 |
GB2191577A (en) | 1987-12-16 |
ES2006484A6 (es) | 1989-05-01 |
AU7345487A (en) | 1987-12-10 |
LU86909A1 (fr) | 1987-11-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3718621C2 (de) | ||
DE3237046C2 (de) | ||
DE68923800T2 (de) | Vorrichtung und verfahren zur bestimmung eines analyten in einer flüssigen probe mittels folgereaktionen. | |
DE2436010C2 (de) | ||
DE3852040T2 (de) | Vorrichtung und verfahren zur bestimmung einer komponente einer probe. | |
EP0397113B1 (de) | Verfahren zum Nachweis spezifisch bindefähiger Substanzen in Körperflüssigkeiten | |
DE3887491T2 (de) | Chromatographische Bindungstesteinrichtungen und Verfahren. | |
DE69816339T2 (de) | Chromatographische vorrichtung und verfahren zum nachweis eines analyts in einer vollblutprobe | |
DE3650513T2 (de) | Verzögerter immunologischer Test in fester Phase | |
EP1143248B1 (de) | Verfahren zu Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests | |
DE69121021T2 (de) | Bindungsnachweisverfahren mit Konjugatrückgewinnung | |
DE3687589T2 (de) | Festkoerpersystem zur verwendung in ligand-rezeptoruntersuchungen. | |
DE69128618T3 (de) | Vorrichtung und verfahren zur ausführung von immunoassays | |
DE3879048T2 (de) | Geraet fuer die laterale immunochromatographische bestimmung. | |
EP0290921B1 (de) | Testträger für die Analyse einer Probenflüssigkeit und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE4037724A1 (de) | Vorrichtungen fuer immunoassays und deren materialien | |
DE212008000023U1 (de) | Vorrichtungen zum Detektieren von Analyten | |
DE2951678A1 (de) | Immunologische bestimmung mit hilfe von lectin | |
DE2943648A1 (de) | Kombinierte heterogene spezifische bindungs-untersuchung zur gleichzeitigen bestimmung von einer mehrzahl von verschiedenen liganden in einer einzigen fluessigkeitsprobe | |
DE2751588A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines liganden oder der liganden-bindungskapazitaet in einem fluessigen medium | |
CH627281A5 (de) | ||
DE2633877A1 (de) | Verfahren zur immunpruefung auf antigene in fester phase | |
DE112006003813T5 (de) | Wasserlösliche Konjugate zur elektrochemischen Detektion | |
EP0349988B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
EP0789714B1 (de) | Antikörperklassenspezifisches entstörungsreagenz |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |