DE3879048T2

DE3879048T2 - Geraet fuer die laterale immunochromatographische bestimmung.

Info

Publication number: DE3879048T2
Application number: DE8888113756T
Authority: DE
Inventors: Julian Gordon; Charles Stuart Gredell Pugh
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-08-25
Also published as: JPH01113662A; EP0306772B1; GR3007381T3; ATE86746T1; ES2039533T3; AU619480B2; EP0306772A1; KR890005513A; AU2175388A; CA1336577C; JPH0627738B2; DE3879048D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung spezifischer Bindungstests. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung des chromatographischen Transports zur Bewegung von Reagentien und reaktiven Probekomponenten.
Es wurde gefunden, daß die Verwendung spezifischer Bindungstests bei einer Vielzahl von klinischen und weiteren Anwendungen von großem Nutzen ist. Solche Tests beinhalten die Detektion und Bestimmung einer Analytsubstanz, die ein Element eines spezifischen Bindungspaars darstellt, bestehend aus einem Liganden und einem Rezeptor. Ligand und Rezeptor stehen in sofern in Beziehung, daß der Rezeptor spezifisch an den Liganden bindet, wobei er in der Lage ist, den Liganden von anderen Probebestandteilen mit ähnlichen Charakteristika zu unterscheiden. Spezifische Bindungstests schließen immunologische Tests ein, die Reaktionen beinhalten zwischen Antikörpern und Antigenen, DNA- und RNA-Hybridisierungsreaktionen und weitere spezifische Bindungsreaktionen wie die, die mit einem Hormon und anderen biologischen Rezeptoren ablaufen. Spezifische Bindungstests können gemäß einer Vielzahl von in der Technik gut bekannten Ausführungsformen durchgeführt werden. Solche Tests schließen kompetitive Bindungstests, "direkte" und "indirekte" Sandwichtests, sowie Agglutinationstests ein.
Da die Ergebnisse der spezifischen Bindungsreaktionen im allgemeinen nicht direkt beobachtet werden können, sind zur Markierung eines Elements des spezifischen Bindungspaars verschiedene Techniken vorgeschlagen worden, damit die Bindungsreaktion indirekt beobachtet werden kann. Geeignete Marker schließen radioaktive Marker, Chromophore und Fluorophore ein, deren Anwesenheit mittels Strahlungsdetektoren, Spektrophotometern oder mit bloßem Auge detektiert werden kann. Wenn die Elemente eines spezifischen Bindungspaars mit einem Enzymmarker markiert sind, kann ihre Anwesenheit durch enzymatische Aktivierung eines Reaktionssystems detektiert werden, das ein signalerzeugendes Substrat/eine signalerzeugende Cofaktorgruppe einschließt, worin eine Verbindung, wie ein Farbstoff, aktiviert wird, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.
Vorrichtungen für einen spezifischen Bindungstest sind in der Technik bekannt und umfassen vertikal angeordnete Elemente einschließlich (a) eines porösen Absorptionsmaterials, das an einem Reaktionsort mit einem Element eines spezifischen Bindungspaars wie einem Antikörper oder Antigen gesättigt ist; (b) eines entfernbaren Vorfilters, der über dem Absorptionsmaterial angeordnet ist und (c) eines Blotters, der unter dem Absorptionsmaterial angeordnet ist. Eine Probeflüssigkeit wie Blut, Serum oder eine andere biologische Flüssigkeit wird in die Vorrichtung hineingegeben, in der der Vorfilter teilchenförmige Materialien und andere Verunreinigungen aus der Probe entfernt, die sonst an der Oberseite des spezifischen Bindungsabsorptionsmaterials abgefangen werden würden. Analytsubstanzen innerhalb der Probe werden mittels spezifischer Bindungsreaktionen mit ihren spezifischen Bindungspartnern auf dem Absorptionsmaterial abgefangen. Nichtanalytkomponenten der Probelösung passieren das Absorptionsmaterial und werden von dem Blotter absorbiert. Zur Entfernung von Nichtanalytkomponenten aus dem Absorptionsmaterial können Waschschritte durchgeführt werden. Zusätzliche Reagentien wie Enzymsubstrate, Cofaktoren und Farbstoffvorstufen können zu dem Absorptionsmaterial hinzugegeben werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Analyt am Reaktionsort anzuzeigen. Das Vorfilter muß dann entfernt werden, um das Anwesenheit oder die Abwesenheit von Analyt am Reaktionsort visuell bestimmen zu können. Solche Testvorrichtungen sind schnell und im allgemeinen zuverlässig, leiden jedoch unter Einschränkungen hinsichtlich der Absorptionseffektivität und -empfindlichkeit, weil der größte Teil des Analyten in dem Probematerial eher um den Reaktionsort auf dem Absorptionsmaterial herumfließt, als durch ihn hindurch.
Verschiedene Beschreibungen sind für die vorliegende Anwendung von Interesse. Tom, et al., U.S. Patentschrift Nr.4,366,241 beschreiben eine Immuntestvorrichtung, die eine relativ kleine Testzone einschließlich eines spezifischen Bindungsreagens und eine relativ breite Absorptionszone umfaßt, die mit der genannten Tmmunosorptionszone in der Beziehung steht, daß sie Flüssigkeit aufnimmt. Immuntests zur Bestimmung der Anwesenheit von Analytmaterial werden durchgeführt, indem die Testvorrichtung mit einer Probelösung, einer Lösung, die enzymmarkiertes spezifisches Bindungsmaterial enthält und mit einer Lösung, die ein enzymkatalysiertes Signalsystem enthält, in Kontakt gebracht wird. Die Lösungen wandern durch die Immunosorptionszone in die Flüssigkeitsabsorptionszone. Das Anwesenheit von Analyt in dem Probematerial wird durch eine Enzymaktivierung des Signalsystems angezeigt.
Deutsch, et al., U.S. Patentschriften Nrn. 4,094,647, 4,235,601 und 4,361,537 beschreiben immunologische und andere Typen von spezifischen Bindungstests, bei denen die Reagentien durch einen chromatographischen Lösungsmitteltransport transportiert werden. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt eine radioaktiv markierte kompetitive Bindungstestausrüstung einen Streifen, der zum Transport einer Entwicklungsflüssigkeit durch Kapillarität in der Lage ist und eine erste Zone zur Aufnahme einer Probe, eine zweite Zone, die mit einem ersten Reagens gesättigt ist, das in der Lage ist, durch die Entwicklungsflüssigkeit transportiert zu werden und eine dritte, mit einem zweiten Reagens gesättigte Zone aufweist. Darüberhinaus umfassen die Vorrichtungen eine Meßzone und ein Verzögerungselement, das entweder das zweite Reagens oder das Streifen-Material sein kann. Das erste Reagens ist in der Lage,mit einem Element bestehend aus der Gruppe (1) Probe, (2) Probe und zweites Reagens, und (3) zweites Reagens in Konkurrenz mit der Probe unter Bildung eines Produkts in einer von der zu bestimmenden Eigenschaft abhängigen Menge zu reagieren. Eine Probe wird mit der ersten Zone in Kontakt gebracht. Der Streifen wird dann in die Entwicklungsflüssigkeit eingetaucht, um einen Transport von Probe und erstem Reagens unter Bildung des Reaktionsprodukts zu bewirken. Das Verzögerungselement verlangsamt die Transportgeschwindigkeit entweder des Produkts oder des ersten Reagens (das sich bewegende Reagens), um die beiden räumlich zu trennen. Die Menge des sich bewegenden Elements wird dann am Meßort gemessen.
Weiterhin ist die Beschreibung der veröffentlichten Europäischen Patentschrift EP-A-0262328 für die vorliegende Erfindung interessant, die Vorrichtungen betrifft zur Durchführung spezifischer Bindungstests unter Verwendung eines sequentiellen chromatographischen Transports von Analyt und Reagensmaterialien. Wasch- und Zugabeschritte werden naturgemäß durchgeführt. Eine flüssige "Mikroschaltung" kann programmiert werden, um eine Vielzahl von mehrstufigen Verfahren durchzuführen und das vorzeitige Vermischen von Probematerialien und Reagentien zu verhindern. Insbesondere betrifft die sequentielle Transportanwendung von Gordon, et al., Vorrichtungen, die einen Teststreifen zur Detektion eines Analyten in einer Probe umfassen, der eine Lage chromatographisches Material enthält, das die Fähigkeit eines schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransports nicht immobilisierter Reagentien und reaktiver Probekomponenten mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels aufweist.
Weiterhin von Interesse für die vorliegende Erfindung sind die Beschreibungen von Piasio, et al., U.S. Patentschrift Nr. 4,255,575 und von Litman, et al., U.S. Patentschrift Nr. 4,391,904. Diese Beschreibungen betreffen spezifische Bindungstestverfahren im allgemeinen und beschreiben die Immobilisierung eines Enzyms oder weiterer Komponenten eines signalerzeugenden Systems, wie eines Cofaktors auf Festphasenmatrizen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Analytsubstanz in einer Probe mittels einer oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionen. Mit Bezug auf die Zeichnungen schließen die Vorrichtungen (10) ein chromatographisches Medium (13) ein, das Kapillarität aufweist, sowie die Fähigkeit für einen chromatographischen Lösungsmitteltransport einer oder mehrerer reaktiver Probenkomponenten und nicht immobilisierter Reagentien besitzt, die einen Reaktionsort (16) aufweisen, an dem ein immobilisiertes Reagens vorhanden ist, das in der Lage ist, ein Element aus der Gruppe bestehend aus der Analytsubstanz und einem spezifischen markierten Bindungsmaterial zu binden. Die Vorrichtungen schließen ebenfalls ein Probeauftragemittel (18) ein, das unmittelbar neben dem chromatographischen Medium (13) angeordnet ist und mit ihm in flüssigem Kontakt steht, sowie vom Reaktionsort stromaufwärts versetzt vorliegt und das zum Zurückhalten eines Probevolumens angepaßt ist, bis es entlang des genannten chromatographischen Mediums zu dem genannten Reaktionsort transportiert wird und ein flüssiges Absorptionsmittel (l9), stromabwärts zum Reaktionsort (16) versetzt, ein. Ein Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung (10), um das Vorliegen oder die Menge einer Analytsubstanz in einer Probe zu bestimmen, schließt die Schritte ein (a) Auftragen eines Probevolumens, das analysiert werden soll, auf das Probeauftragemittel (18), das es ermöglicht, daß die Probe durch Kapillarwirkung herausgezogen und entlang des chromatographischen Mediums (13) durch den Reaktionsort (16) zu dem Flüssigkeitsabsorptionsmittel (19) transportiert wird, (b) Kontaktieren des markierten spezifischen Bindungsmaterials mit dem Reaktionsort (16), (c) Entfernen von ungebundenen Probematerialien und ungebundenen markierten, spezifischen Bindungsmaterialien von dem Reaktionsort (16) und (d) Bestimmen der Anwesenheit oder Menge des markierten spezifischen, am Reaktionsort (16) immobilisierten Bindungsmaterials als Zeichen für das Vorliegen oder die Menge von Analytsubstanz in der Probe.
Die ungebundenen Probematerialien und ungebundenen markierten spezifischen Bindungsmaterialien können von dem Reaktionsort (16) mittels eines Waschschrittes entfernt werden, bei dem eine Waschlösung auf den Reaktionsort (16) aufgebracht wird, vorzugsweise durch Auftragen durch das Probeauftragemittel (18). Alternativ ist eine Waschschritt nicht immer notwendig, wenn das markierte Bindungsmaterial ausreichend verdünnt ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 beschreibt eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 2 zeigt eine Aufsicht auf die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung.
Fig. 3 zeigt eine Sicht entlang der Linie 3-3, der in Fig. 2 gezeigten Vorrichtung.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Anwendung von chromatographischen spezifischen Bindungstest-Techniken bereit. Erfindungsgemäße Vorrichtungen sind durch eine hohe Absorptionseffektivität gekennzeichnet, die insbesondere bei der Anwendung der Erfindung bei der Diagnose pädiatrischer und geriatrischer Patienten vorteilhaft ist, bei denen das Volumen der Probeflüssigkeiten, die von solchen Patienten erhalten werden kann, begrenzt ist. Diese hohe Absorptionseffektivität ist das Ergebnis des chromatographischen Transports von Probe und anderen reaktiven Materialien horizontal durch den Reaktionsort, was die Materialien zwingt, eher der Länge nach durch das chromatographische Medium, das spezifische Bindungsmittel enthält, zu fließen, als durch oder um eine schmale, dicke, mit Medium gesättigte Zone.
Die Vorrichtungen sind zur Analyse von Proben geeignet, die mit teilchenförmigem Material stark belastet sind, ohne die Notwendigkeit eines Vorfilters. Teilchenförmiges Material stört die Analytbestimmung am Reaktionsort nicht, sondern akkumuliert sich stattdessen an der Grenzfläche von Probeauftragemitteln und chromatographischem Material. Dennoch können Vorfilter und insbesondere die, die nicht zu entfernen sind, verwendet werden und in das Probeauftragemittel eingepaßt werden, wenn die Proben besonders stark mit teilchenförmigem Material belastet sind, beispielsweise bei Vollblut.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfassen ein chromatographisches Medium mit einem Reaktionsort, einem Probeauftragemittel, das unmittelbar im Anschluß an das Medium und versetzt stromaufwärts zu dem Reaktionsort angebracht ist, sowie ein Flüssigkeitsabsorptionsmittel, das stromabwärts zu dem Reaktionsort angebracht ist. Am Reaktionsort ist ein immobilisiertes Reagens vorhanden, das in der Lage ist, ein Element aus der Gruppe bestehend aus den genannten Substanzen und dem markierten spezifischen Bindungsmaterial zu binden. Das chromatographische Medium und das Probeauftrage- und Flüssigkeitsabsorptionsmittel sind vorzugsweise in einer Haltevorrichtung angebracht. Die Probematerialien und Reagentien werden zusammen oder nacheinander in das Probeauftragemittel gegeben, das einen Bereich versetzt von dem Reaktionsort, eine Vertiefung, ein Absorptionskissen oder eine volumetrische Abgabevorrichtung, die mit dem chromatographischen Medium in Kontakt steht, umfassen kann. Vorzugsweise ist das Probeauftragemittel eine Vertiefung oder ein Absorptionskissen wie es aus Blottermaterial gefertigt werden kann. Die Probematerialien und Reagentien werden in dem chromatographischen Medium absorbiert und chromatographisch entlang des Mediums und horizontal durch den Reaktionsort transportiert. Die Analytsubstanz und die Reagensmaterialien können durch eine spezifische Bindungsreaktion am Reaktionsort immobilisiert werden, während Nichtanalyt-Probekomponenten und nicht immobilisierte Reagentien durch das chromatographische Medium zu dem Flüssigkeitsabsorptionsmittel, das stromabwärts zu dem Reaktionsort angebracht ist, transportiert werden.
Mit Bezug auf die Zeichnungen beschreiben die Fig. 1 bis 3 eine Vorrichtung (10) zur Detektion eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend einen oberen Gehäuseteil (11), einen unteren Gehäuseteil (12), eine Länge chromatographisches Medium (13) mit einem ersten Ende (14), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, einem zweiten Ende (15), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet und einen Reaktionsort (16), an dem ein Reagens immobilisiert wird, das in der Lage ist, ein Element aus der Gruppe bestehend aus Analytsubstanz und markiertem spezifischem Bindungsmaterial zu binden. Die Vorrichtung (10) umfaßt weiterhin einen Unterlegstreifen (17) im Anschluß an das chromatographische Medium (13), eine Probevertiefung (18), die durch den oberen Rahmenteil (11) festgelegt ist, im Anschluß an das erste Ende (14) des chromatographischen Mediums (13) und ein Blottermaterial (19) stromabwärts zu dem Reaktionsort (16) und im Anschluß an das zweite Ende (15) des chromatographischen Mediums (13).
Gemäß einem Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung (10) bei der Durchführung von Tests vom Sandwichtyp wird ein Probevolumen, das auf Anwesenheit einer Analytsubstanz getestet werden soll, in die Probevertiefung gegeben. Das Probematerial wird in das chromatographische Medium (13) absorbiert, wo es in Richtung des zweiten Endes (15) zu fließen beginnt. Das Probematerial, das, wenn vorhanden, die Analytsubstanz enthält, fließt durch den Reaktionsort (16), an den ein Reagens immobilisiert wird, das in der Lage ist, spezifisch mit irgendeiner Analytsubstanz eine Bindung einzugehen, so daß sie am Reaktionsort (16) immobilisiert wird. Nichtanalyt-Probematerialien fließen weiter durch das chromatographische Medium (13) in Richtung des zweiten Endes (15), wo sie durch das Blottermaterial (19) absorbiert werden.
Nach Beendigung des Transportes des Probematerials aus der Probevertiefung (18) zu dem Blottermaterial (19) wird ein markiertes Reagensmaterial, das in der Lage ist, spezifisch mit der Analytsubstanz zu binden, in die Probevertiefung (18) gegeben, so daß es von dem chromatographischen Medium (13) absorbiert wird und durch den Reaktionsort (16) zu dem zweiten Ende (15) des Mediums transportiert wird, wo es von dem Blottermaterial (19) absorbiert wird. Wenn irgendeine Analytsubstanz am Reaktionsort (16) immobilisiert wird, reagiert das markierte Reagensmaterial mit der Analytsubstanz und wird ebenfalls immobilisiert. Wenn das Reagensmaterial radioaktiv, mit einem Chromophor oder einem Fluorophor markiert ist, kann die Anwesenheit des markierten Materials und somit der Analytsubstanz am Reaktionsort detektiert werden. Wenn das Reagensmaterial enzymmarkiert ist, können zusätzliche Reagentien, wie Enzymsubstrate, Cofaktoren und Farbstoff- Vorstufen, in die Probevertiefung (18) oder direkt zu dem Reaktionsort (16) hinzugegeben werden, um die Anwesenheit der Analytsubstanz anzuzeigen.
Gemäß zwei alternativen Ausführungsformen kann das markierte spezifische Bindungsmaterial in dem chromatographischen Medium stromaufwärts von dem Reaktionsort oder in dem Absorbensmaterial des Probeauftragemittels eingeschlossen sein oder in getrockneter Form vorliegen, so daß es durch Zugabe der Probe wiederhergestellt wird.
Die Vorrichtung (10) gemäß Fig. 1 bis 3 kann auch modifiziert werden, um spezifische Bindungstests des kompetitiven Typs durchzuführen. Gemäß einem solchen Verfahren kann das markierte spezifische Bindungsreagens ausgewählt werden, um mit der Analytsubstanz um die Bindung an das in der Reaktionszone (16) immobilisierte Reagens zu konkurrieren, das in der Lage ist, mit beiden zu binden. Die in der Probe vorliegende Menge Analytsubstanz bestimmt den Anteil der vorbestimmten Menge an markiertem spezifischen Bindungsmaterial, das am Reaktionsort (16) bindet. Die Einstellungen der Menge und/oder Bindungsaffinität des markierten spezifischen Bindungsmaterials können zur Bestimmung der Menge des in der Probe vorliegenden Analyten durchgeführt werden.
Verschiedene andere spezifische Bindungstests können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden. Beispielsweise kann das chromatographische Medium an zusätzlichen Reaktionsorten mit verschiedenen immobilisierten spezifischen Bindungsmitteln gesättigt sein. Solche zusätzlichen Reaktionsorte können zur Detektion zusätzlicher Analytsubstanzen verwendet werden, oder können wie bei einem Test vom kompetitiven Typ verwendet werden, um die Menge der in einer Probe vorhandenen Analytsubstanz zu bestimmen. Zusätzliche Reaktionszonen können zur Absorption von Substanzen verwendet werden, die die genaue Bestimmung des Änalyten stören.
Das chromatographische Medium kann mit weiteren Reagentien und Materialien gesättigt sein, die Farbstoffverbindungen, Enzymsubstrate, Koenzyme und Cofaktoren einschließen, die mit den Enzymmarkierungen unter Bildung von Farbsignalen reagieren, wie es in der Technik gut bekannt ist. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der die markierten spezifischen Bindungsmittel enzymmarkiert sind, wobei die Enzymmarkierung dadurch gekennzeichnet ist, daß ihr Vorliegen durch eine Reaktion mit Elementen einer Gruppe aus einem signalerzeugenden Substrat/Cofaktor bestimmt werden, kann ein erstes Element der Gruppe des signalerzeugenden Substrats/Cofaktors am Reaktionsort auf dem chromatographischen Medium immobilisiert werden. Ein zweites Element der Substrat/Cofaktorgruppe kann zur geeigneten Zeit hinzugegeben werden, um das signalerzeugende System zu aktivieren, wenn eine Enzymmarkierung vorhanden ist. Durch eine vorherige Sättigung des Reaktionsortes mit einem Element aus der Gruppe des signalerzeugenden Substrats/Cofaktors wird ein Zugabeschritt vermieden. Probleme, die mit der Instabilität oder Unlöslichkeit von Substraten, Cofaktoren und Farbstoffvorstufen bei gemeinsamer Lagerung zusammenhängen, werden vermieden. Des weiteren können bestimmte Elemente aus der signalerzeugenden Gruppe von Verbindungen eine geringe chromatographische Beweglichkeit besitzen, mit dem Ergebnis, daß eine vorherige Sättigung am Reaktionsort besonders bevorzugt ist.
Die Vorrichtungen können einzeln, paarweise oder in Mehrfachanordnungen in einem Gehäuse eingeschlossen sein. Das Gehäuse sollte vorzugsweise wasserdicht sein, um ein Auslaufen zu verhindern und kann aus einer Vielzahl von inerten Materialien hergestellt sein, wobei Polymermaterialien wegen ihrer leichten Herstellung bevorzugt sind. Die Probevertiefung sollte ein ausreichendes Volumen aufweisen, um die erforderliche Menge Probe oder Reagentien, die erfindungsgemäß verwendet werden, zu enthalten. Wenn das Flüssigkeitsabsorptionsmittel innerhalb des Gehäuses der Vorrichtung eingeschlossen ist, sollte es mit einem ausreichenden Volumen vorgesehen sein, so daß Probe-, Wasch- und Reagensmaterialien, die während der Testverfahren auf die Vorrichtung aufgebracht werden, alle absorbiert werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der das chromatographische Medium ein Streifen aus Nitrocellulosematerial mit einer Breite von 0,4 cm ist, werden geeigneterweise Probe- und Reagensvolumina im Bereich von 10 l bis 150 ul aufgenommen.
Der Reaktionsort befindet sich stromabwärts von dem Probeauftragemittel und ist von jeder Seite mit dem Auge zu sehen, wobei sie entweder freiliegt oder mit einem transparenten Material bedeckt ist. Der Reaktionsort ist vorzugsweise nicht eingeschlossen, wodurch das Vorliegen oder die Abwesenheit von Signalen am Reaktionsort leicht beobachtet werden kann und außerdem die Zugabe von Reagentien und/oder Waschlösungen zum Reaktionsort ermöglicht wird.
Das Flüssigkeitsabsorptionsmittel, das stromabwärts von dem Reaktionsort angeordnet ist, absorbiert Probematerialien, Reagentien und Waschlösungen und erlaubt somit einen chromatographischen Transport der Probe und anderer Materialien vom ersten Ende des chromatographischen Mediums durch den Reaktionsort zum zweiten Ende des Mediums. Ohne eine solche Absorption würde der chromatographische Transport zum Erliegen kommen, und der Effektivitätsvorteil, der sich aus dem horizontalen Fluß der Probe durch den Reaktionsort ergibt, ginge verloren.
Das Flüssigkeitsabsorptionsmittel kann das chromatographische Medium selbst einschließen, worin Probe und Reagensmaterialien transportiert und von einer ausgedehnten Länge Medium absorbiert werden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die, bei der das Flüssigkeitsabsorptionsmittel neben dem chromatographischen Medium angeordnet ist und stromabwärts vom Reaktionsort versetzt vorliegt. Das versetzte Anordnen des Absorptionsmittels neben dem chromatographischen Medium liefert eine zusätzliche Absorptionskapazität. Das Versetzen des Absorptionsmittels stromabwärts von dem Reaktionsort gewährleistet, daß die Probematerialien und alle anderen Materialien, die stromaufwärts vom Reaktionsort eingebracht werden, hauptsächlich horizontal und nicht vertikal durch den Reaktionsort fließen.
Das Absorptionsmaterial kann aus einer ausgedehnten Länge des chromatographischen Mediums bestehen, besteht aber vorzugsweise aus einer Menge Blottermaterial. Celluloseblottermaterialien, die sich von Holzpulpe oder Baumwolle ableiten, sind geeignet. Das Blottermaterial braucht keine Dimensionen ähnlich denen des chromatographischen Mediums aufzuweisen und ist im allgemeinen breiter und dicker als das chromatographische Medium. Der Blotter braucht nur neben dem chromatographischen Medium vorzuliegen, so daß die Flüssigkeit aus dem chromatographischen Medium in den Blotter fließen kann. Ein besonders bevorzugtes Material ist das Punktblottermaterial von James River Typ 52 (James River Paper Co., Inc., Richmond, VA). Das Absorptionsmittel muß vorzugsweise in der Lage sein, das gesamte Volumen des Probematerials zu absorbieren und ist vorzugsweise in der Lage, die zusätzlichen Reagentien zu absorbieren und dies ziemlich schnell zu tun.
Die chromatographischen Medien, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen solche chromatographischen Substratmaterialien ein, die Kapillarität und die Fähigkeit eines chromatographischen Lösungsmitteltransports nicht immobilisierter Reagentien und Probekomponenten aufweisen. Die erfindungsgemäß verwendeten chromatographischen Medien liegen vorzugsweise in Form von Streifen vor. Während eine große Anzahl chromatographischer Medien, wie gewebte und nicht gewebte, faserartige Materialien, die bei der Papierchromatographie verwendet werden, für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, ist die Verwendung von Chromatographiesubstraten auf einer mikroporösen oder mikrogranularen dünnen Schicht besonders bevorzugt, da die Verwendung solcher Materialien die Geschwindigkeit und Auflösung der erfindungsgemäßen Tests verbessert. Die Materialien sollten vorzugsweise inert sein und im allgemeinen nicht physikalisch oder chemisch mit einer der Probekomponenten, den Reagenspuffern oder Reaktionsprodukten reagieren. Die anhängigen U.S. Patentanmeldungsserien Nr. 912,878, eingereicht am 29. September 1986 und 072,459, eingereicht am 13. Juli 1987, bei denen die Erfinder Mitinhaber sind, deren Beschreibung hier als Referenz angegeben ist, beschreiben eine breite Auswahl geeigneter chromatographischer Substratmaterialien. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung eines mikroporösen Nitrocellulosematerials mit einer Kerngröße von 5 um der Bezeichnung Typ SMWP (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts).
Weil das chromatographische Medium der Vorrichtung vorzugsweise chemisch inert ist, muß es vielleicht an irgendeinem Reaktionsort aktiviert werden, wo es gegebenenfalls ein spezifisches Bindungsreagens gegen den Transport durch das Lösungsmittel immobilisieren soll. Es sind verschiedene Verfahren erforderlich, um das Reagens je nach der besonderen chemischen Natur des Reagens zu immobilisieren. Im allgemeinen ist, wenn das Medium aus Nitrocellulose oder einem Gemisch aus Nitrocelluloseester besteht, keine spezielle chemische Verknüpfung zur Immobilisierung der Reagentien erforderlich. Für weitere Materialien und Reagentien können verschiedene Techniken verwendet werden, die die Einführung funktioneller Gruppen durch Materialien wie Carbonyldiimidazol, Glutaraldehyd oder Bernsteinsäure oder die Behandlung mit Materialien wie Cyanogenbromid einschließen. Weitere geeignete Reaktionen schließen die Behandlung mit Schiff- Basen und Borhydrid zur Reduktion der Aldehyd-, Carbonyl- und Aminogruppen ein. DNA, RNA und bestimmte Antigene können gegen den Lösungsmitteltransport durch Anbacken an das chromatographische Material immobilisiert werden. Das Backen kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 60ºC bis etwa 120ºC für Zeiten, die von etwa 5 Minuten bis etwa 12 Stunden variieren, jedoch vorzugsweise etwa 2 Stunden lang bei etwa 80ºC, durchgeführt werden.
Der Fachmann erkennt sofort die spezifischen Bindungsreagentien, die bei der Erfindung geeignet sind. Sie schließen jene Materialien ein, die Elemente eines spezifischen Bindungspaars, bestehend aus Ligand und Rezeptor, sind. Ligand und Rezeptor stehen in sofern in Beziehung, daß der Rezeptor spezifisch an den Liganden bindet, wobei er in der Lage ist, den Liganden von anderen Materialien mit ähnlichen Eigenschaften zu unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen sind in der Praxis der immunologischen Testtechniken besonders geeignet, wo die spezifischen Bindungsreagentien Antigene und Antikörper einschließlich Antikörperfragmente und synthetischer Antikörper sind. Spezifische Bindungsmaterialien wie Avidin, Biotin, Strepatavidin und Antibiotin können ebenfalls markiert und bei den erfindungsgemäßen, spezifischen, chromatographischen Bindungstests verwendet werden. Die Verfahren, Ausstattungen und Vorrichtungen können sich auch in der Praxis der DNA- und RNA-Hybridisierungstests und weiterer spezifischer Bindungstests als nützlich erweisen, wie bei jenen, die Rezeptoren für Hormone oder andere biologisch aktive Mittel beinhalten.
Blockierungsmittel, die bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Vorrichtungen zur spezifischen Bindung geeignet sind, sind jene Mittel, die in der Lage sind, überschüssige Bindungsstellen auf dem chromatographischen Medium zu blokkieren, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport von Probematerialien oder erfindungsgemäßen Reagentien behindern könnten. Beim Bau der erfindungsgemäßen Vorrichtungen wird das chromatographische Medium mit dem zu immobilisierenden Reagens an der gewünschten Stelle gesättigt. Ist das Reagens an der gewünschten Stelle immobilisiert, wird anschließend vorzugsweise der Streifen so verarbeitet, daß überschüssige Bindungsstellen für andere Reagentien oder Probematerialien blockiert werden. Besonders geeignet ist die Verwendung von Blockierungslösungen, die Proteine wie Casein, Gelatine, Albumin oder Vollserum umfassen. Solche Proteine werden so ausgewählt, daß sie mit den Reagensmaterialien der Tests nicht interferieren oder keine Kreuzreaktionen eingehen. Die Blockierung der Stellen kann vorzugsweise durch Eintauchen der chromatographischen Substratmaterialien in eine Lösung aus 0,2% Casein in physiologischer Salzlösung und durch Lufttrocknen der Streifenmaterialien durchgeführt werden. Weitere Verfahren schliessen das Eintauchen in Lösungen aus 0,1% Gelatine oder 0,1% Rinderserumalbumin, gefolgt von einer Lufttrocknung der Substratmaterialien, ein.

BEISPIEL 1

Gemäß diesem Beispiel wurden Immuntestvorrichtungen vom Sandwich-Typ zur Detektion des Hepatitis B-Oberflächen- Antigens (HBsAg) gebaut und verwendet. Mikroporöses Nitrocellulosematerial mit einer Dicke von etwa 0,15 mm und einer Porengröße von 5 um (Millipore SMWP) wurde auf Mylar und Klebstoff (Monokote, Top Flite Models, Inc., Chicago, IL.) in einem Folientrocknungsgerät bei 60 bis 65ºC laminiert. Die Membran und das Backmaterial wurden zu Streifen einer Breite von 0,4 cm und einer Länge von 2,5 cm zurechtgeschnitten. Anti-HBsAg-Antikörper (Abbott Laboratories, North Chicago, IL.) (0,1-0,2 ul, 1,5 mg/ml) wurden auf die Reaktionsorte aufgegeben und unter Umgebungsbedingungen 15 Minuten lang inkubiert. Die nichtspezifischen Bindungsstellen auf dem chromatographischen Medium wurden dann blockiert und durch Inkubation für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur in einer Lösung, die 0,1% Fischgelatine, 1% Saccharose und 0,14 mg/ml Nitroblautetrazolinium in 10 mM Tris und 150 mM NaCl (pH 7,6) enthielt, an ein Cosubstrat gebunden. Die Streifen wurden dann bei 40ºC etwa 1 Stunde lang getrocknet und bei Umgebungstemperatur in Gegenwart eines Trockenmittels aufbewahrt. Vorrichtungen, die im allgemeinen der Vorrichtung aus den Fig. 1 bis 3 glichen, wurden unter Verwendung der imprägnierten Streifen und des James River-Punktblottermaterials Typ 52 (1,0 cm auf 2,4 cm) hergestellt, das über dem zweiten Ende des Streifens angeordnet wurde, um als Flüssigkeitsabsorptionsmittel zu dienen.
In die Probeauftragevertiefung auf jeder Testvorrichtung wurden 30 ul Probe aus recalcifiziertem Plasma gegeben, das mit verschiedenen Konzentrationen HBsAg versehen worden war. Nachdem die Probe von dem ersten Ende des Nitrocellulosematerials aufgesaugt worden war und durch den Reaktionsort zum zweiten Ende des Nitrocellulosematerials transportiert worden war, vom Blottermaterial absorbiert worden war, wurde ein 15 ul-Aliquot mit Anti-HBsAg-Antikörpern (1 ug/ml) markiertes Biotin zu jeder Probevertiefung gegeben. Nachdem diese Lösung durch die Vorrichtung transportiert worden war, wurde ein 15 ul-Aliquot mit alkalischer Phosphatase markiertes Antibiotin (2 ug/ml) (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) zu jeder Probevertiefung gegeben. Die Reaktionsorte wurden durch Zugabe von 15 ul Waschlösung, die 1% Tritonö X 100 in Tris-gepufferter Salzlösung enthielt, zu jeder Probevertiefung zweimal gewaschen. Eine 15 ul-Aliquot Entwicklungslösung, die 0,5 mg/ml Bromchlorindolylphosphat, 0,1 mg/ml MgCl&sub2; und 1% 2-Amino-2-methylpropanol (pH 9,8) enthielt, wurde dann zu jeder Probevertiefung gegeben, und die Entwicklung einer Farbreaktion wurde 5 Minuten lang ermöglicht, bevor die Reaktion durch Zugabe von 15 ul einer Lösung aus 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gestoppt wurde. Probelösungen, die keine HBsAg enthielten, produzierten kein Signal, der Reaktionsort war weiß. Probelösungen, die höchstens 0,1 ng/ml HBsAg enthielten, produzierten sofort sichtbare blaugraue Flecken am Reaktionsort. Die Gesamttestzeit betrug 25 Minuten.

BEISPIEL 2

Gemäß diesem Beispiel wurden Vorrichtungen vom Sandwichtyp zur Detektion von HBsAg gebaut und verwendet, bei denen das markierte spezifische Bindungsmaterial mit kolloidalen Goldteilchen markiert war, gemäß dem Verfahren der anhängigen U.S. Patentserie Nr. 072,459, bei dem die Erfinder Mitinhaber sind. Die Vorrichtung und Materialien, die verwendet wurden, waren mit denen identisch, die in Beispiel 1 beschrieben worden waren, mit der Ausnahme, daß Nitroblautetrazolium aus der Blockierungslösung weggelassen wurde.
Zu der Probevertiefung jeder Vorrichtung wurde eine 50 ul- Probe aus recalcifiziertes Plasma gegeben, die mit verschiedenen Mengen HBsAg versehen worden war. Nachdem die Probe von dem ersten Ende des Nitrocellulosematerials aufgesaugt worden war, wurde ein 50 ul-Aliquot Anti-HBsAg-Antikörper, die mit kolloidalen, in einer Konzentration von 5 ug/ml (Abbott Laboratories) adsorbierten 40 nm-Goldteilchen markiert worden waren, zu jeder Probevertiefung gegeben. Die Gesamtzeit für den Test betrug 15 Minuten. Probelösungen, die kein HBsAg enthielten, produzierten kein Signal, das über den Hintergrund heraustrat. Probelösungen, die höchstens 1,0 ng/ml HBsAg enthielten, produzierten am Reaktionsort sichtbare violette Flecken. Da die Antikörper-Goldteilchen ausreichend verdünnt waren, war kein Waschschritt erforderlich.

Claims

1. Testvorrichtung zur Bestimmung des Vorliegens oder der Menge einer Analytsubstanz in einer Probe mittels einer oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionen umfassend

ein chromatographisches Medium, das Kapillarität und die Fähigkeit zum chromatographischen Transport durch Lösungsmittel einer oder mehrerer reaktiver Probekomponenten sowie nicht-immobilisierter Reagentien aufweist, einschließlich eines Reaktionsortes, an dem ein immobilisiertes Reagens, das in der Lage ist, eine Verbindung aus der Gruppe bestehend aus der Analyt-Substanz zu binden, vorliegt und eines markierten spezifischen Bindungsmaterials,

ein Probeaufgabemittel, das im Anschluß an und in Flüssigkeitskontakt mit dem genannten chromatographischen Medium angeordnet ist und sich versetzt flußaufwärts von dem Reaktionsort befindet und das zum zurückhalten eines Volumens der Probe bis zu deren Transport entlang des genannten chromatographischen Mediums zu dem genannten Reaktionsort geeignet ist und

ein Flüssigkeitsabsorptionsmittel versetzt flußabwärts von dem genannten Reaktionsort.

2. Testvorrichtung nach Anspruch 1, worin das genannte Flüssigkeitsabsorptionsmittel das genannte chromatographische Medium ist.

3. Testvorrichtung nach Anspruch 1, worin das genannte Flüssigkeitsabsorptionsmittel versetzt flußabwärts von dem genannten Reaktionsort im Anschluß an das chromatographische Medium angeordnet ist.

4. Testvorrichtung nach Anspruch 1, worin eine Verbindung einer signalerzeugenden Substrat-/Cofaktorgruppe an dem genannten Reaktionsort immobilisiert wird.

5. Testvorrichtung nach Anspruch 4, worin Nitroblautetrazolinium an dem genannten Reaktionsort immobilisiert wird.

6. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder der Menge an Analyt-Substanz in einer Probe, wobei bei dem Verfahren

ein chromatographisches Medium, das Kapillarität und die Fähigkeit zum chromatographischen Transport durch Lösungsmittel einer oder mehrerer reaktiver Probekomponenten sowie nicht-immobilisierter Reagentien aufweist, einschließlich eines Reaktionsortes, an dem ein immobilisiertes Reagens, das in der Lage ist, eine Verbindung aus der Gruppe bestehend aus der Analyt-Substanz zu binden, vorliegt und eines markierten spezifischen Bindungsmaterials

ein Probeaufgabemittel, das im Anschluß an und in flüssigem Kontakt mit dem genannten chromatographischen Material angebracht ist und sich versetzt flußaufwärts von dem genannten Reaktionsort befindet und das zum Zurückhalten eines Volumens der Probe bis zu seinem Transport entlang des genannten chromatographischen Mediums zu dem genannten Reaktionsort geeignet ist und

ein flüssiges Absorptionsmittel versetzt flußabwärts von dem genannten Reaktionsort angewendet werden, wobei das genannte Verfahren

(a) das Aufbringen eines Volumens der genannten Probe auf das genannte Probeaufgabemittel, welches es ermöglicht, daß die genannte Probe durch Kapillarwirkung aus dem genannten chromatographischen Medium herausgezogen und entlang des chromatographischen Mediums durch den genannten Reaktionsort zu dem genannten Absorptionsmittel transportiert wird

(b) das Zusammenbringen des genannten markierten spezifischen Bindungsmaterials mit dem Reaktionsort und

(c) die Bestimmung des Vorliegens oder der Menge des an dem genannten Reaktionsort immobilisierten, markierten, spezifischen Bindungsmaterials als Zeichen für das Vorliegen oder der Menge der Substanz in der Probe, umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem ungebundene Probematerialien, und ungebundene spezifische Bindungsmaterialien aus der Reaktionszone mittels eines Waschschrittes entfernt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das genannte Flüssigkeitsabsorptionsmittel im Anschluß an das genannte chromatographische Material und versetzt stromabwärts von dem genannten Reaktionsort angeordnet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der genannte Reaktionsort eine immobilisierte Verbindung einer signalerzeugenden Substrat-/Cofaktorgruppe einschließt, wobei das Verfahren weiterhin die Stufe (c') des Kontaktierens einer oder mehrerer zusätzlicher Verbindungen aus der genannten signalerzeugenden Substrat/Cofaktorgruppe mit dem genannten Reaktionsort zur Auslösung einer Signal-Erzeugungsreaktion umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Nitroblautetrazolinium an dem genannten Reaktionsort immobilisiert wird und Bromchlorindolphosphat zur Auslösung einer Signal-Erzeugungsreaktion zugegeben wird.