DE3852040T2 - Vorrichtung und verfahren zur bestimmung einer komponente einer probe. - Google Patents
Vorrichtung und verfahren zur bestimmung einer komponente einer probe.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die geeignet ist zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe. Insbesondere betrifft sie eine Vorrichtung, die geeignet ist, um einen Analyten zu bestimmen unter Verwendung eines Komplexes mit vier Gliedern oder "quaternären Komplexes".
- Die Bildung von Sandwiches aus Antigen und Antikörper und deren Verwendung in Immunoassays ist seit mehr als 15 Jahren in Gebrauch. Es gibt zwei verschiedene Trends auf diesem Gebiet. Der erste Trend wär hin zu einer Bildung von ternären Komplexen, d. h. Komplexen der Form Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2; *, wobei Ab&sub2; * eine Markierung trägt. Der spätere Trend ist hin zu Mehrkomponentsystemen, gewöhnlich quaternären Systemen, betrifft aber manchmal auch fünf oder mehr Komponenten. In der Diskussion des Standes der Technik wird diese Unterscheidung aufrechterhalten.
- Die Patentliteratur enthält viele Beispiele von Erfindungen auf diesem Gebiet. Ein frühes Beispiel eines solchen Tests findet sich in Schuurs et al., U.S. Patent Nr. 3,654,090 (1972), das nicht nur als historischer Hintergrund geeignet ist, sondern auch zum Verständnis einiger Schlüsselmerkmale dieses Gebietes.
- Schuurs et al. lehrt den Nachweis eines Antigens unter Verwendung eines an eine Festphase gebundenen Antikörpers gegen ein Epitop oder eine Bindungsstelle des Antigens ebenso wie einen löslichen mit Enzym markierten Antikörper, der mit einem zweiten Teil des Antigens bindet. Das in Schuurs et al. offenbarte Verfahren betrifft die Bestimmung der Enzymmarkierung, nachdem sich das Sandwich zwischen gebundenem Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper gebildet hat. Dies wird entweder in der festen Phase oder in der flüssigen Phase erreicht durch Zugabe eines Substrats für die Enzymmarkierung. Gewöhnlich erzeugt die Enzym-Substrat-Reaktion eine Farbe oder Farbveränderung, die in "Ja-Nein"-Tests erkannt werden kann oder quantitativ ausgewertet werden kann, wenn die Menge der vorhandenen Substanz zu bestimmen ist.
- In Schuurs et al. nicht enthalten ist irgendeine Diskussion über monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente und dies ist nicht überraschend, da Schuurs et al. 1968 eingereicht und 1972 erteilt wurde, d. h. viel früher als der Durchbruch der Hybridoma-Technik, der anschließend an die Entwicklung der Köhler-Milstein-Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper erfolgte.
- Schuurs et al. erhielten ein weiteres Patent 1974, U.S. Patent Nr. 3,791,932, das wiederum auf Sandwich-Assays gerichtet war. Dieses Patent beschreibt den sogenannten "Vorwärts"-Sandwich-Immunoassay. Diese Art von Test erfordert eine spezifische Reihenfolge von Stufen, d. h. die zu testende Probe wird zuerst mit dem unlöslichen Bindungspartner in Kontakt gebracht und die Reaktion zwischen diesen beiden wird bis zur Vervollständigung ablaufen gelassen. Die Festphasenkomplexe werden aus der Lösung entfernt und der zweite Bindungspartner, der eine Enzymmarkierung aufweist, wird dann zu der festen Phase zugegeben. Nach der Bindung des Komplexes wird die Enzymmarkierung bestimmt mit Standardtechniken, auf die oben Bezug genommen wurde. Wiederum gibt es keinen Hinweis auf monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente.
- Ling lehrte in U.S. Patent Nr. 3,867,517 (1975), daß Enzyme nicht die einzige Markierung sind, die in Sandwich-Assays verwendet werden können. Dieses Patent beschreibt einen Vorwärts-Sandwich-Assay und als Markierung einen radioaktiven Antikörper. Die radioaktive Markierung war ¹²&sup5;I, ein radioaktives Standardisotop. Die radioaktive Markierung von Antikörpern ist eine Standardtechnik, geht aber von der Gegenwart der geeigneten Aminosäuren in dem Antikörpermolekül zur Bindung des radioaktiven Iods aus. Ansonsten wird die Markierung nicht festgehalten.
- Schuurs et al. erhielten 1977 ein weiteres Patent, U.S. Patent Nr. 4,016,043. Dieses Patent beansprucht, daß eine einfachere Version des elementaren Sandwich-Assays gelehrt werde. Es lehrt die Verwendung einer unlöslichen Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und einer markierten Probe der gleichen Komponente. Dieses Verfahren geht davon aus, daß das nachzuweisende Antigen zwei identische Epitopstellen aufweist. Außerdem schließt die Verwendung von zwei identischen Rezeptoren die Verwendung von "simultanen" Tests, die unten diskutiert werden, aus. Die Folge davon ist, daß es bis zu 60 Stunden lang dauern kann, bis der Schuurs '043-Test abgeschlossen ist. In klinischen oder diagnostischen Labors ist das Erfordernis so langer Zeiträume unannehmbar.
- Piasio et al. lehrten in U.S. Patent Nr. 4,098,876 (1978) einen "umgekehrten" Sandwich-Assay. Dieses Patent ist wichtig, da es zum ersten Mal zeigte, daß die zu bestimmende Komponente zuerst an den löslichen markierten Antikörper und dann an den immobilisierten Antikörper gebunden werden könnte. Es war auch eine Verbesserung, daß auf eine Waschstufe verzichtet werden konnte, was bedeutete, daß Zeit bei Durchführung des Tests gespart werden konnte. Piasio et al. lehren, daß ihr Test idealerweise in weniger als einer 1/2 Stunde abgeschlossen sein könnte. Dieses paradigmatische System wurde in den Beispielen nicht verwirklicht, aber die Zeit lag wesentlich unter den 60 Stunden von Schuurs et al., wie oben diskutiert. Ein wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist es, daß erhebliche Mengen an immobilisiertem Antikörper erforderlich sind.
- Niswender, U.S. Patent Nr. 4,048,298 (1977), ist eigentlich kein Sandwich-Assay, zeigt aber eine Erfindung, bei der ein immobilisierter Antikörper verwendet wurde, um einen anderen Antikörper zu binden. Dieses Patent lehrt eine interessante Variante älterer kompetitiver Immunoassays. Bei Niswender wird ein an eine feste Phase gebundener Antikörper mit der zu untersuchenden Probe ebenso wie mit einem zweiten radioaktiv markierten Antikörper, der an den ersten Antikörper, nicht aber an die zu bestimmende Komponente bindet, in Kontakt gebracht. Dies bewirkt, daß der Forscher die vorhandene Substanz bestimmen kann, indem er bestimmt, wieviel radioaktiv markierter Antikörper an die feste Phase bindet.
- Dieses Patent zeigt, daß Antikörper auch an andere Antikörper und nicht nur an Antigene binden können. Diese Eigenschaft ist wichtig für neuere Tests, von denen einige unten diskutiert werden.
- Schwarzberg erkannte in U.S. Patent Nr. 4,235,689 (1980), daß Antikörper zwei verschiedene Anteile besitzen, den Fc-Teil oder die "konstante" Region und den Fab-Teil, der der Teil des Antikörpers ist, der an die Epitopstelle bindet. Schwarzberg erzeugte Komplexe von markierten Fab-Fragmenten, die an einen Liganden gebunden waren, zum Beispiel ein Polypeptid. Dieser Komplex wird dann in sogenannten "kompetitiven" Tests verwendet. Es werden keine Festphasenbindung oder Sandwich-Tests beschrieben.
- Jeong et al. lehren in U.S. Patent Nr. 4,244,940 (1981) einen "simultanen" Sandwich-Immunoassay. Ein solcher Test erfordert ein Antigen mit verschiedenen Epitopstellen, da zwei verschiedene Antikörper oder Rezeptoren verwendet werden müssen aus den oben angegebenen Gründen.
- Jeong et al. zeigen, daß 1981 der Stand der Technik auf diesem Gebiet, Vorwärts-, umgekehrte und simultane Tests lehrte, wobei immer ternäre Komplexe (d. h. Komplexe aus drei Arten) gebildet wurden. Man begann im Stand der Technik die Verwendung von Fab-Fragmenten als "Verbindungs"-Moleküle (Schwarzberg) zu sehen, aber sie wurden nicht als wesentlicher Teil eines Immunoassaysystems verwendet, noch wurden monoklonale Antikörper verwendet.
- Beide Ideen wurden in Patenten gelehrt, die 1983 erteilt wurden. David et al. überwand in U.S. Patent Nr. 4,376,110 (1983) ein Vorurteil im Stand der Technik, daß monoklonale Antikörper nicht "klebrig" genug seien, d. h. eine unzureichende Affinität besaßen, um in Sandwich-Assays verwendet zu werden. David et al. lehrten, daß alle drei Formen von ternären Sandwich-Assays mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt werden konnten, solange sie eine Affinität von mindestens 10&sup8; l/mol hatten. Moussebois et al. lehrten in U.S. Patent Nr. 4,397,060 (1983), daß ein Agglutionationstest durchgeführt werden könnte unter Verwendung von Fab-Fragmenten, die an einen festen Träger gebunden sind. Dieses Patent zeigt jedoch wieder, daß Fab-Fragmente nicht als Partner in Immunoassays betrachtet wurden, obwohl monoklonale Antikörper selbst nun verwendet wurden.
- Gallati et al. lehrten in U.S. Patent Nr. 4,467,031 (1984) einen spezifischen Sandwich-Assay zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA). Das Schlüsselmerkmal dieser Erfindung war die Verwendung verschiedener Salzkonzentrationen, um die Komplexbildung zu verbessern. Es ist ein "Vorwärts"-Sandwich-Test, in dem Sinne, in dem der Ausdruck hier definiert ist, und es wird die Möglichkeit diskutiert, daß zwei monoklonale Antikörper in dem Test verwendet werden. Es ergibt sich, daß dies auch ein ternärer Komplex ist und daß ein Fab-Fragment nicht verwendet wird.
- Woods et al. lehren in U.S. Patent Nr. 4,469,787 (1984) einen Sandwich-Test, der die Bindung einer Markierung an den Fc- Teil eines zweiten Antikörpers erfordert. Die Markierung wird nicht direkt an den zweiten Antikörper gebunden, sondern bei der Woods et al. Erfindung besteht die Erfindung darin, daß die Markierung an den Fc-Teil des Antikörpers gebunden wird, nachdem der ternäre Komplex gebildet ist. Dies geschieht, um eine Wechselwirkung zwischen Markierung und immobilisiertem erstem Antikörper zu verhindern.
- U.S. Patent Nr. 4,486,530 (1984), das David et al. erteilt wurde und eine Continuation-in-Part von U.S. Patent Nr. 4,376,110, das oben diskutiert wurde, ist, lehrt wiederum ternäre monoklonale Antikörper-Sandwiches und deren Nachweis. Dieses Patent trägt dazu bei, daß Sandwich-Assays in homogener Phase durchgeführt werden können, d. h. ohne Phasentrennung. Dies wird erreicht, indem die monoklonalen Antikörperkomponenten der ternären Komplexe mit Markierungen markiert werden, die nicht reagieren, wenn sie nicht durch den "Leim" eines Antigens mit vielen Epitopen zusammengebracht werden.
- Carro et al. kombinieren in U.S. Patent Nr. 4,522,922 (1985) Sandwich-Tests mit einer älteren Form des Immunoassays, dem sogenannten "Ausfällungs"-Test. Diese Erfindung lehrt die Bildung eines ternären Sandwiches und die anschließende Zugabe eines Ausfällungsmittels, um den Komplex aus der Lösung auszufällen. Dies ist ein Radioimmunoassay, bei dem polyklonale Antiseren angewendet werden.
- Die neuesten Patente auf diesem Gebiet zeigen Modifikationen des Sandwich-Grundprinzips. Petska lehrt in U.S. Patent Nr. 4,623,621 (1986), daß ein oligomeres Protein bestimmt werden kann, indem ein an eine Festphase gebundener monoklonaler Antikörper, der für ein einmal an dem sich wiederholenden Proteinteil des Moleküls vorhandenes Epitop spezifisch ist. Nach der Festphasenbindung wird eine zweite Probe des gleichen monoklonalen Antikörpers, nur markiert, gebunden. Wiederum wird ein ternärer Komplex gebildet, nur mit ganzen Antikörpern und ein gleichzeitiges Testen ist nicht möglich.
- Das erste Beispiel eines quaternären Systems wird in U.S. Patent Nr. 4,343,896 gezeigt, das an Wolters et al. ausgegeben wurde. Dieses Patent, das auf einer 1976 eingereichten Erkenntnis basiert, lehrt den festphasengebundenen Komplex Ab&sub1;-Ab&sub2;-Ag- Ab&sub3; *. Eine entscheidende Beschränkung des Wolters-Patentes besteht darin, daß Ab&sub2; und Ab&sub3; * von verschiedenen Tierarten kommen. Der Grund hierfür ist, daß Ab&sub1; gegen die konstante Region, d. h. den "Fc"-Teil von Ab&sub2; gerichtet ist. Alle Antikörper einer speziellen immunologischen Klasse, die von der gleichen Tierart stammen, haben identische Fc-Teile. Der Stand der Technik lehrt, daß dann, wenn Ab&sub2; und Ab&sub3; von der gleichen Tierart wären, nicht nur Ab&sub1;-Ab&sub2;-Ag-Ab&sub3;*, sondern auch Ab&sub1;-Ab&sub3; erhalten würden, die beide an die Festphase binden, was Wechselwirkung und ungenaue Ergebnisse verursachen wurde.
- Axen et al. lehren in U.S. Patent Nr. 4,469,796 (1984), daß mehr als drei Komponenten an einer Immunreaktion beteiligt sein können, aber der einzige Komplex mit vier Partnern, der gelehrt wird, ist ein an die feste Phase gebundener Komplex von Ag-Ab&sub1;-Ab&sub2;-Ab&sub3;*. Es ist anzumerken, daß in der Beschreibung der Reaktanten in Spalte 1, Zeilen 41 bis 60, Axen et al. Fab-Fragmente nie erwähnt.
- Tanswell et al. lehren in U.S. Patent Nr. 4,624,930 (1986) Komplexe aus vier Komponenten, worin ein erster und dritter Rezeptor in Lösung das Antigen binden, während ein zweiter Festphasenantikörper an den ersten Antikörper bindet. Die Lehre von Tanswell ist allgemein auf die Verwendung eines Doppelantikörpersystems gerichtet und offenbart nicht spezifisch monoklonale Antikörper.
- Forrest et al. gehen in U.S. Patent Nr. 4,659,678 (1987) über die oben diskutierte Bindung von vier Partnern hinaus und bilden tatsächlich einen pentavalenten Komplex aus Antikörper- Hapten-Antikörper-Antigen-Antikörper. Das Schwanzende des Komplexes ist ein radioaktiv markierter Antikörper. Mindestens ein Antikörper muß ein monoklonaler Antikörper sein.
- In Forrest et al. sind im Detail ziemlich lange die Vorteile und Nachteile von Tests unter Bildung von Komplexen mit vielen Gliedern angegeben. Die Lösung der Probleme, die zum Beispiel in Spalte 2, Zeilen 1 bis 5, angegeben ist, besteht darin, einen festphasengebundenen mAb zu verwenden, um einen Komplex Ab-Ag-Fab * zu binden. Das einzige Mal, wo ein festphasengebundener mAb verwendet wird, um den Komplex mAb&sub2;-Ag-Fab* zu binden, erfordert bei Forrest jedoch, daß mAb&sub2; an ein weiteres Antigen gebunden wird, so daß der Festphasenkomplex mAb&sub1;-Ag&sub2;-mAb&sub2;-Ag&sub1;- Fab * gebildet wird. Es versteht sich in diesem Zusammenhang jedoch, daß "Ag&sub2;" tatsächlich für ein Verbindungsglied steht, da mAb&sub2; nicht zwei Ag bindende Stellen besitzen kann.
- Mehrschichtanalyseelemente für die immunologische Bestimmung mit blockierenden Schichten werden in den U.S. Patenten Nr. 4,459,358 und 4,613,567 beschrieben. Diese blockierenden Schichten dienen nur zur optischen Unterscheidung zum Nachweis in zwei verschiedenen Schichten und haben keinen Einfluß auf die Diffusion der Testlösung.
- US-PS 4,459,358 beschreibt ein Mehrschichtelement mit einer Reaktionsschicht, einer Isolierungsschicht und einer Registrierungsschicht. Die einzige Aufgabe der Isolierungsschicht ist es, den Nachweis der nachweisbaren Molekülart in der Reaktionsschicht zu verhindern und den Nachweis auf die Molekülarten, die durch die Registrierungsschicht diffundiert sind, zu begrenzen.
- US-PS 4,613,567 beschreibt ein Mehrschichtelement mit einer ersten Nachweisschicht, einer Blockierungsschicht und einer zweiten Nachweisschicht. Die Blockierungsschicht schließt Pigmente als Blockierungsmittel für Licht ein. Daher ist es möglich, beide Nachweisschichten zu messen.
- Ein Zweischichtelement, das ein Medium zur Aufnahme einer Probelösung über einen bestimmten Zeitraum einschließt, wird in US-PS 4,587,102 beschrieben. Das Element umfaßt eine Nachweisschicht und eine Reaktionsschicht, wobei die Reaktionsschicht ein fasriges poröses Medium mit einer Fähigkeit zur Wasseraufnahme umfaßt.
- Die Anmeldung ist gerichtet auf eine Vorrichtung (Apparat), die für Immunoassays, zum Beispiel immunoenzymometrische Assays, kompetitive Assays und Verdrängungs-Assays verwendet werden kann.
- Insbesondere kann sie verwendet werden für ein Verfahren zur Bestimmung eines quaternären Komplexes aus einem an eine feste Phase gebundenem Antikörper, der den Fc-Teil eines monoklonalen Antikörpers, nicht aber den Fab-Teil, bindet, einem ganzen monoklonalen Antikörper, der den Analyten bindet, dem Analyten selbst und einem markierten Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers.
- Daher ist die Erfindung gerichtet auf eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, welche umfaßt:
- a) eine erste Zone, welche eine markierte Probe (i) des zu bestimmenden Analyten, (ii) eines Analogen des Analyten oder (iii) eines Rezeptors, welcher spezifisch den Analyten bindet, enthält,
- b) eine zweite Zone, welche in mindestens teilweisem Fluidkontakt mit der ersten Zone steht und für die Fluidaufnahme aus der ersten Zone ausgebildet ist, wobei die zweite Zone einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor enthält, der (i) sowohl den Analyten der Probe als auch den markierten Analyten, (ii) sowohl den Analyten der Probe als auch das markierte Analoge des Analyten oder (iii) den nicht an den Analyten der Probe gebundenen markierten Rezeptor bindet,
- c) eine dritte Zone, die eine reaktionsfähige Komponente enthält, wobei sich die reaktionsfähige Komponente mit der Markierung auf dem markierten Analyten, dem markierten Analogen des Analyten oder dem markierten Rezeptor unter Bildung eines nachweisbaren Anteils verbindet, wobei die dritte Zone von der zweiten Zone durch ein Mittel, das fluiddurchlässig gemacht werden kann, getrennt ist, wobei das Mittel derart angeordnet ist, daß das Durchfließen der reaktionsfähigen Komponente aus der dritten Zone und in die zweite Zone vor dem Abschluß der Reaktion zwischen dem an eine feste Phase gebundenen Rezeptor und der nicht-gebundenen eine Markierung tragenden Probe verhindert wird, und
- d) eine vierte Zone, welche in mindestens teilweisem Fluidkontakt mit der zweiten Zone steht und für die Fluidaufnahme aus der zweiten Zone ausgebildet ist.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe, welche umfaßt:
- a) eine erste Zone, welche eine Probe einer Vielzahl von unterschiedlichen, nicht an eine feste Phase gebundenen Rezeptoren enthält, die den Analyten spezifisch binden, wobei einer der Rezeptoren eine Markierung trägt und ein zweiter keine Markierung trägt,
- b) eine zweite Zone, welche in mindestens teilweisem Fluidkontakt mit der ersten Zone steht und für die Fluidaufnahme aus der ersten Zone ausgebildet ist, wobei die zweite Zone einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor enthält, der den keine Markierung tragenden Rezeptor der ersten Zone bindet und den markierten Rezeptor nicht spezifisch bindet,
- c) eine dritte Zone, die eine reaktionsfähige Komponente enthält, wobei sich die reaktionsfähige Komponente mit der Markierung auf dem markierten Analyten, auf dem markierten Analogen des Analyten oder auf dem markierten Rezeptor unter Bildung eines nachweisbaren Anteils verbindet, wobei die dritte Zone von der zweiten Zone durch ein Mittel, das fluiddurchlässig gemacht werden kann, getrennt ist, wobei das Mittel derart angeordnet ist, daß das Durchfließen der reaktionsfähigen Komponente aus der dritten Zone in die zweite Zone vor dem Abschluß der Reaktion zwischen dem an eine feste Phase gebundenen Rezeptor und der ungebundenen eine Markierung tragenden Probe verhindert wird, und
- d) eine vierte Zone, welche in mindestens teilweisem Fluidkontakt mit der zweiten Zone steht und für die Fluidaufnahme aus der zweiten Zone ausgebildet ist.
- Wie diese und weitere Aspekte der Erfindung erreicht werden, ergibt sich aus der folgenden Offenbarung.
- Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, die als "Streifen mit 1 1/2 Saugschichten (Dochten)" bezeichnet wird.
- Fig. 2 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die als "Doppelsaugschichtstreifen" bezeichnet wird.
- Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die als "verzögertes physikalisches Auftragsystem" bezeichnet wird.
- Fig. 4 liefert eine Ausführungsform der Erfindung, die als "verzögertes Diffusionsauftragsystem" bezeichnet wird.
- Fig. 5 ist eine Ausführungsform, die als "Ringstreifen" bekannt ist.
- Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, die "Streifen mit integrierter Matrix" genannt wird.
- Fig. 7 zeigt ein Modell der Erfindung, das als "Streifen mit äußerem Druck" bekannt ist.
- Bezugnehmend auf Fig. 1 wird ein erfindungsgemäßer Teststreifen 11 gezeigt. Eine stabile Trägerfolie 12 ist vorgesehen, die der gesamten Vorrichtung Halt gibt. Ein fakultativer Schwamm 13 ist gezeigt, der zum Beispiel einen Puffer oder andere Reagenzien, die zur Vorbereitung der Probe für die Analyse nützlich sind, enthalten kann. Die Probe kann auf eine erste Zone 14 aufgetragen werden, zum Beispiel mit einer Pipette, und der Schwamm kann direkt in eine Flüssigkeit getaucht werden, oder eine Flüssigkeit kann direkt aufgetragen werden, zum Beispiel mit einer Pipette.
- Die "erste Zone" ist mit der Nummer 14 gezeigt und enthält mindestens einen zu bestimmenden Analyten, ein Analog dieses Analyten oder einen nicht an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der den zu bestimmenden Analyten bindet. Verschiedene Substanzen sind möglich. Obwohl es häufig der Fall ist, daß der zu bestimmende Analyt ein Antigen ist, zum Beispiel ein virales Protein, ein Arzneimittel oder ein Arzneimittelrückstand usw., können andere Substanzen bestimmt werden, insbesondere wenn die zu analysierende Probe keine biologische Flüssigkeit ist. Die erste Zone 14 kann auch, im Fall eines Sandwich-Assays, die zwei monoklonalen Antikörper von der gleichen Art, die den zu bestimmenden Analyten binden, enthalten. Wenn ein Sandwich-Assay durchgeführt wird, trägt einer der beiden monoklonalen Antikörper, die in der ersten Zone 14 enthalten sind, eine Markierung, zum Beispiel ein Enzym.
- Die "dritte Zone" 15 enthält ein Substrat für die Markierung der ersten Zone 14. Dieses Substrat kann zum Beispiel ein Substrat sein, auf das ein Enzym einwirkt, zum Beispiel beta- Galactosid, wenn das Enzym beta-Galactosidase ist. Es kann eine Substanz sein, die dazu notwendig ist, daß die Markierung ihre Funktion erfüllt. Zum Beispiel kann das Substrat der dritten Zone eine Substanz sein, die sich mit der Markierung der ersten Zone verbindet unter Bildung eines fluoreszierenden Anteils oder eines funktionierenden Moleküls. Zum Beispiel können Markierung und Substrat die Hälften eines vollständigen Enzyms sein, das die katalytische Aktivität erst besitzt, wenn die Teile zusammengebracht werden.
- Die erste und dritte Zone müssen getrennt voneinander gehalten werden, so daß eine vorzeitige Reaktion zwischen Markierung und Substrat nicht auftritt. Dies wird erreicht durch die Blockierungseinrichtung 16, die zwischen der ersten und dritten Zone 14 und 15 angeordnet ist. Diese Blockierungseinrichtung muß nicht aus einem speziellen Material sein, solange die Diffusion zwischen den Zonen 14 und 15 verhindert wird, bis die Probe in die zweite Zone eingetreten ist.
- Die zweite Zone 17 enthält einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der mit jedem der Reagenzien in der ersten Zone 14 bindet, das nicht mit dem Analyten der Probe reagiert, oder, wenn ein Sandwich-Assay durchgeführt wird, enthält diese zweite Zone einen an eine Festphase gebundenen Rezeptor, der nur den Fc-Teil eines monoklonalen Antikörpers bindet.
- Bei einer alternativen Konstruktion ist die zweite Zone in zwei Teile geteilt, wovon einer Fc-spezifisch ist und der andere nicht. In diesem Fall hängt die Bildung eines Signals natürlich davon ab, ob ein quaternärer Komplex gebildet wird oder nicht. Der nicht-spezifische an eine Matrix gebundene Antikörper dient daher als negative Kontrolle.
- Es ist anzumerken, daß die erste Zone 14 und die zweite Zone 17 zumindest teilweise in Fluidkontakt miteinander sein müssen. Die zweite Zone 17 und die dritte Zone 15 können in Fluidkontakt sein, müssen aber nicht. Die Ausführungsform der Fig. 1 zeigt tatsächlich keinen Fluidkontakt zwischen der zweiten und dritten Zone wegen der Gegenwart der Sperrfolie 18. Diese Sperrfolie dient dazu, den Durchgang des Substrats von der dritten Zone in die zweite Zone zu verlangsamen. Dies läßt zu, daß irgendwelche Reaktionen zwischen der an eine feste Phase gebundenen Komponente und dem nicht-umgesetzten Reagens der ersten Zone oder den Sandwiches mAb-Ag-Fab* auftreten, ohne eine vorzeitige Bildung des Signals. Da das Substrat schließlich in die zweite Zone eintreten muß, ist die Sperre 18 aus einem flüssigkeitsdurchlässigen Material, vorzugsweise einem Polyvinylalkohol, oder einem Material, das bei Kontakt mit einem oberflächenaktiven Mittel flüssigkeitsdurchlässig wird.
- Die vierte Zone 19 ist in Kontakt mit der zweiten Zone 17 und nimmt überschüssige Probe und Reagenzien auf. Sie dient als "Abfallbehälter" für die gesamte Vorrichtung.
- Ein fakultativer Deckel 20 ist auch vorgesehen. Dieser gibt der Vorrichtung zusätzliche Stabilität.
- In Fig. 2 ist eine Modifikation der Vorrichtung von Figur 1 gezeigt. In der Vorrichtung 21 sind alle Komponenten gleich wie in Vorrichtung 11, außer daß festzustellen ist, daß der Schwamm 13 hier direkt mit der ersten Zone 14 in Kontakt ist und keinen direkten Kontakt mit der dritten Zone 15 hat. Es gibt auch keinen teilweisen Fluidkontakt zwischen der ersten und dritten Zone. Ein vorzeitiger Kontakt von Markierung und Substrat wird vermieden, indem diese zum Beispiel in den dachstrohartigen Positionen 22 und 23 angeordnet sind, die voneinander durch die Sperre 16 getrennt sind.
- Fig. 3 zeigt eine Ausführungsform, bei der der fakultative Schwamm 13 der Fig. 1 und 2 nicht verwendet wird. Hier enthält die Vorrichtung 31 eine erste Zone 32, der die Probe direkt zugegeben wird. Die erste Zone 32 hat dieselbe Funktion wie die erste Zone 14 in den Fig. 1 und 2. Sie ist in teilweisem Fluidkontakt mit der zweiten Zone 33, die natürlich die gleiche Funktion hat wie die zweite Zone 17 in den Fig. 1 und 2. Ein Hauptunterschied zwischen der Vorrichtung von Fig. 3 und der der Fig. 1 und 2 ist die Anordnung und Konstruktion der dritten Zone, die das Substrat enthält. Wie sich unter Bezugnahme auf Fig. 3 ergibt, ist die dritte Zone, die die Teile 34 und 35 enthält, unter der zweiten Zone und ist mit dieser in Fluidkontakt. Die dritte Zone enthält Substrat im Bereich 35 und wird getragen von der Schicht 34.
- Wenn die Schicht 34 Flüssigkeit aufnimmt, die durch Komponente 43 gewandert ist, bringt dies Substrat 35 in Kontakt mit der zweiten Zone. Die Blockierungsschicht 44 verhindert den Fluidkontakt zwischen Zone 1 und Komponente 43. Komponente 34 kann zum Beispiel ein zusammengepreßter Schwamm sein, der bei Kontakt mit Flüssigkeit quillt.
- In dieser Anordnung ist eine vorzeitige Reaktion von Markierung und Substrat kein Problem, da zu der Zeit, wo die Flüssigkeit die dritte Zone erreicht und das Substrat freisetzt, jede Reaktion zwischen dem markierten Reaktanten der ersten Zone und dem an eine feste Phase gebundenen Reaktanten der dritten Zone bereits stattgefunden hat. Das Substrat diffundiert in die zweite Zone, wo der nachweisbare Anteil gebildet wird. Überschüssige Probe und Reagenzien werden in die vierte Zone 19 ausgetragen, wie in der Ausführungsform von Fig. 1, und die gesamte Vorrichtung wird wiederum durch die Trägerfolie 12 zusammengehalten.
- Ein fakultatives Merkmal, das in dieser Vorrichtung gezeigt wird, ist die Abdeckeinrichtung 36. Die Abdeckeinrichtung läßt eine genauere Beobachtung der auf dem Teststreifen vor sich gehenden Reaktion zu. Im allgemeinen läßt diese Abdeckeinrichtung nur eine selektive Sicht zu, indem Sichteinrichtungen oder "Fenster" an verschiedenen Positionen vorgesehen werden. Nur eine Sichteinrichtung ist tatsächlich notwendig und diese sollte über der zweiten Zone 33 sein, so daß die Bildung eines nachweisbaren Anteils beobachtet werden kann. Wenn die Abdeckeinrichtung 36 weitere Sichteinrichtungen über der vierten Zone 19 enthält, kann man die Reaktion zwischen Substrat und markiertem Bindungspartner oder nicht-umgesetztem markiertem Fab-Fragment beobachten. Wenn die Abdeckeinrichtung 36 zur Verwendung zum Beispiel in der Vorrichtung der Fig. 1 und 2 ausgebildet ist, kann auch eine Sichteinrichtung vorgesehen werden an einem Punkt, wo sich die Zonen 1 und 3 treffen. Dadurch kann der Forscher feststellen, ob ein vorzeitiges Vermischen von Markierung und Substrat aufgetreten ist. Die Abdeckeinrichtung kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich Folien. Sie kann auch ein mit Spritzguß geformter Deckel oder eine mit Spritzguß geformte Abdeckung sein, die Teil eines mit Spritzguß geformten Behälters ist.
- Fig. 4 unterscheidet sich von der Vorrichtung von Fig. 3 darin, daß die Schutzschicht 37 das Substrat 35 in der dritten Zone bedeckt und die Substratdiffusion in die Zone 2 gestartet wird durch Flüssigkeit aus Zone 2, die in die Schutzschicht 37 eintritt. Dies gibt eine größere Sicherheit, daß ein vorzeitiges Vermischen von Substrat nicht stattfindet. Die Abdeckeinrichtung 36, die, wie ausgeführt wurde, fakultativ ist, ist in dieser Ausführungsform nicht enthalten, obwohl sie es sein könnte.
- Fig. 5, die "Ringausführungsform", zeigt die Ausführungsform der Vorrichtung, bei der der Schwamm 13 zum Auftragen der Probe verwendet wird, wie in Fig. 2 oben. Die Probe läuft in die erste Zone 14, wo die Reaktion zum Beispiel zwischen Analyt und Bindungspartner oder mAb, Fab* und Ag stattfindet. Der gesamte Inhalt der ersten Zone 14 läuft in die zweite Zone 17, wo entweder nicht-umgesetzte markierte Substanz oder Sandwiches von dem hier angeordneten an die feste Phase gebundenen Reaktanten aufgenommen werden. Alles was in der zweiten Zone 17 nicht gebunden ist, wird über die Einrichtung 38 durch 39 geführt, das irgendeine Markierung enthält. Der überschüssige Teil der flüssigen Probe kommt in den Abfall 19, die Konfiguration der Vorrichtung ist jedoch so, daß die Probe, statt hier festgehalten zu werden, in die dritte Zone 15 gedrückt wird, die das Markierungssubstrat enthält. Da diese Konfiguration ein Durchleiten in die dritte Zone 15 erzwingt, ist auch ein Fließen zurück zu 19 ausgeschlossen. Über die Einrichtung 52 läuft das das Substrat enthaltende Material dann durch die Sperre 53 zurück in die zweite Zone 17, wo die Reaktion des an die feste Phase gebundenen markierten Reaktanten und des Substrats stattfindet. Die Sperre 53 wird so ausgewählt, daß die Probe, obwohl sie durch die Sperre 53 von der Einrichtung 52 fließen kann, nicht von der zweiten Zone 17 dahin fließen kann.
- Fig. 6 zeigt die Ausführungsform der Vorrichtung einer "integrierten Matrix". Bei dieser Ausführungsform werden die zweite und dritte Zone im wesentlichen Eins in der Matrix 42. Das Substrat ist in diese Matrix eingearbeitet, zum Beispiel durch Einkapseln, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Vereinigen der beiden Zonen in einer Matrix erfordert, daß das Substrat erst freigesetzt wird zu dem Zeitpunkt, zu dem der markierte Reaktant aus der ersten Zone 14 mit dem an eine feste Phase gebundenen Material, das darin enthalten ist, reagiert hat.
- Die letzte dargestellte Ausführungsform in Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung 71. Hier sind alle dargestellten Elemente wie in den Fig. 1 und 2, außer daß in dieser Ausführungsform die dritte Zone, die das Substrat 15 enthält, von der zweiten Zone 17 getrennt ist. Nur durch Anwendung einer äußeren Kraft auf 15 kann das Substrat in Kontakt mit der an eine feste Phase gebundenen Markierung gebracht werden.
- Verschiedene Tests können in irgendeiner oder allen bevorzugten Ausführungsformen, die in den Fig. 1 bis 7 gezeigt sind, durchgeführt werden. Zur Erläuterung sind die Mechanismen verschiedener Tests unter Verwendung der Vorrichtungen der Figuren 1, 4 und 5 angegeben, obwohl es für den Fachmann eindeutig ist, daß einer oder alle für die Verwendung in irgendeiner der Vorrichtungen ausgebildet werden können.
- Bei Durchführung eines Tests auf die Gegenwart von Thyroxin (auch T4 genannt) in Blut wird zum Beispiel eine Probe auf die erste Zone 14 der Vorrichtung von Fig. 1 aufgetragen. Leitungswasser wird auf den Schwamm 13 gebracht und wandert in die dritte Zone 15. Die erste Zone enthält T4 spezifische Antikörper, die die Enzymmarkierung Meerrettichperoxidase tragen, während Zone 15 irgendeines der Meerrettichperoxidase-Standardsubstrate enthält, zum Beispiel Orthophenylendiamin. Die Probe beginnt in die zweite Zone 17 zu wandern, die in an Festphase gebundener und immobilisierter Form entweder T4 selbst oder das verwandte Molekül T3 enthält. Beim Wandern durch die Zone 14 reagiert alles T4 in der Probe mit den mit Meerrettichperoxidase markierten T4 spezifischen Antikörpern unter Bildung von Komplexen. Diese werden zusammen mit nicht-komplexierten Antikörpern in die zweite Zone 17 gewaschen über die Flüssigkeit, die durch Zone 15 wandert. Die differentielle Diffusion tritt auf wegen der Sperre 18.
- Während die Sperre 18 gelöst wird, reagiert irgendwelcher nicht-komplexierter Antikörper mit an die feste Phase gebundenem T3 oder T4 in der zweiten Zone 17 und der vorher gebildete T4- Antikörper-Komplex fließt in die Abfallzone 19. Das Substrat für die Meerrettichperoxidase fließt dann in die zweite Zone 17, wo es mit dem an der festen Phase immobilisierten Enzym reagiert. Dies erzeugt ein quantitativ auswertbares Signal, wie vom Fachmann erkannt wird. Die Menge an Enzym, die durch die feste Phase aufgefangen wird, ist ein Maß dafür, wieviel T3 oder T4 in der Probe war.
- Auf gleiche Weise kann man einen Sandwich-Assay zum Beispiel für carcinoembryonales Antigen (CEA), eine Substanz mit mehreren Epitopen, unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 4 durchführen. Bei einem solchen Test enthält die erste Zone 32 sowohl monoklonale Maus-Anti-Human-CEA-Antikörper als auch Fab- Fragmente von monoklonalen Maus-Anti-Human-CEA-Antikörpern, die mit beta-Galactosidase markiert sind. Bei Kontakt der ersten Zone 32 mit der Probe bildet sich ein Sandwich zwischen dem ganzen Antikörper (mAb), dem CEA (Ag) und dem Fragment (Fab*). Dieses mAb-Ag-Fab*-Sandwich fließt zusammen mit nicht-umgesetztem mAb und Fab * in die zweite Zone 33, die gebunden und immobilisiert an einer Festphase einen Fc-spezifischen Schaf-Anti-Maus- Antikörper enthält. Diese feste Phase bindet sowohl das oben beschriebene Sandwich als auch überschüssigen mAb. Da Fab* keinen Fc-Teil enthält, wird dieser jedoch nicht gebunden und fließt in die Abfallzone. Mittlerweile hat etwas von der Probe das Substrat Resorufin-beta-Galactopyranosid freigesetzt, das in die zweite Zone 33 wandert. Dieses Substrat reagiert mit den in diesem Bereich gebundenen Fab*-Fragmenten, was einen Hinweis auf die Gegenwart und Menge von CEA in der Probe gibt.
- Unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 5 kann man einen kompetitiven Test zur Bestimmung, ob ein Patient dem HIV- Virus ausgesetzt war, durchführen. Mit dieser Art von Test werden Antikörper statt Antigenen nachgewiesen, was zeigt, daß für die Zwecke der vorliegenden Erfindung diese äquivalent sind.
- Ein Antikörper gegen gp120 von HIV, der mit einem Enzym, zum Beispiel einer Peroxidase, konjugiert ist, wird in die erste Zone 14 der Vorrichtung 51 eingearbeitet. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen HIV enthalten kann, wird über Schwamm 13 eingeführt und diffundiert in 14. Die Mischung aus Probe und Konjugat fließt in die zweite Zone 17, die immobilisiert in der festen Phase genug HIV-gp120 enthält, um alles markierte IgG zu binden, wenn kein anderer Antikörper vorhanden ist. Nicht-gebundenes Konjugat fließt über die Einrichtung 38 in die Falle 39, die jegliche freie Markierung aus der Probe entfernt. Die verbleibende Lösung fließt durch die dritte Zone 15, wobei Substrat freigesetzt wird, das über eine Einwegsperre in die Matrix fließt, wo es mit gebundener Markierung reagiert. Es besteht eine indirekte Beziehung, d. h. je mehr Markierung gebunden wird, desto weniger Antikörper war in der Probe und umgekehrt.
- Verschiedene Materialien können für jeden Bereich der Erfindung verwendet werden. Als Rezeptoren können zusätzliche Materialien wie Protein A und Biotin-Avidin-Komplexe u. a. verwendet werden, obwohl Antikörper bevorzugt sind.
- Der immobilisierte Rezeptor, der den vierten Teil des quaternären Komplexes bildet, kann irgendeines der oben aufgeführten Materialien sein, solange er den ersten monoklonalen Antikörper bindet und keine monoklonalen Antikörperfragmente bindet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, die den Fc-Teil anderer Antikörper binden, aber keine Fragmente binden.
- Wenn ein Antikörper als feste Phase verwendet wird, ist ein monoklonaler Antikörper bevorzugt, obwohl polyklonale Antiseren verwendet werden können. Die Art, in der der an eine Festphase gebundene Antikörper erzeugt wird, ist nicht wesentlich, solange es keine Kreuzreaktivität zwischen dem ersten Rezeptor und dem monoklonalen Antikörper-Fab-Fragment gibt. Der monoklonale Antikörper, der das Antigen und das monoklonale Antikörper- Fab-Fragment bindet, stammen jedoch von der gleichen Art.
- Die für das Fab-Fragment verwendete Markierung kann irgendeine der üblichen für Immunoassays verwendeten Markierungen sein, aber besonders bevorzugt sind Enzyme, die mit ihren Substraten unter Bildung gefärbter Substrate reagieren. Beispiele für solche Enzyme sind beta-Galactosidase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Urease und Amylase, obwohl zu erkennen ist, daß dies nur Beispiele sind und nicht beschränken sollen, welche Enzyme' hier verwendet werden können. Es ist dem Fachmann klar, daß dann, wenn Avidin der an die Matrix gebundene Rezeptor ist, ein biotinylierter monoklonaler Antikörper verwendet werden kann. Wenn dies der Fall ist, muß die markierte Komponente kein Fab-Fragment sein, sondern kann ein ganzer mAb sein.
- Die Anordnung des markierten Fab-Fragments oder mAb und des ersten unmarkierten oder Biotin/Avidin-markierten Antikörpers in der ersten Zone ist kein kritisches Merkmal der Erfindung. Diese können so angeordnet werden, daß die Probe einen vor dem anderen erreicht, oder so, daß sie gleichzeitig in Kontakt sind.
- Das Material, aus dem die Vorrichtung hergestellt ist, kann viele verschiedene Merkmale aufweisen. Natürlich müssen die verschiedenen Zonen für Flüssigkeiten absorptiv sein und eine gute Kapillarität besitzen. Beispiele für solche Materialien sind Saugpapier, Nitrocellulosepapier, Schwämme und andere absorptive Materialien. Diese können fasrig oder nicht sein und die verschiedenen Zonen können aus verschiedenen Materialien, die verschiedene Grade an Kapillarität, Absorption usw. besitzen, zusammengesetzt sein.
- Der Rezeptor ist mit irgendeinem Standardmittel, das im Stand der Technik zur Immobilisierung solcher Rezeptoren bekannt ist, immobilisiert, zum Beispiel an einem festen Träger, zum Beispiel durch Fixierung mit Bromcyan.
- Wenn die Sperren in der Vorrichtung verwendet werden, wie oben erwähnt, müssen sie so ausgewählt werden, daß sie Flüssigkeit durchlassen. Inerte Polymere sind bevorzugt und besonders bevorzugt ist Polyvinylalkohol (PVA). Andere geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt.
- Wenn die Abdeckeinrichtung verwendet wird, müssen die Öffnungen offen, transparent oder durchscheinend sein. Ein bevorzugtes Material dafür ist transparentes Mylar, während der Rest des Deckels ein ausreichend steifes Material umfassen kann, zum Beispiel eine Metallfolie, die mit einem transparenten Material abgedeckt sein kann oder nicht.
- Die weiteren Merkmale der Erfindung, zum Beispiel der Träger und die undurchlässige Sperre zwischen der ersten Zone und der Substratzone, umfassen übliche im Stand der Technik bekannte Materialien.
- Das folgende Beispiel erläutert die Arbeitsweise der Erfindung, soll aber nicht als Beschränkung der vorhergehenden Diskussion verstanden werden.
- Eine Vorrichtung zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin (hCG) wurde hergestellt und getestet.
- Ein Stück 4210-Papier (Firma Kalff) wurde in einen 2,6 cm langen und 0,6 cm breiten Streifen geschnitten (erste Zone). Ein Ende wurde mit 10 ul PBS-Puffer getränkt (pH 7,0, 1% BSA, 0,1% Tween 20) und der Mittelteil wurde mit 7,5 ul einer Lösung getränkt, die 20 U/ml eines Konjugats eines Fab-Teils eines monoklonalen Antikörpers gegen hCG und beta-Galactosidase enthielt. Das monoklonale Antikörperfragment hatte keine Kreuzreaktivität gegenüber luteinisierendem Hormon. Dieser Teil wurde auch mit 75 ul einer 100 ug/ml Lösung eines monoklonalen Antikörpers gegen die beta-Kette von hCG getränkt. Das Ende des Streifens gegenüber dem mit Puffer getränkten Ende wurde mit 10 ul einer wäßrigen Lösung von 5% Polyvinylalkohol getränkt. Der entstehende Streifen überlappte 0,5 mm ,einen Streifen aus 3512-Papier von Schleicher & Schull (zweite Zone), der 1 cm lang und 0,6 cm breit war. Dieses Papier war aktiviert worden unter Verwendung von Bromcyan und ein Schaf-Antikörper gegen den Fc-Teil von Maus-Antikörpern war daran befestigt. Dieser Streifen überlappte 0,5 mm eines 5 cm langen und 0,6 cm breiten Streifens D28-Papier (Whatman), der mit 150 ul einer wäßrigen Lösung von 18% Polyvinylalkohol getränkt war (Abfallzone). Die drei Streifen, die wie angegeben überlappten unter Bildung eines kontinuierlichen Streifens, wurden auf einem 10 cm langen, 0,6 cm breiten Streifen aus Polystyrol befestigt unter Verwendung eines Klebebandes. Die so erzeugten Streifen wurden jeweils in Urinproben eingetaucht, die so kalibriert waren, daß sie 0, 100, 250 und 500 mIU/ml hCG enthielten. Nach 5 Minuten wurde jeder Streifen in eine Lösung mit 0,8 mmol Resorufin-beta-Galactopyranosid in 100 mmol Hepes-Puffer (pH 7,5) getaucht und 5 Minuten lang entwickeln gelassen. Alle Streifen, die in hCG-haltigen Urin getaucht worden waren, zeigten eine leuchtend rote Farbe in der zweiten Zone und der Abfallzone, während der Streifen, der in die Probe getaucht worden war, die kein hCG enthielt, in der zweiten Zone gelb war und in der dritten Zone rot war. Die Farbveränderung ist ein Hinweis auf die Wirkung von beta-Galactosidase auf Resorufin-beta-Galactopyranosid in der zweiten Zone und der Abfallzone.
- Es ergibt sich, daß das vorhergehende Beispiel sehr leicht modifiziert werden könnte, zum Beispiel, indem eine getrennte Zone mit Resorufin-beta-Galactopyranosid getränkt würde in der oben beschriebenen Art und Weise, und die Entwicklung der Farbänderung könnte durch eine Abdeckeinrichtung beobachtet werden, wie bereits beschrieben.
Claims (26)
1. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Probe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine
markierte Probe der einen (i) zu bestimmenden Komponente,
(ii) eines Analoges der Komponente oder (iii) eines
Rezeptors, welcher sich an besagte Komponente spezifisch
bindet, enthält,
(b) eine zweite Zone (17, 33), welche in
mindestens teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone
steht und zur Fluidaufnahme aus besagter erster Zone
(14, 32) angepaßt ist, wobei besagte zweite Zone (17,
33) einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor
enthält, der sich an eines der folgenden bindet: (i)
sowohl die Komponente der Probe als auch die markierte
Komponente, (ii) sowohl die Komponente der Probe als
auch das markierte Analoge der Komponente, oder (iii)
den an die Komponente der Probe nicht gebundenen,
markierten Rezeptor,
(c) eine dritte Zone (15, 35), die eine
reaktionsfähige Komponente enthält, welche reaktionsfähige
Komponente sich mit dem Markierer auf besagter
markierter Komponente, auf dem markierten Analogen der
Komponente oder auf dem markierten Rezeptor unter Bildung
eines detektierbaren Komplexes verbindet, wobei besagte
dritte Zone (15, 35) von besagter zweiter Zone (17, 33)
durch ein Mittel (18, 44), das fluiddurchlässig gemacht
werden kann, getrennt ist, wobei besagtes Mittel derart
positioniert ist, daß das Durchfließen besagter
reaktionsfähiger Komponente aus der besagten dritten Zone
(15, 35) in die besagte zweite Zone (17, 33) vor
dem Abschluß der Reaktion zwischen dem besagten, an
eine feste Phase gebundenen Rezeptor und der nicht
gebundenen Markierer tragenden Probe verhindert wird,
und
(d) eine vierte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (17,
35) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter zweiter
Zone (17, 33) angepaßt ist.
2. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Fluidprobe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine Probe
einer Vielzahl von unterschiedlichen, an eine feste
Phase nicht gebundenen Rezeptoren enthält, die sich an
besagte Komponente spezifisch binden, wobei einer der
besagten Rezeptoren einen Markierer und ein zweiter
keinen Markierer trägt,
(b) eine zweite Zone (17, 33), welche in
mindestens teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone
(14, 32) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter
erster Zone (14, 32) angepaßt ist, wobei besagte zweite
Zone (17, 33) einen an eine feste Phase gebundenen
Rezeptor enthält, der sich an den keinen Markierer
tragenden Rezeptor der ersten Zone bindet und sich mit
besagtem markierten Rezeptor nicht spezifisch bindet,
(c) eine dritte Zone (15, 35), die eine
reaktionsfähige Komponente enthält, welche reaktionsfähige
Komponente sich mit dem Markierer auf besagter
markierter Komponente, auf dem markierten Analogen der
Komponente oder auf dem markierten Rezeptor unter Bildung
eines detektierbaren Komplexes verbindet, wobei besagte
dritte Zone (15, 35) von besagter zweiter Zone (17, 33)
durch ein Mittel (18, 44), das fluiddurchlässig gemacht
werden kann, getrennt ist, wobei besagtes Mittel derart
positioniert ist, daß das Durchfließen
besagter
reaktionsfähiger Komponente aus der besagten dritten Zone
(15, 35) in die besagte zweite Zone (17, 33) vor
dem Abschluß der Reaktion zwischen dem besagten, an
eine feste Phase gebundenen Rezeptor und der nicht
gebundenen Markierer tragenden Probe verhindert wird,
und
(d) eine vierte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (17,
33) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter zweiter
Zone (17, 33) angepaßt ist.
3. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Probe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine
markierte Probe der (i) zu bestimmenden Komponente,
(ii) eines Analogen der Komponente oder (iii) eines
Rezeptors welcher sich an besagte Komponente spezifisch
bindet, enthält,
(b) eine zweite Zone (17, 33), welche in
mindestens teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone
steht und zur Fluidaufnahme aus besagter erster Zone
(14, 32) angepaßt ist, wobei besagte zweite Zone (17,
33) einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor
enthält, der sich an eines der folgenden bindet: (i)
sowohl die Komponente der Probe als auch die markierte
Komponente, (ii) sowohl die Komponente der Probe als
auch das markierte Analoge der Komponente, oder (iii)
den an die Komponente der Probe nicht gebundenen,
markierten Rezeptor,
(c) eine dritte Zone (15, 35), die eine
reaktionsfähige Komponente enthält, welche reaktionsfähige
Komponente sich mit dem Markierer auf besagter
markierter Komponente, auf dem markierten Analogen der
Komponente oder auf dem markierten Rezeptor unter Bildung
eines detektierbaren Komplexes verbindet, wobei besagte
dritte Zone (15, 35) von besagter zweiter Zone (17, 33)
durch eine Lücke oder einen Luftraum so getrennt ist,
daß das Durchfließen besagter reaktionsfähiger
Komponente aus der besagten dritten Zone in die besagte
zweite Zone vor dem Abschluß der Reaktion zwischen dem
besagten, an die feste Phase gebundenen Rezeptor und
der nicht gebundenen Markierer tragenden Probe
verhindert wird, wobei sich besagte dritte Zone (15, 35) in
Bezug auf besagte zweite Zone (17, 33) zwecks Schaffung
von Fluidkontakt bewegt und dadurch das Durchfließen
der reaktionsfähigen Komponente in besagte zweite Zone
in Gang setzt, und
(d) eine vierte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (17,
33) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter zweiter
Zone (17, 33) angepaßt ist.
4. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Fluidprobe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine Probe
einer Vielzahl von unterschiedlichen, an eine feste
Phase nicht gebundenen Rezeptoren enthält, die sich an
besagte Komponente spezifisch binden, wobei einer der
besagten Rezeptoren einen Markierer und ein zweiter
keinen Markierer trägt,
(b) eine zweite Zone (17, 33), welche in
mindestens teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone
(14, 32) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter
erster Zone (14, 32) angepaßt ist, wobei besagte zweite
Zone (17, 33) einen an eine feste Phase gebundenen
Rezeptor enthält, der sich an den keinen Markierer
tragenden Rezeptor der ersten Zone bindet und sich mit
besagtem markiertem Rezeptor nicht spezifisch bindet,
(c) eine dritte Zone (15, 35), welche eine
reaktionsfähige Komponente enthält, welche reaktionsfähige
Komponente sich mit dem Markierer auf besagter
markierter Komponente, auf dem markierten Analogen der
Komponente
oder auf dem markierten Rezeptor unter Bildung
eines detektierbaren Komplexes verbindet, wobei besagte
dritte Zone (15, 35) von besagter zweiter Zone (17, 33)
durch eine Lücke oder einen Luftraum so getrennt ist,
daß das Durchfließen besagter reaktionsfähiger
Komponente aus der besagten dritten Zone (15, 35) in die
besagte zweite Zone (17, 33) vor dem Abschluß der
Reaktion zwischen dem besagten, an eine feste Phase
gebundenen Rezeptor und der nicht gebundenen Markierer
tragenden Probe verhindert wird, wobei sich besagte dritte
Zone (15, 35) in Bezug auf besagte zweite Zone (17, 33)
zur Schaffung von Fluidkontakt bewegt und dadurch das
Durchfließen der reaktionsfähigen Komponente in
besagte zweite Zone (17, 33) in Gang setzt, und
(d) eine vierte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (17,
33) steht und zur Fluidaufnahme aus besagter zweiter
Zone (17, 33) angepaßt ist.
5. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Probe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine
markierte Probe der (i) zu bestimmenden Komponente,
(ii) eines Analogen der Komponente oder (iii) einen
Rezeptor, welcher sich an besagte Komponente spezifisch
bindet, enthält,
(b) eine zweite Zone (42), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone steht
und zur Fluidaufname aus besager erster Zone (14, 32)
angepaßt ist, wobei besagte zweite Zone (42) sowohl
(1) einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der
sich an eines der folgenden bindet: (a) sowohl die zu
bestimmende Komponente als auch die markierte
Komponente, (b) sowohl die Komponente als auch das markierte
Analoge der Komponente, oder (c) den an die zu
bestimmende Komponente nicht gebundenen, markierten Rezeptor,
als auch (2) eine reaktionsfähige Komponente, welche
reaktionsfähige Komponente sich mit besagtem Markierer
unter Bildung eines detektierbaren Komplexes verbindet,
und (3) Mittel zur Verzögerung der Verbindung des
Markierers mit der reaktionsfähigen Komponente bis zum
Abschluß der Reaktion zwischen dem an die feste Phase
gebundenen Rezeptor und der nicht gebundenen Markierer
tragenden Probe im wesentlichen abgeschlossen ist,
enthält, und
(c) eine dritte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (42)
steht und zur Fluidaufnahme aus besagter zweiter Zone
(42) angepaßt ist.
6. Apparat zur Bestimmung einer Komponente in
einer Fluidprobe, welcher umfaßt:
(a) eine erste Zone (14, 32), welche eine Probe
einer Vielzahl von unterschiedlichen, an eine feste
Phase nicht gebundenen Rezeptoren enthält, die sich an
besagte Komponente nicht spezifisch binden, wobei einer
der besagten Rezeptoren einen Markierer und ein zweiter
keinen Markierer trägt,
(b) eine zweite Zone (42), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter erster Zone steht
und zur Fluidaufnahme aus besagter erster Zone (14, 32)
angepaßt ist, wobei besagte zweite Zone sowohl (1)
einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der sich
an eines der folgenden bindet: (a) sowohl die zu
bestimmende Komponente als auch die markierte Komponente,
(b) sowohl die Komponente als auch das markierte
Analoge der Komponente, oder (c) den an die zu bestimmende
Komponente nicht gebundenen, markierten Rezeptor, als
auch (2) eine reaktionsfähige Komponente, welche
reaktionsfähige Komponente sich mit besagtem Markierer
unter Bildung einer feststellbaren Entität verbindet, und
(3) Mittel zur Verzögerung der Verbindung des
Markierers mit der reaktionsfähigen Komponente bis die
Reaktion
des an die feste Phase gebundenen Rezeptors mit
der nicht gebundenen Markierer tragenden Probe im
wesentlichen abgeschlossen ist, enthält, und
(c) eine dritte Zone (19), welche in mindestens
teilweisem Fluidkontakt mit besagter zweiter Zone (42)
steht und zur Fluidaufnahme aus der zweiten Zone (42)
angepaßt ist.
7. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 4, in
welchem besagte erste (19, 32) und besagte dritte Zone
(15, 35) miteinander in mindestens teilweisem
Fluidkontakt stehen.
8. Apparat nach dem Anspruch 5 oder 6, in welchem
besagte erste (14, 32) und besagte zweite Zone (42)
miteinander in mindestens teilweisem Fluidkontakt
stehen.
9. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 4, in
welchem besagte erste Zone (14, 32) mit besagter zweiter
Zone (17, 33) in mindestens teilweisem Fluidkontakt
steht und besagte dritte Zone (15, 35) mit besagter
zweiter Zone (17, 33) in mindestens teilweisem
Fluidkontakt steht.
10. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, in
welchem besagte erste (14, 32) und besagte dritte Zone
(15, 35) voneinander getrennt sind.
11. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 4, in
welchem besagte zweite (17, 33) und besagte dritte Zone
(15, 35) voneinander getrennt sind.
12. Apparat nach Anspruch 11, in welchem besagte
zweite (17, 33) und besagte dritte Zone (15, 35) durch
eine flüssige durchlässige Sperre (18) getrennt sind.
13. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, welcher
außerdem eine fünfte Zone (13) enthält, welche fünfte
Zone (13) mit besagter erster Zone (14, 32) in
mindestens teilweisem Fluidkontakt steht und zur Aufnahme
einer Probe angepaßt ist.
14. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, welcher
außerdem eine fünfte Zone (13) enthält, welche fünfte
Zone (13) mit besagter erster (14, 32) und besagter
dritter Zone (15, 35) in mindestens teilweisem
Fluidkontakt steht und zur Aufnahme einer Probe angepaßt
ist.
15. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, welcher
außerdem eine zur Hindurch-sichtbarmachung einer
Bestimmungsreaktion angepaßte Abschirmung (36) enthält,
wobei besagte Abschirmung mindestens ein
Sichtbarmachungsmittel enthält, welches in besagter Abschirmung
über besagte zweite Zone (17, 33, 42) positioniert ist.
16. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, in
welchem besagte zweite und besagte dritte Zone miteinander
(42) gesamthaft verbunden sind.
17. Apparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, welcher
außerdem ein Mittel (38, 39, 19, 15, 52, 53) zur
Trennung eines detektierbaren Komplexes von der nicht
reagierten reaktionsfähigen Komponente enthält, wobei
besagter detektierbarer Komplex mit besagter zweiter Zone
(17, 33) in mindestens teilweisem Fluidkontakt steht.
18. Verfahren zur Bestimmung einer Komponente
einer flüssigen Probe, gemäß welchem besagte Probe mit
einem Apparat nach den Ansprüchen 2, 4 oder 6 in
Kontakt gebracht wird, wobei besagter Apparat in der
ersten Zone (14, 32) einen entfernbaren ersten
monoklonalen Antikörper, der sich an besagte Komponente
bindet, und einen markierten monoklonalen Antikörper oder
ein markiertes Fragment eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an besagte Komponente bindet, beinhaltet,
welcher besagte erste monoklonale Antikörper und besagter
markierte monoklonale Antikörper oder markiertes
Fragment eines monoklonalen Antikörpers von derselben
Spezies abgeleitet sind, wobei das Inkontaktbringen unter
Bedingungen erfolgt, welche die Bildung eines Komplexes
des besagten ersten monoklonalen Antikörpers, der
besagten Komponente und des besagten markierten
monoklonalen Antikörpers oder Fragmentes begünstigt, besagter
Komplex mit einem immobilisierten zweiten Rezeptor in
der zweiten Zone (17, 33, 42), welcher sich an den
besagten ersten monoklonalen Antikörper, jedoch nicht an
den besagten markierten monoklonalen Antikörper oder
das Fragment unter Bedingungen in Kontakt gebracht
wird, welche die Bildung eines quartären Komplexes
zwischen dem besagten ersten Komplex und dem besagten
immobilisierten Rezeptor begünstigen, und der Markierer
in besagtem quartären Komplex oder in dem Rückstand der
besagten Probe als Meßwert der besagten Komponente
gemessen wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem
besagter zweiter Rezeptor ein für den Fc-Anteil des besagten
ersten monoklonalen Antikörpers spezifischer Antikörper
ist.
20. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem
besagter zweiter Rezeptor ein Antikörper und besagtes
Fragment ein Fab-Fragment ist.
21. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem der
besagte Markierer des Fragmentes eines monoklonalen
Antikörpers ein Enzym ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, in welchem
besagtes Enzym die beta-Galactosidase ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem
besagtes Messen dadurch erfolgt, daß der besagte quartäre
Komplex mit einem eine Färbung erzeugenden Substrat für
den besagten Markierer in Kontakt gebracht wird und die
derart erzeugte Färbung als Meßwert der besagten
Komponente gemessen wird.
24. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem
besagter erster monoklonaler Antikörper eine Substanz des
Biotin-Avidin-Komplexes trägt und besagter
immobilisierter
zweiter Rezeptor ein Bindungspartner des
besagten Komplexes ist.
25. Verwendung des Apparates nach den Ansprüchen
1, 3 oder 5 für eine kompetitive Immunbestimmung.
26. Verwendung des Apparates nach den Ansprüchen
2, 4 oder 6 für eine Sandwich-Immunbestimmung.
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