DE3587394T2 - Rekombinante Virusproteine begleitet von lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS). - Google Patents

Rekombinante Virusproteine begleitet von lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS).

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Dino Dina
Carlos George-Nascimento
Rob Hallewell
Paul A Luciw
Deborah Parkes
Ray Sanchez Pescador
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Description

  • Diese Erfindung liegt auf dem Fachgebiet der Gentechnik. Insbesondere betrifft sie rekombinante Virusproteine, die mit lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) assoziiert sind.
  • Mit der Entdeckung des menschlichen T-Zell-lymphotropen Virus-I (HTLV-I) als infektiöses Agens bei Menschen wurde nachgewiesen, daß Retroviren Menschen infizieren und Krankheiten verursachen können. Nachdem HTLV-I eingeführt worden war, wurde ein zweites Virus derselben Familie, HTLV-II, ein bei Haarzellen-Leukämie nachgewiesener Stamm, gefunden. Seit dieser Zeit sind noch andere menschliche Retroviren isoliert worden, die bei Opfern mit lymphadenopathischem Syndrom (LAS)und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) vorkommen. Verschiedene Retroviren sind aus Individuen mit AIDS (manchmal HTLV-III genannt) oder LAS (manchmal LAV genannt) isoliert worden. Vgl. beispielsweise Barr -Sinoussi et al., Science 220 (1983), 868-871, und Montagnier et al., Cold Spring Harbor Symposium (1984), im Druck; Vilmer et al., Lancet 1 (1984), 753, Popovic et al., Science 224 (1984), 497, und Gallo et al., Science 224 (1984), 500. Ein Vergleich von HTLV-III und LAV findet sich in Feorino et al., Science (1984), a.a.O . . Vgl. auch Klatzman et al., Science 225 (1984), 59-62, Montagnier et al., ebenda (1984), 63-66, und die darin zitierten Referenzen für einen Überblick des Fachgebietes. Eine allgemeine Diskussion der T-Zell-Leukämie-Viren findet sich in Marx, Science 22 (1984), 475-477. Levy et al., Science 225 (1984), 840-842, beschreiben die Isolierung von ARV (AIDS-assoziierten Retroviren).
  • Zur Zeit der Einreichung dieser Anmeldung wurden diese Viren (HTLV-III, LAV und ARV) allgemein als menschliches T- Zell-lymphotropes Retrovirus (hTLR) bezeichnet. Seit 1986 jedoch wurde der gleichbedeutende allgemeine Begriff "Human Immune Deficiency Virus" (HIV) als anerkannte Bezeichnung für solche Viren eingeführt. Anschließend wurde eine Unterteilung der allgemeinen Gruppe HIV in HIV-I und HIV-II nötig. Da die Anmeldung ARV-2-Isolate betrifft, die HIV-I-Isolate sind, wurde hTLR (HIV) in der Anmeldung durch HIV-I ersetzt, demgemäß sind die Ansprüche auf HIV-I beschränkt. Die HIVs (hTRLs) können derselben Klasse zugeordnet werden, wenn sie in Morphologie, Serologie, in den Optima der Reversen Transkriptase und der Cytopathologie den in den vorstehenden Referenzen beschriebenen Eigenschaften ähnlich sind. Beispielsweise bevorzugt die Reverse Transkriptase Mg²&spplus; und weist ein pH-Optimum von etwa 7,8 auf.
  • DNA-Clone, die HIV-Proteine codieren, werden in EP-A1- 0173529, EP-A1-0178978, EP-A2-0185 444 und WO 86/02383 offenbart.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Folgende:
  • Rekombinantes DNA-Konstrukt zur Expression eines rekombinanten Polypeptids in einer das Konstrukt enthaltenden Zelle, wobei das Konstrukt Kontrollsequenzen, die die Transkription und Translation des rekombinanten Polypeptids in der Zelle regulieren, und eine von den Kontrollsequenzen regulierte codierende Sequenz umfaßt, wobei die codierende Sequenz eine DNA- Sequenz von mindestens etwa 21 Bp im Leseraster umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine antigene HIV-I- Aminosäuresequenz von Fig. 2 codiert, wobei die Sequenz mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv und mit HIV-I reaktiv ist.
  • Zelle, die ein vorstehend beschriebenes rekombinantes DNA-Konstrukt enthält, wobei die Zelle die antigene HIV-I-Aminosäuresequenz exprimiert und frei von anderen Zellen ist, die die antigene HIV-I-Aminosäuresequenz nicht exprimieren.
  • Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das eine antigene HIV-I-Aminosäuresequenz umfaßt, wobei eine Population der vorstehend beschriebenen Zellen unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen das rekombinante Polypeptid exprimiert wird.
  • Immunassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-I in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Antikörper enthält, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein rekombinantes Polypeptid zur Bindung der Antikörper verwendet wird und das rekombinante Polypeptid eine antigene env-, gag- oder pol-HIV-I-Aminosäuresequenz umfaßt, die in der in Fig. 2 gezeigten Sequenz enthalten ist, wobei das Polypeptid mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv ist.
  • Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt transformiert ist, wobei das Konstrukt eine DNA- Sequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz aus einem env-, gag- oder pol-Polypeptid von HIV-I codiert.
  • Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-I- Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß es einen festen Träger umfaßt, an den ein vorstehend beschriebenes rekombinantes Polypeptid gebunden ist.
  • Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte von proviraler DNA (ARV-2).
  • Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz von ARV-2(9B). Die Aminosäuresequenzen für die Produkte der gag-, pol- und env- Gene sind bezeichnet. Die U3-, R- und U5-Regionen der LTRs sind auch bezeichnet. Die cap-Stelle ist Position +1. Eine 3 Bp-umgedrehte Wiederholung an den Enden des LTR, die TATA-Box in Position -29, die zum 3'-Ende der tRNAlys komplementäre Sequenz in Position 183 und das Polyadenylierungssignal in Position 9174 sind unterstrichen. Die darüberstehenden Linien bezeichnen die Aminosäuresequenzen, die aus Virionproteinen bestimmt wurden. Die Nucleotide sind am Anfang jeder Linie numeriert und die Aminosäuren am Ende jeder Linie bezeichnet.
  • Fig. 3 stellt einen Arbeitsablaufplan dar, der das Vorgehen zur Herstellung von Plasmid pGAG25-10 zeigt.
  • Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz des p25 gag-Gens, das in Plasmid pGAG25-10 cloniert ist, und die durch dieses Gen codierte Aminosäuresequenz.
  • Fig. 5 zeigt den codierenden Strang der Nucleotidsequenz, cloniert in pGAG41-10, für die Herstellung des Fusionsproteins p41 gag und die entsprechende Aminosäuresequenz.
  • Fig. 6 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-p16 gag-Protein codiert, das in Plasmid ptac5 cloniert wurde, zur Erzeugung eines Expressionsplasmides für die Herstellung des p16 gag-Proteins in Bakterien.
  • Fig. 7 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-env- Protein codiert und zur Herstellung von Plasmid pDPC303 verwendet wurde.
  • Fig. 8 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-p31- Protein codiert und in Plasmid pTP31 enthalten ist.
  • Die HIV-I-DNA-Sequenzen, die entweder aus proviraler DNA oder cDNA isoliert und cloniert oder synthetisiert wurden, können zur Expression von Polypeptiden verwendet werden, die ein Vorläuferprotein, das einer weiteren Behandlung durch Spaltung unterworfen wird, oder ein komplettes reifes Protein oder ein Fragment davon darstellen können. Die kleinste Sequenz von Interesse zur Bereitstellung einer Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, die zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor, z. B. ein Immunglobulin, fähig ist, hat 21 Bp, üblicherweise mindestens 45 Bp, ausschließlich dem Initiationscodon. Die Sequenz kann einen beliebigen größeren Teil des Polypeptids oder das komplette Polypeptid codieren oder sie kann benachbarte Bereiche eines Vorläuferpolypeptids umfassen, so daß sie Teile von Sequenzen oder ganze Sequenzen umfaßt, die zwei oder mehrere verschiedene reife Polypeptide codieren. Die Sequenz macht üblicherweise weniger als etwa 5 kBp aus, häufiger weniger als etwa 3 kBp.
  • Sequenzen von besonderem Interesse, die offene Leseraster aufweisen (Fig. 2), kennzeichnen die Strukturgene für die gag-Proteine (p16 und p25), das env-Protein und das pol-Protein (p31). Es muß so verstanden werden, daß die vorstehenden Sequenzen mit anderen, im Retrovirus vorliegenen Sequenzen verspleißt werden können, so daß es sein kann, daß das 5'-Ende der Sequenz nicht die N-terminale Aminosäure des Expressionsproduktes codiert. Die Spleißstelle kann am 5'-Terminus des offenen Leserasters oder innerhalb des offenen Leserasters liegen. Das Initiationscodon für das Protein ist möglicherweise nicht das erste Codon für Methionin, sondern es kann das zweite oder dritte Methionin sein, so daß die Verwendung der gesamten vorstehend angegebenen Sequenz zu einem verlängerten Protein führen kann. Jedoch findet bei gag- und env-Genen in Säugerzellen eine proteolytische Prozessierung statt, wobei zusätzliche Aminosäuren entfernt werden können.
  • Zur Isolierung der verschiedenen Domänen kann das Provirus mit Restriktionsendonucleasen gespalten und die Fragmente einer Elektrophorese unterworfen werden, sodann werden Fragmente, die die richtige Größe aufweisen und mit einer Sonde einen Doppelstrang bilden, falls erforderlich isoliert, in einem Clonierungsvektor cloniert und aus dem Vektor herausgeschnitten. Die Fragmente können sodann für die Expression zubereitet werden. Überflüssige Nucleotide können von einem oder beiden Termini durch Spaltung mit Bal31 entfernt werden. Durch Restriktionskartierung können geeignete Restriktionsstellen außerhalb oder innerhalb des codierenden Bereiches lokalisiert werden. Zur Definition eines Terminus kann Primer-Reparatur oder in vitro-Mutagenese für Insertionen, Deletion, Punktmutationen oder Mehrfachmutationen oder dgl. eingesetzt werden, wobei Codons entweder kryptisch oder unter Austauschen der Aminosäure verändert werden können, Restriktionsstellen eingeführt oder entfernt werden können oder dergleichen. Wenn das Gen verkürzt worden ist, können die verlorenen Nucleotide unter Verwendung eines Adaptors ersetzt werden. Adaptoren sind zum Anfügen an codierende Bereiche besonders nützlich, um das richtige Leseraster sicherzustellen.
  • Die env-Domäne des HIV-I-Genoms kann durch Spaltung des Provirus mit EcoRI und KpnI und Reinigung eines Fragmentes mit 3300 Basenpaaren (Bp) erhalten werden, wobei das Fragment etwa 400 Bp des 5'-nicht-codierenden und etwa 200 Bp des 3'-nichtcodierenden Bereichs enthält. Drei verschiedene Methionine, die von der Sequenz im 5'-Ende des offenen Leserasters codiert werden, können als translationale Initiationsstellen dienen.
  • Die Spaltung von proviralen Sequenzen mit SacI und EcoRV stellt ein Fragment mit etwa 2300 Bp bereit, das die gag-Domäne und ein zweites kleines offenes Leseraster nahe beim 3'- Ende des gag-Bereichs enthält. Die gag-Domäne macht etwa 1500 Bp aus und codiert ein großes Vorläuferprotein, das zum Erhalt von Proteinen von etwa 25 000 (p25), 16 000 (p16) und 12 000 (p12) Daltons prozessiert wird. Die Spaltung mit SacI und BglII kann auch eingesetzt werden, um ausschließlich die gag- Domäne mit den p12-, p25- und teilweise p16-Bereichen zu erhalten.
  • Die Spaltung des Vorstehenden mit KpnI und SstI stellt ein Fragment bereit, das den Teil der pol-Domäne enthält, der p31 codiert.
  • Die Polypeptide, die durch die vorstehenden DNA-Sequenzen exprimiert werden, können auf ganz verschiedene Art und Weise verwendet werden. Die Polypeptide oder immunologisch aktive Fragmente davon können als diagnostische Reagentien, wobei sie in markierter oder unmarkierter Form oder immobilisiert (d. h. gebunden an eine feste Oberfläche) verwendet werden, als Impfstoffe, bei der Herstellung von monoclonalen Antikörpern, z. B. hemmenden Antikörpern, oder dergleichen eingesetzt werden.
  • Die DNA-Sequenzen können mit anderen Sequenzen, wie Viren, z. B. Vacciniavirus oder Adenovirus, verknüpft und zur Impfung verwendet werden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz des viralen Antigens in das Vacciniavirus an einer solchen Stelle eingefügt werden, daß sie exprimiert werden kann, wodurch ein Antigen von HIV-I bereitgestellt wird, das vom Wirt als Immunogen erkannt wird. Hierbei können die gag-, Pol- oder env-Gene oder Fragmente davon, die Immunogene codieren, eingesetzt werden.
  • Eine weitere Alternative besteht darin, die gag-, env- oder pol-Bereiche oder Teile davon mit HBsAg-Gen oder pre-S- HBsAg-Gen oder immunogenen Teilen davon zu verknüpfen, die zur Bildung von Partikeln in einem einzelligen Mikroorganismuswirt, z. B. Hefe, oder in Säugerzellen, befähigt sind. Auf diese Weise werden Partikel hergestellt, die, wenn der Wirt mit zusammengesetzten Partikeln geimpft wird, dem Wirt das HIV-I-Immunogen in immunogener Form präsentieren.
  • Als Impfstoffe können die verschiedenen Formen des Immunogens über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, z. B. oral, parenteral, intravenös, intraarteriell, subcutan und dergleichen. Üblicherweise werden sie in einem physiologisch verträglichen Träger bereitgestellt, im allgemeinen in destilliertem Wasser, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen. Verschiedene Adjuvantien können zugegeben werden, wie z. B. Aluminiumhydroxid, und die Dosierungen, die Häufigkeit der Verabreichung und die Art der Verabreichung empirisch bestimmt werden.
  • Zum Erhalt der HIV-I-Sequenz kann das Virus aus dem Überstand einer infizierten Wirtszelle pelletiert werden. Eine RNA-Sorte von 9 kB wird durch Elektrophorese der viralen RNA in Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt und anschließende Phenolextraktion gereinigt. Die gereinigte RNA kann sodann in einer Reversen Transkriptase-Reaktion als Matrize eingesetzt werden, wobei Primer mit zufälliger Sequenz verwendet werden. Die resultierende cDNA wird sodann auf Hybridisierung an PolyA+-RNA aus infizierten und nichtinfizierten Zellen abgesucht. Eine Hybridisierung, die bei Proben aus infizierten, nicht aber bei solchen aus nichtinfizierten Zellen stattfindet, ist auf das HIV-I zurückzuführen.
  • Genomische DNA aus infizierten Zellen kann durch Restriktionsenzyme gespalten und zur Herstellung einer Bakteriophagenbank verwendet werden. Aufgrund der Restriktionsanalyse der früher erhaltenen Fragmente des Retrovirus kann das virale Genom mit EcoRI teilweise gespalten werden, sodann können DNA- Fragmente von 9 kB bis 15 kB isoliert und zur Herstellung der Genbank eingesetzt werden. Der resultierende rekombinante Phage kann unter Verwendung eines "Double-Lift" -Absuchverfahrens unter Einsatz der viralen cDNA-Sonde abgesucht werden, worauf eine weitere Reinigung, z. B. Plaque-Reinigung, und eine Propagierung in großen Flüssigkulturen folgt. Aus der Bank kann die vollständige Sequenz des Virus erhalten und mit der vorstehend beschriebenen Sonde nachgewiesen werden.
  • HIV-I-DNA (entweder Provirus oder c-DNA) kann in einem beliebigen geeigneten Vektor cloniert werden. Konstrukte können entweder ringförmig oder linear hergestellt werden, wobei die HIV-I-DNA, entweder die gesamte HIV-I-DNA oder Fragmente davon, an ein Replikationssystem ligiert werden kann, das in einem Mikroorganismuswirt, in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen (Säuger, Hefe, Arthropoden, Pflanzen) funktionell ist. Mikroorganismuswirte umfassen E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa, S. cerevisiae, N. crassa usw . . Replikationssysteme können aus CoIEI, 2-Mikron-Plasmid, Lambda, SV40, Rinderpapillomavirus oder dergleichen stammen, d. h. sowohl aus Plasmiden als auch aus Viren. Neben dem Replikationssystem und der HIV-I-DNA enthält das Konstrukt üblicherweise außerdem einen oder mehrere Marker, die eine Selektion von transformierten oder transfizierten Wirten ermöglichen. Marker umfassen eine Biozid-Resistenz, z. B. die Resistenz gegen Antibiotika, Schwermetalle usw., die Komplementierung in einem auxotrophen Wirt, so daß dieser prototroph wird, und dergleichen.
  • Zur Expression werden Expressionsvektoren verwendet. Bei der Expression in Mikroorganismen kann sich der Expressionsvektor vom Clonierungsvektor darin unterscheiden, daß er Signalsequenzen aufweist, die die transkriptionale und translationale Initiation und Termination regulieren, und außerdem ein Replikationssystem umfassen kann oder auch nicht, das im Expressionswirt funktionell ist. Die codierende Sequenz ist zwischen den die Initiation und Termination regulierenden Signalen eingefügt, so daß sie unter deren regulatorischer Kontrolle liegt. Expressionsvektoren können außerdem die Verwendung von regulierbaren, z. B. temperatursensitiven oder durch Chemikalien induzierbaren, Promotoren oder von Genen umfassen, die die Integration und Amplifizierung des Vektors und der HIV-I-DNA erlauben, wie z. B. tk, dhfr, Metallothionein oder dergleichen.
  • Der Expressionsvektor wird in einen geeigneten Wirt eingeführt, wobei die regulatorischen Signale in einem solchen Wirt funktionell sind. Der Expressionswirt wird in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, wobei das gewünschte Polypeptid hergestellt und aus den Zellen oder, sofern das Polypeptid ausgeschieden wird, aus dem Medium isoliert wird.
  • Wenn ein Wirt eingesetzt wird, in dem die transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signale von HIV-I funktionell sind, kann die HIV-I-DNA-Sequenz so präpariert werden, daß sie für die Expression des gewünschten Polypeptids in geeigneter Weise neben den regulatorischen Signalen angeordnet ist.
  • Die Polypeptidprodukte können in im wesentlichen reiner Form erhalten werden, insbesondere frei von Trümmern aus menschlichen Zellen, wobei die Trümmer Verunreinigungen wie Proteine, Polysaccharide, Lipide, Nucleinsäuren, Viren, Bakterien, Pilze usw. und Kombinationen davon umfassen können. Im allgemeinen enthalten die Polypeptidprodukte weniger als etwa 0,1, üblicherweise weniger als etwa 0,01 Gew.-%, verunreinigendes Material aus dem Expressionswirt. Abhängig davon, ob das gewünschte Polypeptid im Cytoplasma produziert oder ob es ausgeschieden wird, ist die Art und Weise der Isolierung verschieden. Sofern das Produkt im Cytoplasma vorliegt, werden die Zellen geerntet, lysiert, das Produkt extrahiert und gereinigt, wobei Lösungsmittelextraktion, Chromatographie, Gel- Ausschluß, Elektrophorese oder dergleichen eingesetzt wird. Sofern das gewünschte Produkt ausgeschieden wird, wird es aus dem Nährmedium extrahiert und gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt.
  • Die Expressionsprodukte der env-, gag- und pol-Gene und immunogene Fragmente davon, die immunogene Stellen aufweisen, können zum Absuchen von Antiseren aus Patientenblut verwendet werden, um zu bestimmen, ob Antikörper vorliegen, die an HIV- I-Antigene binden. Im serologischen Test werden eines oder mehrere der rekombinanten Antigene verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen des Tests wird eine Kombination aus gag-, env- und pol-Antigenen eingesetzt. Eine Kombination aus rekombinanten p25-, p31- und env-Antigenen ist besonders bevorzugt. Viele verschiedene Immunassay-Techniken können eingesetzt werden, umfassend markierte oder unmarkierte Antigene oder immobilisierte Antigene. Die Markierung kann aus fluoreszierenden Substanzen, Radionucliden, Enzymen, chemilumineszierenden Substanzen, magnetischen Teilchen, Enzymsubstraten, Cofaktoren oder Inhibitoren, Liganden oder dergleichen bestehen.
  • Eine besonders geeignete Technik umfaßt die Bindung des Antigens an einen Träger, wie z. B. an die Oberfläche eines Teströhrchens oder die Vertiefung einer Testplatte oder an einen Streifen aus einem Material, wie z. B. Nitrocellulose oder Nylon, welches Proteine bindet, und das Inkontaktbringen der Probe mit dem immobilisierten Antigen. Nach Waschen des Trägers zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Antisera werden markierte Antikörper gegen menschliches Ig zugefügt. Der Träger wird sodann erneut gewaschen, um ungebundene markierte Antikörper gegen menschliches Ig zu entfernen. Anschließend wird das Vorliegen von gebundenem Analyt durch Nachweis der Markierung bestimmt.
  • ELISA und "Dot-Blot"-Assays sind zum Absuchen von Blut- und Serumproben auf anti-HIV-I-Antikörper besonders nützlich. Beim ELISA-Test werden Mikrotiterplatten mit Vertiefungen verwendet, die mit dem (den) antigenen HIV-I-Polypeptid(en) beschichtet worden sind. Außerdem werden die Vertiefungen typischerweise danach mit einem nichtantigenen Protein beschichtet, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern in der Probe an die Oberfläche der Vertiefungen zu verhindern. Die Probe wird in die Vertiefungen eingebracht und darin eine geeignete Zeitspanne unter Bedingungen inkubiert, die eine Antigen-Antikörper-Bindung begünstigen.
  • Anti-HIV-I-Antikörper, die in der Probe vorliegen, binden sodann an das (die) Antigen(e) auf der Vertiefungswand. Anschließend wird die Probe entfernt und die Vertiefungen gewaschen, um die verbliebene ungebundene Probe zu entfernen. Anschließend wird ein Reagenz, das enzymmarkierte Antikörper gegen menschliches Immunglobulin enthält, in die Vertiefungen eingebracht und darin inkubiert, wobei die Bindung zwischen den markierten Antikörpern gegen menschliches Ig und den an die Vertiefungswand gebundenen Komplexen aus HIV-I-Antigen und menschlichem Antikörper stattfinden kann. Nach vollständigem Ablaufen der Inkubation wird das Reagenz entfernt und die Vertiefungen zur Entfernung von ungebundenem markiertem Reagenz gewaschen. Sodann wird ein Substratreagenz in die Vertiefungen zugegeben und darin inkubiert. Die enzymatische Aktivität auf dem Substrat wird visuell oder spektrophotometrisch bestimmt und ist ein Indikator für das Vorliegen und die Menge des an die Vertiefungsoberfläche gebundenen Immunkomplexes, der anti- HIV-I-Antikörper enthält.
  • Das "Dot-Blot"-Verfahren umfaßt die Verwendung von HIV-I- Antigen(en), das (die) an ein Stück oder einen Streifen aus saugfähigem Trägermaterial, wie z. B. Nitrocellulose-Filterpapier oder Nylonmembran, immobilisiert ist (sind), anstelle der mit Antigen beschichteten Mikrotiterplatten. Anschließend wird der Träger auch mit einem nichtantigenen Protein behandelt, um eine unspezifische Bindung von Antikörper an den Träger zu verhindern. Der das Antigen tragende Träger wird in die Probe eingetaucht und zur Inkubation darin belassen. Wieder kommt es zur Bindung der in der Probe vorliegenden anti-HIV-I-Antikörper an das (die) an den Träger immobilisierte(n) Antigen(e). Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der Träger aus der Probe entnommen und wiederholt in Waschpuffer eingetaucht, um die ungebundene Probe vom Papier zu entfernen. Sodann wird der Träger eine geeignete Inkubationszeit in das Reagenz mit dem enzymmarkierten Antikörper gegen menschliches Ig eingetaucht. Nach der Behandlung mit dem markierten Reagenz wird der Träger in Waschpuffer eingetaucht und danach in der Substratlösung inkubiert. Die Enzymaktivität, die das Vorliegen von anti-HIV- I-Antikörper-enthaltenden Komplexen auf dem Träger anzeigt, führt zu Farbänderungen auf dem Träger, die optisch nachgewiesen werden können.
  • Jede dieser Techniken kann so modifiziert werden, daß andere Markierungen als Enzyme verwendet werden können. Dementsprechend werden die Ablese- oder Nachweisverfahren verändert.
  • Die antigenen Polypeptide von HIV-I können auch selbst als Immunogene verwendet oder mit anderen Polypeptiden kombiniert werden, wobei Antiseren oder monoclonale Antikörper hergestellt werden, die zur Therapie oder Diagnose verwendet werden können. Die Immunglobuline können aus einer beliebigen Säugerquelle, z. B. einem Nager, wie Ratte oder Maus, einem Primaten, wie Pavian, Affe oder Menschen, oder dergleichen stammen. Zur Diagnose können die Antikörper in herkömmlicher Art und Weise eingesetzt werden, um HIV-I in einer klinischen Probe nachzuweisen.
  • Die HIV-I-DNA-Sequenzen können auch mit isotopen und nichtisotopen Labels oder Markierungen markiert und als DNA- Sonden verwendet werden, um das Vorliegen von natürlichen HIV- I-Nucleotidsequenzen in solchen Proben nachzuweisen, von denen angenommen wird, daß sie diese enthalten.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise als einschränkend angesehen werden.
    • 1. "AIDS Related Virus-2" (ARV-2), Reinigung und Herstellung von viraler RNA
  • Die mit ARV-2 infizierten HUT-78-Zellen (ATCC Hinterlegungsnummer CRL 8597, hinterlegt am 7. August 1984) wurden von Dr. Jay Levy, University of California, San Francisco, erhalten. Die Kulturen wurden zwei Wochen in RPMI-Medium mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. Sodann wurden die Kulturen unter Verwendung eines SW-28-Rotors eine Stunde bei 2 kUpM und 4ºC zentrifugiert. Das Pellet, das das Virus enthielt, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, auf Eis resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde mit 10 ug DNase (Boehringer Mannheim) versetzt und auf einen linearen Saccharosegradienten (15 bis 50% in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 20 mM NaCl) aufgetragen. Der Gradient wurde vier Stunden bei 34 kUpM und 4ºC in einem SW-41-Rotor zentrifugiert. Fünf Fraktionen 2,5 ml wurden gesammelt und ein Aliquot jeder Fraktion in einem Gel aus 1% Agarose und 5 mM Methylquecksilberhydroxid der Elektrophorese unterworfen (Bailey und Davidson, Anal. Biochem. 70 (1976), 75-85), wobei bestimmt wurde, welche Fraktion die virale RNA mit 9 kB enthielt. Die Fraktion, die die viralen RNA enthielt, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, auf 10 ml verdünnt und zwei Stunden bei 34 kUpM und 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA, 0,1% SDS und 200 ug/ml Proteinase K resuspendiert. Die Inkubation wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Gemisch wurde mit Phenol extrahiert, die wäßrige Phase auf 400 mM NaCl gebracht und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und bei -70ºC gelagert.
  • Zur Reinigung der viralen RNA aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Nucleinsäurepellet wurde eine Probe der Elektrophorese in einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt, das 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielt, unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 0,1% Ethidiumbromid gefärbt und die Nucleinsäurebanden unter UV-Licht sichtbargemacht. Die Region, die 9 kB entsprach, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose zwei bis drei Minuten bei 70ºC in drei Volumina 0,3 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, geschmolzen. Das Gemisch wurde mit dem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wurde erneut mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde mit kaltem 95% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in Wasser resuspendiert und bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert. 100 ml Kulturmedium ergaben 0,5 bis 1 ug gereinigte RNA.
    • 2. Synthese der markierten homologen viralen Sonde
  • Eine 32 P-markierte cDNA wurde zu der über das Gel gereinigten viralen RNA hergestellt, wobei Primer mit zufälliger Sequenz verwendet wurden (Kalbsthymus-Primer), die, wie in Maniatis et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982, beschrieben, hergestellt wurden. Das Reaktionsgemisch enthielt 2 ul 0,5 M MgCl&sub2;, 5 ul 0,1 M Dithiothreitol, jeweils 2,5 ul 10 mM dATP, 10 mM dGTP und 10 mM dTTP, 2,5 ul Kalbsthymus-Primer (100 A&sub2;&sub6;&sub0;/ml), 0,5 ug virale RNA, 5 ul Actinomycin D (200 ug/ml), 10 ul ³²P-dCTP (> 3000 Ci/mMol, 1 mCi/ml) und 1 ul AMV-Reverse Transkriptase (17 Einheiten/ul) in einem Reaktionsvolumen von 50 ul. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Sonde wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephade® G50-Säule von freien Nucleotiden gereinigt. Das Ausschlußvolumen wurde vereinigt, NaCl bis zu einer Endkonzentration von 400 mM und einzelsträngige Träger-DNA bis zu 100 ug/ml zugefügt und die cDNA mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und die eingebauten ³²P-Impulse gezählt.
    • 3. Nachweis von ARV-Sequenzen in PolyA+-RNA hergestellt aus infizierten HUT-78-Zelenl
  • PolyA+-RNA wurde aus HUT-78-Zellen, infiziert mit ARV-2, ARV-3 oder ARV-4 (drei verschiedene Isolate aus drei verschiedenen AIDS-Patienten), und aus nichtinfizierten HUT-78-Zellen hergestellt. Die PolyA+-RNA wurde auf 1% Agarosegelen, die 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielten (Bailey und Davidson, a.a.O.), einer Elektrophorese unterworfen, auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit der homologen Sonde hybridisiert, die wie in Abschnitt 2 beschrieben hergestellt worden war. Hybridisierungen wurden in 50% Formamid, 3 · SSC, bei 42ºC durchgeführt. Gewaschen wurde in 0,2 · SSC bei 50ºC. Eine Bande mit 9 kBp lag in allen drei Proben der infizierten HUT-78- Zellen vor. Diese Bande fehlte in PolyA+ aus nichtinfizierten Zellen.
    • 4. Nachweis von ARV-Sequenzen in infizierten und nichtinfizierten HUT-78-Zellen
  • Hochmolekulare (chromosomale) DNA wurde aus mit ARV-2 infizierten Kulturen von HUT-78-Zellen und aus nichtinfizierten HUT-78-Zellen nach dem Verfahren von Luciw et al., Molec. and Cell Biol. 4 (1984), 1260-1269, hergestellt. Die DNA wurde mit Restriktionsenzym(en) gespalten, einer Elektrophorese in 1% Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulose geblottet, wobei das von Southern (1975), a.a.O., beschriebene Verfahren angewendet wurde. Blots wurden mit ³²P-markierter Sonde (106 cpm/Blot) in einem Gemisch, das 50% Formamid, 3 · SSC, 10 mM Hepes, pH 7.0, 100 ug/ml denaturierte Träger-DNA, 100 ug/ml Hefe-RNA und 1 · Denhardt enthielt, 36 Stunden bei 42ºC hybridisiert. Die Filter wurden einmal bei Rauintemperatur in 2 · SSC und zweimal bei 42ºC in 0,2 · SSC, 0,1% SDS, gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und auf einen X-Omat-Film unter Verwendung eines Verstärkungsschirmes aufgebracht.
  • Die homologe ³²P-Sonde gegen ARV-2 hybridisierte spezifisch mit zwei Banden in der mit SacI gespaltenen DNA aus infizierten Zellen. Diese Banden fehlten, wenn DNA aus nichtinfizierten Zellen verwendet wurde, dies zeigte, daß die Sonde spezifisch mit infizierten Zellen hybridisiert, vermutlich mit dem in der chromosomalen DNA integrierten Provirus. Das Molekulargewicht der Banden beträgt etwa 5 kB und 3 kB.
  • Um festzustellen, ob verschiedene Enzyme die proviralen Sequenzen spalten können, wurden mehrere andere Restriktionsspaltungen der Zell-DNA unter Verwendung von EcoRI, SphI oder KpnI oder doppelte Spaltungen unter Verwendung von zwei solchen Enzymen durchgeführt. Die Southern-Ergebnisse zeigen spezifische Banden, die hybridisieren, wenn DNA aus infizierten Zellen verwendet wird. Fig. 1 zeigt eine schematische Karte der Positionen von Restriktionsenzymstellen in der proviralen Sequenz und bezeichnet Fragmentstellen.
    • 5. Clonierung von proviraler ARV-2-DNA
  • Hochmolekulare Zell-DNA aus infizierten HUT-78-Zellen wurde hergestellt, wobei das Verfahren von Luciw et al., a.a.O., angewendet wurde. Die DNA wurde mit EcoRI, das im Provirus einmal schneidet, gespalten, in einem Saccharosegradienten zentrifugiert und die Fraktionen, die 8 bis 15 kB entsprachen, vereinigt, dialysiert und durch Ethanolfällung eingeengt. Der aus dem Bakteriophagen · stammende Clonierungsvektor EMBL-4 (Karn et al., Methods Enzvinol. 101 (1983), 3-19) wurde mit einem Gemisch aus den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI und Sall vollständig gespalten und die DNA sodann durch Phenol- Chloroform-Extraktion entproteinisiert, mit kaltem Ethanol gefällt und in Ligierungspuffer resuspendiert. Die EMBL-4-Phagen-DNA und das EcoRI-Spaltprodukt von zellulärer DNA wurden gemischt und ligiert und die resultierenden rekombinanten Phagengenome in vitro verpackt. Nach Phageninfektion von λ-sensitivem E. coli (DP50supF) wurden etwa 500 000 Phagenplaques auf Nitrocellulosefilter übertragen, die DNA fixiert und die Filter mit einer homologen ³²P-Sonde abgesucht, die, wie in Abschnitt 2 beschrieben, hergestellt worden war. In dem anfänglichen "Double-Lift"- Absuchverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, NY, 1982) wurden von 500 000 Phagen elf rekombinante Phagen an die virale cDNA-Sonde angelagert, diese wurden einer weiteren Plaque-Reinigung unterworfen und in großen Flüssigkulturen zur Herstellung von rekombinanter DNA vermehrt. Plaque-gereinigte Phagen, die ARV- DNA enthielten, wurden in Flüssigkultur in E. coli DP50supF vermehrt, Phagenpartikel geerntet, in CsCl-Gradienten in Banden aufgetrennt und die rekombinante Phagen-DNA durch Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung hergestellt (Maniatis et al., a.a.O.). Ein ug gereinigte Phagen-DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten, einer Elektrophorese auf 1% Agarosegelen unterworfen und mit Ethidiumbromid unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die DNA aus diesen Gelen wurde auf Nitrocellulose übertragen und zeigte Annelierung mit der viralen cDNA-Sonde.
  • Einer der elf Phagen, der mit λ-ARV-2(9B) bezeichnet worden war, wurde am 25. Januar 1985 bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 40158. λ-ARV-2(9B) enthielt eine Insertion von proviraler DNA in voller Länge zusammen mit flankierenden Zellsequenzen. Die Spaltung von λ-ARV-2(9B)-DNA mit SacI ergab virale DNA-Fragmente von 3,8 kB und 5,7 kB. EcoRI-Spaltung von λ-ARV-2(9B) erzeugte Virus-enthaltende DNA- Fragmente mit 6,4 kB und 8,0 kB; eine doppelte Spaltung mit SacI und EcoRI ergab virale DNA-Fragmente mit 3,8 kB und 5,4 kB. Dieses Muster stimmt mit demjenigen eines mit Zell-DNA verbundenen Provirus überein.
  • Zusätzlich zu λ-ARV-2(9B) wurde ein Phage erhalten, der (1) die linke Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle der viralen DNA aus enthielt, wobei er sich in die flankierende Zell-DNA erstreckte (λ-ARV-2(8A)) und (2) ein Phage, der die rechte Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle der viralen DNA aus aufweist, wobei er sich in die flankierende Zell-DNA erstreckte (λ-ARV-2(7D)). Die Bakteriophagen λ-ARV- 2(7D) (rechts) und λ-ARV-2(8A) (links) wurden am 26. Oktober 1984 bei der ATCC hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern 40143 bzw. 40144.
    • 6. Polymorphismus
  • Um die Verwandtschaft von unabhängigen ARV-Isolaten zu bestimmen, wurden Restriktionsenzym-Spaltprodukte von DNA aus HUT-78-Zellen, die mit ARV-3 und ARV-4 infiziert waren, mit der aus clonierter ARV-2-DNA hergestellten Sonde analysiert. Das SacI-Spaltprodukt von ARV-3-DNA war dem von ARV-2 ähnlich, wohingegen die HindIII-Spaltprodukte unterschiedliche Muster zeigten. Das SacI-Spaltprodukt und das PstI-Spaltprodukt von ARV-4-DNA unterschieden sich von den entsprechenden Spaltprodukten von ARV-2-DNA. Die Intensität der sich anlagernden Signale war mit ARV-3- und ARV-4-Proben viel geringer (etwa 10- mal niedriger) als diejenige, die mit ARV-2-DNA erhalten wurde, möglicherweise infolge der Tatsache, daß in den ARV-3- und ARV-4-Kulturen weniger Zellen infiziert waren. Die Virusspezifischen DNA-Fragmente, die durch SacI-Behandlung von ARV- 3- und ARV-4-DNA hergestellt worden waren, machten insgesamt 9,0 bis 9,5 kBp aus, ein Wert, der dem von ARV-2 ähnlich ist und mit den RNA-Genomgrößen übereinstimmt.
    • 7. Sequenzierung von proviraler DNA
  • Fragmente oder Subfragmente von ARV-2-DNA aus dem λ-Phagen 9B wurden hergestellt und gemäß herkömmlichen Verfahren in M13 cloniert (Maniatis et al., a.a.O.). Die Sequenzierung wurde gemäß Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, durchgeführt, wobei der universelle M13-Primer oder chemisch synthetisierte Primer verwendet wurden, die komplementär zur ARV-2-Sequenz sind. Die Sequenz wird in Fig. 2 gezeigt.
    • 8. Aminosäure-Sequenzanalyse der von P25- und p16-gag codierten Proteine
  • ARV-2 wurde wie in Abschnitt 1 hergestellt und gereinigt. Die viralen Proteine wurden der Elektrophorese auf einem Acrylamidgel unterworfen und die Bande, die einem Protein mit 24 000 Dalton oder einem mit 16 000 Dalton entsprach, aus dem Gel ausgeschnitten und zur Sequenzierung verwendet. Eine Mikrosequenzanalyse wurde unter Verwendung des Proteinsequenzators Modell 470A von Applied Biosystems durchgeführt, wie von Hewick et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 7990-7997, beschrieben. Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch HPLC unter Verwendung einer Beckman Ultrasphere ODS-Säule und eines Trifluoressigsäure-Acetonitril-Puffersystems identifiziert, wie von Hawke et al., Anal. Biochem. 120 (1982), 302-311, beschrieben. Tabelle 1 zeigt die ersten 20 Aminosäuren aus dem Amino-Terminus, die für das p25 gag-Protein bestimmt wurden, Tabelle 2 zeigt die ersten 30 Aminosäuren für das p16 gag-Protein. TABELLE 1: Amino-terminale Sequenz von p25 gag Position Aminosäure TABELLE 2: Aiaino-terminale Sequenz von p16 gag Position Aminosäure
  • Die Aminosäuresequenz von Tabelle 1 kann aus der ARV-2- DNA-Sequenz von Fig. 2 vorausgesagt werden. Diese Ergebnisse bestätigen somit, daß das angegebenen offene Leseraster von gag tatsächlich translatiert wird und die N-Termini von p25 und p16 darstellt.
    • 9. Expression des p25 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien A. Wirt-Vektor-System
  • Das p25 gag-Protein wird von dem mit Plasmid pGAG25-10 transformierten E. coli-Stamm D1210 synthetisiert.
  • Plasmid pGAG25-10 ist ein pBR322-Derivat, das die für p25 gag codierende Sequenz unter transkriptionaler Kontrolle eines hybriden tac-Promotors enthält (De Boer et al., PNAS 80 (1983), 21-25), der aus den Sequenzen der trp- und lac-UV5- Promotoren stammt. Die Expression von p25 gag wird in bakteriellen Transformanten mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert.
  • E. coli D1210, ein Stamm, der den lac-Repressor im Übermaß herstellt, trägt die lacIq- und lacY&spplus;-Allele auf dem Chromosom, ist aber ansonsten identisch mit E. coli HB101 (F&supmin;, lacI&spplus;, laco&spplus;, lacZ&spplus;, lacY&supmin;, gal&supmin;, pro&supmin;, leu&supmin;, thi&supmin;, end&supmin;, hsm&supmin;, hsr&supmin;, recA&supmin;, rpsL&supmin;), von dein er hergeleitet wurde.
    • B. Konstruktion von pGAG25-10
  • Plasmid pGAG25-10 wurde durch Clonierung eines für p25 gag codierenden DNA-Fragmentes mit 699 Bp in Plasmid ptac5 konstruiert, gemäß dem in Fig. 3 gezeigten Schema. Der Vektor ptac5 ist ein pBR322-Derivat, das den tac-Promotor, Shine Delgarno-Sequenzen und einen Polylinker als Ersatz für die ursprünglichen, zwischen den EcoRI- und PvuII-Restriktionsstellen enthaltenen pBR322-Sequenzen umfaßt.
  • Das DNA-Fragment mit 699 Bp codiert das komplette p25 gag-Protein (Aminosäurereste 139 bis 369, wie in Fig. 2 numeriert), wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß in pGAG25-10 ein Methionin als erste Aminosäure eingefügt wurde, um die translationale Initiation zu ermöglichen. Diese Änderung, wie auch weitere Änderungen der Nucleotidsequenz, wie nachstehend angegeben, wurde erhalten, indem Teile des DNA- Fragmentes chemisch synthetisiert wurden. Das DNA-Fragment umfaßt außerdem zwei Stopp-Codons am 3'-Ende der Sequenz.
  • Fig. 4 zeigt die in pGAG25-10 clonierte Nucleotidsequenz und die daraus hervorgehende Aminosäuresequenz. DNA-Sequenzen, die in der Figur nicht unterstrichen sind, wurden direkt aus der ARV-2(9B)-cDNA hergeleitet. Alle anderen Sequenzen wurden chemisch synthetisiert oder vom Vektor ptac5 hergeleitet. Änderungen, bezogen auf die ursprüngliche cDNA, wurden in diese DNA-Sequenz eingeführt, wobei Restriktionsstellen erzeugt oder deletiert, ein Methionin vor dem Prolin (erster Rest von p25) eingefügt oder Stopp-Codons nach dem letzten Codon von p25 gag eingebaut wurden. Wie vorstehend aufgezeigt, kommt es jedoch durch alle Änderungen der DNA-Sequenz, ausgenommen die im ersten Codon, zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz von p25 gag.
    • C. Herstellung des D1210-(pGAG25-10)-Stammes und Charakterisierung des durch Transformanten exprimierten p25 gag- Proteins
  • E. coli D1210-Zellen werden unter Befolgen eines Standardprotokolls (Cohen et al., PNAS 69 (1972), 2110) für die Transformation kompetent gemacht. Die Transformation wird, wie im Protokoll angegeben, mit 25 bis 50 ng pGAG25-10 durchgeführt. Das Transformationsgemisch wird auf Agarplatten plattiert, die mit L-Brühe, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, hergestellt wurden. Die Platten werden 12 Stunden bei 37ºC inkubiert.
  • Einzelne Ampicillin-resistente Kolonien werden in 1 ml L- Brühe, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, überführt und bei 37ºC gezüchtet. Die Expression des p25 gag-Proteins wird induziert, indem 10 ul 100 mM IPTG (Sigma) zum Erhalt einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben werden, worauf eine zweistündige Inkubation bei 37ºC folgt.
  • Die Zellen aus 1 ml induzierten Kulturen werden pelletiert und in 100 ul Laemmli-Probenpuffer resuspendiert. Nach drei Zyklen aus Kochen und Einfrieren werden Proben der resultierenden Lysate auf herkömmlichen denaturierenden Acrylamidgelen analysiert. Proteine werden durch Färbung mit Coomassie- Blau sichtbar gemacht.
  • Das Ausmaß der Expression wird als erstes dadurch bestimmt, daß das Erscheinen von neuen Proteinbanden bei den fraglichen induzierten Proben im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wird. Proteine mit solchen Molekulargewichten, die für die exprimierten Gene erwartet werden, machten in den Rekombinanten mit der höchsten Expression 2 bis 5% des gesamten Zellproteins aus, dies wurde durch visuelle Begutachtung im Vergleich zu einem Standarprotein bestimmt, dessen Menge bekannt war.
  • Die Echtheit der exprimierten Proteine wird durch herkömmlichen Western-Transfer der Proteine auf Nitrocellulose und durch Analyse mit geeigneten menschlichen oder Kaninchen- Immunseren oder mit monoclonalen Antikörpern der Maus (vgl. E.4.a., nachstehend) oder durch ELISA-Tests von löslichen E. coli-Proteinen unter Verwendung von menschlichen Immunseren aus AIDS-Patienten (vgl. E.4.b., nachstehend) bestimmt.
    • D. Fermentationsverfahren D.1. Herstellung des transformierten Original-Anzuchtvorrats
  • Transformierte Zellen aus einer Kultur, die p25 gag in hohen Konzentrationen (3%) exprimiert, werden auf eine L- Brühe-Platte ausgestrichen, die 100 ug/ml Ampicillin enthält, und die Platte über Nacht bei 37ºC inkubiert. Eine Einzelkolonie wird in 10 ml L-Brühe, 100 ug/ml Ampicillin, eingeimpft und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Ein Aliquot wird verwendet, um mittels Restriktionskartierung mit SaII und PstI die Plasmidstruktur zu bestätigen. Ein zweites Aliquot wird verwendet, um die Expression von p25 gag zu induzieren, und der Rest der Kultur wird durch Zusatz von ¼ Volumen 75%-igem sterilem Glycerin auf 15% Glycerin gebracht. Die Glycerin-Zellvorräte werden in Aliquots zu je 1 ml aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff oder in einem Trockeneis-Ethanol-Bad rasch eingefroren. Diese Original-Anzuchtvorräte werden bei -70ºC gelagert.
    • D.2. Original-Platte/Einzelkolonien und Übernacht-Kulturen
  • Der Original-Anzuchtvorrat wird mit einem sterilen Auftrageinstrument aufgenommen, damit wird sodann eine L-Brühe- Platte, die 100 ug/ml Ampicillin enthält, ausgestrichen. Einzelkolonien von dieser Platte werden zur Beimpfung von 20 bis 50 ml L-Brühe/Amp. verwendet, die anschließend über Nacht bei 37ºC inkubiert wird.
    • D.3. Fermenter-Impfmaterial
  • Ein Aliquot der Übernachtkultur wird zur Beimpfung von größeren Volumina (1 bis 6 Liter) L-Brühe/Amp. verwendet. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC inkubiert und nach Erreichen einer OD&sub6;&sub5;&sub0; von etwa 5 als Impfmaterial für den Fermenterlauf eingesetzt.
    • D.4. Fermentation und Ernte
  • Fermenter (Kapazität: 16 Liter), die 10 l L-Brühe und 1 ml Antischaum enthalten, werden mit 100 bis 500 ml Impfkultur beimpft. Die Zellen werden bei 37ºC bis zu einer OD von etwa 1 gezüchtet. Die Expression von p25 gag wird durch Zusatz von 100 ml einer IPTG-Lösung (100 mM) induziert, wodurch im Fermenter eine Endkonzentration von 1 mM erhalten wird. Die Zellen werden weitere drei Stunden gezüchtet und anschließend unter Einsatz von kontinuierlicher Durchflußzentrifugation geerntet. An dieser Stelle können die Zellen eingefroren und bis zur Reinigung von p25 gag bei -20ºC aufbewahrt werden. Alternativ können 250-Liter-Ferinenter mit 1 bis 5 l Impfkultur beimpft werden. Wachstum, Induktion und Ernte werden, wie vorstehend angegeben, durchgeführt.
    • E. Reinigung und Charakterisierung von p25 gag E. 1. Zellaufschluß
  • Gefrorene E. coli-Zellen werden aufgetaut und in 2,5 Volumina Lysepuffer (0,1 M Natriumphosphat (NaPi), pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) suspendiert. Die Zellen werden in einem nichtkontinuierlichen System unter Verwendung einer 300 ml- Glaseinheit der "Dynomill" und 140 ml mit Säure gewaschenen Glasperlen 15 Minuten bei 3000 UpM aufgeschlossen. Die ummantelte Kammer wird durch eine -20ºC kalte Ethylenglykollösung kühl gehalten. Die aufgeschlossenen Zellen werden zur Entfernung von Zelltrümmern und Glasperlen 25 Minuten bei 27 000 · g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und bei 4ºC gehalten.
    • E.2. Selektive Proteinfällung
  • Das Zellextrakt wird durch langsame Zugabe von Ammoniumsulfat bei 4ºC auf 30% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gebracht. Das Extrakt wird nach Erreichen der Endkonzentration 10 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 27 000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton® X-100 und 5% SDS resuspendiert und sodann 5 Minuten gekocht.
    • E.3. Gelfiltration
  • Die durch die selektive Fällung erhaltene Fraktion wird einer Gelfiltration unterworfen, wobei eine in 0,03 M NaPi, pH 6,8, äquilibrierte G50-Sephadex-Säule verwendet wird. Die Chromatographie wird in der gleichen Lösung durchgeführt. Die Fraktionen werden gesammelt und die Absorbanz bei 280 nm bestimmt. Fraktionen, die Protein enthalten, werden vereinigt und durch Protein-Gelelektrophorese, Western-Analyse und ELISA charakterisiert.
    • E.4. Charakterisierung von rekombinantem p25 gag a. Protein-Gelelektrophorese
  • Die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse (10 bis 20% Gradientengele) der Proteine aus den pGAG25-enthaltenden Zellen und aus Kontrollzellen zeigte, daß in Zellen, die p25 gag-Expressionsplasmide enthielten, nach Depression des tacI-Promotors mit IPTG unterschiedliche Mengen eines Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000 spezifisch induziert wurden. Die Identität des p25 gag-Genproduktes wurde sowohl durch einen "Enzyme linked Immunosorbent Assay" (ELISA, vgl. E.4.c.) als auch durch die Western-Immunblot-Analyse (vgl. E.4.b.) bestätigt, wobei sowohl Serum von AIDS-Patienten als auch ein monoclonaler Antikörper gegen virales p25 gag verwendet wurde.
    • b. Western-Analyse
  • Die Proben wurden unter denaturierenden Bedingungen einer Elektrophorese auf einem 10 bis 20% Polyacrylamid-Gradientengel unterworfen. Die Proben wurden auf Nitrocellulose elektrogeblottet. Das Nitrocellulosepapier wurde mit einer 1 : 250-Verdünnung von Referenzserum von AIDS-Patienten (EW5111, erhalten von P. Feorino, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia) und anschließend mit einer 1 : 500-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Immunglobulin (Cappel, Nr. 3201-0081) gewaschen. Alternativ wurde die Nitrocellulose mit unverdünntem Kulturüberstand von 76C, einem murinen monoclonalen Antikörper gegen ARV-2-p25 gag, und anschließend mit einer 1 : 500-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen Maus-Immunglobulin (TAGO, Nr. 6450) gewaschen. Das Substrat für die Immunblots war ein HRP-Farbentwicklungs-Reagenz, das 4-Chlor-1-naphthol enthielt.
  • Das p25 gag-Protein reagierte sowohl mit dein Referenzserum von AIDS-Patienten als auch mit dem monoclonalen Antikörper, dagegen zeigt es keine Reaktivität mit dem nichtimmunen Serum.
    • c. ELISA
  • p25 gag wurde, wie vorstehend beschrieben, aus bakteriellen Extrakten gereinigt. Die Reaktivität von Seren mit dem gereinigten Protein wurde getestet, indem Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 0,25 ug/ml beschichtet, Verdünnungen von Testseren (positives Referenzserum EW5111 von menschlichem negativem Serum) und anschließend eine 1 : 1000-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Immunglobulin zugegeben wurden. p25 gag-Protein reagierte mit dem positiven Serum mit einem Titerationskurven-Mittelpunkt von etwa 1 : 800. Mit dein Serum von einer normalen Versuchsperson zeigte sich keine Reaktivität.
    • 10. Vergleich des rekombinanten p25 gag-Proteins und des natürlichen p25 gag-Proteins in ELISA
  • Die Reaktivität von gereinigtem rekombinantem p25 gag mit verschiedenen Seren wurde mit der von natürlichem p25 gag-Protein, das durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt worden war, in einem ELISA-Test verglichen. Zur Kontrolle wurden außerdem Tests durchgeführt, wobei aufgeschlossenes, über Gradienten gereinigtes Virus (5 ug/ml) verwendet wurde.
  • Mikrotiterplatten aus PVC wurden mit 10 ug/ml (50 ul pro Vertiefung in 0,1 M Natriumborat, pH 9,0) der Ascites-Ig-Fraktion, bestehend aus murinem monoclonalem Antikörper 76C gegen p25 gag, zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und die Vertiefungen mit 10% normalem Ziegenserum in PBS gefüllt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit normaler Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Triton® X-100 (ST), gewaschen und Verdünnungen des Test-ARV-Proteins (50 ul pro Vertiefung in ST mit 10% Ziegenserum [STGS]) zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platten wurden zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, mit ST gewaschen und anschließend mit 50 ul/Vertiefung des gegen aufgeschlossenes ARV erhaltenen Kaninchen-Antiserums (1 : 1000-Verdünnung in STGS) eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen, eine Stunde mit 50 ul einer 1 : 1500- Verdünnung in STGS von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen Kaninchen-Immunglobulin inkubiert, gewaschen, anschließend mit 50 ul Substratlösung pro Vertiefung (150 ug/ml 2,2'-Azinodi[3-ethylbenzthiazolensulfonsäure], 0,001% H&sub2;O&sub2;, 0,1 M Citrat, pH 4) versetzt. Die Umsetzung wurde nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC durch Zusatz von 50 ul 10% SDS pro Vertiefung abgestoppt. Die Absorbanz wurde auf einem Flow-Titertech- ELISA-Ablesegerät bei 414 nm abgelesen. Proben wurden doppelt getestet, hiermit wurde bei einer Verdünnung von 1 : 10 begonnen, danach wurden serielle zweifache Verdünnungen angelegt.
  • In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse der Tests zusammengefaßt, wobei die acht AIDS-Seren im Test mit aufgeschlossenem Virus als positiv eingestuft und die sechs normalen Seren im Test mit aufgeschlossenem Virus als negativ eingestuft wurden. ELISA-TEST-TITERa SERUM-NUMMER aufgeschl. Virus rekomb. p25 gag virales p25 gag Gruppe I: Seren, im Virus-ELISAb als positiv eingestuft Gruppe II: Seren, im Virus-ELISAb als negativ eingestuft
  • a. Angegeben als der reziproke Wert der Serumverdünnung, die ein Signal ergab, das 50% des Maxiinums entsprach.
  • b. Die Ergebnisse wurden durch Immunfluoreszenz und Immunblotting, wie vorstehend beschrieben, bestätigt.
  • c. Kein nachweisbares Signal bei einer Serumverdünnung von 1 : 25.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß das aus Bakterien gereinigte p25 gag sich in einem ELISA mit acht Seren von AIDS-Patienten genauso verhält wie das auf ähnliche Weise gereinigte p25 gag aus AIDS-Virus. Die Ergebnisse des ELISA zeigen, daß bei den Spiegeln der anti-p25-gag-Antikörper eine große Schwankungsbreite vorliegt, die darauf hinweist, daß Antikörper gegen einige Virus-codierte Proteine möglicherweise nicht nachgewiesen werden können, wenn herkömmliche, auf Virus basierende Testsysteme verwendet werden.
    • 11. Expression des P41 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien
  • Ein Fusionsprotein aus den p25 gag- und p16 gag-Proteinen von ARV-2, das mit p41 gag bezeichnet wurde, wurde in dem mit Plasmid pGAG41-10 transformierten E. coli-Stamm D1210 synthetisiert. pGAG41-10 wurde aus Plasmid pGAG25-10 konstruiert, wie in Fig. 3 gezeigt, indem ein SphI-HpaI-Fragment aus dem ARV-2-Genom eingefügt wurde, das die Sequenzen aus dem C-terminalen p16 gag-Teil des p53 gag-Vorläufer-Polyproteins und einen Teil des p25 gag-Proteins zwischen den SphI- und BamHI- Stellen von pGAG25-10 enthielt. Der codierende Strang der in pGAG41-10 clonierten DNA-Sequenz wird in Fig. 5 dargestellt. Die Transformation und die Induktion der Expression wurden nach den vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zellen wurden behandelt und das p41 gag-Protein auf einem mit Coomassie gefärbten Gel, wie vorstehend beschrieben, sichtbar gemacht. Das ungefähre Molekulargewicht des beobachteten Proteins betrug 41 000 Dalton. Das Protein reagierte in Western- und ELISA-Analysen, die wie vorstehend durchgeführt wurden, mit AIDS-Seren und monoclonalem Antikörper gegen p25 gag.
    • 12. Expression des p16 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien
  • Die Sequenz, die in Fig. 6 gezeigt wird und die das p16 gag-Protein codiert, wurde chemisch synthetisiert, wobei von Hefe bevorzugte Codons verwendet wurden. Das SalI-Fragment mit glatten Enden (381 Bp) wurde in das mit PvuII-SalI gespaltene und über Gel isolierte ptac5 cloniert (vgl. die vorstehenden Abschnitte 9 und 11). Das resultierende Plasinid wurde zur Transformation von D1210-Zellen verwendet, wie im vorstehenden Absatz 9 beschrieben. Die Expression wurde mit IPTG induziert und die Proteine durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Analyse analysiert. Eine Bande mit etwa 16 000 Dalton wurde in den transformierten Zellen durch IPTG induziert. Dieses Protein zeigte in Western-Blots mit Iminunseren von AIDS- Patienen Reaktivität. Keine Reaktivität wurde mit Seren von normalen Versuchspersonen beobachtet.
  • Ein rekombinantes gag-Protein wurde außerdem in Cos-Zellen (Säugerzellen) exprimiert.
    • 13. Produktion des ARV-2-env-Proteins durch Hefe A. Wirt-Vektor-System
  • Ein partielles env-Protein wird durch das mit Plasmid pDPC303 transformierte S. cerevisiae 2150-2-3 synthetisiert. Plasmid pDPC303 ist ein Hefe-Expressionsvektor, der die für 2/3 des env-Proteins codierende Sequenz und außerdem pBR322- Sequenzen, umfassend das amp®-Gen, und 2-Mikron-Sequenzen, umfassend das Hefe-leu-2-04-Gen enthält. Die Expression von env steht unter Regulation der Hefe-Pyruvatkinase-Promotor- und -Terminator-Sequenzen. Hefestamm S. cerevisiae 2150-2-3 weist den nachstehenden Genotyp auf: Mat a, ade 1, leu 2-112, cirº. Dieser Stamm wurde von Dr. Leland Hartwell, University of Washington, erhalten.
    • B. Konstruktion von pDPc303, einem Hefe-Expressionsvektor für das env-Protein
  • Plasmid pDPC303 enthält eine "Expressionskassette" (nachstehend beschrieben) für env, cloniert in die BamHI- Stelle von Vektor pC1/1. Vektor pc1/1 enthält pBR322- und 2- Mikron-Sequenzen, umfassend die amp®- und Hefe-leu-2-04-Marker. Er wurde von pJDB219d (Beggs, Nature 275 (1978), 104) abgeleitet, indem der pMB9-Bereich durch pBR322-Sequenzen ersetzt worden war.
  • Die "Expressionskassette" für env besteht aus den nachstehenden Sequenzen, die in dieser Reihenfolge fusioniert waren (5' nach 3'): Hefe-Pyruvatkinase (PYK) -Promotor, env-cDNA und PYK-Terminator. Die PYK-Promotor- und -Terminator-Regionen wurden von PYK-cDNA abgeleitet, die, wie in Burke et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 2193-2201, beschrieben, isoliert worden war.
  • Das in die Expressionskassette clonierte env-Fragment wurde von ARV-2-cDNA abgeleitet und umfaßt ein cDNA-Fragment mit 1395 Bp, das für env-Aminosäurereste codiert, die durch Nt. 5857 bis Nt. 7251 codiert werden (Fig. 2). Außerdem werden fünf zusätzliche Codons in das Leseraster im 5'-Ende fusioniert, wobei das erste Codon einem Methionin entspricht, und vier zusätzliche Codons werden in das Leseraster am 3'- Ende fusioniert, worauf ein Stopp-Codon folgt. Die zusätzlichen Codons wurden nur eingebaut, um die Clonierungsverfahren zu erleichtern.
  • Fig. 7 zeigt den codierenden Strang der in pDPC303 clonierten Nucleotidsequenz und die daraus hergeleitete Aminosäuresequenz. DNA-Sequenzen, die in der Figur nicht unterstrichen sind, stammten direkt aus der vorstehend beschriebenen ARV- 2(9B)-cDNA. Alle anderen Sequenzen wurden entweder chemisch synthetisiert oder aus dem PYK-Vektor hergeleitet.
    • C. Herstellung des 2150-(pDPC303)-Stammes
  • Hefezellen S. cerevisiae 2150-2-3 (Mat a, ade 1, leu 2- 04, cirº) wurden, wie von Hinnen et al. (PNAS 75 (1978), 1929- 1933) beschrieben, transformiert und auf leu&supmin;-Selektivplatten plattiert. Einzelkolonien wurden in leu&supmin;-Selektivmedien überimpft und bis zur Sättigung gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet, sodann das env-Protein gereinigt und wie nachstehend beschrieben charakterisiert.
    • D. Reinigung und Charakterisierung des env-Proteins D.1. Zellaufschluß
  • Gefrorene S. cerevisiae 2150-2-3 (pDPC303) werden aufgetaut und in 1 Volumen Lysepuffer supendiert (1 ug/ml Pepstatin, 0,001 M PMSF, 0,001 M EDTA, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 0,8), sodann wird 1 Volumen von mit Säure gewaschenen Glasperlen zugefügt. Die Zellen werden in einem nichtkontinuierlichen System unter Verwendung einer 300-ml-Glaseinheit der "Dynomill" bei 3000 UpM 10 Minuten aufgebrochen. Die Ummantelung wird mit einer -20ºC kalten Ethylenglykollösung kühl gehalten. Die Glasperlen werden dekantiert, indem man das Gemisch 3 Minuten auf Eis sich absetzen läßt. Der Zellextrakt wird gewonnen und bei 18 000 UpM (39 200 · g) 35 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag (Pellet 1), wie nachstehend beschrieben, behandelt.
    • D.2. SDS-Extraktion von unlöslichem Material
  • Pellet 1 wird in 4 Volumina Tris-HCl-Puffer resuspendiert (0,01 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 M NaCl, 0,001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin, 0,001 M EDTA, 0,1% SDS) und 2 Stunden bei 4ºC unter Bewegung extrahiert. Die Lösung wird 15 Minuten bei 6300 · g zentrifugiert. Die unlösliche Fraktion (Pellet 2) wird in 4 Volumina (360 ml) PBS (pro Liter: 0,2 g KCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 8,0 g NaCl, 2,9 g Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O), 0,1% SDS, 0,001 M EDTA, 0,001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin, resuspendiert und 15 Minuten bei 6300 · g zentrifugiert. Das Pellet (Pellet 3) wird in 4 Volumina PBS, 0,2% SDS, 0,001 M EDTA, 0,001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin suspendiert und 12 Stunden bei 4ºC unter Bewegung auf einem Röhrchenschüttler extrahiert. Die Lösung wird 15 Minuten bei 6300 · g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird gewonnen und, wie nachstehend angegeben, weiter gereinigt. (Das Pellet kann erneut extrahiert werden, indem es in 4 Volumina 2,3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, resuspendiert und 5 Minuten gekocht wird. Nach dem Kochen wird die Lösung 15 Minuten bei 6300 · g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird gewonnen und weiter gereinigt.)
    • D.3. Selektive Fällung und Gelfiltration
  • Die lösliche Fraktion wird durch Fällung mit 30% Ammoniumsulfat bei 4ºC eingeengt. Das Pellet (Pellet 4) wird in 2,3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, resuspendiert und auf einer ACA 34 (LKB Products) Gelfiltrationssäule chromatographiert. Die Säule wird mit PBS, 0,1% SDS, bei Rauintemperatur äquilibriert. Die Chromatographie wird in der gleichen Lösung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,3 ml/min entwickelt. Fünf Fraktionen zu je 5 ml werden gesammelt, vereinigt und durch Protein-Gelelektrophorese, Western-Analyse und ELISA charakterisiert. Sofern es nötig ist, werden die vereinigten Fraktionen durch Vakuumdialyse auf Spectrapor #2 (Molekulargewichtsausschluß 12 bis 14 K) eingeengt.
    • D.4. Charakterisierung von rekombinantem env
  • Die SDS-Polyacryamidgel-Analyse (12% Acrylamidgele) zeigte, daß in den Hefezellen, die mit dem env-enthaltenen Vektor transformiert worden waren, ein neues Protein mit 55 000 Dalton synthetisiert wurde. Das Protein mit 55 000 Dalton fehlte in den Zellen, die mit dem Kontrollplasmid (Vektor ohne env- Insertion) transformiert worden waren. Die Identität von env wurde sowohl durch ELISA (vgl. 9.E.4.c) als auch durch Western-Analyse unter Verwendung von Serum von AIDS-Patienten bestätigt. In beiden Tests zeigte das Protein mit 55 000 Dalton Immunreaktivität. Keine Reaktivität wurde mit Serum von normalen Versuchspersonen erhalten.
  • Außerdem wurde das rekombinante env in Säugerzellen (Cos- Zellen) exprimiert.
    • 14. Expression des p31 pol-Proteins von ARV-2 in Bakterien A. Wirt-Vektor-System
  • Der C-terminale Bereich des Polymerase-Gens (p31 pol) wird durch den mit Plasmid pTP31.2 transformierten E. coli- Stamm D1210 synthetisiert. Plasinid pTP31.2 ist ein Abkömmling von pBR322, der die p31-codierende Sequenz unter transkriptionaler Kontrolle des hybriden tac-Promotors enthält (beschrieben in 9.A). Die Expression von p31 wird in bakteriellen Transformanten durch IPTG induziert.
    • B. Konstruktion von pTP31.2 B.1. Konstruktion der M13-Matrize 01100484
  • Ein DNA-Fragment mit 5,2 kB wurde aus einem KpnI-Spaltprodukt von ARV-2(9b) isoliert, enthaltend das 3'-Ende des pol-Gens, orf-1, env und das 5'-Ende von orf-2, das auf einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Sea-Pack) laufengelassen worden war, mit Phenol bei 65ºC extrahiert, mit 100% Ethanol gefällt und in TE resuspendiert. 8 ul dieses Materials wurden weiter mit SstI in einem Endvolumen von 10 ul eine Stunde bei 37ºC gespalten. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms wurden 1,25 ul dieses Spaltproduktes in Gegenwart von ATP und in einem Endvolumen von 20 ul an 20 ng des vorher mit KpnI und SstI gespaltenen M13mp19 ligiert. Man ließ die Umsetzung zwei Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. 5 ul dieses Gemisches wurden zur Transformation von kompetenten E. coli JM101 verwendet. Klare Plaques wurden gezüchtet und einzelsträngige DNA hergestellt, wie in Messing und Vieira, Gene 19 (1982), 269- 276, beschrieben.
    • B.2. In vitro-Mutagenese von 01100484
  • Die DNA-Sequenz in 01100484 wurde durch gezielte Mutagenese verändert, um eine von NcoI erkannte Restriktionsstelle (CCATGG) zu erzeugen. Ein Oligodesoxynucleotid wurde unter Verwendung von Festphasen-Phosphoramidit-Chemie synthetisiert, bei dem das A durch ein C in Position 4299 (Fig. 2) ersetzt und das T durch ein A in Position 4305 (Fig. 2) ausgetauscht war. Diese beiden Änderungen sind bezüglich der Aminosäuresequenz stumm, die zweite wurde eingeführt, um die Stabilität der heterologen Moleküle zu vermindern. Das Oligomer wurde ARV-216 genannt, weist die Sequenz:
  • 5'-TTAAAATCACTTGCCATGGCTCTCCAATTACTG auf und entspricht dem nichtcodierenden Strang, da die von M13 stammende Matrize 01100484 einzelsträngig ist und den codierenden Strang enthält. Das 5'-phosphorylierte Oligomer wurde bei 55ºC in Gegenwart von 5'-entphosphoryliertein M13-Sequenzierungs-Primer, 50 mM Tris-HCl, pH 8, 20 mM KCl, 7 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM EDTA an die 01100484-M13-Matrize angelagert. Die Polymerisationsreaktion wurde in 100 ul durchgeführt, die 50 ng/ul DNA-Doppelstrang, 150 uM dNTPs, 1 mM ATP, 33 mM Tris-Acetat, pH 7,8, 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 5 mM DTT, 12,5 Einheiten T4-Polymerase, 100 ug/ml T4-Gen-32-Protein und 5 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 30ºC inkubiert und die Umsetzung durch Zusatz von EDTA und SDS (10 mM bzw. 0,2% Endkonzentration) abgestoppt. Kompetente JM101 E. coli-Zellen wurden mit 1, 2 und 4 ul einer 1 : 10-Verdünnung des Polymerisationsproduktes transformiert und in YT-Platten plattiert. Plaques wurden durch Adsorption an Nitrocellulosefilter abgehoben und in 0,2 M NaOH, 1,5 M NaCl, denaturiert, anschließend in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,3, 3 M NaCl, neutralisiert und in 6 · SSC äquilibriert. Die Filter wurden trockengetupft, zwei Stunden bei 80ºC gebacken und in 0,2% SDS, 10 · Denhardt, 6 · SSC, bei 37ºC für die Annelierung vorbehandelt. Nach einer Stunde wurden 7,5 Millionen cpm markiertes ARV-216 zu den Filtern zugegeben und weitere zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden 20 Minuten bei 42ºC in 6 · SSC gewaschen, trockengetupft und eine Stunde bei -70ºC unter Einsatz eines Verstärkungsschirms auf einen Film aufgelegt. Stark hybridisierende Plaques wurden gezüchtet und einzelsträngige DNA aus ihnen hergestellt und als Matrizen für die Sequenzierung verwendet. Die Sequenzierung zeigte, daß die Matrize 01021785 sowohl die NcoI-Stelle als auch die zweite, vorstehend erwähnte Substitution enthält.
  • Ein zweites Oligomer wurden synthetisiert, um die Stellen für SaII und EcoRI unmittelbar hinter dem Terminationscodon des pol-Gens einzufügen (Position 5101, Fig. 2). Dieses Oligomer wurde ARV-248 genannt und hat die Sequenz:
  • 5'-GGTGTTTTACTAAAGAATTCCGTCGACTAATCCTCATCC. Unter Verwendung der Matrize 01020785 wurde die gezielte Mutagenese, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Waschen der Filter nach der Hybridisierung bei 65ºC durchgeführt wurde. Wie vorstehend wurden acht stark hybridisierende Plaques gezüchtet und einzelsträngige DNA sequenziert. Die Sequenz der Matrize 01031985 zeigt, daß sie wie geplant die Restriktionsstellen NcoI, SalI und EcoRI enthält.
    • B.3. Isolierung von NcoI-EcoRI- und NcoI-SalI-DNA-Fraqmenten, die p31 enthalten
  • Die Replikative Form (RF) der 01031985-Matrize wurde hergestellt, indem sechs klare Plaques jeweils in 1,5 ml 2 · YT fünf Stunden bei 37ºC gezüchtet wurden. Doppelsträngige DNA wurde erhalten, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, beschrieben, vereinigt und in 100 ul Endvolumen resuspendiert. 10 ul RF wurden mit NcoI und EcoRI in einem Endvolumen von 20 ul gespalten. Dieses Fragment wurde für die direkte p31-Expression in Bakterien verwendet. Weitere 20 ul RF wurden mit NcoI und SaII in 40 ul gespalten. Dieses Fragment wurde für die Expression von p31 in Hefe verwendet. Die Proben wurden auf einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Sea-Pack) laufengelassen und die DNAs durch Fluoreszenz mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Banden mit 800 Bp wurden ausgeschnitten und die DNAs aus dem Gel, wie vorstehend erwähnt, extrahiert und in 10 ul TE resuspendiert. Die Fragmente wurden ARV248NR#2 bzw. ARV248NL genannt.
    • B.4. Clonierung von P31 in plot7
  • Der Vektor plot7 (3 ug) (Hallewell et al., Nucl. Acid Res. 13, Nr. 6 (1985), 2017-2034) wurde mit NcoI und EcoRI in 40 ul Endvolumen gespalten und die Enzyme nach drei Stunden durch Hitze inaktiviert. 2 ul dieses Spaltproduktes wurden mit 2 ul ARV248NR#2 gemischt und in 20 ul in Gegenwart von ATP und T4-DNA-Ligase bei 14ºC über Nacht ligiert, 10 ul dieses Gemisches wurden sodann zur Transformation kompetenter D1210-Zellen verwendet. Kolonien, die gegen 2 mM IPTG und 100 ug/ml Ampicillin resistent waren, wurden selektiert und aus jeder dieser Kolonien supergeknäulte ("supercoiled") DNA extrahiert. Anschließend wurden die DNAs mit NcoI und EcoRI gespalten und durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Clone mit der geeigneten Insertion von 800 Bp wurden zur weiteren Verwendung selektiert. Sie werden mit pRSP248 Nummer 3 und 4 bezeichnet.
    • B.5. Konstruktion von PTP31
  • Die in 01100485 eingeführte NcoI-Stelle liegt 52 Bp stromabwärts vom mutmaßlichen Start von p31. Drei Oligomere wurden wie vorstehend synthetisiert, die die ersten 18 Aminosäuren von p31 codieren und am 3'-Ende des Moleküls ein kohäsives NcoI-Ende erzeugen. Das 5'-Ende des Moleküls ist über das Initiationscodon verlängert worden, damit es eine Ribosomenbindungsstelle umfaßt. Die Oligomeren, die synthetisiert wurden, haben die Sequenzen:
  • Jeweils 150 pMol entphosphoryliertes ARV-211, phosphoryliertes ARV-222 und ARV-223 wurden an 20 ug pRSP248, das vorher mit NcoI gespalten worden war, in einem Endvolumen von 62 41 18 Stunden bei 14ºC ligiert. Nach Phenolextraktion und Ethanolfällung wurde die DNA in 40 41 H&sub2;O resuspendiert und mit 15 Einheiten Klenow-Fragment in Gegenwart von 0,5 mM dNTPs eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt, in 40 ul H&sub2;O resuspendiert und mit EcoRI gespalten. Sodann wurde die DNA auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt laufengelassen und das Fragment mit etwa 820 Bp, wie vorstehend beschrieben, extrahiert und in einem Endvolumen von 20 ul H&sub2;O resuspendiert. Nach Phosphorylierung der Enden wurden 5 ul der Probe mit 150 ng plot7, das mit PvuII und EcoRI gespalten worden war und dessen Enden entphosphoryliert worden waren, in Gegenwart von T4-DNA-Ligase und ATP in einem Endvolumen von 31 ul 18 Stunden bei 14ºC inkubiert. 5 ul des Ligierungsproduktes wurden zur Transformation- von RR1deltaM15 eingesetzt. Clone, die gegen 100 4g/ml Ampicillin resistent waren, wurden selektiert und supergeknäulte DNA aus ihnen extrahiert. Die DNAs wurden mit NcoI und EcoRI gespalten und auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Kolonien mit der Insertion in geeigneter Größe wurden erhalten und mit pTP31 bezeichnet. Die in der Insertion enthaltene p31-Sequenz wird in Fig. 8 gezeigt. Unterstrichene Sequenzen wurden durch chemische Synthese erhalten. Andere stammten aus DNA.
    • C. Absuchen von Transformanten auf spezifische Proteine, die mit AIDS-Seren reagieren
  • Bakterielle Transformanten, die entweder den Vektor alleine oder den Vektor zusammen mit der p31-DNA (pTP31.2) enthielten, wurden in L-Brühe mit 0,02% Ampicillin bis zu einer OD&sub6;&sub5;&sub0; von 0,5 gezüchtet. Die Kulturen wurden durch Zusatz von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM induziert und drei weitere Stunden gezüchtet. Bakterien aus Kulturen zu je 1 ml wurden pelletiert und in 200 ul Gel-Probenpuffer resuspendiert. Die Zellen wurden durch drei Zyklen aus Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen, gekocht und die Extrakte auf 12.5% Polyacrylamid-SDS-Minigele aufgetragen. Die Proteine wurden der Elektrophorese unterworfen und durch Elektro-Blotting auf Nitrocellulose übertragen. Die Nitrocellulosefilter wurden mit Serum EW5111 (1 : 100 verdünnt; positives Referenzserum aus dem CDC, das stark mit viralem p31 reagiert), Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Ig und HRP-Substrat umgesetzt. Bei Gelanalyse von Extrakten aus Transformanten mit der p31-DNA wurden eine hervorstechende Bande bei etwa 30 000 D und mehrere Banden mit niedrigerem Molekulargewicht gefunden, die in Extrakten aus den mit dein Vektor alleine transformierten Bakterien nicht vorlagen.
    • D. Beweisführung. daß das Polypeptid aus dem C-terminalen Bereich des pol-Gens zu dem viralen p31-Protein analog ist
  • Lysozym-NP40-Extrakte wurden aus Bakterien hergestellt, die entweder mit pTP31.2 oder mit dem Vektor alleine transformiert worden waren. 5-ml-Kulturen wurden gezüchtet, die Zellen pelletiert, sodann in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 mM EDTA, 1 mg/ml Lysozym, resuspendiert und 15 Minuten bei 0ºC inkubiert, anschließend wurden Nacl, MgCl&sub2; und NP40® bis zu Endkonzentrationen von 0,4, 5 mM bzw. 0,5% zugefügt, gemischt und mit DNase I (100 ug/ml) 30 Minuten bei 0ºC inkubiert. Wenn das EW5111-Serum (1 : 100-Verdünnung) vor der Umsetzung mit einem Virus-Blot mit einer 1 : 10-Verdünnung der Zellextrakte aus den mit pTP31.2 transformierten Bakterien inkubiert wurde, war die virale p31-Bande vollständig verschwunden, während die Reaktivität mit anderen viralen Proteinen unbeeinflußt blieb. Im Gegensatz dazu absorbierten die Extrakte aus den mit dem Vektor alleine transformierten Bakterien die p31-reaktiven Antikörper nicht. Das virale p31-Protein ist somit das Produkt der C-terminalen oder Endonuclease-Region des pol-Gens von ARV-2.
    • 15. Expression des p31 pd-Proteins in Hefe A. Konstruktion eines Hefe-Vektors p31/GAP-ADH2: Clonierung von p31 in pAB24
  • Das ARV248NL-Fragment wurde in pBS100 cloniert, das vorher mit NcoI und SaII gespalten worden war. pBS100 ist ein aus pAB12 abgeleiteter bakterieller Vektor mit einer BamHI-Kassette, bestehend aus dem GAP-ADH2-Promotor, einem ARV-env-Gen als ein NcoI-SalI-Fragment und dem GAP-Terminator. Die BamHI-Kassette aus zwei positiven Clonen von pBS100/p31/GAP-ADH2 wurde in pAB24 cloniert, einen Hefevektor mit sowohl ura- als auch leu-Selektionsvermögen. Beide Orientierungen der Kassette in diesem Vektor wurden herausgesucht und zur Transformation des Hefestammes AB110 (Mat a, ura 3-52, leu 2-04, oder sowohl leu 2-3 als auch leu 2-112, pep 4-3, his 4-580, cirº) eingesetzt. Diese Zellen wurden sowohl auf ura&supmin;- als auch leu&supmin;-Platten plattiert. Außerdem wurden ura&supmin;-Zellen auf leu&supmin;-Platten plattiert.
    • B. Induktion der Expression von P31
  • Drei verschiedene Induktionsverfahren wurden durchgeführt: 1. Die auf ura&supmin;-Platten aufgebrachten ura&supmin;-Kolonien wurden 24 Stunden in YEP/1% Glucose induziert. Mit diesen Proben wurde sowohl eine Western- als auch eine Polyacrylamidgel- Analyse durchgeführt. Beide Ergebnisse waren negativ. 2. Kolonien aus ura&supmin;-Platten, aufgebracht auf leu&supmin;-Platten, wurden entweder in leu&supmin;/3% Ethanol oder in YEP/1% Glucose 24 Stunden induziert. Mit diesen Proben wurden eine Western- und eine Polyacrylamidgel-Analyse durchgeführt, wobei die Ergebnisse auch negativ waren. 3. Kolonien aus leu&supmin;-Platten, aufgebracht auf leu&supmin;-Platten, wurden entweder in leu&supmin;/3% Ethanol oder YEP/1% Glucose 24 Stunden induziert. Das Polyacrylamidgel zeigte ein negatives Ergebnis. Mit diesen Proben wurde keine Western-Analyse durchgeführt.
    • 16. Expression des Superoxid-Dismutase (SOD)-p31-Fusionsproteins in Hefe A. Konstruktion des pC1/1-pSP31-GAP-ADH2-Derivats
  • Zur Konstruktion eines Gens für ein Fusionsprotein SOD- p31, das in Hefe exprimiert werden soll, wurde Plasmid (pSI4/39-2) verwendet. Dieses Plasmid enthält das SOD-Gen, fusioniert an das Proinsulin-Gen unter der Regulation des ADH- 2/GAP-Promotors. Das Proinsulin-Gen liegt zwischen der EcoRI- und der SalI-Restriktionsstelle. Um das Proinsulin-Gen durch das ARV248NL-Fragment zu ersetzen, wurden zwei Oligomere unter Einsatz von Phosphoramidit-Chemie synthetisiert, die mit ARV- 300 bzw. ARV-301 bezeichnet wurden. Wenn die beiden Oligomeren angelagert werden, erzeugen die Sequenzen auf jeder Seite des Moleküls kohäsive Enden für EcoRI und NcoI. ARV-300 und ARV- 301 haben die Sequenzen:
  • 2 ug pSI4/39-2, linearisiert mit EcoRI, wurden in Gegenwart von ATP und T4-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 35 ul an jeweils 100 pMole phosphoryliertes ARV-300 und entphosphoryliertes ARV-301 ligiert. Die Umsetzung wurde 18 Stunden bei 14ºC durchgeführt. Die DNA wurde mit SaII weiter gespalten, sodann die Fragmente auf einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetrennt und ein Fragment, enthaltend den Vektor plus das SOD-Gen (etwa 6,5 kB), wie vorstehend beschrieben, gereinigt und in 50 ul TE resuspendiert. 5 ul dieses Präparates wurden an 5 ul ARV248NL in einem Endvolumen von 20 ul 18 Stunden bei 14ºC ligiert und 5 ul zur Transformation von kompetenten HB101-Zellen verwendet. Das resultierende Plasmid wurde pSP31 genannt. 20 ug dieses Plasmids wurden mit BamHI gespalten und ein Fragment mit etwa 2900 Bp durch Gelelektrophorese isoliert, in TE resuspendiert und an das vorher mit BamHI gespaltene pC1/1 ligiert. Diese DNA wurde zur Transformation von HB101 verwendet, wobei Tranformanten mit der BamHI-Kassette erhalten wurden. Die Hefestämme 2150, PO17 und AB110 wurden mit diesem pC1/1-psP31-GAP-ADH2-Abkömmling transformiert, sowohl kurze als auch lange Orientierungen. Der Stamm 2150 ergab keine Transformanten. Alle anderen Transformanten wurden auf leu&supmin;- Platten aufgebracht.
    • B. Induktion von pC1/1-pSP31-GAP-ADH2
  • Drei verschiedene Induktionsarten wurden versucht: 1. PO17-Kolonien wurden entweder in einer 10 ml-Kultur mit YEP/1% Glucose oder in einer leu&supmin;/3% Ethanol-Kultur 24 Stunden induziert. Die Hefe-Pellets wurden sowohl durch Polyacrylamidgele als auch durch Western-Verfahren analysiert, und, obwohl sogar das mit Coomassie gefärbte Gel ein negatives Ergebnis zeigte, hob die Western-Analyse bei beiden Induktionsmethoden eine Bande mit dem richtigen Molekulargewicht hervor.
  • 2. PO17-Kolonien wurden in einer 30 ml-Kultur mit YEP/1% Ethanol 48 Stunden induziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten während der Induktion wurden Aliquots durch PAGE analysiert. Das mit Coomassie gefärbte Gel zeigt eine Bande im richtigen Molekulargewichtsbereich (47 bis 50 kD), die nach 14 Stunden in YEP/1% Ethanol erscheint und nach 24-stündiger Induktion ein Intensitätsmaxiinum erreicht. Das Western-Ergebnis stimmt gut mit dem Coomassie-gefärbten Gel überein und zeigt nach 24 und 48 Stunden starke Banden. 3. AB110-Kolonien wurden entweder in leu&supmin;/3% Ethanol oder YEP/1% Glucose 24 Stunden induziert. PAGE und Western-Analysen wurden durchgeführt, wobei für beide Induktionsverfahren die Ergebnisse der PAGE negativ und die der Western-Analyse positiv waren.
    • 17. Reinigung und Charakterisierung von SOD-P31 aus Bakterien oder Hefe
  • Gefrorene Bakterienzellen (Hefezellen) werden bei Raumtemperatur aufgetaut und in 1,5 Volumina Lysepuffer (für Bakterien: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF; für Hefen: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF) suspendiert und mit einem Volumen von mit Säure gewaschenen Glasperlen gemischt.
  • Die Zellen werden 15 Minuten in einem nichtkontinuierlichen System aufgeschlossen, wobei die Glaskammer einer "Dynomill"-Einheit bei 3000 UpM eingesetzt wird, die mit einer Kühleinheit von -20ºC verbunden ist. Die Glasperlen läßt man zwei bis drei Minuten auf Eis absitzen, sodann wird das Zelllysat entfernt. Die abgesetzten Glasperlen werden zweimal mit 30 ml Lysepuffer bei 4ºC gewaschen. Das Zellysat wird 30 Minuten bei 39 000 · g zentrifugiert.
  • Das Pellet, das bei der vorstehenden Zentrifugation erhalten wird, wird einmal mit Lysepuffer gewaschen, nachdem es aufgewirbelt und bei 4ºC suspendiert wurde (die gleiche Zentrifugation wie vorstehend). Das gewaschene Pellet wird mit 0,2% SDS (für Bakterien) und 0,1% SDS (für Hefe) in Lysepuffer versetzt und 10 Minuten bei 4ºC hin- und herbewegt. Das Lysat wird 30 Minuten bei 39 000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in Probenpuffer (67,5 mM Tris-Cl, pH 7,0, 5% β-Mercaptoethanol, 2,3% SDS) 10 Minuten gekocht und 10 Minuten bei 39 000 · g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und sodann 60 Minuten bei 100 000 · g zentrifugiert (60 Ti-Rotor). Bei Verwendung von Hefe wird dieser Schritt durch eine 0,45 um-Filtration ersetzt. Der Überstand aus der vorstehenden Zentrifugation wird auf eine Gelfiltrationssäule (2,5 · 90 cm, ACA 34 LKB) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,3 bis 0,4 ml/min, äquilibriert mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,1% SDS, aufgetragen (maximal 50 mg Protein). Die Fraktionen, die SOD-p31 enthalten, werden vereinigt und entweder durch Vakuumdialyse oder unter Verwendung einer YM5-Amicon-Membran bei 40 psi eingeengt. Das Protein wird als eingeengte Lösung bei -20ºC gelagert.
  • Die Gelelektrophorese-Analyse zeigt, daß das SOD-p31-Protein entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 46 kD wandert und zu über 90% rein ist.
    • 18. ELISA auf Antikörper gegen HIV-I unter Verwendung von rekombinanten ARV-2-Polypeptiden
  • Vorratslösungen des gereinigten p25 gag-Proteins (1,25 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2), des gereinigten env-Proteins (2 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2) und des gereinigten SOD-p31-Fusionsproteins (2 mg/ml in 20 mM Natriuinphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2) wurden hergestellt.
  • Zur Beschichtung der Mikrotiterplatten (Dynatech Immulon I) wurden jeweils ein Teil der Vorratslösungen von p25 gag, env und SOD-p31 zu 997 Teilen Borat-Beschichtungspuffer (0,05 M Borat, pH 9,0) zugefügt. 100 ul Beschichtungslösung wurden in jede Vertiefung zugegeben, sodann die Platten zugedeckt und zwei Stunden bei 37ºC oder 12 Stunden bei 4ºC inkubiert. Anschließend wurde die Beschichtungslösung aus den Vertiefungen abgesaugt und die Platten sechsmal mit Waschlösung (0,137 M 0,8% NaCl, 0,05% Triton® X-100) gewaschen.
  • Serumproben wurden in Verdünnungslösung (0,1% Casein, 1 mM EDTA, 1% Triton® X-100, 0,5 M NaCl, 0,01% Thimerosal, pH 7,5) 1 : 100 verdünnt, wobei die Verdünnungslösung mit Hefe- (Stamm AB103.1)-Proteinextrakt (1 : 40-Verdünnung, etwa 2 mg Protein pro ml in PBS, enthaltend 1% Triton® X-100, 2 mM PMSF, 0,01% Thimerosal) und E. coli-Proteinextrakt (1 : 40-Verdünnung, etwa 1 mg Protein pro ml in PBS, enthaltend 1% Triton® X-100, 2 mM PMSF, 0,01% Thimerosal) versetzt war. Die Extraktionsverfahren waren ähnlich wie die vorstehend in den Abschnitten 13 und 14 beschriebenen Verfahren, wobei nichtrekombinante Stämme verwendet wurden. 100 ul des verdünnten Serums wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Platten sechsmal mit Waschlösung gewaschen.
  • Ziegen-Antiserum gegen menschliches Ig, markiert mit Meerrettich-Peroxidase (Cappel), 1 : 8000 verdünnt in Verdünnungslösung ohne Zusatz von Hefe- oder E. coli-Extrakten, wurde mit 100 ul pro Vertiefung auf die Platten aufgetragen und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Platten sechsmal mit Waschlösung gewaschen. Sodann wurde die Substratlösung (10 ml Citratpuffer (10,5 g Citronensäure/Liter dH&sub2;O, pH bis 4,0 mit 6 M NaOH), 0,1 ml ABTS (15 mg/ml 2,2'- Azino-di-(3-ethylbenzthiazolensulfonsäure) in dH&sub2;O) und 0,33 ul H&sub2;O&sub2;) mit 100 ul pro Vertiefung auf die Platten aufgetragen und die Platten in Folie eingewickelt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die Umsetzung durch Zusatz von 50 ul 10% SDS pro Vertiefung abgestoppt. Die Ergebnisse wurden mit einer Dynatech-ELISA-Ablesevorrichtung abgelesen, eingestellt auf doppelte Wellenlängen-Ablesung: Absorbanz- Wellenlänge von 1 (410 nm) und Referenz-Wellenlänge von 4.
    • Ergebnisse
  • Die folgenden Seren wurden getestet: A. 89 aufeinanderfolgende Blutspender aus der Kansas City-Blutbank ("normale Blutspender"): Log-Nr. 1001-1081, 1085-1092.
  • B. 52 Seren von Patienten mit lymphadenopathischem Syndrom (LAD) oder AIDS oder Sexualpartner von Personen mit LAD oder AIDS (mit "Kontaktpers." bezeichnet), alle erhalten von der UCSF-AIDS-Serumbank: Log-Nr. 4601-4652.
  • Der verwendete Positiv/Negativ-Ausschluß wurde fünfmal bestimmt (durchschnittliches Hintergrundsignal - Signal mit Verdünnungsmittel alleine) und betrug 0,195. Somit wurden Seren mit Signalen unter 0,195 als (-) eingestuft; diejenigen darüber wurden als (+) eingestuft. Außerdem wurde jede Probe durch das handelsübliche ABBOTT HTLV III EIA-Kit (Abbott Labs) und durch Western-Analyse getestet.
  • Die Tests mit den bezeichneten Proben von normalen Blutspendern waren im erfindungsgeinäßen ELISA alle bis auf eine negativ. Dieses normale Serum erwies sich im ABBOTT HTLV III EIA-Test als negativ, war aber in Wirklichkeit positiv, was durch die Western-Analyse bestätigt wurde.
  • Die Ergebnisse der Tests mit den 52 Seren von LAD- und AIDS-Patienten und Kontaktpersonen sind nachstehend als Tabelle dargestellt: Serum-Nr. Diagnose ABBOTT EIA erfindungsgem. ELISA Western Kontaktpers. AIDS LAD
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße ELISA, wobei rekombinante ARV-Proteine verwendet werden, mindestens so gut ist wie der ABBOTT HTLV III EIA-Test oder die Western-Analyse.
  • In dem in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen ELISA wurden die Hefe- und Bakterienextrakte zum Serum zugegeben, um Serumantikörper gegen Hefen und Bakterien zu binden und zu verhindern, daß solche Antikörper an die rekombinanten ARV-2-Proteine binden. Sowohl Hefe- als auch Bakterienextrakte waren erforderlich, da die rekombinanten Polypeptide in Hefe exprimierte Polypeptide und in Bakterien exprimierte Polypeptide umfassten. Wenn alle diese Polypeptide im gleichen Organismustyp exprimiert würden, bräuchte man nur ein Extrakt. Wenn beispielweise ein in Hefe exprimiertes p25 gag-Polypeptid durch das bakteriell hergestellte p25 gag-Polypeptid der Probe ersetzt wird, müssen zu den Serumproben nur Hefeextrakte zugegeben werden.
    • 19. Dot-Blot-Analyse für Antikörper gegen HIV-I unter Verwendung von rekombinanten ARV-2-Polypeptiden
  • Nitrocellulose-Streifen (0,5 · 5 cm) werden mit 50 ng Polypeptid in PBS getüpfelt (Tüpfelvolumen 2 ul). Nach Tüpfelung werden die Streifen eine Stunde oder länger bei Raumtemperatur getrocknet. Sodann werden die Streifen in einer 5%igen Lösung von fettfreier "Carnation"-Trockenmilch in PBS und 0,01% Thimerosal 15 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur nachbeschichtet. Jede Probe mit Testlösung wird in 0,5 ml der Nachbeschichtungslösung in einem Teströhrchen 1 : 50 verdünnt. Ein nachbeschichteter Streifen wird sodann in das Teströhrchen gebracht und in der Probe unter Schwenken eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Anschließend wird der Streifen aus dem Röhrchen entfernt und mit Nachbeschichtungslösung gewaschen. Der Streifen wird sodann 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Reagenz aus mit Meerrettich-Peroxidase markiertem Ziegen- Antiserum gegen menschliches Ig inkubiert, das in Nachbeschichtungslösung 1 : 500 verdünnt wurde. Nach Inkubation im markierten Antikörper wird der Streifen der Reihe nach mit PBS, 1% Triton und destilliertem Wasser gewaschen. Die Streifen werden entwickelt, indem sie 15 Minuten bei Raum- Minuten bei Raumtemperatur in Substratlösung inkubiert werden (vgl. den vorstehenden Abschnitt 23).
  • Positive Proben bewirken an der Tüpfelstelle eine mit dem Auge wahrnehmbare Farbänderung. Proben von normalen (negativen) Seren ergeben keine Farbänderung oder ein schwaches Signal, das von einem positiven Signal unterschieden werden kann. Mit Seren, die schwache Signale ergeben, können Kompetitionstests durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß sie negativ sind. Im Kompetitionstest wird zu der Testprobe Polypeptid (10 bis 25 ug/ml) zugegeben und das Gemisch eine Stunde bei 37ºC inkubiert, bevor der Streifen in der Probe inkubiert wird. Bei wirklich positiven Seren wird das Signal durch das zugefügte Polypeptid vollständig blockiert, wohingegen bei normalen (negativen) Seren keine Änderung des Signals auftritt.
  • Proben von Organismen, die die vorstehend beschriebenen ARV-2-p25 gag- und ARV-2-env-Polypeptide und das Fusionsprotein aus ARV-2-p31 und SOD exprimieren, wurden bei der "American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern und die Daten dieser Hinterlegungen sind nachstehend aufgelistet. Expressionsprodukt ATCC-Hinterlegungs-Nr. Datum der Hinterl. 27. August 1985

Claims (36)

1. Rekombinantes DNA-Konstrukt zur Expression eines rekombinanten Polypeptids in einer das Konstrukt enthaltenden Zelle, wobei das Konstrukt Kontrollsequenzen umfaßt, die die Transkription und die Translation des rekombinanten Polypeptids in der Zelle regulieren und eine von den Kontrollsequenzen regulierte codierende Sequenz, wobei die codierende Sequenz eine DNA-Sequenz von mindestens etwa 21 bp im Leserahmen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine gegen HIV-I antigene Aminosäuresequenz von Fig. 2 codiert, wobei die Sequenz mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv und mit HIV-I reaktiv ist.
2. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer eukaryontischen Zelle.
3. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer Hefezelle.
4. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer bakteriellen Zelle.
5. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz eines env-Polypeptids von HIV-I codiert.
6. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz ein komplettes env-Polypeptid codiert.
7. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz eines gag-Polypeptids von HIV-I codiert.
8. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die DNA-Sequenz ein komplettes gag-Polypeptid codiert.
9. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz eines pol-Polypeptids von HIV-I codiert.
10. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei die DNA-Sequenz ein komplettes pol-Polypeptid codiert.
11. Zelle, die ein rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält, wobei die Zelle die gegen HIV-I antigene Aminosäuresequenz exprimiert und frei von anderen Zellen ist, die die gegen HIV-I antigene Aminosäuresequenz nicht exprimieren.
12. Zelle nach Anspruch 11, wobei das rekombinante DNA-Konstrukt ein von der Zelle erkanntes Replikationssystem umfaßt.
13. Zelle nach Anspruch 12, wobei die Zelle eukaryontisch ist.
14. Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Zelle eine Hefe ist.
15. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das eine gegen HIV-I antigene Aminosäuresequenz umfaßt, wobei eine Population von Zellen nach Anspruch 11 unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen das rekombinante Polypeptid exprimiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zellen eukaryontisch sind.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zellen Hefe oder Bakterien sind.
18. Immunassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-I in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Antikörper enthält, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein rekombinantes Polypeptid zur Bindung der Antikörper verwendet wird und das rekombinante Polypeptid eine antigene env-, gag- oder pol-HIV-I-Aminosäuresequenz umfaßt, die in der in Fig. 2 gezeigten Sequenz enthalten ist, wobei das Polypeptid mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv ist.
19. Immunassay nach Anspruch 18, wobei mindestens eine env- Aminosäuresequenz und eine gag-Aminosäuresequenz zur Bindung der Antikörper verwendet werden.
20. Immunassay nach Anspruch 19, wobei mindestens eine pol- Aminosäuresequenz zur Bindung der Antikörper zusätzlich verwendet wird.
21. Diagnostisches Reagenz, Immunogen oder Impfstoff, fähig zur Bindung eines anti-HIV-I-Antikörpers in menschlichem Serum, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz, Immunogen oder der Impfstoff aus einem Antigen besteht, das ein immunogenes Fragment von mindestens sieben Aminosäuren eines HIV-I env-, gag- oder pol-Polypeptids umfaßt, wobei das Fragment mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv ist und eine in der in Fig. 2 gezeigten Sequenz enthaltene Sequenz besitzt.
22. Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 transformiert ist.
23. Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 6 transformiert ist.
24. Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 7 transformiert ist.
25. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 24, wobei die gag-Aminosäuresequenz p16 gag umfaßt.
26. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 24, wobei die gag-Aminosäuresequenz p25 gag umfaßt.
27. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 24, wobei die gag-Aminosäuresequenz ein Fusionsprotein aus p16 gag und p25 gag Aminosäuresequenzen umfaßt.
28. Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 transformiert ist.
29. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 28, wobei die pol-Aminosäuresequenz p31 pol umfaßt.
30. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 28, wobei die pol-Aminosäuresequenz ein Fusionsprotein aus Superoxiddismutase und der p31 pol-Aminosäuresequenz umfaßt.
31. Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-I- Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß es eine feste Unterlage umfaßt, an die ein rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 22 gebunden ist.
32. Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-I- Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß es eine feste Unterlage umfaßt, an die ein rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 24 gebunden ist.
33. Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-I- Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß es eine feste Unterlage umfaßt, an die ein rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 28 gebunden ist.
34. DNA-Sequenz, die ein HIV-I-Polypeptid codiert und von dem Phagen ARV-2 (7D) (ATCC Nr. 40143), ARV-2 (8A) (ATCC Nr. 40144) oder ARV-2 (9B) (ATCC Nr. 40158) stammt.
35. Rekombinantes DNA-Konstrukt fähig zur Expression eines antigenen rekombinanten HIV-I-Polypeptids, das aus einem Organismus mit der ATCC Nr. 53246, ATCC Nr. 20769 oder ATCC Nr. 20768 stammt.
36. Isoliertes Polynucleotid, das die ARV-2-Sequenz aus Figur 2 oder ein Fragment mit mindestens 21 bp davon umfaßt, vorausgesetzt, daß das Fragment mit mindestens 21 bp nicht ist
i) eine virale 3,5 kb Insertion aus dem rekombinanten HTLV-III Clon BH5,
ii) eine virale 5,5 kb Insertion aus dem rekombinanten HTLV-III Clon BH8, oder
iii) eine virale 9,0 kb Insertion aus dem rekombinanten HTLV-III Clon BHIO, offenbart in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A1 0 173 529 ferner vorausgesetzt, daß das Fragment mit mindestens 21 bp nicht ist
a) eine virale 0,6 kbp Insertion aus mit LAV75 bezeichnetem LAV,
b) eine virale 0,8 kbp Insertion aus mit LAV82 bezeichnetem LAV,
c) eine virale 2,5 kbp Insertion aus mit LAV13 bezeichnetem LAV,
d) eine virale 9,1 bis 9,2 kbp Insertion aus dem Phagen XJ19,
e) ein sich von KpnI (6100) bis ungefähr BamHI (8150) von XJ19 erstreckendes DNA-Fragment,
f) ein sich von ungefähr KpnI (3500) bis ungefähr BgIII (6500) von XJ19 erstreckendes DNA-Fragment, oder
g) ein sich von ungefähr PstI (800) bis ungefähr KpnI (3500) von XJ19 erstreckendes DNA-Fragment
offenbart in der europäischen Patentanmeldung EP-A1- 0 178 978
ferner vorausgesetzt, daß das Fragment mit mindestens 21 bp nicht ist
I ein 2,3 kbp KpnI-KpnI-Fragment,
II ein 1,0 kbp EcoRI-EcoRI-Fragment, oder
III ein 2,4 kbp EcoRI-HindIII-Fragment,
offenbart in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A2-0 185 444.
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HK (1) HK102495A (de)
LU (1) LU91049I2 (de)
NL (2) NL300137I2 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7205101B1 (en) 1984-10-31 2007-04-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences, recombinant polypeptides, and applications thereof
US7285271B1 (en) 1984-10-31 2007-10-23 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide
US7393949B1 (en) 1987-12-24 2008-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences
US7408053B1 (en) 1984-10-31 2008-08-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant DNA constructs for GAG polypeptides and polypeptides produced thereby

Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3486216T2 (de) * 1983-04-25 1994-02-17 Chiron Corp Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren.
US6395495B1 (en) 1983-09-15 2002-05-28 Institut Pasteur Methods and kits for detecting antibodies against an HIV variant
GB8423659D0 (en) 1984-09-19 1984-10-24 Pasteur Institut Cloned dna sequences
US5217861A (en) * 1983-09-15 1993-06-08 Institut Pasteur Antigen of a human retrovirus, namely p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions containing the antigen, a diagnostic method for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and pre-AIDS and a kit therefor
US7217508B1 (en) 1983-09-15 2007-05-15 Institut Pasteur Cloned DNA sequence related to genomic RNA of human immunodeficiency virus (HIV-1)
US7205102B1 (en) 1983-09-15 2007-04-17 Institut Pasteur Cloned DNA sequences related to the genomic RNA of lymphadenopathy-associated virus (LAV) and proteins encoded by said LAV genomic RNA
GB8429099D0 (en) * 1984-11-16 1984-12-27 Pasteur Institut Closed dna sequences
US6428952B1 (en) * 1983-09-15 2002-08-06 Institut Pasteur Methods and kits employing LAV antigens for the detection of HIV-1-specific antibodies
US7232654B1 (en) 1983-09-15 2007-06-19 Institut Pasteur DNA sequence of the LTR region of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)
US6600023B1 (en) 1983-09-15 2003-07-29 Institut Pasteur Antibody directed against HIV-1 P25 antigen
US7351412B1 (en) 1983-12-05 2008-04-01 Institut Pasteur Cloned DNA sequences related to the genomic RNA of lymphadenopathy-associated-virus (LAV) and proteins encoded by said LAV genomic RNA
EP0164556B1 (de) * 1984-05-11 1994-03-02 Chiron Corporation Erhöhte Hefetranskription unter Verwendung einer Hybridkonstruktion der Promotorregion
US9328391B1 (en) 1984-08-22 2016-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cloning and expression of HIV-1 DNA
US9309574B1 (en) 1984-08-22 2016-04-12 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Molecular cloning of HIV-1 from immortalized cell lines
US6001977A (en) * 1984-08-22 1999-12-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloning and expression of HTLV-III DNA
US5705612A (en) 1984-10-18 1998-01-06 Institut Pasteur And Centre National De La Recherche Scientifique NEF peptide encoded by human immunodefiency virus type 1 (HIV-1)
NZ230372A (en) * 1984-10-18 1994-02-25 Pasteur Institut Hiv antigen, assay and vaccine.
US7045130B1 (en) 1984-10-18 2006-05-16 Institut Pasteur Antibodies against antigens of human immunodeficiency virus (HIV-1)
US6894152B1 (en) 1984-11-16 2005-05-17 Institut Pasteur Cloned DNA sequences related to the genomic RNA of lymphadenopathy-associated-virus (LAV) and proteins encoded by said LAV genomic RNA
US6534285B1 (en) * 1984-12-24 2003-03-18 Genentech, Inc. Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use
JP2869063B2 (ja) * 1985-04-08 1999-03-10 ジエネテイツク システムズ コ−ポレイシヨン ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性であるｇａｇによりコードされたペプチドの発現及び使用
GR860915B (en) * 1985-04-08 1986-07-11 Genetic Systems Corp Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to lav
IE64785B1 (en) * 1985-04-08 1995-09-06 Genetic Systems Corp Expression of immunologically reactive viral proteins
US5773210A (en) * 1985-04-19 1998-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein and method of testing for AIDS
NZ215867A (en) * 1985-04-19 1989-10-27 Hoffmann La Roche Aids envelope protein, dna vectors and method of production
US4629783A (en) * 1985-04-29 1986-12-16 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
JP2564268B2 (ja) * 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
FR2593519B1 (fr) * 1985-09-25 1994-01-07 Oncogen Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
DE3688051T2 (de) * 1985-12-17 1993-06-24 Akzo Nv Immunochemisches reagenz.
DE3674555D1 (de) * 1985-12-20 1990-10-31 Abbott Lab Immuntest fuer antikoerper gegen htlv-iii.
JPS62164696A (ja) * 1986-01-06 1987-07-21 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー ＨＴＬＶ−３ｇａｇ遺伝子の発現
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
US4808536A (en) * 1986-02-27 1989-02-28 Centocor, Inc. Immunochemical method for detection of antibody against HTLV-III core protein based upon recombinant HTLV-III gag gene encoded protein
US5075211A (en) * 1986-03-26 1991-12-24 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
US4925784A (en) * 1986-04-04 1990-05-15 Hoffmann-La Roche Inc. Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
US4983387A (en) * 1986-05-19 1991-01-08 Viral Technologies Inc. HIV related peptides, immunogenic antigens, and use therefor as subunit vaccine for AIDS virus
US5017688A (en) * 1986-06-12 1991-05-21 Biogen, Inc. Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection
US4943627A (en) * 1986-06-12 1990-07-24 Biogen, Inc. Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection
US5034511A (en) 1987-04-13 1991-07-23 Institut Pasteur Variant of LAV viruses
EP0255190A3 (de) * 1986-08-01 1990-08-29 Repligen Corporation Rekombinante Polypeptide und ihre Verwendungen sowie Test für den AIDS-Virus
US5166050A (en) * 1986-08-20 1992-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies and peptides useful in treating and diagnosing HIV infections
NZ221440A (en) * 1986-08-20 1991-11-26 Genetic Systems Corp Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections
DE3636540A1 (de) * 1986-10-27 1988-04-28 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren
SE8701628D0 (sv) * 1987-04-16 1987-04-16 Erling Norrby Medel for analys mm
EP0293792A3 (de) * 1987-06-01 1990-01-17 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Von menschlichem Immunmangelvirus GAG-kodierte Proteine
US5679399A (en) 1987-07-17 1997-10-21 Bio Barrier, Inc. Method of forming a membrane, especially a latex or polymer membrane, including multiple discrete layers
US5549924A (en) * 1987-07-17 1996-08-27 Robin Renee Thill Shlenker Method of forming a membrane, especially a latex or polymer membrane, including a deactivating barrier and indicating layer
US5447837A (en) * 1987-08-05 1995-09-05 Calypte, Inc. Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both
US5118602A (en) * 1987-08-26 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Feline T-lymphotropic lentivirus assay
PT88416B (pt) * 1987-09-04 1992-10-30 Wellcome Found Processo para determinacao imunologica de anticorpos e processo para a preparacao de uma proteina com capacidade de ligacao a anticorpos e de composicoes farmaceuticas que a contem
JPS6474990A (en) * 1987-09-17 1989-03-20 Susumu Maeda Vector, recombinant dna, virus and production of protein
DK643188A (da) * 1987-11-24 1989-05-25 Smithkline Biolog Ekspression af hiv-proteiner i e.coli og s.cerevisiae
US5322769A (en) * 1988-03-11 1994-06-21 Abbott Laboratories Methods for using CKS fusion proteins
US5204259A (en) * 1988-05-06 1993-04-20 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. Methods and systems for producing HIV antigens
FR2635532B1 (fr) * 1988-07-29 1992-05-22 Pasteur Institut Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant
DE68918867T2 (de) * 1988-09-13 1995-02-16 Chiron Corp Mutanten des hiv-1 Hüllproteins mit fehlenden hypervariabelen domänen.
US5656458A (en) * 1988-11-04 1997-08-12 Chiron Corporation Expression and processing of amino terminus acetylated FGF's in yeast
CA2003383A1 (en) * 1988-11-23 1990-05-23 Sushil G. Devare Synthetic dna derived recombinant hiv antigens
ES2066887T3 (es) * 1989-02-03 1995-03-16 Abbott Lab Anticuerpo monoclonal para diferenciar individuos seropositivos hiv-2 de los hiv-1.
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
US6337209B1 (en) 1992-02-26 2002-01-08 Glaxo Wellcome Inc. Molecular constructs containing a carcinoembryonic antigen regulatory sequence
UA41266C2 (uk) † 1990-04-04 2001-09-17 Чірон Корпорейшн Комбінація послідовностей епітопів вірусу гепатиту с (hcv), спосіб виявлення антитіл до вірусу гепатиту с (hcv), набір для виконання аналізу при виявленні антитіл до антигену гепатиту с (hcv)
AU9028791A (en) * 1990-10-05 1992-04-28 President And Fellows Of Harvard College Detection and isolation of ligands
US5773211A (en) * 1991-07-10 1998-06-30 Abbott Laboratories Differentiation of HTLV-I and HTLV-II using synthetic peptides
US6352826B1 (en) * 1991-11-25 2002-03-05 Yoreh Biotechnologies, Ltd. Method and kit for the detection of retroviral specific antibodies in seronegative individuals
WO1993020443A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 Abbott Laboratories Assay verification control for analytical methods
AU677225B2 (en) * 1992-10-06 1997-04-17 Dade Behring Marburg Gmbh Retrovirus from the HIV group and its use
AU686616B2 (en) 1993-03-26 1998-02-12 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
US20070202127A1 (en) * 1993-06-07 2007-08-30 Duke University Nucleic acids encoding DP-178 and other viral fusion inhibitor peptides useful for treating aids
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US6074646A (en) * 1993-10-26 2000-06-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Nondenatured HIV envelope antigens for detecting early HIV-specific antibodies
US6025141A (en) * 1993-12-10 2000-02-15 The Canadian Red Cross Society Immunofluorescence assay for the detection of antibodies using recombinant antigens in insoluble form
US5695928A (en) * 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
DE4405810A1 (de) 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
US6319665B1 (en) 1994-06-07 2001-11-20 Inverness Medical Technology, Inc. Home test kit and method with telephone verification of results
US6043347A (en) 1996-10-10 2000-03-28 Probe International Inc. Compositions and methods for treating viral infections
US6392029B1 (en) * 1997-05-09 2002-05-21 The Research Foundation Of State University Of New York HIV chemokines
US8765461B2 (en) 1997-05-09 2014-07-01 Linda B. Ludwig HIV antisense proteins
US20030118985A1 (en) * 1997-05-14 2003-06-26 Hunt Jeffrey C. Mouse monoclonal antibody (5-21-3) to human immunodeficiency virus gp41 protein
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
US6846905B2 (en) * 1997-08-15 2005-01-25 Abbott Laboratories Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV
KR20000006334A (ko) * 1998-06-26 2000-01-25 이선경 바이러스코딩염기서열이전혀없는고효율레트로바이러스벡터
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
ATE384795T1 (de) 1998-12-31 2008-02-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Modifizierte hiv env polypeptide
EP1141314A2 (de) 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Für antigene polypeptide des hiv type c kodierende polynukleotide, entsprechende polypeptide und verwendungen davon
CA2360347C (en) 1998-12-31 2013-05-07 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
EP1574210B1 (de) 1999-02-26 2016-04-06 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Mikroemulsionen mit adsorbierten Makromolekülen
US6235479B1 (en) 1999-04-13 2001-05-22 Bio Merieux, Inc. Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample
AU4366000A (en) 1999-04-14 2000-11-14 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
EP1307130A4 (de) 2000-02-04 2005-01-12 Beth Israel Hospital Impfstoff gegen menschlichen immunschwächevirus
AU2001268716A1 (en) 2000-06-23 2002-01-08 Maxygen, Inc. Novel chimeric promoters
CA2835978C (en) 2000-09-01 2016-10-11 Gen-Probe Incorporated Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
DE60118798T2 (de) * 2000-10-13 2007-04-12 Chiron Corp., Emeryville Fragmente des introns a des cytomegalovirus
US6818392B2 (en) * 2000-12-06 2004-11-16 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof
WO2002079470A1 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 King A Christie Disease-specific promoter chimeras for gene expression
AU2002316578A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-18 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1444521A4 (de) * 2001-09-17 2006-12-06 Univ Texas Verfahren und zusammensetzungen unter beteiligung von thymidinphosphorylase als marker für hiv-infektion, den verlauf von aids und arzneistoffresistenz
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US20060115814A1 (en) * 2002-02-28 2006-06-01 Cloyd Miles W Methods and compositions, relating to hiv gp41 antigens and other hiv envelope antigens
ES2385485T3 (es) 2003-12-03 2012-07-25 Abbott Laboratories Sonda de ácido nucleico lineal de doble hebra y usos de la misma
EP2309269B1 (de) 2004-09-08 2016-10-26 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Zusammensetzungen und verfahren zur detektion von hiv-1/hiv-2 infektion
CA2582055C (en) 2004-09-30 2014-04-08 Gen-Probe Incorporated Assay for detecting and quantifying hiv-1
WO2006038883A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Advanced Network Technology Laboratories Pte Ltd User provisioning with multi-factor authentication
WO2007070372A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-21 Entremed, Inc. Compositions and methods for inhibiting cellular proliferation
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
US20080299624A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Edward Heslop Continuous fermentation apparatus and method
ES2316302B1 (es) * 2007-09-27 2010-01-26 Fundacion Reina Mercedes Para La Investigacion Sanitaria Metodo de analisis inmunologico, su utilizacion y kit para su realizacion.
EP2612868B1 (de) 2007-11-01 2018-08-15 Astellas Pharma Inc. Immunsuppressive Polypeptide und Nucleinsäuren
WO2010135663A2 (en) 2009-05-21 2010-11-25 The United States Of America , As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection
WO2011005799A2 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
US10113206B2 (en) 2010-02-24 2018-10-30 Grifols Therapeutics Inc. Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (HIV)
EP3187585A1 (de) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv-glycoproteine und rekombinante vektoren
WO2012006380A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
DK2691530T3 (en) 2011-06-10 2018-05-22 Univ Oregon Health & Science CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS
JP6120839B2 (ja) 2011-07-06 2017-04-26 ノバルティス アーゲー カチオン性水中油型エマルジョン
WO2013006834A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
EP2568289A3 (de) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunselektion von rekombinantem vesikulärem Stomatitisvirus mit Expression von HIV-1-Proteinen durch Breitbandneutralisierungs-Antikörper
EP2768530A1 (de) 2011-10-11 2014-08-27 Novartis AG Rekombinante polycistronische selbstreplizierende rna-moleküle
EP2586461A1 (de) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Von einem eingehüllten Virus abgeleitete Virenpartikel
SG11201406592QA (en) 2012-05-04 2014-11-27 Pfizer Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
EP2679596B1 (de) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 Env-proteinvariante
BR112015023355A8 (pt) 2013-03-14 2018-01-30 Abbott Lab antígenos recombinantes ns3 de hcv e mutantes dos mesmos para detecção de anticorpos aprimorada.
EP3916103A1 (de) 2013-03-14 2021-12-01 Abbott Laboratories Monoklonale antikörper gegen hcv-core lipid-bindender domäne
EP2968526A4 (de) 2013-03-14 2016-11-09 Abbott Lab Hcv-antigen-antikörper-kombinationstest sowie verfahren und zusammensetzungen zur verwendung darin
EP2848937A1 (de) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Verfahren zur Identifizierung neuartiger HIV-1-Immunogene
EP2873423B1 (de) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (de) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere
ES2811523T3 (es) 2016-01-19 2021-03-12 Pfizer Vacunas contra el cáncer
US11098310B2 (en) 2016-01-27 2021-08-24 Just-Evotec Biologics, Inc. Expression from transposon-based vectors and uses
US11028410B2 (en) 2016-01-27 2021-06-08 Just-Evotec Biologics, Inc. Hybrid promoter and uses thereof
US11261462B2 (en) 2016-01-27 2022-03-01 Just-Evotec Biologics, Inc. Inducible expression from transposon-based vectors and uses
IT201600116554A1 (it) * 2016-11-17 2018-05-17 Fond Ri Med Probiotic yeasts as novel vaccination vectors
PE20200613A1 (es) 2017-07-11 2020-03-11 Pfizer Composiciones inmunogenicas

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA443605A (en) 1947-08-12 Forrest David Surface grinder
IE52036B1 (en) 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
EP0062574A3 (de) 1981-03-31 1982-12-29 The Regents Of The University Of California Synthese von Virusproteinen
FR2506904A1 (fr) 1981-05-29 1982-12-03 Applic Catalytiques Ste Ly Procede de regulation d'une installation de chauffage et dispositif pour sa mise en oeuvre
DK368882A (da) 1981-08-25 1983-02-26 Alan John Kingsman Expessions vektorer
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4775622A (en) 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4468382A (en) 1982-07-15 1984-08-28 New England Medical Center, Inc. Polypeptide-toxin hybrid protein
EP0116201B1 (de) 1983-01-12 1992-04-22 Chiron Corporation Sekretorische Expression in Eukaryoten
US4797359A (en) * 1983-05-10 1989-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast
EP0136798A3 (de) * 1983-08-25 1986-02-19 Biotech Research Laboratories Inc. Titrierungsplatte und Testsatz zum Nachweis von Antikörpern in menschlichem Serum und ihre Herstellung und Verwendung
US5173400A (en) * 1983-09-15 1992-12-22 Institut Pasteur Antibody detection of antibodies to viral proteins in serum
GB8423659D0 (en) † 1984-09-19 1984-10-24 Pasteur Institut Cloned dna sequences
FR2571968B1 (fr) * 1984-10-18 1989-03-17 Pasteur Institut Virus purifie des lymphadenopathies et du syndrome d'immuno-depression acquise et antigenes d'enveloppe de ce virus, procede d'obtention de ce virus et de ces antigenes d'enveloppe de ce virus, applications de ce virus ou de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic des susdites affections.
GB8324800D0 (en) * 1983-09-15 1983-10-19 Pasteur Institut Antigens
JPS6061534A (ja) * 1983-09-16 1985-04-09 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド
US4519857A (en) 1983-10-05 1985-05-28 Natmar, Inc. Elastic band sealer apparatus and method for forming a continuous non-overlapping band
US5374519A (en) * 1983-12-05 1994-12-20 Institut Pasteur Oligopeptides comprising p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions comprising peptides of p18 protein of HIV, and diagnostic kits and methods for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS)
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
EP0152030A3 (de) * 1984-02-03 1986-08-13 Juridical Foundation Japanese Foundation for Cancer Research Adult-T-Zell-Leukemiavirus-Antigenpolypeptid
US4618578A (en) * 1984-07-17 1986-10-21 Chiron Corporation Expression of glycoprotein D of herpes simplex virus
NZ228756A (en) * 1984-04-23 1990-10-26 Us Health Detection of hiv antigen using competition immune assay or western blot assay
US4652599A (en) * 1984-04-23 1987-03-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS using permissive cells
US4520113A (en) * 1984-04-23 1985-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions
JPS60226658A (ja) * 1984-04-25 1985-11-11 Matsushita Electric Works Ltd 加熱器
US4738922A (en) * 1984-05-25 1988-04-19 Dana Farber Cancer Institute Trans-acting transcriptional factors
US4716102A (en) * 1984-08-15 1987-12-29 Regents Of The University Of California Purified AIDS-associated virus ARV-2
US9328391B1 (en) * 1984-08-22 2016-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cloning and expression of HIV-1 DNA
IL76082A (en) † 1984-08-22 1991-07-18 Us Health Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof
DE3431140A1 (de) * 1984-08-24 1986-03-06 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Enhancer fuer eukaryotische expressionssysteme
JPS6226300A (ja) * 1984-10-10 1987-02-04 セントコ−・インコ−ポレ−テツド Ｈｔｌｖ−３ｄｎａのクロ−ニングおよび発現
NZ230372A (en) * 1984-10-18 1994-02-25 Pasteur Institut Hiv antigen, assay and vaccine.
CA1341482C (en) 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
US4725669A (en) * 1984-11-09 1988-02-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III
DE3588134T2 (de) 1984-12-24 1997-03-20 Genentech Inc Fusionen von AIDS-verwandten Polypeptiden
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4629783A (en) * 1985-04-29 1986-12-16 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
DE3650175T3 (de) 1985-04-29 2007-09-06 Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules Synthetische antigene zum nachweis von aids.
AU603768B2 (en) * 1985-07-04 1990-11-29 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin
US5175098A (en) * 1985-08-07 1992-12-29 Genetic Systems Corporation Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to HIV
US5079342A (en) * 1986-01-22 1992-01-07 Institut Pasteur Cloned DNA sequences related to the entire genomic RNA of human immunodeficiency virus II (HIV-2), polypeptides encoded by these DNA sequences and use of these DNA clones and polypeptides in diagnostic kits
US5306614A (en) * 1986-01-22 1994-04-26 Institut Pasteur Methods and kits for diagnosing human immunodeficiency virus type 2(HIV-2)
US5310651A (en) * 1986-01-22 1994-05-10 Institut Pasteur DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2
US5066782A (en) * 1986-01-22 1991-11-19 Institut Pasteur Retrovirus capable of causing AIDS, means and method for detecting it in vitro
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
GB2197321B (en) * 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
GB8717430D0 (en) * 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5169753A (en) * 1989-06-05 1992-12-08 Genelabs Incorporated Method and kit for detecting human retrovirus
JP2767078B2 (ja) * 1990-10-17 1998-06-18 アメリカ合衆国 Ｈｉｖ―１の分子クローンとその使用法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7205101B1 (en) 1984-10-31 2007-04-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences, recombinant polypeptides, and applications thereof
US7273695B1 (en) 1984-10-31 2007-09-25 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HIV immunoassays using synthetic envelope polypeptides
US7285271B1 (en) 1984-10-31 2007-10-23 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide
US7408053B1 (en) 1984-10-31 2008-08-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant DNA constructs for GAG polypeptides and polypeptides produced thereby
US7425428B1 (en) 1984-10-31 2008-09-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant DNA construct for HIV envelope polypeptides and polypeptides produced thereby
US7527925B1 (en) 1984-10-31 2009-05-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Purified pol DNA, a recombinant DNA construct for expression of HIV pol polypeptide sequences and a cell containing such construct
USRE41158E1 (en) 1984-10-31 2010-03-02 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences
US7393949B1 (en) 1987-12-24 2008-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences
US7442525B1 (en) 1987-12-24 2008-10-28 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Method for expressing HIV polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
US5156949A (en) 1992-10-20
DE122005000031I1 (de) 2005-10-13
HK102495A (en) 1995-06-30
DE10399037I2 (de) 2004-05-06
CA1341423C (en) 2003-03-04
JP2004081219A (ja) 2004-03-18
EP1245678A3 (de) 2002-10-09
ATE295881T1 (de) 2005-06-15
US7408053B1 (en) 2008-08-05
EP1245678A2 (de) 2002-10-02
NL300137I1 (nl) 2004-02-02
US5688688A (en) 1997-11-18
DE3588252T2 (de) 2006-02-02
US6458527B1 (en) 2002-10-01
US6531276B1 (en) 2003-03-11
NL300137I2 (nl) 2005-11-01
JPH07313184A (ja) 1995-12-05
DE3588253D1 (de) 2005-07-14
NL300197I1 (de) 2005-08-01
DE10399037I1 (de) 2006-06-08
ATE90384T1 (de) 1993-06-15
DE3588253T2 (de) 2006-02-16
EP1245678B1 (de) 2005-06-08
ATE297468T1 (de) 2005-06-15
EP0181150B1 (de) 1993-06-09
JPH09235297A (ja) 1997-09-09
JPS61173782A (ja) 1986-08-05
JP2865283B2 (ja) 1999-03-08
EP0181150B2 (de) 2003-03-12
DE1245678T1 (de) 2003-09-18
EP0518443B1 (de) 2005-05-18
DE3587394D1 (de) 1993-07-15
JPH11341992A (ja) 1999-12-14
DE3587394T3 (de) 2004-02-26
JPH07311199A (ja) 1995-11-28
LU91049I2 (fr) 2004-01-26
JP2005137383A (ja) 2005-06-02
EP0181150A1 (de) 1986-05-14
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