DE3587394T3

DE3587394T3 - Rekombinante Virusproteine begleitet von lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS).

Info

Publication number: DE3587394T3
Application number: DE3587394T
Authority: DE
Inventors: Paul A. Luciw; Dino Dina; Kathelyn Steimer; Ray Sanchez Pescador; Carlos George-Nascimento; Deborah Parkes; Rob Hallewell; Philip J. Barr; Martha Truett
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-10-31
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2005-10-31
Also published as: US5156949A; DE122005000031I1; HK102495A; DE10399037I2; CA1341423C; JP2004081219A; EP1245678A3; ATE295881T1; US7408053B1; EP1245678A2; NL300137I1; US5688688A; DE3588252T2; US6458527B1; US6531276B1; NL300137I2; JPH07313184A; DE3588253D1; NL300197I1; DE10399037I1

Description

Diese Erfindung liegt auf dem Fachgebiet der Gentechnik. Insbesondere betrifft sie rekombinante Virusproteine, die mit lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) assoziiert sind.
Mit der Entdeckung des menschlichen T-Zell-lymphotropen Virus-I (HTLV-I) als infektiöses Agens bei Menschen wurde nachgewiesen, daß Retroviren Menschen infizieren und Krankheiten verursachen können. Nachdem HTLV-I eingeführt worden war, wurde ein zweites Virus derselben Familie, HTLV-II, ein bei Haarzellen-Leukämie nachgewiesener Stamm, gefunden. Seit dieser Zeit sind noch andere menschliche Retroviren isoliert worden, die bei Opfern mit lymphadenopathischem Syndrom (LAS)- und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) vorkommen. Verschiedene Retroviren sind aus Individuen mit AIDS (manchmal HTLV-III genannt) oder LAS (manchmal LAV genannt) isoliert worden. Vgl. beispielsweise Barre-Sinoussi et al., Science 220 (1983), 868–871, und Montagnier et al., Cold Spring Harbor Symposium (1984), im Druck; Vilmer et al., Lancet 1 (1984), 753, Popovic et al., Science 224 (1984), 497, und Gallo et al., Science 224 (1984), 500. Ein Vergleich von HTLV-III und LAV findet sich in Feorino et al., Science (1984), a.a.O.. Vgl. auch Klatzman et al., Science 225 (1984), 59–62, Montagnier et al., ebenda (1984), 63–66, und die darin zitierten Referenzen für einen Überblick des Fachgebietes. Eine allgemeine Diskussion der T-Zell-Leukämie-Viren findet sich in Marx, Science 22 (1984), 475–477. Levy et al., Science 225 (1984), 840–842, beschreiben die Isolierung von ARV (AIDS-assoziierten Retroviren).
Zur Zeit der Einreichung dieser Anmeldung wurden diese Viren (HTLV-III, LAV und ARV) allgemein als menschliches T-Zell-lymphotropes Retrovirus (hTLR) bezeichnet. Seit 1986 jedoch wurde der gleichbedeutende allgemeine Begriff "Human Immune Deficiency Virus" (HIV) als anerkannte Bezeichnung für solche Viren eingeführt. Anschließend wurde eine Unterteilung der allgemeinen Gruppe HIV in HIV-I und HIV-II nötig. Da die Anmeldung ARV-2-Isolate betrifft, die HIV-I-Isolate sind, wurde hTLR (HIV) in der Anmeldung durch HIV-I ersetzt, demgemäß sind die Ansprüche auf HIV-I beschränkt. Die HIVs (hTRLs) können derselben Klasse zugeordnet werden, wenn sie in Morphologie, Serologie, in den Optima der Reversen Transkriptase und der Cytopathologie den in den vorstehenden Referenzen beschriebenen Eigenschaften ähnlich sind. Beispielsweise bevorzugt die Reverse Transkriptase Mg²⁺ und weist ein pH-Optimum von etwa 7,8 auf.
DNA-Clone, die HIV-Proteine codieren, werden in EP-A1-0173529, EP-A1-0178978, EP-A2-0185 444 und WO 86J02383 offenbart.
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
1 zeigt eine Restriktionskarte von proviraler DNA (ARV-2).
2 zeigt die Nucleotidsequenz von ARV-2(9B). Die Aminosäuresequenzen für die Produkte der gag-, pol- und env-Gene sind bezeichnet. Die U3-, R- und U5-Regionen der LTRs sind auch bezeichnet. Die cap-Stelle ist Position +1. Eine 3 Bp-umgedrehte Wiederholung an den Enden des LTR, die TATA-Box in Position –29, die zum 3'-Ende der tRNA^lys komplementäre Sequenz in Position 183 und das Polyadenylierungssignal in Position 9174 sind unterstrichen. Die darüberstehenden Linien bezeichnen die Aminosäuresequenzen, die aus Virionproteinen bestimmt wurden. Die Nucleotide sind am Anfang jeder Linie numeriert und die Aminosäuren am Ende jeder Linie bezeichnet.
3 stellt einen Arbeitsablaufplan dar, der das Vorgehen zur Herstellung von Plasmid pGAG25-10 zeigt.
4 zeigt die Nucleotidsequenz des p25 gag-Gens, das in Plasmid pGAG25-10 cloniert ist, und die durch dieses Gen codierte Aminosäuresequenz.
5 zeigt den codierenden Strang der Nucleotidsequenz, cloniert in pGAG41-10, für die Herstellung des Fusionsproteins p41 gag und die entsprechende Aminosäuresequenz.
6 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-p16 gag-Protein codiert, das in Plasmid ptac5 cloniert wurde, zur Erzeugung eines Expressionsplasmides für die Herstellung des p16 gag-Proteins in Bakterien.
7 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-env-Protein codiert und zur Herstellung von Plasmid pDPC303 verwendet wurde.
Die HIV-I-DNA-Sequenzen, die entweder aus proviraler DNA oder cDNA isoliert und cloniert oder synthetisiert wurden, können zur Expression von Polypeptiden verwendet werden, die ein Vorläuferprotein, das einer weiteren Behandlung durch Spaltung unterworfen wird, oder ein komplettes reifes Protein oder ein Fragment davon darstellen können. Die kleinste Sequenz von Interesse zur Bereitstellung einer Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, die zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor, z. B. ein Immunglobulin, fähig ist, hat 21 Bp, üblicherweise mindestens 45 Bp, ausschließlich dem Initiationscadon. Die Sequenz kann einen beliebigen größeren Teil des Polypeptids oder das komplette Polypeptid codieren oder sie kann benachbarte Bereiche eines Vorläuferpolypeptids umfassen, so daß sie Teile von Sequenzen oder ganze Sequenzen umfaßt, die zwei oder mehrere verschiedene reife Polypeptide codieren. Die Sequenz macht üblicherweise weniger als etwa 5 kBp aus, häufiger weniger als etwa 3 kBp.
Sequenzen von besonderem Interesse, die offene Leseraster aufweisen (2), kennzeichnen die Strukturgene für die gag-Proteine (p16 und p25) und das env-Protein. Es muss so verstanden werden, dass die vorstehenden Sequenzen mit anderen, im Retrovirus vorliegenden Sequenzen verspleißt werden können, so daß es sein kann, daß das 5'-Ende der Sequenz nicht die N-terminale Aminosäure des Expressionsproduktes codiert. Die Spleißstelle kann am 5'-Terminus des offenen Leserasters oder innerhalb des offenen Leserasters liegen. Das Initiationscodon für das Protein ist möglicherweise nicht das erste Codon für Methionin, sondern es kann das zweite oder dritte Methionin sein, so daß die Verwendung der gesamten vorstehend angegebenen Sequenz zu einem verlängerten Protein führen kann. Jedoch findet bei gag- und env-Genen in Säugerzellen eine proteolytische Prozessierung statt, wobei zusätzliche Aminosäuren entfernt werden können.
Zur Isolierung der verschiedenen Domänen kann das Provirus mit Restriktionsendonucleasen gespalten und die Fragmente einer Elektrophorese unterworfen werden, sodann werden Fragmente, die die richtige Größe aufweisen und mit einer Sonde einen Doppelstrang bilden, falls erforderlich isoliert, in einem Clonierungsvektor cloniert und aus dem Vektor herausgeschnitten. Die Fragmente können sodann für die Expression zubereitet werden. Überflüssige Nucleotide können von einem oder beiden Termini durch Spaltung mit Bal31 entfernt werden. Durch Restriktionskartierung können geeignete Restriktionsstellen außerhalb oder innerhalb des codierenden Bereiches lokalisiert werden. Zur Definition eines Terminus kann Primer-Reparatur oder in vitro-Mutagenese für Insertionen, Deletion, Punktmutationen oder Mehrfachmutationen oder dgl. eingesetzt werden, wobei Codons entweder kryptisch oder unter Austauschen der Aminosäure verändert werden können, Restriktionsstellen eingeführt oder entfernt werden können oder dergleichen. Wenn das Gen verkürzt worden ist, können die verlorenen Nucleotide unter Verwendung eines Adaptors ersetzt werden. Adaptoren sind zum Anfügen an codierende Bereiche besonders nützlich, um das richtige Leseraster sicherzustellen.
Die env-Domäne des HIV-I-Genoms kann durch Spaltung des Provirus mit EcoRI und KpnI und Reinigung eines Fragmentes mit 3300 Basenpaaren (Bp) erhalten werden, wobei das Fragment etwa 400 Bp des 5'-nicht-codierenden und etwa 200 Bp des 3'-nicht-codierenden Bereichs enthält. Drei verschiedene Methionine, die von der Sequenz im 5'-Ende des offenen Leserasters codiert werden, können als translationale Initiationsstellen dienen.
Die Spaltung von proviralen Sequenzen mit SacI und EcoRV stellt ein Fragment mit etwa 2300 Bp bereit, das die gag-Domäne und ein zweites kleines offenes Leseraster nahe beim 3'-Ende des gag-Bereichs enthält. Die gag-Domäne macht etwa 1500 Bp aus und codiert ein großes Vorläuferprotein, das zum Erhalt von Proteinen von etwa 25 000 (p25), 16 000 (p16) und 12 000 (p12) Daltons prozessiert wird. Die Spaltung mit SacI und BalII kann auch eingesetzt werden, um ausschließlich die gag-Domäne mit den p12-, p25- und teilweise p16-Bereichen zu erhalten.
Die Polypeptide, die durch die vorstehenden DNA-Sequenzen exprimiert werden, können auf ganz verschiedene Art und Weise verwendet werden. Die Polypeptide oder immunologisch aktive Fragmente davon können als diagnostische Reagentien, wobei sie in markierter oder unmarkierter Form oder immobilisiert (d. h. gebunden an eine feste Oberfläche) verwendet werden, als Impfstoffe, bei der Herstellung von monoclonalen Antikörpern, z. B. hemmenden Antikörpern, oder dergleichen eingesetzt werden.
Die DNA-Sequenzen können mit anderen Sequenzen, wie Viren, z. B. Vacciniavirus oder Adenovirus, verknüpft und zur Impfung verwendet werden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz des viralen Antigens in das Vacciniavirus an einer solchen Stelle eingefügt werden, daß sie exprimiert werden kann, wodurch ein Antigen von HIV-I bereitgestellt wird, das vom Wirt als Immunogen erkannt wird. Hierbei können die gag- oder env-Gene oder Fragmente davon, die Immunogene codieren, eingesetzt werden.
Eine weitere Alternative besteht darin, die gag- oder env-Bereiche oder Teile davon mit HBsAg-Gen oder pre-S-HBsAg-Gen oder immunogenen Teilen davon zu verknüpfen, die zur Bildung von Partikeln in einem einzelligen Mikroorganismuswirt, z. B. Hefe, oder in Säugerzellen, befähigt sind. Auf diese Weise werden Partikel hergestellt, die, wenn der Wirt mit zusammengesetzten Partikeln geimpft wird, dem Wirt das HIV-I-Immunogen in immunogener Form präsentieren.
Als Impfstoffe können die verschiedenen Formen des Immunogens über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, z. B. oral, parenteral, intravenös, intraarteriell, subcutan und dergleichen. Üblicherweise werden sie in einem physiologisch verträglichen Träger bereitgestellt, im allgemeinen in destilliertem Wasser, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen. Verschiedene Adjuvantien können zugegeben werden, wie z. B. Aluminiumhydroxid, und die Dosierungen, die Häufigkeit der Verabreichung und die Art der Verabreichung empirisch bestimmt werden.
Zum Erhalt der HIV-I-Sequenz kann das Virus aus dem Überstand einer infizierten Wirtszelle pelletiert werden. Eine RNA-Sorte von 9 kB wird durch Elektrophorese der viralen RNA in Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt und anschließende Phenolextraktion gereinigt. Die gereinigte RNA kann sodann in einer Reversen Transkriptase-Reaktion als Matrize eingesetzt werden, wobei Primer mit zufälliger Sequenz verwendet werden. Die resultierende cDNA wird sodann auf Hybridisierung an PolyA+-RNA aus infizierten und nichtinfizierten Zellen abgesucht. Eine Hybridisierung, die bei Proben aus infizierten, nicht aber bei solchen aus nichtinfizierten Zellen stattfindet, ist auf das HIV-I zurückzuführen.
Genomische DNA aus infizierten Zellen kann durch Restriktionsenzyme gespalten und zur Herstellung einer Bakteriophagenbank verwendet werden. Aufgrund der Restriktionsanalyse der früher erhaltenen Fragmente des Retrovirus kann das virale Genom mit EcoRI teilweise gespalten werden, sodann können DNA-Fragmente von 9 kB bis 15 kB isoliert und Zur Herstellung der Genbank eingesetzt werden. Der resultierende rekombinante Phage kann unter Verwendung eines "Double-Lift"-Absuchverfahrens unter Einsatz der viralen cDNA-Sonde abgesucht werden, worauf eine weitere Reinigung, z. B. Plaque-Reinigung, und eine Propagierung in großen Flüssigkulturen folgt. Aus der Bank kann die vollständige Sequenz des Virus erhalten und mit der vorstehend beschriebenen Sonde nachgewiesen werden.
HIV-I-DNA (entweder Provirus oder c-DNA) kann in einem beliebigen geeigneten Vektor cloniert werden. Konstrukte können entweder ringförmig oder linear hergestellt werden, wobei die HIV-I-DNA, entweder die gesamte HIV-I-DNA oder Fragmente davon, an ein Replikationssystem ligiert werden kann, das in einem Mikroorganismuswirt, in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen (Säuger, Hefe, Arthropoden, Pflanzen) funktionell ist. Mikroorganismuswirte umfassen E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa, S. cerevisiae, N. crassa usw.. Replikationssysteme können aus ColE1, 2-Mikron-Plasmid, Lambda, SV40, Rinderpapillomavirus oder dergleichen stammen, d. h. sowohl aus Plasmiden als auch aus Viren. Neben dem Replikationssystem und der HIV-I-DNA enthält das Konstrukt üblicherweise außerdem einen oder mehrere Marker, die eine Selektion von transformierten oder transfizierten Wirten ermöglichen. Marker umfassen eine Biozid-Resistenz, z. B. die Resistenz gegen Antibiotika, Schwermetalle usw., die Komplementierung in einem auxotrophen Wirt, so daß dieser prototroph wird, und dergleichen.
Zur Expression werden Expressionsvektoren verwendet. Bei der Expression in Mikroorganismen kann sich der Expressionsvektor vom Clonierungsvektor darin unterscheiden, daß er Signalsequenzen aufweist, die die transkriptionale und translationale Initiation und Termination regulieren, und außerdem ein Replikationssystem umfassen kann oder auch nicht, das im Expressionswirt funktionell ist. Die codierende Sequenz ist zwischen den die Initiation und Termination regulierenden Signalen eingefügt, so daß sie unter deren regulatorischer Kontrolle liegt. Expressionsvektoren können außerdem die Verwendung von regulierbaren, z. B. temperatursensitiven oder durch Chemikalien induzierbaren, Promotoren oder von Genen umfassen, die die Integration und Amplifizierung des Vektors und der HIV-I-DNA erlauben, wie z. B. tk, dhfr, Metallothionein oder dergleichen.
Der Expressionsvektor wird in einen geeigneten Wirt eingeführt, wobei die regulatorischen Signale in einem solchen Wirt funktionell sind. Der Expressionswirt wird in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, wobei das gewünschte Polypeptid hergestellt und aus den Zellen oder, sofern das Polypeptid ausgeschieden wird, aus dem Medium isoliert wird.
Wenn ein Wirt eingesetzt wird, in dem die transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signale von HIV-I funktionell sind, kann die HIV-I-DNA-Sequenz so präpariert werden, daß sie für die Expression des gewünschten Polypeptids in geeigneter Weise neben den regulatorischen Signalen angeordnet ist.
Die Polypeptidprodukte können in im wesentlichen reiner Form erhalten werden, insbesondere frei von Trümmern aus menschlichen Zellen, wobei die Trümmer Verunreinigungen wie Proteine, Polysaccharide, Lipide, Nucleinsäuren, Viren, Bakterien, Pilze usw. und Kombinationen davon umfassen können. Im allgemeinen enthalten die Polypeptidprodukte weniger als etwa 0,1, üblicherweise weniger als etwa 0,01 Gew.-%, verunreinigendes Material aus dem Expressionswirt. Abhängig davon, ob das gewünschte Polypeptid im Cytoplasma produziert oder ob es ausgeschieden wird, ist die Art und Weise der Isolierung verschieden. Sofern das Produkt im Cytoplasma vorliegt, werden die Zellen geerntet, lysiert, das Produkt extrahiert und gereinigt, wobei Lösungsmittelextraktion, Chromatographie, Gel-Ausschluß, Elektrophorese oder dergleichen eingesetzt wird. Sofern das gewünschte Produkt ausgeschieden wird, wird es aus dem Nährmedium extrahiert und gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt.
Die Expressionsprodukte der env- und gag-Gene und immunogene Fragmente davon, die immunogene Stellen aufweisen, können zum Absuchen von Antiseren aus Patientenblut verwendet werden, um zu bestimmen, ob Antikörper vorliegen, die an HIV-I-Antigene binden. Im serologischen Test werden eines oder mehrere der rekombinanten Antigene verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen des Tests wird eine Kombination aus gag-, env- und pol-Antigenen eingesetzt. Eine Kombination aus rekombinanten p25-, p31- und env-Antigenen ist besonders bevorzugt. Viele verschiedene Immunassay-Techniken können eingesetzt werden, umfassend markierte oder unmarkierte Antigene oder immobilisierte Antigene. Die Markierung kann aus fluoreszierenden Substanzen, Radionucliden, Enzymen, chemilumineszieren den Substanzen, magnetischen Teilchen, Enzymsubstraten, Cofaktoren oder Inhibitoren, Liganden oder dergleichen bestehen.
Eine besonders geeignete Technik umfaßt die Bindung des Antigens an einem Träger, wie z. B. an die Oberfläche eines Teströhrchens oder die Vertiefung einer Testplatte oder an einen Streifen aus einem Material, wie z. B. Nitracellulose oder Nylon, welches Proteine bindet, und das Inkontaktbringen der Probe mit dem immobilisierten Antigen. Nach Waschen des Trägers Zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Antisera werden markierte Antikörper gegen menschliches Ig zugefügt. Der Träger wird sodann erneut gewaschen, um ungebundene markierte Antikörper gegen menschliches Ig zu entfernen. Anschließend wird das Vorliegen von gebundenem Analyt durch Nachweis der Markierung bestimmt.
ELISA und "Dot-Blot"-Assays sind zum Absuchen von Blut- und Serumproben auf anti-HIV-I-Antikörper besonders nützlich. Beim ELISA-Test werden Mikrotiterplatten mit Vertiefungen verwendet, die mit dem (den) antigenen HIV-I-Polypeptid(en) beschichtet worden sind. Außerdem werden die Vertiefungen typischerweise danach mit einem nichtantigenen Protein beschichtet, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern in der Probe an die Oberfläche der Vertiefungen zu verhindern. Die Probe wird in die Vertiefungen eingebracht und darin eine geeignete Zeitspanne unter Bedingungen inkubiert, die eine Antigen-Antikörper-Bindung begünstigen.
Anti-HIV-I-Antikörper, die in der Probe vorliegen binden sodann an das (die) Antigen e) auf der Vertiefungswand. Anschließend wird die Probe entfernt und die Vertiefungen gewaschen, um die verbliebene ungebundene Probe zu entfernen. Anschließend wird ein Reagenz, das enzymmarkierte Antikörper gegen menschliches Immunglobulin enthält, in die Vertiefungen eingebracht und darin inkubiert, wobei die Bindung zwischen den markierten Antikörpern gegen menschliches Ig und den an die Vertiefungswand gebundenen Komplexen aus HIV-I-Antigen und menschlichem Antikörper stattfinden kann. Nach vollständigem Ablaufen der Inkubation wird das Reagenz entfernt und die Vertiefungen zur Entfernung von ungebundenem markiertem Reagenz gewaschen. Sodann wird ein Substratreagenz in die Vertiefungen zugegeben und darin inkubiert. Die enzymatische Aktivität auf dem Substrat wird visuell oder spektrophotometrisch bestimmt und ist ein Indikator für das Vorliegen und die Menge des an die Vertiefungsoberfläche gebundenen Immunkomplexes, der anti-HIV-I-Antikörper enthält.
Das "Dot-Blot"-Verfahren umfaßt die Verwendung von HIV-I-Antigen(en), das (die) an ein Stück oder einen Streifen aus saugfähigem Trägermaterial, wie z. B. Nitrocellulose-Filterpapier oder Nylonmembran, immobilisiert ist (sind), anstelle der mit Antigen beschichteten Mikrotiterplatten. Anschließend wird der Träger auch mit einem nichtantigenen Protein behandelt, um eine unspezifische Bindung von Antikörper an den Träger zu verhindern. Der das Antigen tragende Träger wird in die Probe eingetaucht und zur Inkubation darin belassen. Wieder kommt es zur Bindung der in der Probe vorliegenden anti-HIV-I-Antikörper an das (die) an den Träger immobilisierte(n) Antigen(e). Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der Träger aus der Probe entnommen und wiederholt in Waschpuffer eingetaucht, um die ungebundene Probe vom Papier zu entfernen. Sodann wird der Träger eine geeignete Inkubationszeit in das Reagenz mit dem enzymmarkierten Antikörper gegen menschliches Tg eingetaucht. Nach der Behandlung mit dem markierten Reagenz wird der Träger in Waschpuffer eingetaucht und danach in der Substratlösung inkubiert. Die Enzymaktivität, die das Vorliegen von anti-HIV-I-Antikörper-enthaltenden Komplexen auf dem Träger anzeigt, führt zu Farbänderungen auf dem Träger, die optisch nachgewiesen werden können.
Jede dieser Techniken kann so modifiziert werden, daß andere Markierungen als Enzyme verwendet werden können. Dementsprechend werden die Ablese- oder Nachweisverfahren verändert.
Die antigenen Polypeptide von HIV-I können auch selbst als Immunogene verwendet oder mit anderen Polypeptiden kombiniert werden, wobei Antiseren oder monoclonale Antikörper hergestellt werden, die zur Therapie oder Diagnose verwendet werden können. Die Immunglobuline können aus einer beliebigen Säugerquelle, z. B. einem Nager, wie Ratte oder Maus, einem Primaten, wie Pavian, Affe oder Menschen, oder dergleichen stammen. Zur Diagnose können die Antikörper in herkömmlicher Art und Weise eingesetzt werden, um HIV-I in einer klinischen Probe nachzuweisen.
Die HIV-I-DNA-Sequenzen können auch mit Isotopen und nichtisotopen Labels oder Markierungen markiert und als DNA-Sonden verwendet werden, um das Vorliegen von natürlichen HIV-I-Nucleotidsequenzen in solchen Proben nachzuweisen, von denen angenommen wird, daß sie diese enthalten.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise als einschränkend angesehen werden.
1. "AIDS Related Virus-2" (ARV-2), Reinigung und Herstellung von viraler RNA
Die mit ARV-2 infizierten HUT-78-Zellen (ATCC Hinterlegungsnummer CRL 8597, hinterlegt am 7. August 1984) wurden von Dr. Jay Levy, University of California, San Francisco, erhalten. Die Kulturen wurden zwei Wochen in RPMI-Medium mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. Sodann wurden die Kulturen unter Verwendung eines SW-28-Rotors eine Stunde bei 2 kUpM und 4°C zentrifugiert. Das Pellet, das das Virus enthielt, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, auf Eis resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde mit 10 μg DNase (Boehringer Mannheim) versetzt und auf einen linearen Saccharosegradienten (15 bis 50% in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 20 mM NaCl) aufgetragen. Der Gradient wurde vier Stunden bei 34 kUpM und 4°C in einem SW-41-Rotor zentrifugiert. Fünf Fraktionen à 2,5 ml wurden gesammelt und ein Aliquot jeder Fraktion in einem Gel aus 1% Agarose und 5 mM Methylquecksilberhydroxid der Elektrophorese unterworfen (Bailey und Davidson, Anal. Biochem. 70 (1976), 75–85), wobei bestimmt wurde, welche Fraktion die virale RNA mit 9 kB enthielt. Die Fraktion, die die viralen RNA enthielt, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA, auf 10 ml verdünnt und zwei Stunden bei 34 kUpM und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA, 0,1% SDS und 200 μg/ml Proteinase K resuspendiert. Die Inkubation wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Gemisch wurde mit Phenol extrahiert, die wäßrige Phase auf 400 mM NaCl gebracht und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und bei –70°C gelagert.
Zur Reinigung der viralen RNA aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Nucleinsäurepellet wurde eine Probe der Elektrophorese in einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt, das 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielt, unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 0,1% Ethidiumbromid gefärbt und die Nucleinsäurebanden unter UV-Licht sichtbargemacht. Die Region, die 9 kB entsprach, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose zwei bis drei Minuten bei 70°C in drei Volumina 0,3 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, geschmolzen. Das Gemisch wurde mit dem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wurde erneut mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde mit kaltem 95% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in Wasser resuspendiert und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert. 100 ml Kulturmedium ergaben 0,5 bis 1 μg gereinigte RNA.
2. Synthese der markierten homologen viralen Sonde
Eine ³²P-markierte cDNA wurde zu der über das Gel gereinigten viralen RNA hergestellt, wobei Primer mit zufälliger Sequenz verwendet wurden (Kalbsthymus-Primer), die, wie in Maniatis et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982, beschrieben, hergestellt wurden. Das Reaktionsgemisch enthielt 2 μl 0,5 M MgCl₂, 5 μl 0,1 M Dithiothreitol, jeweils 2,5 μl 10 mM dATP, 10 mM dGTP und 10 mM dTTP, 2,5 μl Kalbsthymus-Primer (100 A₂₆₀/ml), 0,5 μg virale RNA, 5 μl Actinomycin D (200 μg/ml), 10 μl ³²P-dCTP (>3000 Ci/mMol, 1 mCi/ml) und 1 μl AMV-Reverse Transkriptase (17 Einheiten/μl) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Sonde wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex^® G50-Säule von freien Nucleotiden gereinigt. Das Ausschlußvolumen wurde vereinigt, NaCl bis zu einer Endkonzentration von 400 mM und einzelsträngige Träger-DNA bis zu 100 μg/ml zugefügt und die cDNA mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und die eingebauten ³²P-Impulse gezählt.
3. Nachweis von ARV-Sequenzen in PolyA+-RNA hergestellt aus infizierten HUT-78-Zellen
PolyA+-RNA wurde aus HUT-78-Zellen, infiziert mit ARV-2, ARV-3 oder ARV-4 (drei verschiedene Isolate aus drei verschiedenen AIDS-Patienten), und aus nichtinfizierten HUT-78-Zellen hergestellt. Die PolyA+-RNA wurde auf 1% Agarosegelen, die 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielten (Bailey und Davidson, a.a.O.), einer Elektrophorese unterworfen, auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit der homologen Sonde hybridisiert, die wie in Abschnitt 2 beschrieben hergestellt worden war. Hybridisierungen wurden in 50% Formamid, 3 × SSC, bei 42°C durchgeführt. Gewaschen wurde in 0,2 × SSC bei 50°C. Eine Bande mit 9 kBp lag in allen drei Proben der infizierten HUT-78-Zellen vor. Diese Bande fehlte in PolyA+ aus nichtinfizierten Zellen.
4. Nachweis von ARV-Sequenzen in infizierten und nichtinfizierten HUT-78-Zellen
Hochmolekulare (chramosomale) DNA wurde aus mit ARV-2 infizierten Kulturen von HUT-78-Zellen und aus nichtinfizierten HUT-78-Zellen nach dem Verfahren von Luciw et al., Molec. and Cell Biol. 4 (1984), 1260–1269, hergestellt. Die DNA wurde mit Restriktionsenzym(en) gespalten, einer Elektrophorese in 1% Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulose geblottet, wobei das von Southern (1975), a.a.O., beschriebene Verfahren angewendet wurde. Blots wurden mit ³²P-markierter Sonde (10⁶ cpm/Blot) in einem Gemisch, das 50% Formamid, 3 × SSC, 10 mM Hepes, pH 7.0, 100 μg/ml denaturierte Träger-DNA, 100 μg/ml Hefe-RNA und 1 × Denhardt enthielt, 36 Stunden bei 42°C hybridisiert. Die Filter wurden einmal bei Raumtemperatur in 2 × SSC und zweimal bei 42°C in 0,2 × SSC, 0,1% SDS, gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und auf einen X-Omat-Film unter Verwendung eines Verstärkungsschirmes aufgebracht.
Die homologe ³²P-Sonde gegen ARV-2 hybridisierte spezifisch mit zwei Banden in der mit SacI gespaltenen DNA aus infizierten Zellen. Diese Banden fehlten, wenn DNA aus nichtinfizierten Zellen verwendet wurde, dies zeigte, daß die Sonde spezifisch mit infizierten Zellen hybridisiert, vermutlich mit dem in der chromosomalen DNA integrierten Provirus. Das Molekulargewicht der Banden beträgt etwa 5 kB und 3 kB.
Um festzustellen, ob verschiedene Enzyme die proviralen Sequenzen spalten können, wurden mehrere andere Restriktionsspaltungen der Zell-DNA unter Verwendung von EcoRI, SphI oder KpnI oder doppelte Spaltungen unter Verwendung von zwei solchen Enzymen durchgeführt. Die Southern-Ergebnisse zeigen spezifische Banden, die hybridisieren, wenn DNA aus infizierten Zellen verwendet wird. 1 zeigt eine schematische Karte der Positionen von Restriktionsenzymstellen in der proviralen Sequenz und bezeichnet Fragmentstellen.
5. Clonierung von proviraler ARV-2-DNA
Hochmolekulare Zell-DNA aus infizierten HUT-78-Zellen wurde hergestellt, wobei das Verfahren von Luciw et al., a.a.O., angewendet wurde. Die DNA wurde mit EcoRI, das im Provirus einmal schneidet, gespalten, in einem Saccharosegradienten zentrifugiert und die Fraktionen, die 8 bis 15 kB entsprachen, vereinigt, dialysiert und durch Ethanolfällung eingeengt. Der aus dem Bakteriophagen λ stammende Clonierungsvektor EMBL-4 (Karn et al., Methods Enzymol. 101 (1983), 3–19) wurde mit einem Gemisch aus den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI und SalI vollständig gespalten und die DNA sodann durch Phenol-Chloroform-Extraktion entproteinisiert, mit kaltem Ethanol gefällt und in Ligierungspuffer resuspendiert. Die EMBL-4-Phagen-DNA und das EcoRI-Spaltprodukt von zellulärer DNA wurden gemischt und ligiert und die resultierenden rekombinanten Phagengenome in vitro verpackt. Nach Phageninfektion von λ-sensitivem E. coli (DP50supF) wurden etwa 500 000 Phagenplaques auf Nitrocellulosefilter übertragen, die DNA fixiert und die Filter mit einer homologen ³²P-Sonde abgesucht, die, wie in Abschnitt 2 beschrieben, hergestellt worden war. In dem anfänglichen "Double-Lift"- Absuchverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, NY, 1982) wurden von 500 000 Phagen elf rekombinante Phagen an die virale cDNA-Sonde angelagert, diese wurden einer weiteren Plaque-Reinigung unterworfen und in großen Flüssigkulturen zur Herstellung von rekombinanter DNA vermehrt. Plaque-gereinigte Phagen, die ARV-DNA enthielten, wurden in Flüssigkultur in E. coli DP50supF vermehrt, Phagenpartikel geerntet, in CsCl-Gradienten in Banden aufgetrennt und die rekombinante Phagen-DNA durch Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung hergestellt (Maniatis et al., a.a.O.). Ein μg gereinigte Phagen-DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten, einer Elektrophorese auf 1% Agarosegelen unterworfen und mit Ethidiumbromid unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die DNA aus diesen Gelen wurde auf Nitrocellulose übertragen und zeigte Annelierung mit der viralen cDNA-Sonde.
Einer der elf Phagen, der mit λ-ARV-2(9B) bezeichnet worden war, wurde am 25. Januar 1985 bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 40158. λ-ARV-2(9B) enthielt eine Insertion von proviraler DNA in voller Länge zusammen mit flankierenden Zellsequenzen. Die Spaltung von λ-ARV-2(9B)-DNA mit SacI ergab virale DNA-Fragmente von 3,8 kB und 5,7 kB. EcoRI-Spaltung von λ-ARV-2(9B) erzeugte Virus-enthaltende DNA-Fragmente mit 6,4 kB und 8,0 kB; eine doppelte Spaltung mit SacI und EcoRI ergab virale DNA-Fragmente mit 3,8 kB und 5,4 kB. Dieses Muster stimmt mit demjenigen eines mit Zell-DNA verbundenen Provirus überein.
Zusätzlich zu λ-ARV-2(9B) wurde ein Phage erhalten, der (1) die linke Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle der viralen DNA aus enthielt, wobei er sich in die flankierende Zell-DNA erstreckte (λ-ARV-2(8A)) und (2) ein Phage, der die rechte Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle der viralen DNA aus aufweist, wobei er sich in die flanierende Zell-DNA erstreckte (λ-ARV-2(7D)). Die Bakteriophagen λ-ARV-2(7D) (rechts) und λ-ARV-2(8A) (links) wurden am 26. Oktober 1984 bei der ATCC hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern 40143 bzw. 40144.
6. Polymorphismus
Um die Verwandtschaft von unabhängigen ARV-Isolaten zu bestimmen, wurden Restriktionsenzym-Spaltprodukte von DNA aus HUT-78-Zellen, die mit ARV-3 und ARV-4 infiziert waren, mit der aus clonierter ARV-2-DNA hergestellten Sonde analysiert. Das SacI-Spaltprodukt von ARV-3-DNA war dem von ARV-2 ähnlich, wohingegen die HindIII-Spaltprodukte unterschiedliche Muster zeigten. Das SacI-Spaltprodukt und das PstI-Spaltprodukt von ARV-4-DNA unterschieden sich von den entsprechenden Spaltprodukten von ARV-2-DNA. Die Intensität der sich anlagernden Signale war mit ARV-3- und ARV-4-Proben viel geringer (etwa 10-mal niedriger) als diejenige, die mit ARV-2-DNA erhalten wurde, möglicherweise infolge der Tatsache, daß in den ARV-3- und ARV-4-Kulturen weniger Zellen infiziert waren. Die Virusspezifischen DNA-Fragmente, die durch SacI-Behandlung von ARV-3- und ARV-4-DNA hergestellt worden waren, machten insgesamt 9,0 bis 9,5 kBp aus, ein Wert, der dem von ARV-2 ähnlich ist und mit den RNA-Genomgrößen übereinstimmt.
7. Sequenzierung von proviraler DNA
Fragmente oder Subfragmente von ARV-2-DNA aus dem λ-Phagen 9B wurden hergestellt und gemäß herkömmlichen Verfahren in M13 cloniert (Maniatis et al., a.a.O.). Die Sequenzierung wurde gemäß Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, durchgeführt, wobei der universelle M13-Primer oder chemisch synthetisierte Primer verwendet wurden, die komplementär zur ARV-2-Sequenz sind. Die Sequenz wird in 2 gezeigt.
8. Aminosäure-Sequenzanalyse der von p25- und p16-gag codierten Proteine
ARV-2 wurde wie in Abschnitt 1 hergestellt und gereinigt. Die viralen Proteine wurden der Elektrophorese auf einem Acrylamidgel unterworfen und die Bande, die einem Protein mit 24 000 Dalton oder einem mit 16 000 Dalton entsprach, aus dem Gel ausgeschnitten und zur Sequenzierung verwendet. Eine Mikrosequenzanalyse wurde unter Verwendung des Proteinsequenzators Modell 470A von Applied Biosystems durchgeführt, wie von Hewick et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 7990–7997, beschrieben. Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch HPLC unter Verwendung einer Beckman Ultrasphere ODS-Säule und eines Trifluoressigsäure-Acetonitril-Puffersystems identifiziert, wie von Hawke et al., Anal. Biochem. 120 (1982), 302–311, beschrieben. Tabelle 1 zeigt die ersten 20 Aminosäuren aus dem Amino-Terminus, die für das p25 gag-Protein bestimmt wurden, Tabelle 2 zeigt die ersten 30 Aminosäuren für das p16 gag-Protein. TABELLE 1: Amino-terminale Sequenz von p25 gag
TABELLE 2: Amino-terminale Sequenz von p16 gag
Die Aminosäuresequenz von Tabelle 1 kann aus der ARV-2-DNA-Sequenz von 2 vorausgesagt werden. Diese Ergebnisse bestätigen somit, daß das angegebenen offene Leseraster von gag tatsächlich translatiert wird und die N-Termini von p25 und p16 darstellt.
9. Expression des p25 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien
A. Wirt-Vektor-System
Das p25 gag-Protein wird von dem mit Plasmid pGAG25-10 transformierten E. coli-Stamm D1210 synthetisiert.
Plasmid pGAG25-10 ist ein pBR322-Derivat, das die für p25 gag codierende Sequenz unter transkriptionaler Kontrolle eines hybriden tac-Promotors enthält (De Boer et al., PNAS 80 (1983), 21–25), der aus den Sequenzen der trp- und lac-UV5-Promotoren stammt. Die Expression von p25 gag wird in bakteriellen Transformanten mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert.
E. coli D1210, ein Stamm, der den lac-Repressor im Übermaß herstellt, trägt die lacI^q- und lacY⁺-Allele auf dem Chromosom, ist aber ansonsten identisch mit E. coli HB101 (F^–, lacI⁺, lacO⁺, lacZ⁺, lacY^–, gal^–, pro^–, leu^–, thi^–, end^–, hsm^–, hsr^–, recA^–, rpsL^–), von dem er hergeleitet wurde.
B. Konstruktion von pGAG25-10
Plasmid pGAG25-10 wurde durch Clonierung eines für p25 gag codierenden DNA-Fragmentes mit 699 Bp in Plasmid ptac5 konstruiert, gemäß dem in 3 gezeigten Schema. Der Vektor ptac5 ist ein pBR322-Derivat, das den tac-Promotor, Shine Delgarno-Sequenzen und einen Polylinker als Ersatz für die ursprünglichen, zwischen den EcoRI- und PvuII-Restriktionsstellen enthaltenen pBR322-Sequenzen umfaßt.
Das DNA-Fragment mit 699 Bp codiert das komplette p25 gag-Protein (Aminosäurereste 139 bis 369, wie in 2 numeriert), wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß in pGAG25-10 ein Methionin als erste Aminosäure eingefügt wurde, um die translationale Initiation zu ermöglichen. Diese Änderung, wie auch weitere Änderungen der Nucleotidsequenz, wie nachstehend angegeben, wurde erhalten, indem Teile des DNA-Fragmentes chemisch synthetisiert wurden. Das DNA-Fragment umfaßt außerdem zwei Stopp-Codons am 3'-Ende der Sequenz.
4 zeigt die in pGAG25-10 clonierte Nucleotidsequenz und die daraus hervorgehende Aminosäuresequenz. DNA-Sequenzen, die in der Figur nicht unterstrichen sind, wurden direkt aus der ARV-2(9B)-cDNA hergeleitet. Alle anderen Sequenzen wurden chemisch synthetisiert oder vom Vektor ptac5 hergeleitet. Änderungen, bezogen auf die ursprüngliche cDNA, wurden in diese DNA-Sequenz eingeführt, wobei Restriktionsstellen erzeugt oder deletiert, ein Methionin vor dem Prolin (erster Rest von p25) eingefügt oder Stopp-Codons nach dem letzten Codon von p25 gag eingebaut wurden. Wie vorstehend aufgezeigt, kommt es jedoch durch alle Änderungen der DNA-Sequenz, ausgenommen die im ersten Codon, zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz von p25 gag.
C. Herstellung des D1210-(pGAG25-10)-Stammes und Charakterisierung des durch Transformanten exprimierten p25 gag-Proteins
E. coli D1210-Zellen werden unter Befolgen eines Standardprotokolls (Cohen et al., PNAS 69 (1972), 2110) für die Transformation kompetent gemacht. Die Transformation wird, wie im Protokoll angegeben, mit 25 bis 50 ng pGAG25-10 durchgeführt. Das Transformationsgemisch wird auf Agarplatten plattiert, die mit L-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, hergestellt wurden. Die Platten werden 12 Stunden bei 37°C inkubiert.
Einzelne Ampicillin-resistente Kolonien werden in 1 ml L-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, überführt und bei 37°C gezüchtet. Die Expression des p25 gag-Proteins wird induziert, indem 10 μl 100 mM IPTG (Sigma) zum Erhalt einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben werden, worauf eine zweistündige Inkubation bei 37°C folgt.
Die Zellen aus 1 ml induzierten Kulturen werden pelletiert und in 100 μl Laemmli-Probenpuffer resuspendiert. Nach drei Zyklen aus Kochen und Einfrieren werden Proben der resultierenden Lysate auf herkömmlichen denaturierenden Acrylamidgelen analysiert. Proteine werden durch Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht.
Das Ausmaß der Expression wird als erstes dadurch bestimmt, daß das Erscheinen von neuen Proteinbanden bei den fraglichen induzierten Proben im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wird. Proteine mit solchen Molekulargewichten, die für die exprimierten Gene erwartet werden, machten in den Rekombinanten mit der höchsten Expression 2 bis 5% des gesamten Zellproteins aus, dies wurde durch visuelle Begutachtung im Vergleich zu einem Standarprotein bestimmt, dessen Menge bekannt war.
Die Echtheit der exprimierten Proteine wird durch herkömmlichen Western-Transfer der Proteine auf Nitrocellulose und durch Analyse mit geeigneten menschlichen oder Kaninchen-Immunseren oder mit monoclonalen Antikörpern der Maus (vgl. E.4.a., nachstehend) oder durch ELISA-Tests von löslichen E. coli-Proteinen unter Verwendung von menschlichen Immunseren aus AIDS-Patienten (vgl. E.4.b., nachstehend) bestimmt.
D. Fermentationsverfahren
D.1. Herstellung des transformierten Original-Anzuchtvorrats
Transformierte Zellen aus einer Kultur, die p25 gag in hohen Konzentrationen (3%) exprimiert, werden auf eine L-Brühe-Platte ausgestrichen, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, und die Platte über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Einzelkolonie wird in 10 ml L-Brühe, 100 μg/ml Ampicillin, eingeimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Ein Aliquot wird verwendet, um mittels Restriktionskartierung mit SalI und PstI die Plasmidstruktur zu bestätigen. Ein zweites Aliquot wird verwendet, um die Expression von p25 gag zu induzieren, und der Rest der Kultur wird durch Zusatz von 1/4 Volumen 75%-igem sterilem Glycerin auf 15% Glycerin gebracht. Die Glycerin-Zellvorräte werden in Aliquots zu je 1 ml aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff oder in einem Trockeneis-Ethanol-Bad rasch eingefroren. Diese Original-Anzuchtvorräte werden bei –70°C gelagert.
D.2. Oriainal-Platte/Einzelkolonien und Übernacht-Kulturen
Der Original-Anzuchtvorrat wird mit einem sterilen Auftrageinstrument aufgenommen, damit wird sodann eine L-Brühe-Platte, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, ausgestrichen. Einzelkolonien von dieser Platte werden zur Beimpfung von 20 bis 50 ml L-Brühe/Amp. verwendet, die anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert wird.
D.3. Fermenter-Impfmaterial
Ein Aliquot der Übernachtkultur wird zur Beimpfung von größeren Volumina (1 bis 6 Liter) L-Brühe/Amp. verwendet. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C inkubiert und nach Erreichen einer OD₆₅₀ von etwa 5 als Impfmaterial für den Fermenterlauf eingesetzt.
D.4. Fermentation und Ernte
Fermenter (Kapazität: 16 Liter), die 10 l L-Brühe und 1 ml Antischaum enthalten, werden mit 100 bis 500 ml Impfkultur beimpft. Die Zellen werden bei 37°C bis zu einer OD von etwa 1 gezüchtet. Die Expression von p25 gag wird durch Zusatz von 100 ml einer IPTG-Lösung (100 mM) induziert, wodurch im Fermenter eine Endkonzentration von 1 mM erhalten wird. Die Zellen werden weitere drei Stunden gezüchtet und anschließend unter Einsatz von kontinuierlicher Durchflußzentrifugation geerntet. An dieser Stelle können die Zellen eingefroren und bis zur Reinigung von p25 gag bei –20°C aufbewahrt werden. Alternativ können 250-Liter-Fermenter mit 1 bis 5 1 Impfkultur beimpft werden. Wachstum, Induktion und Ernte werden, wie vorstehend angegeben, durchgeführt.
E. Reinigung und Charakterisierung von p25 qag
E.1. Zellaufschluß
Gefrorene E. coli-Zellen werden aufgetaut und in 2,5 Volumina Lysepuffer (0,1 M Natriumphosphat (NaPi), pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) suspendiert. Die Zellen werden in einem nichtkontinuierlichen System unter Verwendung einer 300 ml-Glaseinheit der "Dynomill" und 140 ml mit Säure gewaschenen Glasperlen 15 Minuten bei 3000 UpM aufgeschlossen. Die ummantelte Kammer wird durch eine –20°C kalte Ethylenglykollösung kühl gehalten. Die aufgeschlossenen Zellen werden zur Entfernung von Zelltrümmern und Glasperlen 25 Minuten bei 27 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und bei 4°C gehalten.
E.2. Selektive Proteinfällung
Das Zellextrakt wird durch langsame Zugabe von Ammoniumsulfat bei 4°C auf 30% (NH₄)₂SO₄ gebracht. Das Extrakt wird nach Erreichen der Endkonzentration 10 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 27 000 × g zentrifugiert. Das Pellet wird in 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton^® X-100 und 5% SDS resuspendiert und sodann 5 Minuten gekocht.
E.3. Gelfiltration
Die durch die selektive Fällung erhaltene Fraktion wird einer Gelfiltration unterworfen, wobei eine in 0,03 M NaPi, pH 6,8, äquilibrierte G50-Sephadex-Säule verwendet wird. Die Chromatographie wird in der gleichen Lösung durchgeführt. Die Fraktionen werden gesammelt und die Absorbanz bei 280 nm bestimmt. Fraktionen, die Protein enthalten, werden vereinigt und durch Protein-Gelelektrophorese, Western-Analyse und ELISA charakterisiert.
E.4. Charakterisierung von rekombinantem p25 gag
a. Protein-Gelelektrophorese
Die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse (10 bis 20% Gradientengele) der Proteine aus den pGAG25-enthaltenden Zellen und aus Kontrollzellen zeigte, daß in Zellen, die p25 gag-Expressionsplasmide enthielten, nach Depression des tacI-Promotors mit IPTG unterschiedliche Mengen eines Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000 spezifisch induziert wurden. Die Identität des p25 gag-Genproduktes wurde sowohl durch einen "Enzyme linked Immunosorbent Assay" (ELISA, vgl. E.4.c.) als auch durch die Western-Immunblot-Analyse (vgl. E.4.b.) bestätigt, wobei sowohl Serum von AIDS-Patienten als auch ein monoclonaler Antikörper gegen vitales p25 gag verwendet wurde.
b. Western-Analyse
Die Proben wurden unter denaturierenden Bedingungen einer Elektrophorese auf einem 10 bis 20% Polyacrylamid-Gradientengel unterworfen. Die Proben wurden auf Nitrocellulose elektrogeblottet. Das Nitrocellulosepapier wurde mit einer 1 : 250-Verdünnung von Referenzserum von AIDS-Patienten (EW5111, erhalten von P. Feorino, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia) und anschließend mit einer 1 : 500-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Immunglobulin (Cappel, Nr. 3201–0081) gewaschen. Alternativ wurde die Nitrocellulose mit unverdünntem Kulturüberstand von 76C, einem murinen monoclonalen Antikörper gegen ARV-2-p25 gag, und anschließend mit einer 1 : 500-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen Maus-Immunglobulin (TAGO, Nr. 6450) gewaschen. Das Sub strat für die Immunblots war ein HRP-Farbentwicklungs-Reagenz, das 4-Chlor-1-naphthol enthielt.
Das p25 gag-Protein reagierte sowohl mit dem Referenzserum von AIDS-Patienten als auch mit dem monoclonalen Antikörper, dagegen zeigt es keine Reaktivität mit dem nichtimmunen Serum.
c. ELISA
p25 gag wurde, wie vorstehend beschrieben, aus bakteriellen Extrakten gereinigt. Die Reaktivität von Seren mit dem gereinigten Protein wurde getestet, indem Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 0,25 μg/ml beschichtet, Verdünnungen von Testseren (positives Referenzserum EW5111 von menschlichem negativem Serum) und anschließend eine 1 : 1000-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Immunglobulin zugegeben wurden. p25 qag-Protein reagierte mit dem positiven Serum mit einem Titerationskurven-Mittelpunkt von etwa 1 : 800. Mit dem Serum von einer normalen Versuchsperson zeigte sich keine Reaktivität.
10. Vergleich des rekombinanten p25 gag-Proteins und des natürlichen p25 gag-Proteins in ELISA
Die Reaktivität von gereinigtem rekombinantem p25 gag mit verschiedenen Seren wurde mit der von natürlichem p25 gag-Protein, das durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt worden war, in einem ELISA-Test verglichen. Zur Kontrolle wurden außerdem Tests durchgeführt, wobei aufgeschlossenes, über Gradienten gereinigtes Virus (5 μg/ml) verwendet wurde.
Mikrotiterplatten aus PVC wurden mit 10 μg/ml (50 μl pro Vertiefung in 0,1 M Natriumborat, pH 9,0) der Ascites-Ig-Fraktion, bestehend aus murinem monoclonalem Antikörper 76C gegen p25 gag, zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und die Vertiefungen mit 10% normalem Ziegenserum in PBS gefüllt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit normaler Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Triton^® X-100 (ST), gewaschen und Verdünnungen des Test-ARV-Proteins (50 μl pro Vertiefung in ST mit 10% Ziegenserum [STGS]) zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platten wurden zwei Stunden bei 37°C inkubiert, mit ST gewa schen und anschließend mit 50 μl/Vertiefung des gegen aufgeschlossenes ARV erhaltenen Kaninchen-Antiserums (1 : 1000-Verdünnung in STGS) eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen, eine Stunde mit 50 μl einer 1 : 1500-Verdünnung in STGS von HRP-konjugiertem Ziegen-Antiserum gegen Kaninchen-Immunglobulin inkubiert, gewaschen, anschließend mit 50 μl Substratlösung pro Vertiefung (150 μg/ml 2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolensulfonsäure], 0,001% H₂O₂, 0,1 M Citrat, pH 4) versetzt. Die Umsetzung wurde nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C durch Zusatz von 50 μl 10% SDS pro Vertiefung abgestoppt. Die Absorbanz wurde auf einem Flow-Titertech-ELISA-Ablesegerät bei 414 nm abgelesen. Proben wurden doppelt getestet, hiermit wurde bei einer Verdünnung von 1 : 10 begonnen, danach wurden serielle zweifache Verdünnungen angelegt.
In der nachstehenden Tablle sind die Ergebnisse der Tests zusammengefaßt, wobei die acht AIDS-Seren im Test mit aufgeschlossenem Virus als positiv eingestuft und die sechs normalen Seren im Test mit aufgeschlossenem Virus als negativ eingestuft wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das aus Bakterien gereinigte p25 gag sich in einem ELISA mit acht Seren von AIDS-Patienten genauso verhält wie das auf ähnliche Weise gereinigte p25 gag aus AIDS-Virus. Die Ergebnisse des ELISA zeigen, daß bei den Spiegeln der anti-p25-gag-Antikörper eine große Schwankungsbreite vorliegt, die darauf hinweist, daß Antikörper gegen einige Virus-codierte Proteine möglicherweise nicht nachgewiesen werden können, wenn herkömmliche, auf Virus basierende Testsysteme verwendet werden.
11. Expression des p41 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien
Ein Fusionsprotein aus den p25 gag- und p16 gag-Proteinen von ARV-2, das mit p41 gag bezeichnet wurde, wurde in dem mit Plasmid pGAG41-10 transformierten E. coli-Stamm D1210 synthetisiert. pGAG41-10 wurde aus Plasmid pGAG25-10 konstruiert, wie in 3 gezeigt, indem ein SphI-HpaI-Fragment aus dem ARV-2-Genom eingefügt wurde, das die Sequenzen aus dem C-terminalen p16 gag-Teil des p53 gag-Vorläufer-Polyproteins und einen Teil des p25 gag-Proteins zwischen den SphI- und BamHI-Stellen von pGAG25-10 enthielt. Der codierende Strang der in pGAG41-10 clonierten DNA-Sequenz wird in 5 dargestellt. Die Transformation und die Induktion der Expression wurden nach den vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zellen wurden behandelt und das p41 gag-Protein auf einem mit Coomassie gefärbten Gel, wie vorstehend beschrieben, sichtbar gemacht. Das ungefähre Molekulargewicht des beobachteten Proteins betrug 41 000 Dalton. Das Protein reagierte in Western- und ELISA-Analysen, die wie vorstehend duchgeführt wurden, mit AIDS-Seren und monoclonalem Antikörper gegen p25 gag.
12. Expression des p16 gag-Proteins von ARV-2 in Bakterien
Die Sequenz, die in 6 gezeigt wird und die das p16 gag-Protein codiert, wurde chemisch synthetisiert, wobei von Hefe bevorzugte Codons verwendet wurden. Das SalI-Fragment mit glatten Enden (381 Bp) wurde in das mit PvuII-SalI gespaltene und über Gel isolierte ptac5 cloniert (vgl. die vorstehenden Abschnitte 9 und 11). Das resultierende Plasmid wurde zur Transformation von D1210-Zellen verwendet, wie im vorstehenden Absatz 9 beschrieben. Die Expression wurde mit IPTG induziert und die Proteine durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Analyse analysiert. Eine Bande mit etwa 16 000 Dalton wurde in den transformierten Zellen durch IPTG induziert. Dieses Protein zeigte in Western-Blots mit Immunseren von AIDS-Patienen Reaktivität. Keine Reaktivität wurde mit Seren von normalen Versuchspersonen beobachtet.
Ein rekombinantes gag-Protein wurde außerdem in Cos-Zellen (Säugerzellen) exprimiert.
13. Produktion des ARV-2-env-Proteins durch Hefe
A. Wirt-Vektor-System
Ein partielles env-Protein wird durch das mit Plasmid pDPC303 transformierte S. cerevisiae 2150-2-3 synthetisiert. Plasmid pDPC303 ist ein Hefe-Expressionsvektor, der die für 2/3 des env-Proteins codierende Sequenz und außerdem pBR322-Sequenzen, umfassend das amp^R-Gen, und 2-Mikron-Sequenzen, umfassend das Hefe-leu-2-04-Gen enthält. Die Expression von env steht unter Regulation der Hefe-Pyruvatkinase-Promotor- und -Terminator-Sequenzen. Hefestamm S. cerevisiae 2150-2-3 weist den nachstehenden Genotyp auf: Mat a, ade 1, leu 2–112, cir°. Dieser Stamm wurde von Dr. Leland Hartwell, University of Washington, erhalten.
B. Konstruktion von pDPC303 einem Hefe-Expressionsvektor für das env-Protein
Plasmid pDPC303 enthält eine "Expressionskassette" (nachstehend beschrieben) für env, cloniert in die BamHI-Stelle von Vektor pC1/1. Vektor pC1/1 enthält pBR322- und 2-Mikron-Sequenzen, umfassend die amp^R- und Hefe-leu-2-04-Marker. Er wurde von pJDB219d (Beggs, Nature 275 (1978), 104) abgeleitet, indem der pMB9-Bereich duch pBR322-Sequenzen ersetzt worden war.
Die "Expressionskassette" für env besteht aus den nachstehenden Sequenzen, die in dieser Reihenfolge fusioniert waren (5' nach 3'): Hefe-Pyruvatkinase(PYK)-Promotor, env-cDNA und PYK-Terminator. Die PYK-Promotor- und -Terminator-Regionen wurden von PYK-cDNA abgeleitet, die, wie in Burke et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 2193–2201, beschrieben, isoliert worden war.
Das in die Expressionskassette clonierte env-Fragment wurde von ARV-2-cDNA abgeleitet und umfaßt ein cDNA-Fragment mit 1395 Bp, das für env-Aminosäurereste codiert, die durch Nt. 5857 bis Nt. 7251 codiert werden (2). Außerdem werden fünf Zusätzliche Codons in das Leseraster im 5'-Ende fusioniert, wobei das erste Codon einem Methionin entspricht, und vier zusätzliche Codons werden in das Leseraster am 3'-Ende fusioniert, worauf ein Stopp-Codon folgt. Die zusätzlichen Codons wurden nur eingebaut, um die Clonierungsverfahren zu erleichtern.
7 zeigt den codierenden Strang der in pDPC303 clonierten Nucleotidsequenz und die daraus hergeleitete Aminosäuresequenz. DNA-Sequenzen, die in der Figur nicht unterstrichen sind, stammten direkt aus der vorstehend beschriebenen ARV-2(9B)-cDNA. Alle anderen Sequenzen wurden entweder chemisch synthetisiert oder aus dem PYK-Vektor hergeleitet.
C. Herstellung des 2150-(pDPC303)-Stammes
Hefezellen S, cerevisiae 2150-2-3 (Mat a, ade 1, leu 2-04, cir°) wurden, wie von Hinnen et al. (PNAS 75 (1978), 1929-1933) beschrieben, transformiert und auf leu^--Selektivplatten plattiert. Einzelkolonien wurden in leu^–-Selektivmedien überimpft und bis zur Sättigung gezüchtet, Die Zellen wurden geerntet, sodann das env-Protein gereinigt und wie nachstehend beschrieben charakterisiert.
D. Reinigung und Charakterisierung des env-Proteins
D.1. Zellaufschluß
Gefrorene S. cerevisiae 2150-2-3 (pDPC303) werden aufgetaut und in 1 Volumen Lysepuffer supendiert (1 μg/ml Pepstatin, 0,001 M PMSF, 0,001 M EDTA, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 0,8), sodann wird 1 Volumen von mit Säure gewaschenen Glasperlen zugefügt. Die Zellen werden in einem nichtkontinuierlichen System unter Verwendung einer 300-ml-Glaseinheit der "Dynomill" bei 3000 UpM 10 Minuten aufgebrochen. Die Ummantelung wird mit einer –20°C kalten Ethylenglykollösung kühl gehalten. Die Glasperlen werden dekantiert, indem man das Gemisch 3 Minuten auf Eis sich absetzen läßt. Der Zellextrakt wird gewonnen und bei 18 000 UpM (39 200 × g) 35 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag (Pellet 1), wie nachstehend beschrieben, behandelt.
D.2. SDS-Extraktion von unlöslichem Material
Pellet 1 wird in 4 Volumina Tris-HCl-Puffer resuspendiert (0,01 M Tris-HCl, pH 8, 0, 0, 01 M NaCl, 0, 001 M PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 0,001 M EDTA, 0,1% SDS) und 2 Stunden bei 4°C unter Bewegung extrahiert. Die Lösung wird 15 Minuten bei 6300 × g zentrifugiert. Die unlösliche Fraktion (Pellet 2) wird in 4 Volumina (360 ml) PBS (pro Liter: 0,2 g KCl, 0,2 g KH₂PO₄, 8,0 g NaCl, 2,9 g Na₂HPO₄·12H₂O), 0,1% SDS, 0,001 M EDTA, 0,001 M PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, resuspendiert und 15 Minuten bei 6300 × g zentrifugiert. Das Pellet (Pellet 3) wird in 4 Volumina PBS, 0,2% SDS, 0, 001 M EDTA, 0, 001 M PMSF, 1 μg/ml Pepstatin suspendiert und 12 Stunden bei 4°C unter Bewegung auf einem Röhrchenschüttler extrahiert. Die Lösung wird 15 Minuten bei 6300 × g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird gewonnen und, wie nachstehend angegeben, weiter gereinigt. (Das Pellet kann erneut extrahiert werden, indem es in 4 Volumina 2,3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, resuspendiert und 5 Minuten gekocht wird. Nach dem Kochen wird die Lösung 15 Minuten bei 6300 × g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird gewonnen und weiter gereinigt.)
D.3. Selektive Fällung und Gelfiltration
Die lösliche Fraktion wird durch Fällung mit 30% Ammoniumsulfat bei 4°C eingeengt. Das Pellet (Pellet 4) wird in 2,3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, resuspendiert und auf einer ACA 34 (LKB Products) Gelfiltrationssäule chromatographiert. Die Säule wird mit PBS, 0,1% SDS, bei Raumtemperatur äquilibriert. Die Chromatographie wird in der gleichen Lösung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,3 ml/min entwickelt. Fünf Fraktionen zu je 5 ml werden gesammelt, vereinigt und durch Protein-Gelelektrophorese, Western-Analyse und ELISA charakterisiert. Sofern es nötig ist, werden die vereinigten Fraktionen durch Vakuumdialyse auf Spectrapor #2 (Molekulargewichtsausschluß 12 bis 14 K) eingeengt.
D.4. Charakterisierung von rekombinantem env
Die SDS-Polyacryamidgel-Analyse (12% Acrylamidgele) zeigte, daß in den Hefezellen, die mit dem env-enthaltenen Vektor transformiert worden waren, ein neues Protein mit 55 000 Dalton synthetisiert wurde. Das Protein mit 55 000 Dalton fehlte in den Zellen, die mit dem Kontrollplasmid (Vektor ohne env-Insertion) transformiert worden waren. Die Identität von env wurde sowohl durch ELISA (vgl. 9.E.4.c) als auch durch Western-Analyse unter Verwendung von Serum von AIDS-Patienten bestätigt. In beiden Tests zeigte das Protein mit 55 000 Dalton Immunreaktivität. Keine Reaktivität wurde mit Serum von normalen Versuchspersonen erhalten.
Außerdem wurde das rekombinante env in Säugerzellen (Cos-Zellen) exprimiert.
14. ELISA auf Antikörper gegen HIV-I unter Verwendung von rekombinanten ARV-2-Polypeptiden
Vorratslösungen des gereinigten p25 gag-Proteins (1,25 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2), des gereinigten env-Proteins (2 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2) und des gereinigten SOD-p31-Fusionsproteins (2 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,2) wurden hergestellt.
Zur Beschichtung der Mikrotiterplatten (Dynatech Immulon I) wurden jeweis ein Teil der Vorratslösungen von p25 gag, env und SOD-p31 zu 997 Teilen Borat-Beschichtungspuffer (0,05 M Borat, pH 9,0) zugefügt. 100 μl Beschichtungslösung wurden in jede Vertiefung zugegeben, sodann die Platten zugedeckt und zwei Stunden bei 37°C oder 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Beschichtungslösung aus den Vertiefungen abgesaugt und die Platten sechsmal mit Waschlösung (0,137 M 0,8% NaCl, 0,05% Triton^® X-100) gewaschen.
Serumproben wurden in Verdünnungslösung (0,1% Casein, 1 mM EDTA, 1% Triton^® X-100, 0,5 M NaCl, 0,01% Thimerosal, pH 7,5) 1 : 100 verdünnt, wobei die Verdünnungslösung mit Hefe-(Stamm AB103.1)-Proteinextrakt (1 : 40-Verdünnung, etwa 2 mg Protein pro ml in PBS, enthaltend 1% Triton^® X-100, 2 mM PMSF, 0,01% Thimerosal) und E. coli-Proteinextrakt (1 : 40-Verdünnung, etwa 1 mg Protein pro ml in PBS, enthaltend 1% Triton^® X-100, 2 mM PMSF, 0,01% Thimerosal) versetzt war. Die Extraktionsverfahren waren ähnlich wie die vorstehend in den Abschnitten 13 und 14 beschriebenen Verfahren, wobei nichtrekombinante Stämme verwendet wurden. 100 μl des verdünnten Serums wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten sechsmal mit Waschlösung gewaschen.
Ziegen-Antiserum gegen menschliches Ig, markiert mit Meerrettich-Peroxidase (Cappel), 1 : 8000 verdünnt in Verdünnungslösung ohne Zusatz von Hefe- oder E. coli-Extrakten, wurde mit 100 μl pro Vertiefung auf die Platten aufgetragen und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten sechsmal mit Waschlösung gewaschen. Sodann wurde die Substratlösung (10 ml Citratpuffer (10,5 g Citronensäure/Liter dH₂O, pH bis 4,0 mit 6 M NaOH), 0,1 ml ABTS (15 mg/ml 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolensulfonsäure) in dH₂O) und 0,33 μl H₂O₂) mit 100 μl pro Vertiefung auf die Platten aufgetragen und die Platten in Folie eingewickelt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Umsetzung durch Zusatz von 50 μl 10% SDS pro Vertiefung abgestoppt. Die Ergebnisse wurden mit einer Dynatech-ELISA-Ablesevorrichtung abgelesen, eingestellt auf doppelte Wellenlängen-Ablesung: Absorbanz-Wellenlänge von 1 (410 nm) und Referenz-Wellenlänge von 4.
Ergebnisse
Die folgenden Seren wurden getestet:

A. 89 aufeinanderfolgende Blutspender aus der Kansas City-Blutbank ("normale Blutspender"): Log-Nr. 1001–1081, 1085–1092.
B. 52 Seren von Patienten mit lymphadenopathischem Syndrom (LAD) oder AIDS oder Sexualpartner von Personen mit LAD oder AIDS (mit "Kontaktpers." bezeichnet), alle erhalten von der UCSF-AIDS-Serumbank: Log-Nr. 4601–4652.

Der verwendete Positiv/Negativ-Ausschluß wurde fünfmal bestimmt (durchschnittliches Hintergrundsignal – Signal mit Verdünnungsmittel alleine) und betrug 0,195. Somit wurden Seren mit Signalen unter 0,195 als (-) eingestuft; diejenigen darüber wurden als (+) eingestuft. Außerdem wurde jede Probe durch das handelsübliche ABBOTT HTLV III EIA-Kit (Abbott Labs) und durch Western-Analyse getestet.
Die Tests mit den bezeichneten Proben von normalen Blutspendern waren im erfindungsgemäßen ELISA alle bis auf eine negativ. Dieses normale Serum erwies sich im ABBOTT HTLV III EIA-Test als negativ, war aber in Wirklichkeit positiv, was durch die Western-Analyse bestätigt wurde.
Die Ergebnisse der Tests mit den 52 Seren von LAD- und AIDS-Patienten und Kontaktpersonen sind nachstehend als Tabelle dargestellt:
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße ELISA, wobei rekombinante ARV-Proteine verwendet werden, mindestens so gut ist wie der ABBOTT HTLV III EIA-Test oder die Western-Analyse.
In dem in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen ELISA wurden die Hefe- und Bakterienextrakte zum Serum zugegeben, um Serumantikörper gegen Hefen und Bakterien zu binden und zu verhindern, daß solche Antikörper an die rekombinanten ARV-2-Proteine binden. Sowohl Hefe- als auch Bakterienextrakte waren erforderlich, da die rekombinanten Polypeptide in Hefe exprimierte Polypeptide und in Bakterien exprimierte Polypeptide umfassten. Wenn alle diese Polypeptide im gleichen Organismustyp exprimiert würden, bräuchte man nur ein Extrakt. Wenn beispielweise ein in Hefe exprimiertes p25 gag-Polypeptid durch das bakteriell hergestellte p25 gag-Polypeptid der Probe ersetzt wird, müssen zu den Serumproben nur Hefeextrakte zugegeben werden.
15. Dot-Blot-Analyse für Antikörper gegen HIV-I unter Verwendung von rekombinanten ARV-2-Polypeptiden
Nitrocellulose-Streifen (0,5 × 5 cm) werden mit 50 ng Polypeptid in PBS getüpfelt (Tüpfelvolumen 2 μl). Nach Tüpfelung werden die Streifen eine Stunde oder länger bei Raumtemperatur getrocknet. Sodann werden die Streifen in einer 5%igen Lösung von fettfreier "Carnation"-Trockenmilch in PBS und 0,01% Thimerosal 15 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur nachbeschichtet. Jede Probe mit Testlösung wird in 0,5 ml der Nachbeschichtungslösung in einem Teströhrchen 1 : 50 verdünnt. Ein nachbeschichteter Streifen wird sodann in das Teströhrchen gebracht und in der Probe unter Schwenken eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wird der Streifen aus dem Röhrchen entfernt und mit Nachbeschichtungslösung gewaschen. Der Streifen wird sodann 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Reagenz aus mit Meerrettich-Peroxidase markiertem Ziegen-Antiserum gegen menschliches Ig inkubiert, das in Nachbeschichtungslösung 1 : 500 verdünnt wurde. Nach Inkubation im markierten Antikörper wird der Streifen der Reihe nach mit PBS, 1% Triton und destilliertem Wasser gewaschen. Die Streifen werden entwickelt, indem sie 15 Minuten bei Raum temperatur in Substratlösung inkubiert werden (vgl. den vorstehenden Abschnitt 23).
Positive Proben bewirken an der Tüpfelstelle eine mit dem Auge wahrnehmbare Farbänderung. Proben von normalen (negativen) Seren ergeben keine Farbänderung oder ein schwaches Signal, das von einem positiven Signal unterschieden werden kann. Mit Seren, die schwache Signale ergeben, können Kompetitionstests durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß sie negativ sind. Im Kompetitionstest wird zu der Testprobe Polypeptid (10 bis 25 μg/ml) zugegeben und das Gemisch eine Stunde bei 37°C inkubiert, bevor der Streifen in der Probe inkubiert wird. Bei wirklich positiven Seren wird das Signal durch das zugefügte Polypeptid vollständig blockiert, wohingegen bei normalen (negativen) Seren keine Änderung des Signals auftritt.
Proben von Organismen, die die vorstehend beschriebenen ARV-2-p25 gag- und ARV-2-env-Polypeptide exprimieren, wurden bei der "American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern und die Daten dieser Hinterlegungen sind nachstehend aufgelistet.

Claims

Rekombinantes DNA-Konstrukt zur Expression eines rekombinanten Polypeptids in einer das Konstrukt enthaltenden Zelle, wobei das Konstrukt Kontrollsequenzen umfasst, die die Transkription und die Translation des rekombinanten Polypeptids in der Zelle regulieren und eine von den Kontrollsequenzen regulierte codierende Sequenz, wobei die codierende Sequenz eine DNA-Sequenz von mindestens etwa 21 by im Leserahmen umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine antigene HIV-I-gag- oder -env-Aminosäuresequenz von 2 codiert, wobei die Sequenz immunologisch nicht kreuzreaktiv mit HTLV-I und HTLV-II und mit HIV-I reaktiv ist.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer eukaryontischen Zelle.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer Hefezelle.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 zur Expression in einer bakteriellen Zelle.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz eines env-Polypeptids von HIV-I codiert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei die DNA-Sequenz ein komplettes env-Polypeptid codiert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz eines gag-Polypeptids von HIV-I codiert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die DNA-Sequenz ein komplettes gag-Polypeptid codiert.
Zelle, die ein rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, wobei die Zelle die antigene HIV-I-Aminosäuresequenz exprimiert und frei von anderen Zellen ist, die die antigene HIV-I-Aminosäuresequenz nicht exprimieren.
Zelle nach Anspruch 9, wobei das rekombinante DNA-Konstrukt ein von der Zelle erkanntes Replikationssystem umfasst.
Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle eukaryontisch ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das eine antigene HIV-I-Aminosäuresequenz umfasst, wobei eine Population von Zellen nach Anspruch 9 unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen das rekombinante Polypeptid exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen eukaryontisch sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen Hefe- oder Bakterienzellen sind.
Immunassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1 in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein rekombinantes Polypeptid zur Bindung der Antikörper verwendet wird und das rekombinante Polypeptid eine antigene env- oder gag-HIV-I-Aminosäuresequenz umfasst, die in der in 2 gezeigten Sequenz enthalten ist, wobei das Polypeptid mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv ist.
Immunassay nach Anspruch 16, wobei mindestens eine env-Aminosäuresequenz und eine gag-Aminosäuresequenz zur Bindung der Antikörper verwendet werden.
Diagnostisches Reagenz oder Immunogen, fähig zur Bindung eines anti-HIV-1-Antikörpers in menschlichem Serum, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz oder Immunogen aus einem Antigen besteht, das ein immunogenes Fragment von mindestens sieben Aminosäuren eines HIV-I-env- oder -gag- Polypeptids umfasst, wobei das Fragment mit HTLV-I und HTLV-II immunologisch nicht kreuzreaktiv ist und eine in der in 2 gezeigten Sequenz enthaltene Sequenz besitzt.
Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 transformiert ist.
Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 6 transformiert ist.
Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer Zelle hergestellt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt nach Anspruch 7 transformiert ist.
Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 21, wobei die gag-Aminosäuresequenz p16-gag umfasst.
Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 21, wobei die gag-Aminosäuresequenz p25-gag umfasst.
Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 21, wobei die gag-Aminosäuresequenz ein Fusionsprotein aus p16-gag- und p25-gag-Aminosäuresequenzen umfasst.
Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-1-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass es einen festen Träger umfasst, an den ein rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 19 gebunden ist.
Erzeugnis zur Verwendung in einem Immunassay für HIV-1-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass es einen festen Träger umfasst, an den ein rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 21 gebunden ist.
DNA-Sequenz, die ein HIV-I-Polypeptid codiert, das von einem Phagen stammt, der ausgewählt ist aus ARV-2 (7D) (ATCC Nr. 40143) und ARV-2 (8A) (ATCC Nr. 40144).
Rekombinantes DNA-Konstrukt, fähig zur Expression eines antigenen rekombinanten HIV-I-Polypeptids, das aus dem Organismus mit der ATCC Nr. 53246 stammt.
Isoliertes Polynucleotid, das ein Fragment mit mindestens 21 by der gag- oder env-Region der ARV-2-Sequenz aus 2 umfasst, wobei das Polypeptid nicht größer als 180 by ist.