DE68918563T2 - Protease, reverse Transcriptase und Endonuklease von Retroviren und Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme. - Google Patents
Protease, reverse Transcriptase und Endonuklease von Retroviren und Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme, für welche retrovirale Gene codieren, insbesondere die Enzyme Protease, Reverse Transcriptase und Endonuclease (Integrase) und Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Enzyme in Form von reifen oder aktiven Einzelproteinmolekülen und nicht als Teil eines Fusionsproteinmoleküls, indem man die Expression wenigstens eines Gentyps bewirkt, wobei das Proteasegen notwendigerweise von den oben erwähnten drei Typen retroviraler Enzymgene ausgewählt ist, und zwar im Rahmen folgender vier Kombinationen: Das Proteasegen alleine; das Protease- und das Reverse Transcriptase-Gen; das Protease- und Endonuclease-Gen; das Protease-, das Reverse Transcriptase- und das Endonuclease-Gen. Die Expression erfolgt mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technik und gleichzeitig wird die Prozessierung des auf diese Weise exprimierten Produkts mit Hilfe der im exprimierten Produkt enthaltenen Protease bewirkt. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene Proteine, welche man mit Hilfe dieses Verfahrens erhält. Die vorliegende Erfindung stellt Enzyme bereit, wie Protease, Reverse Transcriptase, Endonuclease und gag-Proteine, welche brauchbar sind zur Herstellung von Materialien für Genetic Engineering oder die Retrovirus-Forschung, Materialien zur Entwicklung pharmakotherapeutischer Wirkstoffe auf dem Gebiet retroviraler Infektionserkrankungen, diagnostischer Antigene und diagnostischer Antikörper sowie zur Herstellung von Antigenen für Vakzine.
- Retrovirus ist die generische Bezeichnung für Viren, welche der Familie der Retroviren zugeordnet werden. Die diesen Viren gemeinsamen Merkmale bestehen darin, daß sie eine Hülle, ein Einzelstrang-RNA-Genom und eine Reverse Transcriptase besitzen. Die Viren sind kugelförmig ausgebildet und weisen einen Durchmesser von etwa 80 bis 100 nm auf und enthalten zwei oder drei Moleküle eines linearen (+)-Strang-RNA-Genoms mit einem Molekulargewicht von etwa 2 x 10&sup6; im Viruspartikel. Insbesondere wird die Retrovirus-Familie außerdem in die folgenden drei Unterfamilien eingeteilt: Onkovirus, Lentivirus und Spumavirus (R.E.F. Matthews Edt. "Classification and Nomenclature of Viruses-Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", S. 124-128, S. Karker (Schweiz), 1982). Bekannte Viren, welche der Klasse der Onkoviren zugeordnet sind, die auch als RNA-Tumorviren bezeichnet werden, umfassen das humane T-Zell-Leukämievirus, Katzen-Leukämievirus, Maus- Sarcoma-Virus, Moloney-Maus-Leukämievirus, Rinder-Leukämie- Virus, Schweine-Leukämievirus, Vogel-Leukämievirus, Vogel- Sarcoma-Virus, Vogel-Myeloblastose-Virus und das Rousassoziierten Virus. Bekannte Viren, welche als Lentivirus klassifiziert wurden und bekannt sind für die Verursachung langsamer Virusinfektionen, umfassen die humanen Immunodefizienz-Viren Typ 1 und 2 (im folgenden bezeichnet als "HIV-1" und "HIV-2"), Affen-Immunodefizienz-Virus, Visna-Virus, welches Encephalomyelitis beim Schaf verursacht, Maedi-Virus, welches Jaagsiekte verursacht, Caprine Arthritic Encephalitits- Virus, Equine Infectious Anemia-Virus und das Rinder- Lymphadenitis-Virus (Current Topics in AIDS", Bd. 1, S. 98-117, John Wiley & Sons, 1987; Advances in Virus Research, Bd. 34, s. 189-215, 1988). Die als Spumaviren klassifizierten Viren, werden auch als Foamy Virus bezeichnet und infizieren Säugetiere, wie Menschen, Affen, Rinder und Katzen. Foamy Virus und synzytiale Viren, welche aus diesen Wirten isoliert werden, sind allgemein bekannt. Der hierin verwendete Ausdruck Retrovirus umfaßt alle bekannten und unbekannten gemäß obiger Beschreibung charakterisierten Retroviren.
- Retroviren sind bedeutsam nicht nur im Hinblick auf die ernsthaften und häufig letaien Infektionskrankheiten, welche sie beim Menschen und anderen Lebewesen verursachen, sowie im Hinblick auf die ansteckenden Krankheiten, die ihnen gemeinsam sind. Sie sind auch nützlich für das Verständnis von Erkrankungen, wie z.B. von Sarkomen, und zur Herstellung von Materialien, welche in Forschung und Genetic Engineering Anwendung finden. Da umfangreiche Berichte über diese Viren verfaßt wurden, wird die gegenwärtige Situation in bezug auf typische Retroviren in diesem Kapitel zweckmäßigerweise erläutert. Wie allgemein bekannt ist, wurden Retroviren vor 1980 als Material für onkogene Mechanismen und zur Aufklärung einer langsamen, fremden Virusinfektion untersucht, welche zu unheilbaren Erkrankungen führte. Seit der Entdeckung von AIDS in den Vereinigten Staaten im Jahr 1981 wurden Vergleichsstudien mit verschiedenen Retroviren intensiv durchgeführt, wobei die gesamte Palette von Techniken auf den Gebieten Epidemiologie, Immunologie, Virologie und Molekularbiologie als Forschungsmaterialien oder experimentelle Modelle angewendet wurden, und zwar im Hinblick auf die Erstellung von Methoden zur Behandlung und prävention von AIDS. Mittlerweile gibt es zum Thema AIDS eine große Anzahl geeigneter Berichte (Advances in Virus Research, Bd. 34, S. 189-215, 1988; Annual Review of Immunology, Bd. 6, S. 139-159, 1988; Microbial Pathogenesis, Bd. 5, S. 149-157, 1988). Von diesen Forschungsberichten wird eine Zusammenfassung in bezug auf die HIV-Gene im folgenden gegeben ("HIV and Other Highly Pathogenic Viruses", S. 33-41, Academic Press Inc., 1988; "The Control of Human Retrovirus Gene Expression", S. 79-89, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Cytological Engieering, Bd. 7 (Suppl. 1), S. S5-S15, 1988): Das virale Genom bildet einen Komplex mit einer Reversen Transcriptase und dem Strukturprotein im Kern des Viruspartikels und liegt zusammen mit einer Primer-tRNA im Viruspartikel vor; das Virusgenom umfaßt etwa neun verschiedene Gene einschließlich den grundlegenden drei Hauptgenen, welche für die Viruspartikelkomponenten codieren, die essentiell für die Virus-Vermehrung sind, d.h., daß gag (gruppenspezifisches Antigen)-Gen, das für den Vorläufer des Kernproteins codiert, das pol (Polymerase)-Gen, das für den Vorläufer dreier verschiedener Enyzme codiert, und das env (envelope)-Gen, das für den Vorläufer des Glykoproteins der Hülle codiert. Diese Gene sind vom 5'-Ende zum 3'-Ende in dieser Folge angeordnet: gag, pol und env. Zuweilen sind gag, pol, vif ... und env neben der entsprechenden nächsten Einheit in dieser Reihenfolge angeordnet und ein Teil des 5'-Endes des pol-Gens überlappt mit 240 Basen das 3'-Ende des gag-Gens mit unterschiedlichem Leserahmen. Es wird angenommen, daß im Verlauf der Translation dieses Überlappungsbereiches ein Frame-Shifting erfolgt, so daß die Translation durch Konversion des Stopcodons fortschreitet. Die Expression des gesamten Abschnitts des pol-Gens mit einer Gesamtlänge von etwa 3kb einschließlich des Überlappungsbereichs führt zur Produktion des oben erwähnten Enzym-Vorläufers (Molekulargewicht: 160 kd) in Form eines Fusionsproteins NH&sub2; - Gag - Protease - Reverse Transcriptase - Integrase - COOH. Anschließend wird das auf diese Weise produzierte Polyprotein durch eine aus dem Virus abgeleitete bereits existierende Protease oder durch die Proteaseaktivität innerhalb des Moleküls geschnitten und in die einzelnen reifen Proteine prozessiert, d.h., in die Gag-Proteine und in die Enzyme Protease, Reverse Transcriptase (P66 und P51) und Integrase (P32).
- Sämtliche oben erwähnten Enzyme spielen eine wichtige Rolle im Verlauf der Vermehrung und der Reifung des Virus oder bei der Provirus-Bildung. Die folgenden Funktionen wurden bestätigt oder angenommen: Die Protease nimmt Teil an der posttranslationalen Prozessierung, an der Kernbildung oder am Reifungsprozeß der Viruspartikel. Die Wirkung der Protease besitzt hohe Spezifizität für die Viren, von denen sie abgeleitet ist. Die Reverse Transcriptase wirkt als RNA-abhängige DNA-Polymerase, die den Prozeß der reversen Transcription der genomischen RNA in DNA katalysiert, der den grundlegenden Schritt der Virus-Vermehrung darstellt, und gleichzeitig ist von der Reversen Transcriptase zusätzlich bekannt, daß sie Ribonuclease H-Aktivität besitzt, über welche der RNA-Strang des RNA-DNA-Heteroduplex spezifisch verdaut wird, sowie die DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität zur Produktion der doppelsträngigen DNA; außerdem wird sie üblicherweise als Werkzeug bei der genetischen Rekombination verwendet. Die Integrase ist eine Endonuclease, welche auf die DNA-Kette einwirkt und die Erkennung und das Ausschneiden desjenigen Teils katalysiert, der in das Wirtschromosom integriert werden soll, wobei es sich um eine lineare oder zirkuläre virale doppelsträngige DNA handelt, die von der viralen genomischen RNA revers transcribiert wurde im Verlauf des oben erwähnten reversen Transcriptionsprozesses. Sie nimmt deshalb Teil am Prozeß der Provirus-Bildung.
- Auf den Gebiet der angewandten retroviralen Genforschung wurden aktiv Anstrengungen unternommen, um das HIV- env-Gen zu exprimieren, und zwar in erster Linie bei einem Versuch ein diagnostisches Reagens oder Vakzin gegen AIDS zu entwickeln ("Vaccine", S. 558-567, W.B. Saunders Company, 1988; Science, Bd. 18 [Nr. 12], S. 110-119, 1988). Hinsichtlich der Forschung und Entwicklung auf dem Anwendungsgebiet der retroviralen gag- und pol-Gene sind folgende Anstrengungen allgemein bekannt: beispielsweise wurde der Vorschlag gemacht, daß das Protease-Genprodukt nützlich ist als Reagens für die Entwicklung eines anti-retroviralen Wirkstoffs mit hoher Spezifität als therapeutischer Wirkstoff und für die Grundlagenforschung mit Retroviren (Cytological Engieering, Bd. 7 [Suppl. 1], S. 567-577, 1988); ein Verfahren zur Produktion Reverser Transcriptase unter Verwendung eines Zellstamms, der aus Schweinemilz gewonnen wurde, infiziert mit Schweine- Leukämievirus, das unter die Onkovirus-Kategorie fällt (Japanisches Patent, vorläufige Publikations-Nr. 59-118 081); ein Verfahren zur Produktion Reverser Transcriptase unter Verwendung eines Escherichia coli-Stamms, transformiert mit einem Expressionsvektor, das das Reverse Transcriptase-Gen aus Vogel-Sarkoma-Virus enthält, das zur Kategorie der Onkoviren zählt (US-Patent Nr. 4 663 290); und ein Verfahren zur Produktion Reverser Transcriptase, umfassend die Herstellung eines DNA-Fragments der Reverse Transcriptase-Genregion aus dem pol-Gen des Moloney-Maus-Leukämievirus, das unter die Kategorie der Onkoviren fällt, die Konstruktion eines Expressionsvektors, der dieses DNA-Fragment trägt und anschließend die Reinigung des Produkts aus der Kultur des Transformanden, den man durch Einführung des Expressionsvektors in Escherichia coli erhält (WO 86/06741). Darüber hinaus wurde das Reverse Transcriptase- Enzym als Antigen bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers zur Verwendung bei der Detektion von Reverser Transcriptase aus Vogel-Sarkoma-Virus verwendet (Japanisches Patent, vorläufige Veröffentlichungs-Nr. 61-104 799); außerdem wird bekanntlich die Reverse Transcriptase zur Synthese komplementärer DNA aus Vogel-Myeloblastose-Virus hergestellt und wird ebenfalls aus Moloney-Maus-Leukämievirus oder Rousassoziiertem Virus (RAV-2) gewonnen und wird somit in erster Linie aus Onkoviren direkt hergestellt. Aus obiger Beschreibung geht deutlich hervor, daß sich der Stand der Technik auf die Expression des HIV-env-Gens, auf onkovirale Komponenten, deren onkogenen Effekt und die Verwendung des Reversen Transcriptase- Gens davon konzentrierte. In Praktischer Hinsicht umfassen die mit diesem Stand der Technik verbundenen Schwierigkeiten das Erfordernis zum Schutz gegen biologische Gifte während der Herstellungsverfahren, die Produktionskosten, die Produktionsausbeuten und Schwierigkeiten in bezug auf die Enzymaktivität, Substratspezifität, Reinheit, Homogenität und Stabilität. Es besteht deshalb ein Bedarf an der Entwicklung eines sicheren, kostengünstigen Massenproduktionssystems für Produkte hoher Qualität. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt werden insbesondere diejenigen Verfahren, welche auf Brauchbarkeit und industrielle Anwendbarkeit der verschiedenen retroviralen Enyzme gerichtet sind, insbesondere von Forschern wenig beachtet. Unter diesen Umständen könnte die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Massenproduktion retroviraler Enzymprodukte, d.h. Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, zu niedrigen Kosten den Fortschritt bei der Grundlagenforschung auf dem Gebiet viraler Infektionen und die Entwicklung von Pharmakotherapeutika, diagnostischer und präventiver Wirkstoffo stimulieren und somit von beträchtlicher Bedeutung sein.
- Hansen et al., J. Bio. Chem. 262(26): 12993-12396, 1987 beschreiben die Klonierung des pol-Gens von HIV und dessen Expression in E. coli zur Erzeugung eines Prekursor-Proteins, das durch die Wirkung der HIV-Protease in die reifen Transcriptase-, Endonuclease-, und Proteaseprodukte gespalten wird. Lillehoj et al, J Virol., 62(8): 3053-3058, 1988 und Giam et al., J. Biol. Chem., 263(29): 14617-14620, 1988 beschreiben die Expression von HIV-pol bzw. von Proteaseregionen in Form von Fusionsproteinen mit einem Teil des lacZ-Proteins. Leuthardt et al., Gene, 68: 35-42, 1988 geben eine Erklärung, wie die autoproteolytische Spaltung im offenen Leserahmen von Mol in HIV-1 möglicherweise wirkt, um reife Protease-, Reverse Transcriptase- und Endonuclease-Produkte zu erzeugen. In ähnlicher Weise beschreiben Kotler et al., J. Virol. 62(8): 2696- 2700, 1988 die Prozessierung eines avianen retroviralen gag- Proteins durch Coexpression mit einem Proteasegen.
- Um die oben erwähnten Schwierigkeiten zu überwinden, wurden erfindungsgemäß umfangreiche Studien durchgeführt und als Ergebnis davon wurde ein Verfahren zur Massenproduktion retroviraler Enzymprodukte, d.h. Enzyme wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, bereitgestellt, das in bezug auf biologische Gifte sicher ist und eine stabile und hohe Produktionsausbeute bei niedrigen Kosten gewährleistet. Diese Errungenschaft beruht auf der erfolgreichen Verknüpfung eines Enzymgen-cDNA-Fragments des Virus, welches das retrovirale Proteasegen immer enthält, mit einem induzierbaren Gen mit Expressionsfähigkeit durch Anpassung der entsprechenden Translationsrahmen unter voller Ausnutzung der rekombinanten DNA-Technologie, der Expression des Enzymgen-Produkts und der Prozessierung des Genprodukts selbst durch die exprimierte Protease. Es wurde festgestellt, daß es möglich ist, in stabiler Weise und großer Menge die oben erwähnten Enzyme zu produzieren, die von der cDNA codiert werden, und zwar nicht als Fusionsprotein, sondern als individuelle, reife Proteine mit spezifischer Aktivität in der Kultur, indem man einen Transformanden herstellt, den man dadurch erhält, daß man einen Expressionsvektor einführt, der das oben erwähnte cDNA-Gen enthält und indem man eine zweistufige Kultivierungsmethode, die später beschrieben wird, zur Kultivierung des Transformanden verwendet. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß eine derartige Prozessierung aufgrund der spezifischen Proteaseaktivität eines Teils des Fusionsproteins erfolgte, das Expressionsprodukt des oben erwähnten Gens ist, und insbesondere, daß die Prozessierung ein für die retrovirale Protease spezifisches Phänomen ist. Zusätzlich wurde festgestellt, daß diese Enzyme hohe Reinheit und Homogenität aufweisen, was aus der verbesserten Massenproduktion und Reinigungsprozessen resultiert, und insbesondere wenn aus der Expression retroviraler Gene stammende Enzyme Aktivität mit sehr hoher Substratspezifität besitzen, was spezifisch für Retroviren ist. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen Erkenntnissen.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von einem oder mehreren retroviralen Proteinen bereitgestellt, welches folgende Schritte umfaßt:
- (i) die Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine cDNA-Sequenz umfaßt, die einem oder mehreren retroviralen, für wenigstens ein retrovirales Protein codierenden Genen entspricht, die unter Wahrung des Leserasters mit einer Sequenz verbunden ist, die dem gesamten lacZ-Gen oder einem lacZ-Gen, dem die für eine oder beide der zwei C-terminalen Aminosäuren codierenden Nucleotide fehlen, entspricht, mit der Maßgabe, daß wenigstens eines der retroviralen Gene für eine Protease codiert;
- ii) die Einführung des Expressionsvektors in Zellen des E. coli-Stammes UT48l (FERM BP-2417);
- iii) die Kultivierung der transformierten Zellen unter Bedingungen, bei denen die Gene als Fusionsprotein exprimiert werden, das nachfolgend in situ durch die Wirkung der Protease prozessiert wird, wodurch getrennte, reife Proteinmoleküle gebildet werden, und wobei, wenn wenigstens ein weiteres retrovirales Protein zusätzlich zu der Protease exprimiert wird, die transformierten Zellen nach der Induktion bei etwa 25ºC kultiviert werden.
- Retrovirale Enzyme, wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, welche mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellt werden, sind anwendbar
- als Werkzeuge für das Genetic Engineering zur Dissoziation und Spaltung viraler Komponenten, für die Synthese komplementärer DNA, für die Herstellung von Proviren durch Integration viraler Genome in die Wirtszelle und Transformation der Wirtszelle;
- als Werkzeuge beim Protein-Engineering zur funktionellen und strukturellen Analyse von Proteinen;
- als virologische Werkzeuge für Grundlagenforschung und klinische Forschung zur Aufklärung viraler Vermehrungsmechanismen und zur Entwicklung antiviraler Wirkstoffe, welche einen spezifischen Effekt auf Retroviren ausüben;
- als diagnostische Antigene und zur Herstellung von diagnostischen Antikörpern zur Detektion retroviraler Infektionen, oder als Antigene zur Herstellung von Immunglobulin zur Verwendung bei der Therapie oder der Vakzin-Herstellung zur Vorbeugung gegen retrovirale Sekundär-Infektionen;
- und zusätzlich können die oben erwähnten Enzyme brauchbar sein als Materialien mit Funktionen und Eigenschaften von Protease, Reverser Transcriptase und Integrase, die gegenwärtig bekannt sind und zukünftig aufgeklärt werden.
- Fig.1 zeigt eine graphische Darstellung der Titer von Reverser Transcriptase-Aktivität des Rohextraktes von Escherichia coli, transformiert mit dem Plasmid pPG280, welches das HIV-pol-Gen trägt, und Escherichia coli, transformiert mit dem Vektor pUR290, der das HIV-pol-Gen nicht aufweist; Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung des Ergebnisses einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Humanserum aus HIV- Trägern, von Rohextrakten aus Escherichia coli, transformiert mit dem Plasmid pPG280, welches das HIV-pol-Gen trägt und mit dem Vektor pUR290, der das HIV-pol-Gen nicht trägt; Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung des Elutionsprofils von Reverser Transcriptase, aus einem Escherichia coli-Rohextrakt auf einer Anionenaustauschersäule; Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung der Trennung von Reverser Transcriptase durch Affi- Gel-Heparin-Chromatographie.
- Die vorliegende Erfindung ist folgendermaßen aufgebaut:
- (I) Auswahl retroviraler Enzymgene und Herstellung von DNA-Fragmenten: Verschiedene retrovirale Enzyme entsprechend der obigen "Definition", wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, können für das retrovirale Enzymgen verwendet werden. Diese Gene werden im Rahmen von vier Kombinationen verwendet, welche, wie im "Anwendungsgebiet der Erfindung" beschrieben, das Proteasegen enthalten müssen. Im Falle einer Genexpression mit Hilfe der rekombinanten DNA- Technik werden die oben erwähnten verschiedenen Gene verwendet, indem man sie in eine komplementäre DNA überführt, weil das retrovirale Genom als RNA vorliegt. Eine derartige cDNA kann hergestellt werden durch Klonierung eines proviralen Genoms oder der integrierten genomischen DNA. Bei Verwendung einer genomischen RNA, welche aus dem Viruspartikel extrahiert wurde, kann diese cDNA auch dadurch hergestellt werdend daß man sie aus der cDNA-Bibliothek selektioniert, welche unter Anwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt wurde. Unter dem Gesichtspunkt der Vermeidung einer Infektion bei direktem Arbeiten mit einem Retrovirus, das im hohen Maße gefährlich ist, sind diese Herstellungsverfahren nicht notwendigerweise als einfach zu betrachten. Um deshalb eine biologische Gefährdung aufgrund eines solchen Virus zu vermeiden, und um Arbeit bei den oben erwähnten Herstellungsprozessen zu sparen wird empfohlen, ein bekanntes und kloniertes retrovirales Genom zu verwenden. Wie bereits in der vorausgegangenen allgemeinen Beschreibung erwähnt, ist die Klonierung verschiedener retroviraler Genome, die Herstellung von Restriktionsenzym- Karten und die Bestimmung von Nukleotidsequenzen von Forschern aus verschiedenen Teilen der Welt beschrieben worden und die Verwendung ihrer Erkenntnisse kann deshalb unter dem Aspekt der Sicherheit und der Praktikabilität wünschenswert sein. Die verfügbaren Klone umfassen beispielsweise ein Plasmid mit der Bezeichnung SRA2 (Journal of Virology, Bd. 36, S. 50-61, 1980), das das aviane Sarkoma-Virus-Genom trägt, HIV-1-Provirusgenom Klone, d.h. die Plasmide pNL3-1, pNL3-2 und pNL4-3 (Journal of Virology, Bd. 59, [Nr. 3], S. 284-291, 1986) und das Plasmid pNLH402 aus dem E. coli-Stamm UT481/pNLH402 (Microbiology Research Inst. Registrierungs-Nr. 10436). cDNA-Fragmente können aus diesen Plasmiden mit Hilfe herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch Ausschneiden der DNA aus der erforderlichen Region der oben erwähnten Plasmid-Klone mit Hilfe eines Restriktionsenzyms und Reinigung des resultierenden Produkts durch Phenolextraktion, Chloroformbehandlung oder Ethanolpräzipitation. Die zum Ausschneiden der DNA-Fragmente verwendeten Restriktionsenyzme können in geeigneter Weise unter Bezugnahme auf die Restriktionsenzym-Karte des genomischen DNA- Klons ausgewählt werden. Um beispielsweise DNA-Fragmente aus der gesamten Genregion des oben erwähnten Plasmids pNLH402 auszuschneiden, kann das Restriktionsenzym HindIII (Journal of Virology, Bd. 59, S. 284-291, 1986) verwendet werden.
- (II) Konstruktion des Expressionsvektors und Herstellung eines Transformanden, in welchen der Vektor eingeführt wurde:
- Den Expressionsvektor konstruiert man, indem man das retrovirale genomische cDNA-Fragment, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, in herkömmlicher Weise, wie z.B. unter Verwendung von T4 DNA-Ligase verknüpft. Irgendeiner der folgenden Vektoren kann zu Expressionszwecken verwendet werden: Die üblicherweise bekannten oder käuflich erhältlichen Vektoren, wie z.B. die Plasmidvektoren der pSN508-Serie der Familie der Darmbakterien (US-Patent 4 703 005), der Plasmidvektor pJM105 (Japanisches Patent, vorläufige Veröffentlichungs-Nr. 62-286 930), Vektoren der pBH103-Serie (Japanisches Patent, vorläufige Veröffentlichungs-Nr. 63-22 098) für Hefe, der attenuierte Varicella-Virusvektor (Japanisches Patent, vorläufige Veröffentlichungs-Nr. 53-41 202), der attenuierte Marek's Disease-Virusvektor (Journal of the Japan Veterinary Society, Bd. 27, S. 20-24, 1984; und Gan Monograph on Cancer Research, Bd. 10, 1971), Escherichia coli- Plasmidvektor der pUR290-Serie (EMBO Journal, Bd. 2 [Nr. 10], S. 1791-1794, 1983) und pSN5182 (Journal of Bacteriology, Bd. 157, S. 909-917, 1984). Bei der Konstruktion des Expressionsvektors ist zu beachten, daß das oben erwähnte Enzymgen unter Wahrung des Leserahmens mit einem Gen verbunden wird, das stark exprimiert werden kann. Wenn beispielsweise das oben beschriebene pUR290 verwendet wird, sollte das pol-Gen vorzugsweise stromabwärts vom lacZ-Gen des Plasmids insertiert werden, oder im Falle von pSN5182 stromabwärts vom pstS-Gen des Plasmids. Darüber hinaus, sollte bei enthaltenem Gen die Wahrung des Codon-Leserahmens zwischen den Genen beachtet werden, so daß ein glatter Verlauf der Translation sichergestellt ist. Wird beispielsweise die cDNA von HIV-1, HIV-2, Affen-Immunodefizienz-Virus und Moloney-Maus-Leukämievirus insertiert, wird der Leserahmen des pol-Gens so verbunden, daß er mit denjenigen der Gene zusammenpaßt, die hohe Expressionsfähigkeit besitzen, da die Protease derartiger Viren wie oben beschrieben von der pol-Genregion codiert wird. Andererseits wird eine Protease des Avian-Sarkoma-Virus in der gag-Genregion codiert, welche einen Leserahmen aufweist, der sich von denjenigen des pol-Gens unterscheidet, und das Proteasegen des menschlichen T-Zellen-Leukämievirus oder des Rinder-Leukämie- Virus weist nochmals einen anderen Leserahmen auf, der sich von denjenigen des pol- und des gag-Gens unterscheidet. In diesen Fällen ist Sorgfalt erforderlich, um die Leserahmen aller Gene, d.h. der retroviralen Gene, wie z.B. dem Proteasegen, dem pol-Gen und dem Gen mit hoher Expressionsfähigkeit aufeinander abzustimmen, um eine signifikante Expression des retroviralen Gens sicherzustellen. Die oben erwähnte Anpassung der Leserahmen kann mit Hilfe herkömmlicher Techniken unter Verwendung von Enzymen, wie Restriktionsenzymen, Nuclease Bal31 und Mungobohnen-Nuclease erfolgen. Die optimale Empfängerzelle, welche zur Herstellung eines Transformanden durch Einführung des auf diese Weise konstruierten Expressionsvektors verwendet wird, sollte ausgewählt sein unter Wirtszellen, welche eine Vermehrung und eine Expression des Expressionsvektors erlauben und gleichzeitig sollte von diesen Wirtszellen eine Zelle verwendet werden, die eine einfache Einführung des wie oben beschrieben konstruierten Expressionsvektors ermöglicht und eine sichere Detektionsweise sollte konsequenz gewählt und verwendet werden. Bei Verwendung von Plasmiden der oben erwähnten pSN-Serie als Beispiel für einen Expressionsvektor ist es wünschenswert, den Escherichia coli-Stamm C75 (Microbiologically Research Inst. Registrierungs-Nr. 10191) als wirtszelle zu verwenden, der von einem die alkalische Phosphatase nicht-produzierenden Bakterium durch Einführung des Vektors in ein produktives Bakterium umgewandelt wird. Bei Verwendung der pUR290-Serie können Escherichia coli UT431 (Journal of Bacteriology, Bd. 163, S. 376-284, 1985) verwendet werden. Diese erlauben die Selektion eines mit diesem Vektor erzeugten Transformanden, wobei Ampicillin-Resistenz als Marker verwendet wird. Die Einführung des Expressionsvektors in eine derartige Empfängerzelle kann mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, wie z.B. der Calciumchlorid-Methode (Journal of Molecular Biology, Bd. 53, S. 154-162, 1970) erreicht werden. Die Transformanden, welche den oben erwähnten Enzymgen- Expressionsvektor enthalten, werden mit Hilfe des oben erwähnten Markers aus den positiven Klonen ausgewählt. Nach Extraktion der Expressionsvektor-DNA durch Selektion aus der Transformanden-Kolonie wird diese mit einem Restriktionsenzym verdaut und die resultierenden DNA-Fragmente werden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Daraufhin kann die Größe des insertierten DNA-Fragments gemessen werden und gleichzeitig wird diejenige Kolonie, für welche die Präsenz des DNA- Fragments für das Gen bestätigt wurde, als Transformanden-Klon zur retroviralen Enzymgenexpression ausgewählt. Wenn beispielsweise das Insert die gesamte Dol-Genregion pNLH402 umfaßt, und in den oben erwähnten Expressionsvektor pUR290 eingeführt wurde, so kann ein EcoRI-DNA-Fragment von etwa 4kb nachgewiesen werden.
- (III) Bestätigung der retroviralen Enzymgenexpression durch den Transformanden-Klon und der Massenproduktion verschiedener Enzyme durch Kultivierung des Transformanden:
- Die Bestätigung der Enzymgenexpression durch die Transformanden-Klone kann dadurch erfolgen, daß man beispielsweise ein flüssiges Rohextrakt der vom Klon abgeleiteten Produkte mit Hilfe der Wester-Blot-Technik analysiert. Den Rohextrakt kann man beispielsweise dadurch herstellen, daß man den Transformanden in einem herkömmlichen Kulturmedium kultiviert und induziert, die Zellen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die isolierten Zellen mit Natriumdodecylsulfat und 2-Mercaptoethanol behandelt, mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und den flüssigen Überstand isoliert. Die Western-Blot-Technik kann gemäß dem herkömmlichen Verfahren unter Anwendung verschiedener käuflich erhältlicher Materialien in folgenden Schritten durchgeführt werden: Durchführung einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit den oben erwähnten Rohextrakten; Überführung des aufgetrennten Proteins auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung einer Transblotting-Apparatur und Eintauchen der Membran in eine Gelatinelösung zur Blockierung. Die folgenden Schritte umfassen beispielsweise folgende Stufen, wenn die auf der Membran befindliche Probe ein HIV-pol-Genprodukt ist: Durchführung einer ersten Reaktion mit Humanserum eines HIV-Trägers; Durchführung einer zweiten Reaktion mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Human-IgG-Antikörper nach dem Waschen; Anfärbung mit Wasserstoffperoxidlösung und einem chromogenen Agens nach dem Waschen und Detektion einer Bande, welche spezifisch mit dem Humanserum eines HIV-Trägers reagiert, wodurch die Expression des pol-Gens durch den oben erwähnten Klon bestätigt wird. Für den Fall, daß die Probe ein Genprodukt ist, das von einem anderen Retrovirus als HIV stammt, wird Humanserum eines HIV- Trägers nicht verwendet. Es wird jedoch ein geeignetes retrovirales Serum für die erste Reaktion und ein Antikörper gegen menschliches oder tierisches IgG für die zweite Reaktion verwendet.
- Die Massenproduktion verschiedener Enzyme, wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, durch Kultivierung desjenigen Transformanden, für den eine Enzymexpression bestätigt wurde, wird wie folgt durchgeführt: der Escherichia coli-Transformand wird in LB-Medium bei einer Temperatur von 30-40ºC 12h bis 35h kultiviert, bis eine Bakterienkonzentration von 10&sup9; bis 10¹&sup0; Zellen/ml erreicht wird, um Impfkulturen für die präparative Kultivierung dieses Transformanden zu erhalten. Anschließend inokuliert man diese Impfkulturen in frisch hergestelltes Medium und führt eine zweistufige Kultivierung durch, umfassend eine Vorkultur und eine Nachkultur. Die Vorkultur wird zum Zwecke der Vermehrung der Impfzellen und der Ainplifizierung des Expressionsvektors bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC über einen Zeitraum von 1 bis 24 h oder vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC über einen Zeitraum von 2 bis 12 h durchgeführt. Die Vorkultur wird unterbrochen, wenn im Falle von Escherichia coli eine Bakterienkonzentration in Kultur, d.h. eine Trübung der Kulturflüssigkeit von OD600nm = 0,4 bis 0,7 als Standard erreicht wird. Nach Beendigung der Vorkultur sollten init größter Sorgfalt die Bedingungen für die Induktionskultur eingestellt werden, so daß Transcription und Translation des Enzymgens, das mit dem Expressionsvektor verbunden ist, erfolgt und das Genprodukt nach der Translation in geeigneter Weise modifiziert wird und um die Prozessierung sicherzustellen, um individuelle und einzelne, reife, aktive Proteine zu erhalten und um zu vermeiden, daß das Enzymgenprodukt nach der Translation in ungeordneter Weise durch proteolytische Enzyme zersetzt wird, welche aus den Wirtszellen stammen, und dadurch seine Aktivität verliert. Die induzierte Kultur sollte bei einer Temperatur von 10 bis 30ºC über einen Zeitraum von 1 bis 40 h, vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 28ºC über einen Zeitraum von 3 bis 35 h gehalten werden. Je nach Eigenschaften des verwendeten Expressionsvektors kann die Expression induziert oder beschleunigt werden, beispielsweise dadurch, daß man eine Verringerung der Phosphationen im Medium beim Start der Induktionskultur bewirkt oder indem man einen Induktor dem Medium zugibt und mischt. Die Anwendung der oben erwähnten zweistufigen Kultivierung erlaubt die Produktion verschiedener retroviraler Enzyme, wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, und zwar nicht in Form von Fusionsproteinen, sondern in Form unabhängiger, aktiver Proteine, d.h. als individuelle und einzelne, reife Proteine, üblicherweise bei hohen Ausbeuten im Bereich von 1 bis 10 mg pro l Medium.
- (IV) Reinigung verschiedener retroviraler Enzyme, wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, nach Massenproduktion mit Hilfe eines Expressionsvektors:
- Dies erreicht man durch Kombination herkömmlicher Verfahren, welche beispielsweise umfassen: Extraktion des kultivierten Produkts des Transformanden unter Anwendung von Ausfällung, Zentrifugation oder Filtration; Herstellung von Rohextrakten durch Aufbrechen oder Zerkleinern der transformierten Zellen unter Anwendung einer Ultraschallbehandlung, Hochdruckbehandlung oder eines Homogenisators; Reinigung durch Absorptions-Elutions-Behandlung mit Hilfe von Silikagel oder Aktivkohle, Aussalzen oder Ausfällen mit Hilfe organischer Lösungsmittel; quantitative Reinigung mit Hilfe von Ultrazentrifugation, Säulenchromatographie oder Elektrophorese; oder ein Verfahren zur Reinigung eines Genproduktes durch Fraktionierung durch Dichtegradienten-Zentrifugation nach Adsorption und Elution mit Silikagel und Aktivkohle (Japanisches Patent, vorläufige Veröffentlichungs-Nr. 63-297).
- Die Enzyme, wie Protease, Reverse Transcriptase und Integrase, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens verfügbar sind, können als Flüssigkeit, getrocknetes Pulver oder in adsorbierter Form auf Filterpapier oder einer Membran und eingeschlossen in einer Ampulle, einem Vial oder einem anderen kleinen Behälter bereitgestellt werden. In getrockneter Form kann das Enzym in der erforderlichen Menge verwendet werden, nachdem man es vor der Verwendung einem entsprechenden Volumen destillierten Wassers löst. Nach Adsorption auf Filterpapier oder einer Membran sollte es verwendet werden, nachdem man es mit einer Lösung gemäß Anleitung befeuchtet.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Beispiele genauer beschrieben. Die vorliegende Erfindung wird durch die im folgenden beschriebenen Beispiele nicht beschränkt.
- Messung der Aktivität von Reverser Transcriptase: Ein Reaktionsgemisch stellt man her, umfassend 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 3 mM Dithiothreitol, 0,1 W/V% Nonidet P-40 (von Shell Oil (USA)), 20 ug/ml (rA)n(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (Pharmacia (Schweden)), 0,5 mM dTTP (Deoxythymidintriphosphat) und 1 uCi [³H] dTTP (Deoxythymidintriphosphat). Dieses Reaktionsgemisch gibt man zur Probe in einer Menge von 5 ul auf ein Gesamtvolumen von 50 ul und inkubiert das Gemisch 10 min bei 37ºC. Anschließend wird das Gemisch sofort mit Eis gekühlt und über ein Filterpapier DE81 (von Watman (England)) abfiltriert. Den Filter wäscht man sorgfältig mit einer 5%-igen Natriumphosphatlösung und anschließend mit Ethanol nach Wasserspülung. Nach dem Trocknen bestimmt man die Radioaktivität mit Hilfe eines Flüssigszintillationszählers.
- Konstruktion eines Expressionsvektors, der das Mol- Gen aus Lentivirus trägt:
- 5 ug der Plasmid pNL4-3-DNA (Journal of Virology, 59(2): 284-291, 1986), welche die provirale HIV-Genom-DNA trägt, gibt man zu 5 ul HindIII, 20 ul 5 x RM (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 35 mM MgCl&sub2;, 300 mM NaCl), verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul und extrahiert die Lösung nach einstündiger Inkubation bei 37ºC mit Phenol, gesättigt mit TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1 mM EDTA). Die Wasserschicht behandelt man mit Chloroform, bevor man mit Ethanol ausfällt. Zu dem Gemisch aus 1 ul der durch Auflösen des Niederschlages in 10 ul TE hergestellten Lösung, 0,1 ug (1 ul) des Plasmids pHSG398-DNA, geschnitten mit HindIII und behandelt mit alkalischer Phosphatase, und 2 ul des 10x- Ligationspuffers (660 mM Tris-HCl [pH 7,6], 66 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 1 mM ATP) gibt man 1 ul T4 DNA-Ligase und bringt das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 20 ul. Dann inkubiert man 12 h bei 15ºC. Daran anschließend transformiert man den Escherichia coli-Stamm JM103 mit dieser Reaktionsflüssigkeit unter Anwendung der Calciumchlorid-Methode (Journal of Molecular Biology, 53:154, 1979) und selektiert Chloramphenicol-resistente Kolonien auf einer LB-Medium-Platte (1 W/V% Bacto-Trypton, 0,5 W/V% Bacto-Hefeextrakt, 1 W/V% NaCl und 1,5 W/V% Agar) enthaltend 20 ug/ml Chloramphenicol. Man extrahiert die Plasmid-DNA aus dem Chloramphenicol-resistenten Klon unter Anwendung einer herkömmlichen Methode und erhält den Klon pNLH402 durch Auswahl eines Klons, der ein Fragment von etwa 4,0 kb aufweist, welches aus der DNA des Plasmids pNL4-3 durch HindIII-Behandlung stammt.
- HindIII in einer Menge von 5 ul und 5 x RM in einer Menge von 10 ul gibt zu 5 ul (5 ug) der pNLH402-Plasmid-DNA und verdünnt das Gemisch mit verdünntem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul. Das Gemisch inkubiert man 1 h bei 37ºC und führt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung mit dem Gemisch eine Ethanolfällung durch. Den resultierenden Niederschlag gibt man zu 10 ul 5 x RM und 5 ul BglII und verdünnt mit destilliertem Wasser unter vollständiger Lösung auf ein Gesamtvolumen von 50 ul. Das Gemisch inkubiert man erneut bei 37ºC über einen Zeitraum von 1 h und führt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung mit dem resultierenden Produkt eine Ethanolfällung durch. Die auf diese Weise erhaltene DNA löst man in 10 ul TE.
- Gleichzeitig gibt man 5 ul HindIII und 10 ul 5 x RM zu 5 ul der DNA des Expressionsvektors pUR280 (The EMBO Journal, 2(2): 1791-1794, 1983). Das Gemisch, verdünnt mit destilliertem Wasser auf 50 ul, inkubiert man 1 h bei 37ºC und gibt nach Phenolextraktion, Chloroformbehandlung und Ethanolfällung 10 ul 5 x RM (NaCl-Konzentration: 500 mM) und 5 ul BamHI hinzu. Weitere 35 ul destilliertes Wasser werden hinzugegeben, um eine vollständig Lösung des Niederschlags zu bewirken. Die Lösung wird anschließend 1 h bei 37ºC inkubiert. Nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung fällt man die DNA mit Ethanol aus und löst in 10 ul TE auf.
- Anschließend mischt man pUR290 DNA (1 ul), verdaut mit HindIII und BamHI, mit pNLH402-DNA (1 ul), verdaut mit HindIII und BglII, und gibt 2 ul 10 x Ligationspuffer und 1 ul T4 DNA-Ligase hinzu. Man stellt ein Gesamtvolumen von 20 ul mit destilliertem Wasser ein und läßt 12 h bei 15ºC reagieren. Den Escherichia coli-Stamm UT481 (Journal of Bacteriology, 163: 376-387, 1985) transformiert man mit der Reaktionslösung in Übereinstimmung mit der oben erwähnten Calciumchlorid-Methode. Amipicillin-resistente Kolonien selektiert man auf einer LB- Medium-Platte, welche 20 ug/ml Ampicillin enthält und außerdem selektiert man einen Klon mit einem Fragment von etwa 3,8 kb, welches von pNL4-3 Stammte indem man die Größe des insertierten Fragments durch EcoRI-Spaltung überprüft. Dabei erhält man den Klon UT481/pPG280. Insbesondere wird davon ausgegangen, daß in diesem Klon die HIV-pol-Genregion mit einer Größe von etwa 3,8 kb mit dem 3'-Ende des lacZ-Gens des Plasmids pUR290 verbunden ist, und daß das lacZ- und pol-Genprodukt zunächst als Fusionsprotein (etwa 230 kd) exprimiert wird und wobei die verschiedenen getrennten Enzyme nach der Prozessierung hergestellt werden.
- Herstellung der Lentivirus-Enzyme Protease, Reverse Transcriptase und Integrase durch Kultivierung transformierter Zellen:
- Nach Kultivierung des transformierten Zellklons UT481/pPG280 über einen Zeitraum von 18 h bei 37ºC in einem LB- Medium, welches 20 ug/ml Ampicillin (1 W/V% Bacto-Trypton, 0,5 W/V% Bacto-Hefeextrakt und 1 W/V% NaCl) enthält, gibt man die resultierenden Zellen zu frischem LB-Medium, welches 20 ug pro ml Ampicillin enthält in einer 1:100 Verdünnung und führt die Vorkultivierung durch. Sobald die OD600nm des Mediums einen Wert von 0,5 erreicht, gibt man 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid von Sigma [USA]) hinzu und setzt die Kultivierung 18 h bei 25ºC fort. Die Bakterien zentrifugiert (5000 Upm, 5 min) man ab und suspendiert diese in 1/25 Volumen 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) (0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 W/V% Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol). Nach Ultraschallbehandlung (fünf 30-Sekunden-Stöße, 19,5 kHz, 300 W) trennt man den flüssigen Überstand durch Zentrifugation (19000 Upm, 60 min) ab. Um zu bestätigen, daß das HIV-pol-Genprodukt in diesem flüssigen Rohextrakt vorliegt, wird die Aktivität von Reverser Transcriptase in dem flüssigen Rohextrakt gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Die erwartete signifikante Aktivität von Reverser Transcriptase wurde hierbei beobachtet. Eine Analyse unter Anwendung der Wester-Blot-Technik wird ebenfalls durchgeführt:
- 4 W/V%-Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 W/V% 2-Mercaptoethanol gibt man zu den isolierten Bakterien. Nach 5-minütigem Kochen und Zentrifugation (10 000 Upm, 5 min) elektrophoretisiert man den flüssigen Überstand auf einem 0,1 W/V% SDS - 10 W/V% Polyacrylamidgel. Nach Blotten auf eine Nitrocellulosemembran (S&S [Westdeutschland]) mit Hilfe einer Transblotting-Apparatur (BioRad [USA]) taucht man die Membran in eine 3 W/V% -Gelatinelösung in Übereinstimmung mit einer herkömmlichen Blockierungsmethode ein. Anschließend führt man eine erste Reaktion durch, indem man die Membran mit Humanserum inkubiert, das man von einem HIV-Träger erhält und nach dem Waschen führt man eine zweite Reaktion mit einem Anti-Human-IgG-Antikörper, der mit einem Peroxidase-Marker konjugiert ist (BioRad), durch. Schließlich taucht man nach dem Waschen die Membran in eine chromogene Flüssigkeit ein, welche man herstellt, indem man 0,4 ml DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) und 15 ul 30 W/V% Wasserstoffperoxid-Lösung zu 50 ml TBS (20 mM Tris-HCl [pH 7,4], 500 mM NaCl) gibt, um eine Farbreaktion zu bewirken und zwar innerhalb von 15 min bei Zimmertemperatur. Anschließend wäscht man mit destilliertem Wasser. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Während keine spezifische Bande, welche mit dem Serum des humanen HIV-Trägers reagiert, in der Rohextrakt-Flüssigkeit der transformierten Zellen UT481/pUR290, die den Vektor pUR290 enthalten, der das HIV-pol-Gen nicht trägt, beobachtet werden konnten, wurden Banden für Reverse Transcriptase mit einem Molekulargewicht von 66 kd und 51 kd, für Integrase mit 32 kd und für Protease iuit 12 kd, d.h. die HIV-pol-Genprodukte in der Extraktflüssigkeit transformierter Zellen des Stamms UT481/pPG280 gefunden. Die Abspaltung der Reversen Transcriptase von β-Galactosidase ist leicht zu erkennen aus dem Ergebnis einer Säulenchromatographie mit einem MonoQ- Anionenaustauscher (Pharmacia [Schweden]), wie aus Fig. 3 ersichtlich. Insbesondere kann Reverse Transcriptase-Aktivität in einer Fraktion gefunden werden, welche von der β-Galactosidase- Aktivität vollständig getrennt ist. Dies weist daraufhin, daß, obwohl die HIV-pol-Genprodukte in Form von Fusionsproteinen mit β-Galactosidase gebildet werden, die Region für Protease, Reverse Transcriptase und Integrase dieses Fusionsproteins durch die Wirkung der Protease, welche ihrerseits ein pol- Genprodukt ist, getrennt und in der Zelle akkumuliert werden.
- Konstruktion eines Vektors zur Produktion großer Mengen von Lentivirus-Protease:
- 5 ul HindIII und 10 ul 5 x RM gibt man zu 5 ul DNA des pol-Gen-Expressionsplasmids pPG280, hergestellt gemäß Beispiel 1, und verdünnt das Gemisch mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul. Das Gemisch inkubiert man 1 h bei 37ºC und führt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung mit dem Gemisch eine Ethanolfällung durch. Den resultierenden Niederschlag gibt man zu 5 ul 5 x RM (-NaCl) und 5 ul Ball und verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul, wodurch der Niederschlag ausreichend gelöst wird. Das Gemisch inkubiert man erneut 1 h bei 37ºC und führt mit dem resultierenden Produkt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung eine Ethanolfällung durch. Den resultierenden Niederschlag gibt man zu 5 ul 10 x Polymerase- Puffer (670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 67 mM MgCl&sub2;, 166 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM 2-Mercaptoethanol und 67 uM EDTA) 5 ul einer 10 x dNTP- Lösung (jeweils 3,3 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTP) und 1 ul T4 DNA-Polymerase und verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul, so daß eine ausreichende Auflösung erfolgt. Das Gemisch inkubiert man 15 min bei 37ºC und führt mit dem resultierenden Produkt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung eine Ethanolfällung durch. Zu dem Gemisch aus 1 ul der Lösung, die man herstellt, indem man den resultierenden Niederschlag in 10 ul TE und 2 ul 10 x Ligations-Puffer löst, gibt man 1 ul T4 DNA-Ligase und bringt das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 20 ul. Das Gemisch inkubiert man 12 h bei 15ºC. Den Escherichia coli-Stamm UT481 transformiert mit diesem Reaktionsgemisch in Übereinstimmung mit der oben erwähnten Calciumchlorid-Methode. Ampicillin-resistente Kolonien selektiert man auf LB-Medium- Platten enthaltend 20 ug/ml Ampicillin. Einem Klon, der ein 0,55 kb-Fragment enthält, welches aus dem Plasmid pNL4-3 stammt, selektiert man durch Bestimmung der Größe des insertierten Fragments nach EcoRI-Verdauung. Auf diese Weise erhält man den Klon UT481/pLB550-3.
- Massenproduktion von Lentivirus-Protease durch transformierte Zellen:
- Nach 18-stündiger Kultivierung des transformierten Klons UT481/pLB550-3 bei 37ºC in LB-Medium (enthaltend 20 ug/ml Ampicillin) gibt man die resultierenden Zellen in frisches LB- Medium (enthaltend 20 ug/ml Ampicillin) in einer 1:1-Verdünnung und führt die Vorkultivierung bei 37ºC durch. Hat die OD600nm des Mediums einen Wert von 0,5 erreicht, so gibt man 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, Sigma (USA)) hinzu und kultiviert weitere 6 h bei 37ºC. Die Bakterien werden abzentrifugiert (5000 Upm, 5 min) und man gibt 4 W/V% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 W/V% 2-Mercaptoethanol hinzu. Nach 5-minütigem Kochen und Zentrifugation (10000 Upm, 5 min) elektrophoretisiert man den flüssigen Überstand auf einem 0,1 W/V% SDS - 15 W/V% Polyacrylamid-Gel. Anschließend werden die isolierten Baktieren mit Hilfe der in Beispiel 2 beschriebenen Western-Blot-Technik analysiert. Während keine spezifische Bande, welche mit Serum aus humanem HIV-Träger reagiert, in Rohextrakten von UT481/pUR290 beobachtet werden, beobachtet man eine Proteasebande von 12 kd in den Flüssigextrakten von UT481/pLB550-3. Insbesondere produziert pLB550-3 eine Proteasemenge, die um ein mehrfaches größer ist als diejenige von pPG280. Man geht davon aus, daß in diesem Klon das 0,55 kb HIV-pol-Gen mit dem 3'-Ende des lacZ-Gens aus dem Plasmid pUR290 ligiert ist und daß das lacZ-pol-Genprodukt als Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht von 140 kd produziert wird und daß eine Protease von etwa 12 kd durch Prozessierung gebildet wird.
- Konstruktion eines Expressionsvektors, der das Gen für onkovirale Protease und Mol trägt:
- 5 ul Plasmid-DNA von pSRA2, das die Rous-Sarcoma- Virus-cDNA (Journal of Virology, 36, S. 50-61, 1980) trägt, versetzt man mit 5 ul BamHI und 20 ul 5 x RM und verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul. Dieses Gemisch inkubiert man anschließend 1 h bei 37ºC. Nach dieser Reaktion elektrophoretisiert man das Gemisch auf einem 1 W/V%- Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt und verarbeitet denjenigen Gelabschnitt, der ein 1,8 kb DNA-Fragment enthält. Anschließend führt man nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung mit dem resultierenden Produkt eine Ethanolfällung durch. Ein Gemisch aus 1 ul der durch Auflösen des Niederschlages in 10 ul TE erhaltenen Lösung, 0,1 ug (1 ul) der Plasmid-DNA von pUR291, geschnitten mit BamHI und behandelt mit alkalischer Phosphatase, und 2 ul 10 x Ligations-Puffer, gibt man 1 ul T4 DNA-Ligase hinzu und bringt das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 20 ul. Das Reaktionsgemisch inkubiert man 12 h bei 15ºC. Anschließend transformiert man den Escherichia coli-Stamm UT481 mit dem Reaktionsgemisch unter Befolgung der Calciumchlorid-Methode. Ampicillin-resistente Kolonien selektiert man auf einer LB-Medium-Platte, enthaltend 20 ug/ml Ampicillin. Die Plasmid-DNA extrahiert man aus dem Ampicillin-resistenten Klon unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens und erhält den Klon pSR281 durch Selektion eines Klons, der ein 1,8 kb-Fragment enthält, welches aus dem Plasmid pSRA2 stammt und ein lacZ-gag-Fusionsprotein produziert.
- 5 ul der Plasmid-DNA aus pSRA2 gibt man zu 5 ul PstI und 20 ul 5 x RM (750 mM NaCl) und verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul. Das Gemisch wird anschließend 1 h bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Reaktion elektrophoretisiert man das Gemisch auf einem 1 W/V%-Agarose- Gel mit niedrigem Schmelzpunkt und verarbeitet den Abschnitt mit dem 1,8 kb DNA-Fragment. Anschließend führt man mit dem resultierenden Produkt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung eine Ethanolfällung durch und verdünnt in 10 ul TE. Die doppelsträngige Phagen-DNA von M13mp18 spaltet man mit PstI und behandelt mit alkalischer Phosphatase. 1 ul (0,1 ug) dieser DNA gibt man zu 1 ul des oben erwähnten 3,1 kb DNA-Fragments, 2 ul 10 x Ligations-Puffer und 1 ul T4 DNA-Ligase und verdünnt mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul. Dann inkubiert man 12 h bei 15ºC. Anschließend wird die rekombinante Phagen-DNA verwendet, um den Escherichia coli-Stamm TG1 unter Anwendung der Calciumchlorid-Methode zu transfizieren. Es werden Plaques auf einer 2 YT-Medium-Platte (1,6 W/V% Bacto-Trypton, 1 W/V% Bacto-Hefeextrakt, 0,5 W/V% NaCl und 1,5 W/V% Bacto-Agar), enthaltend X-gal (5-Brom-4-chlor-4-indolyl-β-D- galactopyranosid, Sigma (USA)) gebildet.
- Im nächsten Schritt wird der TG1-Stamm in einem 2YT- Medium (1,6 W/V% Bacto-Trypton, 1 W/V% Bacto-Hefeextrakt und 0,5 W/V% NaCl) vermehrt, bis die OD600nm des Mediums einen Wert von 0,3 erreicht. Ein Teil des achromatischen Klons des resultierenden Plaques wird inokuliert. Eine einzel- und doppelsträngige DNA wird in Übereinstimmung mit herkömmlichen Verfahren hergestellt, nachdem man die Inkubation über mehrere Stunden fortgesetzt hat. Der Klon M13sr31, der das von pSRA2 stammende 3,1 kb-Fragment enthält, wird selektiert, indem man die erhaltene doppelsträngige DNA mit PstI und BamHI verdaut. Das 3,1 kb-Fragment, welches von pSAR2 stammt, codiert für das 3'-Ende des gga-Gens, für das Stopcodon TAG und für das pol- Gen. Die Insertion einer Base vor dem Stopcodon führt zur Expression eines gag-pol-Fusionsgens, das aufeinander abgestimmte Translations-Leserahmen aufweist. Unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese-Kits (Amersham [England]) erhält man den Klon M13sr32, der die Sequenz ATAG aufweist, die man dadurch erhält, daß man eine Base vor dem Stopcodon TAG in M13sr31 einsetzt.
- 5 ul doppelsträngige DNA aus M13sr32 gibt man zu 5 ul PstI und 20 ul 5 x RM und verdünnt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul. Das Gemisch inkubiert man 1 h bei 37ºC. Nach dieser Reaktion elektrophoretisiert man das Gemisch auf einem 1 W/V%-Agarose-Gel mit niedrigem Molekulargewicht und verarbeitet das Gel, das ein 3,1 kb-DNA-Fragment enthält weiter. Anschließend führt man mit dem resultierenden Produkt nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung eine Ethanolfällung durch. Zu dem Gemisch aus 1 ul der Lösung, hergestellt durch Auflösen des Niederschlages in 10 ul TE, 1 ul (0,1 ug) Plasmid-DNA aus pSR281, verdaut mit PstI und behandelt mit alkalischer Phosphotase und 2 ul 10 x Ligations-Puffer, gibt man 1 ul T4 DNA-Ligase hinzu und bringt das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 20 ul. Anschließend inkubiert man das Gemisch 12 h bei 15ºC. Daraufhin transformiert man den Escherichia coli-Stamm UT481 mit diesem Reaktionsgemisch unter Befolgung der Calciumchlorid-Methode und selektiert Ampicillinresistente Kolonien auf einer LB-Medium-Platte, welche 20 ug/ml Ampicillin enthält. Die Plasmid-DNA extrahiert aus dem Ampicillin-resistenten Klon mit Hilfe herkömmlicher Techniken und bestätigt das Vorliegen und die Richtung des 3,1 kb- Fragments, das aus M13sr32 stammt, durch Verdauung des Plasmids mit PstI und BamHI. Auf diese Weise erhält man den Klon UT481/pSR271, von den man annimmt, daß er Protease und pol-Genprodukte exprimiert.
- Insbesondere wird von der 1,8 kb-Region, welche aus pSRA2 stammt und in pSR281 enthalten ist, ein 1,3 kb-Abschnitt, der mit dem 3,1 kb-Fragment aus M13sr32 überlappt, entfernt, wenn man pSR281 mit PstI schneidet.
- Produktion onkoviraler Protease-, Reverse Transcriptase- und Integrase-Enzyme durch Kultivierung transformierter Zellen:
- Nach Kultivierung des transformierten Klons UT481/pSR271 über einen Zeitraum von 18 h bei 37ºC in einem LB- Medium (enthaltend 20 ug/ml Ampicillin) gibt man die resultierenden Zellen zu frischem LB-Medium (enthaltend 20 g/ml Ampicillin) in einer 1:100 Verdünnung und führt die Vorkultivierung durch. Sobald die OD600nm des Mediums einen Wert von 0,5 erreicht, gibt man 1 mM IPTG hinzu und setzt die Kultivierung 18 h bei 25ºC fort. Bakterien isoliert man durch Zentrifugation (5000 Upm, 5 min) und suspendiert sie in 1/25 Volumen 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) (0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 W/V% Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol). Nach Ultraschallbehandlung ( fünf 30-Sekunden-Stöße, 19,5 kHz, 300 W) zentrifugiert man den Überstand ab (19000 Upm, 60 min). Um das Vorliegen des RSV-Genprodukts in dieser Rohextraktflüssigkeit zu bestätigen, wird die Aktivität von Reverser Transcriptase in der Rohextraktflüssigkeit gemessen. Man erhält hierbei die erwartete signifikante Aktivität von Reverser Transcriptase. Eine Wester-Blot-Analyse wird ebenfalls durchgeführt: 4 W/V% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 W/V% 2-Mercaptoethanol gibt man zu den isolierten Bakterien hinzu. Nach 5-minütigem Kochen und Zentrifugieren (10 000 Upm, 5 min) elektrophoretisiert man den Überstand auf einen 0,1 W/V% SDS - 15 W/V% Polyacrylamidgel. Nach Blotten auf eine Nitrocellulosemembran (S&S [Westdeutschland]) unter Verwendung einer Transblotting- Apparatur (BioRad [USA]) wird die Membran in eine 3 W/V%- Gelatinelösung eingetaucht und zwar in Übereinstimmung mit herkömmlichen Blockierungsmethoden. Für eine erste Reaktion wird die Membran anschließend mit Anti-RSV-Kaninchen-Serum inkubiert und nach dem Waschen für eine zweite Reaktion mit einem Anti- Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit einem Peroxidase- Marker (BioRad), inkubiert. Nach dem Waschen wird die Membran schließlich in eine chromogene Flüssigkeit eingetaucht, die man dadurch herstellt, daß man 0,4 ml DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) und 15 ul 30 W/V% Wasserstoffperoxid-Lösung zu 50 ml TBS (20 mM Tris-HCl [pH 7,4], 500 mM NaCl) hinzugibt, um eine Farbbildung zu bewirken und zwar innerhalb eines Zeitraumes von 15 min bei Zimmertemperatur. Anschließend wird mit destilliertem Wasser gewaschen. Während man keine spezifische Bande, welche mit Anti-RSV-Kaninchen-Serum reagiert, in der rohe Extraktflüssigkeit beobachtet, die man aus den transformierten Zellen UT481/pUR290 erhält, welche den Vektor pUR290 tragen, der das RSV-Gen nicht aufweist, beobachtet man Banden von RSV-Reverser Transcriptase in der Extraktflüssigkeit von UT481/pSR271. Obwohl die RSV-Protease und das pol-Genprodukt in Form eines Fusionsproteins mit β-Galactosidase gebildet werden, werden die Abschnitte für Protease und Reverse Transcriptase durch Einwirkung der Protease, welche ihrerseits ein gag-Genprodukt ist, spezifisch aufgetrennt und in der Zelle akkumuliert. Man geht davon aus, daß in dem Klon UT481/pSR271 die 3,6 kb Rous-Sarcoma-Virus gag- und pol-Genregion mit dem 3'-Ende des lacZ-Gens aus Plasmid pUR291 ligiert ist und es wird angenommen, daß die lacZ-, gag- und pol-Genprodukte in Form eines Fusionsproteins (etwa 230 kd) exprimiert werden, das dann unter Freisetzung der Enzyme, d.h. Protease (P15), Reverse Transcriptase (P92, P65) und Integrase (P32), prozessiert wird.
- Extraktion von Reverser Transcriptase:
- Wie in Beispiel 2 erwähnt, kultiviert man den transformierten Escherichia coli-Klon UT481/pPG280 in 9 l LB-Medium (enthaltend 20 ug/ml Ampicillin) bei 25ºC und wenn die Kultur einen OD600nm Wert von 0,5 erreicht, gibt man 1 mM IPTG hinzu. Die Kultivierung setzt man weitere 24 h fort und nach der Abtrennung suspendiert man die Zellen in 120 ml 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) (enthaltend 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 W/V% Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol)-Puffer. Die Bakterienzellen werden durch Ultraschallbehandlung zerstört und abzentrifugiert (19000 Upm, 60 min). Man trennt den Überstand ab, so daß man eine Rohextraktflüssigkeit erhält.
- Reinigung von Reverser Transcriptase:
- Polymine P (BRL [USA)) gibt man in einer Menge von 0,1 W/V% zur Rohextraktflüssigkeit hinzu, und rührt 30 min bei 4ºC und zentrifugiert ab (16000 Upm, 20 min).
- Man gibt Ammoniumsulfat zum Überstand hinzu. Den aus einer zu 40% gesättigten Lösung erhaltenen Niederschlag entfernt man durch Zentrifugation (16000 Upm, 20 min) und erhält 137 ml flüssigen Überstand. Ammoniumsulfat wird bis zu einer 80%-igen Sättigung hinzugegeben und der auf diese Weise produzierte Niederschlag wird in 50 ul des oben erwähnten 40 mM Tris-HCl-Puffers gelöst und gegen den gleichen Puffer, der 50 mM NaCl enthält, dialysiert.
- Quantitative Reinigung von Reverser Transcriptase:
- Die quantitative Reinigung führt man aus unter Anwendung einer DEAE Bio-Gel-A (BioRad [USA]) und Affi-Gel- Heparin (BioRad)-Säulenchromatographie. Die dialysiert Probe gemäß Beispiel 8 trägt man auf eine 30 ml DEAE Bio-Gel-A-Säule auf, welche mit 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) (enthaltend 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 W/V Triton X-100, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 50 mM NaCl) äquilibriert wurde. Die eluierte Probe trägt man anschließend auf eine 30 ml Affi-Gel-Heparin-Säule auf, welche mit dem oben erwähnten Puffer äquilibriert wurde und man eluiert mit 150 ml Puffer, umfassend einen Natriumchloridgradienten von 50 mM bis 400 mM. Das Ergebnis ist in Fig. 4 gezeigt. Die Fraktionen 29 bis 38, welche Reverse Transcriptase-Aktivität aufweisen, werden vereinigt. Die auf diese Weise vereinigten Reverse Transcriptase-Fraktionen dialysiert man gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer (PH 6,8) (enthaltend 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 W/V% Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol) und reinigt sie weiter unter Verwendung einer Hydroxylapatit- Säule (KB-Säule, von Koken [Japan]) durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie. Insbesondere führt man nach Adsorption der oben erwähnten dialysierten Probe auf der Säule eine Elution mit einem linearen Natriumphosphat-Gradienten von 20 bis 400 mM durch und vereinigt diejenigen Fraktionen, welche Reverse Transcriptase-Aktivität besitzen. Auf diese Weise erhält man gereinigte Reverse Transcriptase. Wie durch SDS-PAGE bestätigt, weist die auf diese Weise erhaltene Reverse Transcriptase einen Reinheitsgrad von über 95% auf. Die Ausbeute beträgt 31 % bezogen auf die Rohextraktflüssigkeit.
- Diagnose einer HIV-1-Infektion unter Verwendung gereinigter Reverser Transcriptase:
- Die gemäß Beispiel 9 hergestellte gereinigte Reverse Transcriptase (Proteinkonzentration 250 ug/ml) elektrophoretisiert man auf einem Polyacrylamidgel gemäß Beispiel 2 und blottet diese auf eine Nitrocellulosemembran. Die Membran taucht man in eine 3 W/V%-Gelatinelösung zur Blockierung ein. Anschließend untersucht man auf Vorliegen eines Antikörpers gegen HIV-1-Reverse Transcriptase im Serum von menschlichen HIV-1-Trägern (drei Individuen) unter Verwendung der Western- Blot-Technik. Träger des humanen T-Zell-Leukämievirus (HTLV-1) (fünf Individuen) und gesunde Erwachsene (fünf Individuen) werden in gleicher Weise untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Seren aller drei HIV-1-Träger reagieren mit Reverser Transcriptase (66 kd und 51 kd). Jedoch war dies bei keinem der Seren der Träger von HTLV-1 (das zur gleichen retroviralen Familie gehört wie HIV-1) und bei keinem Serum der fünf gesunden Individuen zu beobachten. Dies weist darauf hing daß die Möglichkeit besteht, die HIV-1-Infektion in spezifischer Weise unter Verwendung der erfindungsgemäß aus Escherichi coli hergestellten gereinigten HIV-1-Reversen Transcriptase zu diagnostizieren. TABELLE 1 - Diagnose der HIV-1-Infektion durch Western- Blotting unter Verwendung von gereinigter Reverser Transcriptase Individuen Reaktivität* Humanserum von HIV-1-Träger Humanserum vom gesunden Erwachsenen * Spezifische immunologische Reaktion gegen gereinigte Reverse Transcriptase ** Die Reaktivität wurde mit Hilfe der Western-Blot-Technik gemessen. Angegeben ist eine positive (+) und eine negative (-) Reaktion.
- (1) Mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren, bei dem ein sehr gefährlicher Retrovirus selbst nicht verwendet wird, kann ein hoher Sicherheitsstandard in bezug auf eine biologische Gefährdung unter Produktionsbedingungen erreicht werden und die Durchführung der Produktion ist einfach.
- (2) Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu sehr hoher Produktausbeuten aller produzierten Enzyme, entsprechend einer Proteinmenge von 1 bis 10 mg pro Liter Bakterienkultur.
- (3) Erfindungsgemäß können trotz der Tatsache, daß retrovirale Protease, Reverse Transcriptase und Integrase als Fusionsprotein mit hoher Expressionsfähigkeit exprimiert werden, verschiedene Enzyme produziert werden, die nicht als Fusionsprotein, sondern als reife Einzelproteine vorliegen, welche spezifisch prozessiert wurden. Das Verfahren ist somit effizienter und rationeller als der Einsatz der Expression einzelner Enzymgene und unter Berücksichtigung der obigen Punkte (1) und (2) ökonomisch, da geringere Produktionskosten anfallen.
- (4) Da Enzyme zu niedrigen Kosten und in großer Menge verfügbar sind, welche eine sehr hohe Spezifität gegenüber retroviralem Substrat und Enzymen aufweisen, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein großer Fortschritt für die Grundlagenforschung auf dem Gebiet retroviraler Infektionskrankheiten, wie AIDS, adulter T-Zell-Leukämie, avianem Sarkom oder avianer Leukämie und feliner Leukämie, und der Entwicklung spezifischer therapeutischer Wirkstoffe und präventiver Wirkstoffe mit hoher selektiver Wirksamkeit und der Diagnose dieser Erkrankungen verbunden, so daß die menschliche Gesundheit verbessert und die Tierhaltung gefördert wird.
- (5) Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann für die Entwicklung einer effizienten und rationellen Massenproduktion dieser Genprodukte eingesetzt werden, da dieses Verfahren die Massenexpression und eine anschließende Prozessierung der verschiedenen anderen Gene, die in dem Virus und dem Retrotransposon enthalten sind, sowie verschiedener retroviraler Enzymgene ermöglicht.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung von einem oder mehreren
retroviralen Proteinen, umfassend folgende Schritte:
(i) die Herstellung eines Expressionsvektors, der eine
cDNA-Sequenz umfaßt, die einem oder mehreren
retroviralen, für wenigstens ein retrovirales Protein
codierenden Genen entspricht, die unter Wahrung des
Leserasters mit einer Sequenz verbunden ist, die dem
gesamten lacZ-Gen oder einem lacZ-Gen, dem die für
eine oder beide der zwei C-terminalen Aminosäuren
codierenden Nucleotide fehlen, entspricht, mit der
Maßgabe, daß wenigstens eines der retroviralen Gene
für eine Protease codiert;
(ii) die Einführung des Expressionsvektors in Zellen des
E.coli-Stammes UT481 (FERM BP-2417);
(iii) die Kultivierung der transformierten Zellen unter
Bedingungen, bei denen die Gene als Fusionsprotein
exprimiert werden, das nachfolgend in situ durch die
Wirkung der Protease prozessiert wird, wodurch
getrennte, reife Proteinmoleküle gebildet werden, und
wobei, wenn wenigstens ein weiteres retrovirales
Protein zusätzlich zu der Protease exprimiert wird,
die transformierten Zellen nach der Induktion bei
etwa 25ºC kultiviert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die retroviralen
Proteine ausgewählt sind unter einer Protease, Reverser
Transcriptase, Endonuclease und Gag-Proteinen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die
transformierten Rezipientenzellen durch ein zweistufiges
Kultivierungsverfahren kultiviert werden.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
transformierten Rezipientenzellen vor der Induktion 1 bis 24
Stunden bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC in Vorkultur
gehalten werden.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das
cDNA-Fragment des retroviralen Gens ausgewählt und hergestellt
wird aus E.coli UT481/pNLH402 (FERM BP-2417) und dem Plasmid
pSRA2.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
cDNA-Fragment des retroviralen Gens in eine der
Clonierungsstellen am 3'-Ende des lacZ-Gens eines Plasmid-
Vektors der Serie pUR290 insertiert wird.
7. Expressionsvektor, umfassend eine cDNA-Sequenz, die einem
oder mehreren retroviralen, für wenigstens ein retrovirales
Protein codierenden Genen entspricht, die unter Wahrung des
Leserasters mit einer Sequenz verbunden ist, die dem gesamten
lacZ-Gen oder einem lacZ-Gen, dem die für eine oder beide der
zwei C-terminalen Aminosäuren codierenden Nucleotide fehlen,
entspricht, mit der Maßgabe, daß wenigstens eines der
retroviralen Gene für eine Protease codiert.
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