DE3588253T2

DE3588253T2 - Rekombinante Proteine von mit Lymphadenopathiesyndrom und/oder erworbenem Immunschwächesyndrom assoziierten Viren

Info

Publication number: DE3588253T2
Application number: DE3588253T
Authority: DE
Inventors: Paul A. Luciw; Dino Dina; Kathelyn Steimer; Ray Sanchez Pescador; Carlos George-Nascimento; Deborah Parkes; Rob Hallewell; Philip J. Barr; Martha Truett
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-10-31
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2005-10-31
Also published as: US5156949A; DE122005000031I1; HK102495A; DE10399037I2; CA1341423C; JP2004081219A; EP1245678A3; ATE295881T1; US7408053B1; EP1245678A2; NL300137I1; US5688688A; DE3588252T2; US6458527B1; US6531276B1; NL300137I2; JPH07313184A; DE3588253D1; NL300197I1; DE10399037I1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung stammt aus dem Gebiet der Gentechnik. Sie betrifft vor allem rekombinante virale Proteine, die mit dem Lymphadenopathie-Syndrom und/oder dem erworbenen Immunschwäche-Syndrom assoziiert sind.
Stand der Technik
Mit der Entdeckung des humanen T-Zell-lymphotropen Virus I (HTLV-I) als infektiösem Agens in Menschen wurde nachgewiesen, dass Retroviren Menschen infizieren können und das ätiologische Agens von Erkrankungen sein können. Nachdem HTLV-I nachgewiesen war, wurde ein zweites Retrovirus aus der gleichen Familie, HTLV-II, in einem nachgewiesenen Haarzellenleukämie-Stamm gefunden. Seit dieser Zeit wurden weitere humane Retroviren isoliert, die mit dem Lymphadenopathie-Syndrom (LAS) und/oder der erworbenen Immunschwäche bei erkrankten Menschen assoziiert sind. Verschiedene Retroviren sind aus Menschen mit AIDS (manchmal als HTLV-III bezeichnet) oder LAS (manchmal als LAV bezeichnet) isoliert worden, siehe beispielsweise Barre-Sinoussi et al., Science (1983) 220:868-871 und Montagnier et al., Cold Spring Harbor Symposium (1984), im Druck; Vilmer et al., Lancet (1984) 1:753, Popovic et al., Science (1984) 224:497 und Gallo et al. Science (1984) 224:500. Ein Vergleich von HTLV-III und LAV kann bei Feorino et al. (1984), siehe oben, gefunden werden, siehe auch Klatzman et al., Science (1984) 225:59-62, Montagnier et al., ebenda (1984) 63–66 und die darin als Überblick über das Fachgebiet angegebenen Literaturzitate. Eine allgemeine Diskussion der T-Zell-Leukämie-Viren kann bei Marx, Science (1984) 224:475–477 gefunden werden. Levy et al., Science (1984) 225:840–842, berichten über die Isolierung von ARV (AIDS-assoziierten Retroviren).
Für die Zwecke dieser Anmeldung werden diese Viren (HTLV-III, LAV und ARV) generisch als humanes T-Zell-lymphotropes Retrovirus (hTLR) bezeichnet. Auf Grund der Ähnlichkeit ihrer Morphologie, ihrer Serologie, der Optima der Reversen Transkriptase und ihrer Cytopathologie, die in den oben angegebenen Literaturzitaten beschrieben werden, kann gezeigt werden, dass die hTLRs zur gleichen Klasse gehören. Die Reverse Transkriptase bevorzugt beispielsweise Mg²⁺ und hat ein pH-Optimum von etwa 7,8.
DNA-Klone, die HTLV-III-Sequenzen enthalten, sind in EP-A-0 173 529 und EP-A-0 185 444 offenbart. DNA-Klone, die LAV-Sequenzen enthalten, sind in EP-A-0 178 978 und WO 86/02383 offenbart.
Offenbarung der Erfindung
hTLR-DNA-Sequenzen, die hTLR-Proteine codieren, rekombinante Expressionsvektoren, die derartige Sequenzen enthalten, rekombinante hTLR-Polypeptide und diagnostische Tests, in denen derartige Polypeptide verwendet werden, werden bereitgestellt.
Spezifische erfindungsgemäße Aspekte sind in den Ansprüchen definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Restriktionskarte von proviraler DNA (ARV-2).
2 zeigt die Nucleotidsequenz von ARV-2(9B). Die Aminosäuresequenzen für die Produkte des gag-, des pol- und des env-Gens werden angegeben. Die U3-, die R- und die U5-Region der LTRs sind ebenfalls gekennzeichnet. Die Cap-Site ist die Position +1. Eine invertierte Sequenzwiederholung von3 bp an den Enden des LTR, die TA-TA-Box in der Position –29, die zu dem 3'-Ende der tRNA^lys komple mentäre Sequenz in der Position 183 und das Polyadenylierungssignal in der Position 9174 sind unterstrichen. Die Überstriche zeigen die Aminosequenzen an, die für Virusproteine ermittelt wurden. Die Nucleotide sind am Anfang jeder Zeile nummeriert, die Aminosäuren am Ende jeder Zeile.
3 enthält ein Flussdiagramm, das die Verfahrensschritte zur Erzeugung des Plasmids pGAG25-10 zeigt.
4 zeigt die Nucleotidsequenz des p25-gag-Gens, das in das Plasmid pGAG25-10 kloniert ist, und die Aminosäuresequenz, die durch dieses Gen codiert wird.
5 zeigt den codierenden Strang der Nucleotidsequenz, die in pGAG41-10 kloniert ist, für die Produktion des Fusionsproteins p41 gag und die entsprechenden Aminosäuren.
6 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das p16-gag-Protein von ARV-2 codiert, die in das Plasmid ptac5 kloniert wurde, um ein Expressionsplasmid für die Produktion des p16-gag-Proteins in Bakterien zu erzeugen.
7 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das ARV-2-env-Protein codiert, die für die Herstellung des Plasmids pDPC303 verwendet wurde.
8 zeigt eine Nucleotidsequenz, die das p31-Protein von ARV-2 codiert und die in dem Plasmid pTP31 enthalten ist.
Ausführungsformen der Erfindung
Die hTLR-DNA-Sequenzen, die entweder aus proviraler DNA oder cDNA isoliert und kloniert wurden oder synthetisiert wurden, können für die Expression von Polypeptiden verwendet werden, die ein Vorläuferprotein, das einer weiteren Prozessierung durch Spaltung unterzogen wird, oder ein vollständiges reifes Protein oder ein Fragment davon sein können. Die kleinste interessierende Sequenz, die eine Sequenz liefert, die eine Aminosäuresequenz codiert, die imstande ist, spezifisch an einen Rezeptor zu binden, z.B. ein Immunoglobulin, umfasst 21 bp, üblicherweise mindestens 45 bp, abgesehen vom Startcodon. Die Sequenz kann einen beliebigen größeren Teil eines Polypeptids oder das vollständige Polypeptid kodieren, oder kann flankierende Regionen eines Vorläuferpolypeptids einschließen, sie kann aber Teile von Sequenzen oder vollständige Sequenzen einschließen, die zwei oder mehrere verschiedene reife Polypeptide codieren. Die Sequenz umfasst üblicherweise weniger als etwa 5 kbp, noch üblicher umfasst sie weniger als etwa 3 kbp.
Sequenzen von besonderem Interesse, die offene Leserahmen aufweisen (5), stellen die Strukturgene für die gag-Proteine (p16 und p25), das env-Protein und das pol-Protein (p31) dar. Es wird darauf hingewiesen, dass die obigen Sequenzen unter Erhalt von anderen Sequenzen gespleißt werden können, die in dem Retrovirus vorhanden sind, so dass das 5'-Ende der Sequenz nicht die N-terminale Aminosäure des Expressionsproduktes codieren muss. Die Spleißstelle kann sich am 5'-Terminus des offenen Leserahmens oder innerhalb des offenen Leserahmens befinden. Das Startcodon für das Protein muss nicht das erste Codon für Methionin sein, sondern kann das zweite oder das dritte Methionin sein, so dass der Einsatz der oben angegebenen vollständigen Sequenz zu einem verlängerten Protein führen kann. Im Fall des gag-Gens und des env-Gens findet jedoch eine proteolytische Prozessierung in den Zellen von Säugetieren statt, die eine Entfernung von zusätzlichen Aminosäuren einschließen kann.
Für die Isolierung der verschiedenen Domänen kann das Provirus mit Restriktionsendonucleasen verdaut werden und können die Fragmente einer Elektrophorese unterzogen werden, und Fragmente, die eine geeignete Größe haben und mit einer Sonde, sofern verfügbar, einen Doppelstrang bilden, werden isoliert, in einen Klonierungsvektor kloniert und aus dem Vektor herausgeschnitten. Die Fragmente können dann für die Expression prozessiert werden. Überflüssige Nucleotide können von einem oder beiden Enden unter Durchführung eines Verdaus mit Bal31 entfernt werden. Durch Restriktionskartierung können geeignete Restriktionsstellen außerhalb oder innerhalb der codierenden Region lokalisiert werden. Primer-Reparatur oder in vitro-Mutagenese können eingesetzt werden, um einen Terminus festzulegen, für Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder Mehrfachmutationen oder dergleichen, wo Codons geändert werden können, entweder kryptisch oder unter Änderung der Aminosäure, Restriktionsstellen eingefügt oder entfernt werden können oder dergleichen. Wo Gene gekappt worden sind, können die verloren gegangenen Nucleotide unter Verwendung eines Adaptors ersetzt werden. Adaptoren sind besonders gut brauchbar für die Verbindung codierender Regionen, um den korrekten Leserahmen zu gewährleisten.
Die env-Domäne des hTLR-Genoms kann durch Verdau des Provirus mit EcoRI und KpnI und Reinigung eines Fragments aus 3300 Basenpaaren (bp) erhalten werden, wobei dieses Fragment etwa 400 by der 5'-nicht-codierenden Region und etwa 200 bp der 3'-nicht-codierenden Region enthält. Drei verschiedene Methionine, die durch die Sequenz am 5'-Ende des offenen Leserahmens codiert werden, können als Startstelle für die Translation verwendet werden.
Der Verdau von proviralen Sequenzen mit SacI und EcoRV liefert ein Fragment von etwa 2300 bp, das die gag-Domäne und einen zweiten kleinen offenen Leserahmen in Richtung des 3'-Endes der gag-Region enthält. Die gag-Domäne hat eine Länge von etwa 1500 bp und codiert ein großes Vorläuferprotein, das prozessiert wird, wodurch Proteine von etwa 25000 (p25), 16000 (p16) und 12000 (p12) Dalton erhalten werden. Der Verdau mit SacI und BglII kann ebenfalls verwendet werden, um ausschließlich die gag-Domäne mit der p12-, der p25- und einem Teil der p16-Region zu erhalten.
Der Verdau des Provirus mit KpnI und SstI liefert ein Fragment, das den Teil der pol-Domäne enthält, der p31 codiert.
Die Polypeptide, die durch die obigen DNA-Sequenzen exprimiert werden, können auf vielfältige Weise angewendet werden. Die Polypeptide oder deren immunologisch aktive Fragmente können als diagnostische Reagenzien, die in markierter oder nicht markierter Form oder in immobilisierter Form verwendet werden, als Impfstoffe, für die Herstellung monoklonaler Antikörper, z.B. hemmender Antikörper, o. dgl. eingesetzt werden.
Um die hTLR-Sequenz zu erhalten, kann das Virus aus dem Überstand infizierter Wirtszellen pelletiert werden. Eine RNA-Spezies von 9 kb wird durch Elektrophorese der viralen RNA in niedrig schmelzenden Agarosegelen, auf die eine Phenolextraktion folgt, gereinigt. Die gereinigte RNA kann dann mit Primern mit Zufallssequenz als Matrize in einer reversen Transkriptionsreaktion verwendet werden. Die resultierende cDNA wird dann einem Screening im Hinblick auf die Hybridisierung mit poly(A)⁺-RNA von infizierten und nicht infizierten Zellen unterzogen. Eine Hybridisierung, die bei infizierten Zellen, nicht jedoch bei nicht infizierten Zellen stattfindet, hängt mit hTLR zusammen.
Die genomische DNA infizierter Zellen kann mit einem Restriktionsenzym verdaut werden und für die Erzeugung einer Bakteriophagen- Bibliothek verwendet werden. Basierend auf der Restriktionsanalyse der zuvor erhaltenen Fragmente des Retrovirus kann das virale Genom partiell mit EcoRI verdaut werden und können DNA-Fragmente mit einer Größe von 9–15 kb isoliert werden und für die Erzeugung der Bibliothek eingesetzt werden. Der resultierende rekombinante Phage kann einem Screening unter Anwendung eines "Double-lift"-Screening-Verfahrens unterzogen werden, wofür die virale cDNA-Sonde eingesetzt wird, worauf eine weitere Reinigung, z.B. eine Plaque-Reinigung und die Vermehrung in großen flüssigen Kulturen folgen. Von der Bibliothek kann die vollständige Sequenz des Virus erhalten werden und mit der oben beschriebenen Sonde nachgewiesen werden.
hLTR-DNA (entweder Provirus oder cDNA) kann in jeden geeigneten Vektor kloniert werden. Konstrukte können hergestellt werden, die entweder ringförmig oder linear sind, für die die hTLR-DNA, entweder die vollständige hTLR-DNA oder Fragmente davon, mit einem Replikationssystem, das in einem als Wirt dienenden Mikroorganismus funktionsfähig ist, der entweder aus prokaryotischen oder eukaroyotischen Zellen (Säugetierzellen, Hefe, Arthropoden, Pflanzen) besteht, verknüpft wird. Als Wirte dienende Mikroorganismen schließen E. coli, B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, etc. ein. Replikationssysteme können von ColE1, 2 mμ Plasmid, λ, SV40, Rinderpapillomavirus o. dgl. abstammen, d.h. sowohl von Plasmiden wie auch von Viren. Neben dem Replikationssystem und der hTLR-DNA umfasst das Konstrukt üblicherweise auch einen oder mehrere Marker, die die Selektion transformierter oder transfizierter Wirte ermöglichen. Marker können Biozidresistenz, z.B. Resistenz gegen Antibiotika, Schwermetalle, etc., Komplementation in einem auxotrophen Wirt, um Prototrophie zu erreichen, u. dgl. einschließen.
Für die Expression werden Expressionsvektoren eingesetzt. Für die Expression in Mikroorganismen kann sich der Expressionsvektor vom Klonierungsvektor dadurch unterschieden, dass er regulatorische Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationssignalsequenzen aufweist, und er kann ein Replikationssystem einschließen oder auch nicht, das in dem Expressionswirt funktionsfähig ist. Die codierende Sequenz wird zwischen dem regulatorischen Initiationssignal und dem regulatorischen Terminationssignal insertiert, so dass sie unter deren regulatorischer Kontrolle stehen. Expressionsvektoren können außerdem die Verwendung regulierbarer Promotoren einschließen, z.B. von Promotoren, die temperatursensitiv oder durch Chemikalien induzierbar sind, oder Gene, die die Integration und Amplifikation des Vektors und der hTLR-DNA ermöglichen, wie tk, dhfr, Metallothionein o. dgl.
Der Expressionsvektor wird in einen geeigneten Wirt eingebracht, in dem die regulatorischen Signale funktionsfähig sind. Der Expressionswirt wird in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, wodurch das gewünschte Polypeptid erzeugt und aus den Zellen oder aus dem Medium, wenn das Polypeptid sezerniert wird, isoliert wird.
Wenn ein Wirt eingesetzt wird, in dem die regulatorischen hTLR-Transkriptionssignale und -Translationssignale funktionsfähig sind, kann die hTLR-DNA-Sequenz prozessiert werden, um für die Expression des gewünschten Polypeptids in geeigneter Anordnung zu den regulatorischen Signalen zu sorgen.
Die Polypeptidprodukte können in im wesentlichen reiner Form erhalten werden, insbesondere frei von Bruchstücken menschlicher Zellen, die Verunreinigungen, wie Proteine, Polysaccharide, Lipide, Nucleinsäuren, Viren, Bakteria, Pilze, etc. und Kombinationen dieser Verunreinigungen enthalten können. Im allgemeinen enthalten die Polypeptidprodukte weniger als etwa 0,1, üblicherweise weniger als etwa 0,01 Gew.-% an kontaminierenden Materialien des Expressionswirtes. In Abhängigkeit davon, ob das gewünschte Polypeptid im Cytoplasma produziert oder sezerniert wird, variiert die Art und Weise der Isolierung des Polypeptids. Wo das Produkt im Cytoplasma vorliegt, werden die Zellen geerntet, lysiert, das Produkt wird extrahiert und gereinigt unter Anwendung von Lösemittelextraktion, Chromatographie, Gelausschlußchromatographie, Elektrophorese o. dgl. Wo das gewünschte Produkt sezerniert wird, wird es aus dem Nährmedium extrahiert und nach einem der oben beschriebenen Verfahren gereinigt.
Die hTLR-DNA-Sequenzen können mit isotopischen oder nicht-isotopischen Labels oder Markern markiert werden und können als DNA-Sonden für den Nachweis des Vorhandenseins von nativen hTLR-Nucleotidsequenzen in Proben verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie diese Sequenzen enthalten.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und stellen keine Beschränkung dar.
EXPERIMENTELLER TEIL
1. Reinigung des AIDS-bezogenen Virus-2 (ARV-2) und Gewinnung von viraler RNA
HUT-78-Zellen, die mit ARV-2 infiziert sind (ATCC-Zugangsnummer CRL 8597, hinterlegt am 7. August 1984), wurden von Dr. Jay Levy, University of California, San Francisco, erhalten. Kulturen wurden zwei Wochen in RPMI-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum kultiviert. Die Kulturen wurden 1 h bei 4 °C und 2000 U/min unter Verwendung eines Rotors SW-28 zentrifugiert. Das Pellet, dass das Virus enthält, wurden in 10 mM Tris-HCL, ph 7,5, auf Eis erneut in Suspension gebracht. Das suspendierte Pellet wurde mit 10 μg DNase (Boehringer Mannheim) behandelt und auf einen linearen Saccharosegradienten geschichtet (15–50 % in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 20 mM NaCl). Der Gradient wurde 4 h bei 4 °C und bei 34000 U/min in einem Rotor SW-41 geschleudert. Fünf 2,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt, und ein Aliquot jeder Fraktion wurde einer Elektrophorese in einem 1%-Agarose-5-mM-Methylquecksilberhydroxid-Gel unterzogen (Bailey und Davidson, Anal. Biochem. (1976) 70:75-85), um zu ermitteln, welche Fraktion die 9 kb umfassende virale RNA enthielt. Die Fraktion, die die virale RNA enthielt, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 1 mM EDTA auf 10 ml verdünnt und 2 h bei 4 °C und 34000 zentrifugiert. Das Pellet wurde dann wieder in 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA, 0,1 % SDS und 200 μg/ml Proteinase K suspendiert. Die Inkubation wurde 15 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Gemisch wurde mit Phenol extrahiert, und die wässrige Phase wurde auf 400 mM NaCl eingestellt, wonach mit Ethanol gefällt wurde. Das Pellet wurde in Wasser suspendiert und bei –70 °C aufbewahrt.
Für die Reinigung der viralen DNA aus dem Nucleinsäurepellet, das wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde eine Probe einer Elektrophorese in einem niedrig schmelzenden 1%-Agarosegel, das 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielt, unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 0,1 % Ethidiumbromid gefärbt, und die Nucleinsäurebanden wurde mit UV-Licht sichtbar gemacht. Der Bereich, der 9 kb entsprach, wurde aus dem Gel herausgeschnitten, wonach die Agarose 2 bis 3 min bei 70 °C in drei Volumina 0,3 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA geschmolzen wurde. Das Gemisch wurde mit einem gleich großen Volumen Phenol extrahiert. Die wässrige Phase wurde erneut mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde mit kaltem 95-%igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet, erneut in Wasser suspendiert und bis zur Verwendung bei –70 °C aufbewahrt. 100 ml Kulturmedium ergaben 0,5 bis 1 μg gereinigte DNA.
2. Synthese einer markierten homologen viralen Sonde
Eine ³²P-markierte cDNA zu der durch Reinigung aus dem Gel erhaltenen viralen RNA wurde unter Verwendung von Primern mit Zufallssequenz (Kalbsthymusprimer) erzeugt, die wie in Maniatis et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. 1982, beschrieben, hergestellt wurde(n). Das Reaktionsgemisch enthielt 2 μl 0,5 M MgCl₂, 5 μl 0,1 M Dithiothreit, jeweils 2,5 μl 10 mM dATP, 10 mM dGTP und 10 mM dTTP, 2,5 μl Kälberthymusprimer (100A₂₆₀/ml), 0,5 μ virale DNA, 5 μl Actinomycin D (200 μg/ml), 10 μl ³²P-dCTP (> 3000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) und 1 μl AMV-Reverse-Transkriptase (17 Einheiten/ μl) in einem 50-μl-Reaktionsvolumen. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Sonde wurde von den freien Nucleotiden durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G50-Säule getrennt. Das Lückenvolumen wurde aufgefangen, NaCl wurde bis zum Erhalt einer Endkonzentration von 400 mM, einzelsträngige Träger-DNA bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben, und die cDNA wurde mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde dann wieder suspendiert, und die Zählrate auf Grund von eingebautem ³²P wurde ermittelt.
3. Nachweis von ARV-Sequenzen in Poly(A)⁺-RNA, gewonnen aus infizierten HUT-78-Zellen.
Poly(A)⁺-RNA wurde aus HUT-78-Zellen, die mit ARV-2, ARV-3 oder ARV-4 (drei verschiedene Isolate von drei verschiedenen AIDS-Patienten) infiziert waren, und aus nicht infizierten HUT-78-Zellen gewonnen. Die Poly(A)⁺-RNA wurde einer Elektrophorese auf 1 %- Agarosegelen, die 5 mM Methylquecksilberhydroxid (Bailey und Davidson, siehe oben) enthielten, unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit der homologen Sonde hybridisiert, die wie in Abschnitt 2 beschrieben hergestellt wurde. Die Hybridisierungen wurden in 50 % Formamid, 3 × SSC bei 42 °C durchgeführt. Waschschritte wurde bei 50 °C in 0,2 × SSC durchgeführt. Für alle drei Proben infizierter HUT-78-Zellen wurde eine 9 kbp-Bande gefunden. Diese Bande fehlte in der Poly(A)⁺-RNA der nicht infizierten Zellen.
4. Nachweis von ARV-Sequenzen in infizierten und nicht infizierten HUT-78-Zellen.
DNA mit hohen Molekulargewicht (chromosomale DNA) wurde aus Kulturen von HUT-78-Zellen, die mit ARV-2 infiziert waren, und aus Kulturen von nicht infizierten HUT-78-Zellen unter Befolgung des Verfahrens von Luciw et al., Molec. and Cell Biol. (1984) 4:1260–1269 gewonnen. Die DNA wurde mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut, einer Elektrophorese in 1%-Agarosegelen unterzogen und unter Befolgung der von Southern beschriebenen Methode (1975), siehe oben, auf Nitrocellulose durch Blotting übertragen. Die Blots wurden mit der ³²P-markierten Sonde 36 h bei 42 °C in einem Gemisch hybridisiert (106 cpm/Blot), das 50 % Formamid, 3 × SSC, 10 mM Hepes, pH 7,0, 100 μg/ml denaturierte Träger-DNA, 100 μg/ml Hefe-RNA und 1 × Denhardt's enthielt. Die Filter wurden einmal bei Raumtemperatur in 2 × SSC und zweimal bei 42 °C in 0,2 × SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Die Filter wurden an der Luft getrocknet und einem X-Omat-Film unter Verwendung einer Verstärkerfolie ausgesetzt.
Die zu ARV-2 homologe ³²P-Sonde hybridisierte spezifisch mit zwei Banden der DNA von infizierten Zellen, die mit SacI gespalten wurde.
Diese Banden fehlten, wenn die DNA von nicht infizierten Zellen verwendet wurde, was darauf hinweist, dass die Sonde spezifisch mit infizierten Zellen hybridisiert, wahrscheinlich mit dem Provirus, das in die chromosomale DNA integriert ist. Das Molekulargewicht der Banden beträgt etwa 5 kb und 3 kb.
Um zu ermitteln, ob andere Enzyme die provirale Sequenz spalten, wurden weitere Spaltungen mit Restriktionsenzymen unter Verwendung von EcoRI, SphI oder KpnI oder doppelte Spaltungen, für die zwei der hier genannten Enzyme verwendet wurden, durchgeführt. Die Southern-Blots zeigen spezifische Banden, die hybridisieren, wenn die DNA von infizierten Zellen verwendet wird. 1 zeigt eine schematische Karte der Positionen von Restriktionsenzymstellen in der proviralen Sequenz und gibt Fragmentbereiche an.
5. Klonierung von proviraler ARV-2-DNA
Zell-DNA mit hohem Molekulargewicht aus infizierten HUT-78-Zellen wurde unter Befolgung des Verfahrens von Luciw et al., siehe oben, gewonnen. Die DNA wurde mit EcoRI verdaut, die einmal in dem Provirus schneidet, in einem Saccharosegradienten zentrifugiert, und Fraktionen, die 8–15 kb entsprechen, wurden gesammelt, einer Dialyse unterzogen und durch Ethanolfällung aufkonzentriert. Der vom λ-Bakteriophagen abgeleitete Klonierungsvektor EMBL-4 (Karn et al., Methods Enzymol (1983) 101:3–19) wurde vollständig mit einem Gemisch der Restriktionsenzyme EcoRI, BamHI und SalI verdaut, und dann wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion die Proteine von der DNA entfernt, wonach die DNA mit kaltem Ethanol gefällt und in einem Ligationspuffer erneut suspendiert wurde. Die EMBL-4-Phagen-DNA und das Produkt des Verdaus der zellulären DNA mit EcoRI wurden gemischt und ligiert, und die resultierenden rekombinanten Phagengenome wurden in vitro verpackt. Nach der Phageninfektion von λ-sensitivem E. coli (DP50supF) wurden etwa 500 000 Phagenplaques auf Nitrocellulosefilter übertragen, die DNA wurde fixiert und die Filter wurden einem Screening mit einer homologen ³²P-Sonde unterzogen, die wie in Abschnitt 2 beschrieben hergestellt wurde. Elf rekombinate Phagen von 500 000 Phagen reassoziierten in dem zunächst durchgeführten "Double-lift"-Screening-Verfahren (Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, NY, 1982) mit der viralen cDNA-Sonde, diese Phagen wurden Plaque-gereinigt und in großen flüssigen Kulturen für die Gewinnung der rekombinanten DNA vermehrt. Plaque-gereinigte Phagen, die ARV-DNA enthalten, wurden in flüssiger Kultur in E. coli DP50supF vermehrt; die Phagenpartikel wurden geerntet und in CsCl-Gradienten in Form von Banden erhalten, und die rekombinante Phagen-DNA wurde durch Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung gewonnen (Maniatis et al., siehe oben). 1 μg gereinigte Phagen-DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut, einer Elektrophorese auf 1%-Agarosegelen unterzogen und mit Ethidiumbromid unter Ultraviolettlicht sichtbar gemacht. Die DNA dieser Gele wurde auf Nitrocellulose übertragen, wo man sie mit der viralen cDNA-Sonde reassoziieren lässt.
Einer der 11 Phagen, der als λ ARV-2(9B) bezeichnet wird, wurde bei der ATCC am 25. Januar 1985 hinterlegt und hat die Zugangsnummer 40158 erhalten. λ ARV-2(9B) enthält eine Insertion, die aus der proviralen DNA voller Länge zusammen mit flankierenden Zellsequenzen besteht. Der Verdau von λ ARV-2(9B)-DNA mit SacI lieferte Fragmente der viralen DNA von 3,8 kb und 5,7 kb. Der EcoRI-Verdau von λ ARV-2(9B) führte zu virushaltigen DNA-Stücken bei 6,4 kb und 8,0 kb; der doppelte Verdau mit SacI und EcoRI ergab Fragmente der viralen DNA bei 3,8 kb und 5,4 kb. Dieses Muster stimmt mit dem Muster eines Provirus überein, das an zelluläre DNA gebunden ist.
Zusätzlich zu λ ARV-2(9B) wurden erhalten: (1) ein Phage (λ ARV-2(8A)), der die linke Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle in der viralen DNA sich erstreckend bis in die flankierende Zell-DNA aufweist, und (2) ein Phage (λ ARV-2(7D)), der die rechte Hälfte des viralen Genoms von der EcoRI-Stelle in der viralen DNA sich erstreckend in die flankierende Zell-DNA aufweist. Die Bakteriophagen λ ARV-2(7D) (rechts) und λ ARV-2(8A) (links) wurden bei der ATCC am 26. Oktober 1984 hinterlegt und haben die Zugangsnummern 40143 bzw. 40144 erhalten.
6. Polymorphismus
Zur Messung des Grades der Verwandtschaft unabhängiger ARV-Isolate wurden die mit Restriktionsenzymen erhaltenen Spaltprodukte der DNA von HUT-78-Zellen, die mit ARV-3 und ARV-4 infiziert waren, mit der Sonde analysiert, die aus klonierter ARV-2-DNA hergestellt wurde. Der SacI-Verdau von ARV-3 DNA ähnelte dem Verdau von ARV-2, wohingegen die mit HindIII erhaltenen Spaltprodukte voneinander abweichende Muster zeigten. Der SacI-Verdau und der PstI-Verdau von ARV-4-DNA unterschied sich vom entsprechenden Verdau von ARV-2 DNA. Die Intensität der infolge der Reassoziation erhaltenen Signale, die mit der ARV-3- und der ARV-4-Probe erhalten wurden, war wesentlich schwächer (in etwa 10-fach schwächer) als das Signal für ARV-2 DNA, was wahrscheinlich daran lag, dass in den ARV-3- und ARV-4-Kulturen weniger Zellen infiziert wurden. Die virusspezifischen DNA-Fragmente, die durch die Behandlung von ARV-3- und ARV-4-DNA mit SacI erhalten wurden, hatten ein Gesamtgewicht von 9,0–9,5 kbp, was einen Wert darstellt, der dem Wert von ARV-2 ähnelt und mit der Größe der RNA-Genome im Einklang steht.
7. Sequenzierung von proviraler DNA
Fragmente oder Subfragmente von ARV-2-DNA aus dem λ-Phagen 9B wurden hergestellt und unter Anwendung herkömmlicher Verfahren (Maniatis et al, siehe oben) in M13 kloniert. Die Sequenzierung wurde gemäß Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74:5463, unter Verwendung des Universalprimers für M13 oder von chemisch synthetisierten Primern, die komplementär zur ARV-2-Sequenz sind, durchgeführt. Die Sequenz wird in 2 gezeigt.
8. Produktion des env-Proteins von ARV-2 durch Hefe
A. Wirt-Vektor-System
Ein partielles env-Protein wird durch S. cerevisiae 2150-2-3 synthetisiert, die mit dem Plasmid pDPC303 transformiert ist. Das Plasmid pDPC303 ist ein Hefeexpressionsvektor, der die Sequenz, die 2/3 des env-Proteins codiert, sowie pBR322-Sequenzen einschließlich des amp^R-Gens und 2-Mikron-Sequenzen einschließlich des leu 2-04-Gens enthält. Die Expression von env erfolgt unter Regulation durch die Hefepyruvatkinase-Promotor-Sequenz und -Terminator-Sequenz. Der Hefestamm S. cerevisiae 2150-2-3 weist den folgenden Genotyp auf: Mat a, ade 1, leu 2–112, cir°. Dieser Stamm wurde von Dr. Leland Hartwell, University of Washington, zur Verfügung gestellt.
B. Konstruktion von pDPC303, eines Hefeexpressionsvektors für das env-Protein.
Das Plasmid pDPC303 enthält eine "Expressionskassette" (Beschreibung weiter unten) für env, die in die BamHI-Stelle des Vektors pCl/1 kloniert ist. Der Vektor pCl/1 enthält pBR322- und 2-MiKron-Sequenzen einschließlich des amp^R-Markers und des Hefe-leu-2-04-Markers. Er wurde aus pJDB219d (Beggs, Nature (1978) 275:104) erzeugt, indem die pMB9-Region durch pBR322-Sequenzen ersetzt wurde.
Die "Expressionskassette" für env besteht aus den folgenden in dieser Reihenfolge (5' nach 3') miteinander verknüpften Sequenzen: Hefe-Pyruvatkinase-(PYK)-Promotor, env-cDNA und PYK-Terminator. Die PYK-Promotorregion und die PYK-Terminatorregion wurden aus PYK-cDNA entnommen, die wie in Burke et al. J. Biol. Chem. (1983) 258:2193–2201 beschrieben isoliert wurde.
Das in die Expressionskassette klonierte env-Fragment wurde aus der cDNA von ARV-2 entnommen und umfasst ein cDNA-Fragment von 1395 bp, das die env-Aminosäurereste codiert, die durch die NT 5857 bis NT 7251 (2) codiert werden, es gibt 5 zusätzliche Codons, die in den Leserahmen am 5'-Ende eingesetzt sind, wobei das erste Codon einem Methionin entspricht, und 4 zusätzliche Codons, die in den Leserahmen am 3'-Ende eingesetzt sind, auf die ein Stopcodon folgt. Die zusätzlichen Codons wurden ausschließlich eingebaut, um die Klonierungsschritte zu erleichtern.
7 zeigt den codierenden Strang der Nucleotidsequenz, die in pDPC303 kloniert wurde, und die sich daraus ableitende Aminosäuresequenz. DNA-Sequenzen, die in der Figur nicht unterstrichen sind, stammen unmittelbar von der oben beschriebenen ARV-2(9B)-cDNA ab. Alle anderen Sequenzen wurden entweder chemisch synthetisiert oder stammen vom PYK-Vektor ab.
C. Herstellung des 2150 (pDPC303) Stammes
Hefezellen S. cerevisiae 2150-2-3 (Mat a, ade 1, leu 2-04, cir°) wurden wie von Hinnen et al. (PNAS (1978) 75:1929–1933) beschrieben transformiert und auf leu-selektive Platten plattiert. Einzelne Kolonien wurden in leu-selektive Medien geimpft und bis zur Sättigung gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet, und das env-Protein wurde wie unten beschrieben gereinigt und charakterisiert.
D. Reinigung und Charakterisierung des env-Proteins.
D.1. Zellaufschluss
Gefrorene S. cerevisiae 2150-2-3 (pDPC303) werden aufgetaut und in 1 Volumen Lysepuffer (1 μg/ml Pepstatin, 0,001 M PMSF, 0,001 M EDTA, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 8,0) suspendiert, wozu 1 Volumen säuregewaschene Glaskügelchen gegeben werden. Die Zellen werden in einem nicht-kontinuierlichen System 10 min unter Verwendung einer 300 ml-Glaseinheit von Dyno Mill bei 3000 U/min zerstört. Der Mantel wird mit einer Ethylenglykollösung mit einer Temperatur von –20 °C gekühlt. Die Glaskügelchen werden dekantiert, nachdem man das Gemisch 3 min auf Eis stehen gelassen hat. Der Zellextrakt wird aufgenommen und 35 min bei 18000 U/min (39200 × g) zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und der Niederschlag (Pellet 1) wird wie unten angegeben weiter behandelt.
D.2. SDS-Extraktion von unlöslichem Material
Das Pellet 1 wird in 4 Volumina Tris-HCl-Puffer (0,01 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 M NaCl, 0,001 M PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 0,001 M EDTA, 0,1 % SDS) erneut suspendiert und 2 h bei 4 °C unter Rühren extrahiert. Die Lösung wird 15 min bei 6300 g zentrifugiert. Die unlösliche Fraktion (Pellet 2) wird in 4 Volumina (360 ml) PBS (pro Liter: 0,2 g KCl, 0,2 g KH₂PO₄, 8,0 g NaCl, 2,9 g Na₂HPO₄·12 H₂O), 0,1 % SDS, 0,001 M EDTA, 0,001 M PMSF, 1 μg/ml Pepstatin erneut suspendiert und 12 h bei 4 °C unter Rühren in einem Schüttelgerät für Röhrchen extrahiert. Die Lösung wird 15 min bei 6300 g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird für die weitere, unten beschriebene Reinigung aufgenommen. (Das Pellet kann erneut extrahiert werden, indem es in 4 Volumina 2,3 % SDS, 5 % β-Mercaptoethanol suspendiert wird und 5 min unter Sieden erhitzt wird. Nach dem Sieden wird die Lösung 15 min bei 6300 g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird für die weitere Reinigung aufgenommen.)
D.3. Selektive Fällung und Gelfiltration
Die lösliche Fraktion wird durch Fällung mit 30 % Ammoniumsulfat bei 4 °C aufkonzentriert. Das Pellet (Pellet 4) wird in 2,3 % SDS, 5 % β-Mercaptoethanol erneut suspendiert und auf einer AA 34 (LKB Products) Gelfiltrationssäule chromatographiert. Die Säule wird mit PBS, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur äquilibriert. Die Chromatographie wird in der gleichen Lösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,3 ml/min durchgeführt. Fünf ml-Fraktionen werden gesammelt und vereinigt und durch Protein-Gelelektrophorese, Western-Analyse und ELISA charakterisiert. Falls erforderlich werden die vereinigten Fraktionen durch Vakuumdialyse auf Spectrapor #2 (MG-Schwelle 12–14 k) aufkonzentriert.
D.4. Charakterisierung von rekombinantem env
Die SDS-Polyacrylamidgeld-Analyse (12 % Acrylamidgele) zeigte, dass in den Hefezellen, die mit dem env-enthaltenden Vektor transformiert wurden, ein neues 55000-Dalton-Protein synthetisiert wurde. Das 55000-Dalton-Protein fehlt bei den Zellen, die mit dem Kontrollplasmid transformiert wurden (Vektor ohne die env-Insertion). Die Identität von env wurde sowohl durch ELISA (siehe 9.E.4.c) und Western-Analyse unter Verwendung des Serums von AIDS-Patienten bestätigt. In beiden Tests zeigte das 55000-Dalton-Protein eine immunologische Reaktivität. Keine Reaktivität wurde mit dem Serum gesunder Menschen erhalten.
Rekombinantes env wurde auch in Säugetierzellen (Cos) exprimiert.

Claims

Isoliertes DNA-Polynucleotid, das ein Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region oder der env-Region der RRV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst, mit der Maßgabe, dass das DNA-Polynucleotid nicht ist: (a) Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH10 (ATCC 40125); (b) erhältlich durch Verdau von Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH10 (ATCC 40125) mit SstI, HindIII, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI, Xhol und/oder Hpal; (c) Klon λJ19 (CNCM I-338); oder (d) erhältlich durch Verdau von Klon λJ19 (CNCM I-338) mit HindIII, SacI, BamHI, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI und/oder XhoI.
Isoliertes DNA-Polynucleotid, das ein Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region oder der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst, wobei das DNA-Polynucleotid einen nicht-isotopischen Marker trägt, mit der Maßgabe, dass das DNA-Polynucleotid nicht ist: (a) Klon λJ19 (CNCM I-338); oder (b) erhältlich durch Verdau von Klon λJ19 (CNCM I-338) mit HindIII, SacI, BamHI, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI und/oder XhoI.
Isoliertes DNA-Polynucleotid, das ein Fragment von 21 bis 45 bp aus der gag-Region oder der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst.
Polynucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung als DNA-Sonde.
DNA- Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das DNA-Polynucleotid ein Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst.
DNA- Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das DNA-Polynucleotid ein Fragment von mindestens 21 bp aus der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst.
DNA- Polynucleotid nach Anspruch 1, 3, 4, 5 oder 6, wobei das DNA-Polynucleotid markiert ist.
DNA- Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei das DNA-Polynucleotid mit einem isotopischen Marker markiert ist.
DNA- Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei das DNA-Polynucleotid mit einem nicht-isotopischen Marker markiert ist.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von HIV-Nucleotidsequenzen in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie HIV-Nucleotidsequenzen enthält, das den Schritt umfasst, die Probe mit einem DNA- Polynucleotid in Kontakt zu bringen, das ein Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region oder der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst, mit der Maßgabe, dass das DNA-Polynucleotid nicht ist: (a) Klon λJ19 (CNCM I-338); oder (b) erhältlich durch Verdau von Klon λJ19 (CNCM I-338) mit HindIII, SacI, BamHI, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI und/oder XhoI.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Polynucleotid ein Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Polynucleotid ein Fragment von mindestens 21 bp aus der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das DNA-Polynucleotid markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das DNA-Polynucleotid mit einem isotopischen Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das DNA-Polynucleotid mit einem nicht-isotopischen Marker markiert ist.
Isoliertes Polynucleotid mit einem Fragment von mindestens 21 bp aus der viralen Insertion in λARV-2(7D) (ATCC 40143) oder λARV-2(8A) (ATCC 40144), mit der Maßgabe, dass das Polynucleotid nicht ist: (a) Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH 10 (ATCC 40125); (b) erhältlich durch Verdau von Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH 10 (ATCC 40125) mit SstI, HindIII, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI, XhoI und/oder HpaI; (c) Klon λJ19 (CNCM I-338); oder (d) erhältlich durch Verdau von Klon λJ19 (CNCM I-338) mit HindIII, SacI, BamHI, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI und/oder XhoI.
Isoliertes Polynucleotid mit einem Fragment von 21 bis 45 bp aus der viralen Insertion in λARV-2(7D) (ATCC 40143) oder λARV-2(8A) (ATCC 40144), mit der Maßgabe, dass das Polynucleotid nicht ist: (a) Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH 10 (ATCC 40125); (b) erhältlich durch Verdau von Klon BH5 (ATCC 40126), Klon BH8 (ATCC 40127) oder Klon BH10 (ATCC 40125) mit SstI, HindIII, PstI, BglII, KpnI, E coRI, SalI, XhoI und/oder HpaI; (c) Klon λJ19 (CNCM I-338); oder (d) erhältlich durch Verdau von Klon λJ19 (CNCM I-338) mit HindIII, SacI, BamHI, PstI, BglII, KpnI, EcoRI, SalI und/oder XhoI.
Verfahren zur Herstellung eines isolierten DNA-Polynucleotids mit einem Fragment von mindestens 21 bp aus λARV-2(7D) (ATCC 40143) oder λARV-2(8A) (ATCC 40144), wobei das DNA-Polynucleotid mindestens teilweise chemisch synthetisiert wird.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 16, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 17, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der gag-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 17, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der pol-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 23, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der p31-pol-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der pol-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Fragment von mindestens 21 bp aus der p31-pol-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 stammt.
Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aus der env-Region von 2 umfasst, wobei die Aminosäuresequenz durch ein Fragment von mindestens 45 bp aus der env-Region der ARV-2-Sequenz gemäß 2 codiert wird.