DE68927665T2 - Von synthetischer DNS abgeleitete rekombinante HIV-1-Antigene - Google Patents
Von synthetischer DNS abgeleitete rekombinante HIV-1-AntigeneInfo
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Description
- VON SYNTHETISCHER DNS ABGELEITETE REKOMBINANTE HIV-1-ANTIGENE
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes HIV-(Humanimmunschwächevirus) Antigen. Ein rekombinantes Antigen, das durch molekulares Klonieren und durch Expression einer synthetischen DNA-Sequenz der verschiedenen HIV-Antigene in einem heterologen Expressionssystem abgeleitet worden ist, kann als Reagenz für den Nachweis von Antikörpern und Antigen in Körperflüssigkeiten von Individuen, die unterschiedlichen HIV-Isolaten ausgesetzt waren, verwendet werden.
- Die Nucleotidsequenz des proviralen Genoms wurde für viele HIV-Isolate ermittelt, einschlieblich den HIV-1-Stämmen HTLV-III (Ratner et al., Nature (1985) 313:277); ARV-2 (Sanchez- Pescador et al., Science (1985) 227:484); LAV (Wain-Hobson et al., Cell (1985) 40:9); und CDC-451 (Desai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8380). Von der Nucleotidsequenz des HIV-2 RCD Isolates wurde von Guyader et al. (Nature (1987) 326:662) berichtet.
- HIV-Antigene wurden bislang aus dem in Gewebekulturen gezogenen Virus oder aus einem molekular geklonten genomischen Fragment, das in heterologen Wirten wie etwa Escherichia coli exprimiert worden war, erhalten. Der aus Gewebekulturen abgeleitete Virus erfordert das beschwerliche und oft schwierige Verfahren des Züchtens von virusinfizierten Zellen unter streng sterilen Bedingungen. Weiterhin ist der aus Gewebekulturen abgeleitete Virus infektiös und daher gefährlich für die Gesundheit der Individuen, die mit seiner Erzeugung und Reinigung befabt sind. Die Expression von molekular geklonten HIV-genomischen Fragmenten überwindet das Problem mit der Gefahr für Lebewesen. Im allgemeinen wird ein HIV-genomisches Fragment eines einzelnen HIV-Isolats mit Säugercodons in einem heterologen System wie etwa Bakterien oder Hefe exprimiert, und es ist auf den Einsatz von verfügbaren Restriktionsstellen, die auf dem viralen Genom zur Klonierung und zur Expression vorhanden sind, beschränkt.
- Es war schwierig, für einige der HIV-Proteine wie das HIV-1-Hüllenantigen-gp41 ["HIV-1 env antigen gp41"] eine Expression in heterologen Systemen zu erhalten. Einige Forscher haben versucht, die hydrophoben Regionen des HIV-1-gp41 zu löschen, um die Expressionspegel zu erhöhen. Die UK Patentanmeldung GB 2188639 beschreibt ein HTLV-III-gag/env- Genprotein, worin die im env-Fragment der DNA-Sequenz gelöschten Codons der ersten hydrophoben Region des gp41-Proteins entsprechen. Das US Patent Nr. 4 753 873 beschreibt ein Peptidfragment für das eine Nukleotidsequenz codiert, wobei die Nukleotide, die für eine erste und zweite hydrophobe Region des HTLV-III-gp41 codieren, gelöscht sind.
- Eine schlechte Expression kann das Ergebnis vieler Faktoren sein, einschließlich der spezifischen Nukleinsäuresequenz des Gens, das exprimiert werden soll, die Säugercodons der zu exprimierenden Sequenz können nicht effizient transcribiert und in einem bestimmten heterologen System übersetzt werden, und einschließlich der Sekundärstruktur der transcribierten Messenger-RNA. Der Einsatz von synthetischen DNA-Fragmenten kann die Expression in heterologen Systemen erhöhen.
- Ein rekombinantes Antigen, welches durch molekulares Klonieren und durch Expression einer synthetischen DNA-Sequenz in heterologen Wirten abgeleitet ist, wird zur Verfügung gestellt. Weiterhin wird eine synthetische DNA-Sequenz, die für das rekombinante Antigen der Erfindung codiert, zur Verfügung gestellt. Die synthetische DNA-Sequenz, die zur Expression von verschiedenen HIV-Antigenen ausgewählt worden ist, basiert auf der Aminosäuresequenz von entweder einem einzigen Isolat oder mehreren Isolaten und ist für die Expression in Escherichia coli durch spezifische Codonselektion optimiert. Die synthetische DNA-Sequenz ergibt eine höhere Expression des besonderen Antigens, für das sie codiert. Dieses Antigen kann virale Antigene ersetzen, die aus einer Gewebekultur zum Einsatz als diagnostische und therapeutische Reagenzied abgeleitet sind.
- Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um HIV- Transmembranhüllengene von voller Länge zu synthetisieren, bei Verwendung von bakteriellen Codons. Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt die Knüpfung von Sequenzen, die als einzelne Proteine schlecht exprimiert werden, an Sequenzen, die mit einer hohen Effizienz exprimiert werden. Die Kombination der Sequenz der gesamten codierenden Region eines Gens eines Virus mit codierenden Sequenzen eines anderen Gens von einem unterschiedlichen Virus zur Erzeugung eines Fusionsproteins kann bewerkstelligt werden. Die so exprimierten Fusionsproteine weisen als einzigartigen Vorteil antigenische Epitopen von zwei viralen Antigenen auf.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ein synthetisches Gen von voller Länge Gen (FSG, "full length synthetic gene") für HIV-1-Transmembranglycoprotein (TMP).
- Figur 1 zeigt die Abfolge der für das TMP-Fragment codierenden Aminosäurereste Nr. 552-668 von HIV-1 mit den Sequenzen der vier unterschiedlichen Isolate, die verwendet werden, um die Aminosäuresequenz von B52-10 abzuleiten.
- Figur 2 zeigt das Zusammensetzen von 16 Oligonukleotiden, um das synthetische TMP-Fragment von Figur 1 auszubilden, und seine Klonierung in PUC18, bezeichnet als B52-10.
- Figur 3 zeigt die DNA und Aminosäuresequenz von FSG, und zeigt die Restriktionsstellen und Subfragmente an, die zum Zusammensetzen verwendet werden.
- Figur 4 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenz, die zur Entwicklung des synthetischen HIV-1-Hüllengens mit bekannten Aminosäuresequenzen aus 13 unabhängigen Isolaten verwendet wird, unter Angabe aller von Linkem abgeleiteten Sequenzen (+) und Aminosäuresubstitutionen (*).
- Figur 5 ist ein schematisches Diagramm des Zusammensetzens und der Klonierung der hauptsächlichen Subfragmente, um FSG in pUC18 auszubilden.
- Figur 6 ist ein schematisches Diagramm der Klonierung von FSG in Lambda-pL-Expressionsvektoren, um pSD301 und pSD302 zu erzeugen.
- Figur 7 zeigt die Aminosäuresequenzen von pSD301 und pSD302, unter Angabe aller von Linkem abgeleiteten Sequenzen (+) und Aminosäuresubstitutionen (*).
- Figur 8 zeigt die Ergebnisse der Expressionsanalyse von pSD301 und P5D302. A) Coomassie-gefärbtes Gel; B) Immunoblot unter Einsatz von AIDS-Patientenseren.
- Synthetische DNA-Fragmente des HIV-Genoms können basierend auf deren korrespondierenden Aminosäuresequenzen synthetisiert werden. Indem die spezielle Region von Interesse zwischen unterschiedlichen Isolaten verglichen wird, kann eine Sequenz ausgewählt werden, die sich von jeder Sequenz, die in der Natur existiert, unterscheidet, weil die Sequenz eine Zusammenstellung der Seqüenzen aus verschiedenen Isolaten ist. Zum Beispiel basiert das synthetische HIV-1-Hüllenprotein, das in Beispiel 1 beschrieben ist, auf den Aminosäuresequenzen von vier unterschiedlichen RIV-1-Isolaten, nämlich, HTLV-IIIB, LAV- 1, ARV-2 und CDC-451.
- Andere Eigenschaften können in die Sequenz eingebaut werden. Beispielsweise können Codons zur optimalen Expression in Bakterien oder Hefe eingeschaltet werden, es können spezifische Restriktionsstellen eingeführt werden, und es können andere Restriktionsstellen entfernt werden. Zusätzlich sollte die Sequenz spezifische Restriktionsstellen sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Fragments besitzen, um die Klonierung in einem bestimmten Vektor zu erleichtern. Synthetische DNA-Fragmente können wie folgt synthetisiert werden: (1) Auswählen einer einzigartigen Proteinsequenz, (2) Reverse Translation, um die komplementäre DNA-Sequenz zu ermitteln, (3) Optimierung der Codons für die Expression in Bakterien oder Hefe, und (4) die Einführung und/oder Entfernung spezifischer Restriktionsstellen.
- Die Tatsache, daß einündsechzig unterschiedliche Nukleotidcodons für 20 Aminosäure codieren wird als die Degeneration des genetischen Codes bezeichnet. Die Forschung hat die Häufigkeiten der Codons ermittelt, die in Nukleinsäuren sowohl in eukaryontischen als auch prokaryontischen Organismen auftreten. (Grantham et al., Nucleic Acids Res. [1980] 9:r43, Gouy et al., Nucleic Acids Res. [1982] 10:7055; Sharp et al., Nucleic Acids Res. [1986] 14:7737.) Sequenzen aus dem gesamten E. coli Genom, mit Beispielen für Sequenzen aus dem Chromosom, den Transposonen und Plasmiden, wurden analysiert. Diese Sequenzen codieren für strukturelle Proteine, Enzyme und regulatorische Proteine. Es wurde eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der Codonbevorzugung innerhalb eines bestimmten Gens und dem Expressionsniveau des Gens aufgezeigt.
- Es ist vorzuziehen, daß das gleiche Codontriplet für jede spezielle Aminosäure der synthetischen DNA-Sequenz verwendet wird. Jedoch können alternative Codons verwendet werden, um eine bestimmte Restriktionsstelle hinzuzufügen oder herauszuschneiden. Die Sequenz sollte einzigartige Restriktionsstellen einschließen, welche verwendet werden können, um ein spezifisches Fragment oder eine Sequenz herauszuschneiden, oder um eine bestimmte Sequenz im Falle eines Fehlers bei der ursprünglichen Synthese zu ersetzen.
- Die Vektorsysteme, die verwendet werden können, umfassen pflanzliche, bakterielle, Hefe-, Insekten- und Säugerexpressionssysteme. Es ist vorzuziehen, daß die Codons für die Expression in dem verwendeten System optimiert sind. Die Proteine und Polypeptide, die von der Erfindung geliefert werden, und die in heterologen Systemen geklont und exprimiert sind, wie oben beschrieben, können für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden.
- Ein bevorzugtes Expressionssystem verwendet das Lambda- pL-Vektorsystem. Dieses Expressionssystem weist die folgenden Merkmale auf: (1) einen starken Lambda-pL-Promotor, (2) einen starken drei-Raster-Translationsterminator rrnBt1, und (3) die Translation beginnt an einem ATG-Codon, acht Basenpaare von der Ribosomenbindungsstelle, die innerhalb einer zugänglichen Ncol- Restriktionsstelle lokalisiert ist.
- Ein weiterer Vorteil des Expressionssystems der vorliegenden Erfindung ist, daß man die synthetischen DNA- Fragmente so anpassen kann, daß sie spezifische DNA-Sequenzen enthalten, die Proteine mit erwünschten Aminosäuresequenzen exprimieren, und daß weiterhin die Möglichkeit der Hinzufügung anderer DNA-Sequenzen an entweder dem 5'- oder dem 3'-Ende erlaubt wird, um den Transfer von synthetischen Fragmenten in zahlreiche Vektoren zu erleichtern.
- Zusätzlich kann der Einsatz von bestimmten Restriktionsstellen an beiden Enden des Fragments ebenfalls den Einbau des Fragments in andere Sequenzen erleichtern, um Fusionsproteine zu erzeugen, welche ebenfalls als diagnostische oder therapeutische Reagenzien verwendet werden können. Beispielsweise kann die HIV-1-gp4l-Sequenz innerhalb oder am Ende eines Kern/Oberflächenantigens der Hepatitis-B-Virus- Sequenz eingebaut werden, um ein Fusionsprotein auszubilden, das in einem einzigen Assayscreeningsystem für den Nachweis von sowohl AIDS als auch Hepatitis B bei künftigen Blutspendern verwendet werden kann. Alternativ kann der Assay verwendet werden, um den Verlauf der Infektion bei einem Patienten aufzuzeichnen.
- Andere Proteine aus jedweder Quelle, einschließlich Bakterien, Hefe, Insekten, Pflanzen oder Säugern, können mit den synthetischen DNA-Fragmenten der Erfindung verwendet werden, um Fusionsproteine zu bilden. Solche, die effizient in ihren jeweiligen Expressionsystems exprimiert werden, werden besonders vorgezogen, weil sie die Expression des synthetischen Fragments des Fusionsproteins verstärken konnen.
- Die synthetischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die von mehreren HIV-Isolaten abgeleitet und zur Expression in E. coli optimiert sind, liefern eine ständige Verfügbarkeit und Einheitlichkeit von HIV-Antigenpräparaten, die Testseren von Individuen erkennen, die genetisch unterscheidbaren Varianten von HIV-Isolaten ausgesetzt waren. Die rekombinante Antigenexpression ist sehr stabil, weil E. coli Codons für seine Synthese verwendet wurden. Darüberhinaus erlaubt die Einfügung von spezifischen Restriktionsstellen die Addition, Deletion oder Substitution von wichtigen antigenischen Epitopen bei den codierenden Sequenzen, eine Eigenschaft, die schwer zu erzielen ist, wenn natürlich auftretende HIV-Sequenzen für die Expression verwendet werden. Die Konstruktion von synthetischen Genen erlaubt ebenfalls die Addition von Proteinsequenzen an entweder dem Amino- oder Carboxyterminus des Gens, wodurch die Entwicklung von neuartigen Reagenzien erlaubt wird. Beispielsweise kann ein Fusionsgen erzeugt werden, das eine Fusion zwischen einem HIV-1-Kernantigen und einem synthetischen HIV-1-Hüllengen umfaßt. Das synthetische Hüllengen umfaßt genauer gesagt die Carboxy-terminus-HIV-1-gp120-Sequenz und das HIV-gp41 von voller Länge. Auf ähnliche Art und Weise kann die HIV-1-Kernantigen-DNA-Sequenz an die HIV-2-gp41- Sequenzen fusioniert werden, welche beide in heterologen Wirtsystemen wie etwa E. coli in hohen Pegeln exprimiert werden können.
- E. coli Stämme, die Plasmide enthalten, die für die Konstrukte gemäß der Erfindung nützlich sind, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 22. November 1988 unter den Hinterlegungsnummern ATCC 67855 (pSD301/RR1/pRK248.clts) und ATCC 67856 (pSD306/CAG456) hinterlegt.
- Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung genauer. Die Beispiele sollen nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend verstanden werden.
- Medien wie etwa Luria-Bertani (LB) und Superbroth II (Dri Form) wurden von Gibco Laboratories Life Technologies, Inc., Madison, Wisconsin erhalten. Restriktionsenzyme, Klenowfragmente von DNA-PolymeraseI, T4-DNA-Ligase, T4-Polynukleotidkinase, Nukleinsäuremolekularegewichtsstandards, M13- Sequenzierungssysteme, X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indonyl-(β-D- galactosid) , IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid), Glycerin, Dithiothreitol, 4-Chlor-1-napthol wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana gekauft, oder von New England Biolabs. Inc., Beverly, Massachusetts, oder Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. Vorgefärbte Proteinmolekulargewichtsstandards, Acrylamid (kristallisiert, elektrophoretischer Reinheitsgrad > 99%); N,N'-Methylen-bis-acrylamid (BIS); N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Biorad Laboratories, Richmond, California, gekauft. Lysozym und Ampicillin wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri beschafft. Meerrettichperoxidase (HRPO)-markierte sekundäre Antikörper wurden von den Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland, beschafft. Seetangagarose (Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt) wurde von FMC Bioproducts, Rockland, Maine, bezogen.
- T50E10 enthielt 50mM Tris, pH 8,0, 10mM EDTA; 1X TG enthielt 100mM Tris, pH 7,5 und 10% Glyzerin; 2X SDS/PAGE Beladungspuffer bestand aus 15% Glyzerin, 5% SDS, 100mM Trisbase, 1M β-Mercaptoethanol und 0,8% Bromophenolblaufarbstoff; TBS enthielt 50mM Tris, pH 8,0, und 150mM Natriumchlorid; die Blockierungslösung bestand aus 5%iger Carnation nicht-fetter Trockenmilch in TBS.
- E. coli JM1O3-Zellen, pUC8, pUC18, pUC19 und M13- Klonierungsvektoren wurden von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey, gekauft; Competent Epicurean coli Stämme XLI-blau und JM109 wurden von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California, gekauft. RR1-Zellen wurden vom Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut, bezogen; und E. coli CAG456 Zellen von Dr. Carol Gross, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin. Der Vektor pRK248.clts wurde von Dr. Donald R. Helinski, University of California, San Diego, California, erhalten.
- Alle Aufschlüsse mit Restriktionsenzymen wurden gemäß den Anleitungen der Lieferanten durchgeführt. Mindestens 5 units Enzym wurden pro Mikrogramm DNA verwendet, und es wurde eine ausreichende Inkubation gestattet, um den Aufschluß der DNA zu vervollständigen. Standardverfahren wurden für die Mini- Zellysate-DNA-Präparation, die Phenol-Chloroform-Extraktion, die Ethanolausfällung von DNA, die Restriktionsanalyse von DNA auf Agarose, und die Reinigung der DNA-Fragmente in Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor, 1982]) verwendet. Für die Plasmidisolationen aus E. coli Stämmen wurden das alkalische Lyse-Verfahren und das Cäsiumchlorid- Ethidiumbromiddichtegradientenverfahren (Maniatis et al.) siehe oben) verwendet. Standardpuffer wurden für T4-DNA-Ligase und T4- Polynukleotidkinase (Maniatis et al., siehe oben) verwendet.
- Um ein synthetisches Gen zu entwickeln, das für das HIV- 1-Hüllenglykoprotein und für Fragmente daraus kodiert, wurden die Aminosäuresequenzen von vier unterschiedlichen viralen HIV- 1- Isolaten, bezeichnet als HTLV-IIIB (BH102), LAV-1 (MAL), ARV- 2 (SF), und CDC-451 (CD42) verglichen. Eine einzigartige Aminosäuresequenz aus den vier Isolaten (Figur 1) wurde ausgewählt, um ein Fragment mit den Aminosäureresten Nr 552-668 (Numerierung von Ratner et al., siehe oben) abzuleiten. Dieses Frägment enthielt neun Aminosäuresubstitutionen (8%) im Vergleich mit dem HTLV-IIIB (BH102) Isolat. Diese Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung von Codons, die optimiert waren, um die hochgradige Expression in E. coli zu erleichtern, zurücktranslatiert. Die mehrdeutigen Nukleotide, die in der zweiten und/oder dritten Base des Codons übrig blieben, wurden so zugeordnet, daß die molekulare Klonierung und die Addition, Substitution oder Deletion von Sequenzen erleichtert wurde. Die DNA-Sequenz wurde dann in acht doppelsträngige Fragmente mit einzigartigen 6bp- (Basenpaaren)Überhängen zum direkten spezifischen Aufschmelzen ["annealing"] unterteilt. Die sechzehn individuellen Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystem 380A DNA- Synthesizer synthetisiert, unter Einsatz von Verfahren und Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Diese gereinigten Oligonukleotide wurden aufgeschmolzen und miteinander ligiert, um das gesamte Fragment zusammenzusetzen, das mit BamHI und Sall aufgeschlossen, in pUC18 ligiert und in E. coli JM103 Zellen transformiert wurde. Ein Klon, der als BS2-10 (Figur 2) bezeichnet wurde, wurde isoliert, dem Restriktionsmapping unterworfen, und seine DNA-Sequenz wurde unter Einsatz des Sanger'schen Dideoxykettenterminationsverfahrens (Sanger et al., J. Mol. Biol. (1982) 162:729) bestätigt.
- Um nachzuweisen, daß der Klon 852-10 dieses einzigartige HIV-1-Transmembranproteinfragment (TMP) exprimiert, wurde die BS2-10/JM103 Kultur bei 37º C in 50ml Luria Broth, in einem 250ml Erlenmeyerkolben aufgezogen. Als die Kulturen eine OD600 von 0,3-05 erreichten, wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1mM hinzugefügt, um die Expressiön zu indüzieren. Die Proben (1,5ml) wurden in 1-stündigen Intervallen entfernt, und die Zellen wurden zu Pellets zentrifugiert und bei einer OD600 von 10,0 in 2X SDS/PAGE Beladungspuffer resuspendiert. Aliquote Anteile (15µl) der vorbereiteten Proben wurden auf ein 15%iges SDS/PAGE Gel aufgegeben, und die Proteine wurden aufgetrennt und dann elektrophoretisch auf Nitrozellulose für das Imunoblotting überführt. Das Nitrozelluloseblatt, das die überführten Proteine enthielt, wurde mit blockierender Lösung eine Stunde lang inkubiert und dann über Nacht bei 40 C mit dem Serum von AIDS- Patienten inkubiert, Welches mit TBS, enthaltend 5% E. coli JM103 Lysat, verdünnt war. Das Nitrozelluloseblatt wurde dreimal in TBS gewaschen, dann mit HRPO-markiertem Ziegen-anti-Human-IgG inkubiert, und mit TBS, enthaltend 10%iges fetales Kälberserum, verdünnt. Die Nitrozellulose wurde dreimal mit TBS gewaschen und die Farbe wurde in TBS entwickelt, das 2 mg/ml 4-Chlor-1- napthol, 0,02% Wasserstoffperoxid und 17% Methanol enthielt. Der Klon BS2-10 zeigte eine stark immunreaktive Bande gegenüber dem AIDS-Patientenserum, was anzeigt, daß das synthetische HIV-1 TMP-Fragment in E. coli exprimiert worden war. Um das HIV-1 Transmembranprotein in voller Länge zusammenzubauen, wie auch die äußersten 37 Carboxy-terminalen Aminosäuren von gp120, wurden die Aminosäuresequenzen der vier zuvor beschriebenen Isolate miteinander verglichen, um eine einzigartige Aminosäuresequenz für dieses Gen abzuleiten. Nachdem diese einzigartige Aminosäuresequenz unter Verwendung von Codons, die für die Expression in E. coli optimiert sind, rücktranslatiert worden war, wurden die mehrdeutigen Nukleotide so zugeordnet, wie zuvor beschrieben. Das synthetische HIV-1-Hüllengen von voller Länge (FSG, "full length dynthetic gene") wurde in sechs zusätzliche Unterfragmente unterteilt. Die komplette DNA- und Aminosäuresequenz des FSG ist in Figur 3 gezeigt, wobei die Restriktionsstellen und die zum Zusammensetzen verwendeten Subfragmente angezeigt sind. Figur 4 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenz, die verwendet wird, um das synthetische HIV-1 Hüllengen zu entwickeln, mit bekannten Aminosäuresequenzen von 13 unabhängigen Isolaten, die in der Los Alamos HIV Data Bank gespeichert sind (Meyers et al., Human Restroviruses and AIDS (1987), Los Alamos National Laboratory). Das Genalign Programm von Intelligenetics wurde verwendet um diese Sequenzen aufzureihen, und die Abfolge zeigt, daß FSG (als SYNGENE in Figur 4 bezeichnet) eine wesentliche Gesamtsequenzhomologie beibehält, verglichen zu anderen bekannten Isolaten. Die Abfolgeparameter und Abfolgetrefferquoten der einzelnen Sequenzen sind ebenfalls gezeigt.
- Die Subfragmente, die unterhalb von BS2-10 lokalisiert sind, und die als 413-1 bis 413-4 bezeichnet sind, wurden zusammen mit zusätzlichen Sequenzen synthetisiert, die eine BamHI-Restriktionsstelle an dem 5'-Ende und eine HindIII- Restriktionsstelle an dem 3'-Ende enthalten, um das molekulare Klonieren und die DNA-Sequenzanalyse der einzelnen Subfragmente zu erleichtern. Die Subfragmente, die stromaufwärts von BS2-10 lokalisiert sind, wurden ebenfalls mit zusätzlichen Sequenzen synthetisiert, die Restriktionsstellen enthielten, die für die Klonierung und für die DNA-Sequenzanalyse nützlich sind. Die Subfragmente, die für die Carboxy-terminale gp120 Aminosäuresequenz codieren, bezeichnet als c-term gp120, enthielten EcoRI- und BamHI-Restriktionsstellen an dem 5'-Ende und BgIII- und Smal-Restriktionsstellen am 3'-Ende. Ähnlich enthielt das Subfragment 415 eine BgIII-Stelle am 5'-Ende und BgIII- und BamHI-Restriktionsstellen am 3'-Ende. Mit Ausnahme des c-term gp120 Subfragments, bei dem beide Stränge synthetisiert wurden, wie für BS2-10 beschrieben, wurden die übrigen Subfragmente des FSG nach einem Verfahren synthetisiert, das das Klenowfragment der DNA-Polymerase I verwendet. Bei diesem Verfahren wurden Oligonukleotide, die gegensätzliche Stränge eines bestimmtem Subfragments umfaßten, und welche zehn komplementäre Basen enthielten, synthetisiert und aufgeschmolzen. Der zweite komplementäre Strang wurde dann vom Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in der Anwesenheit der vier Deoxynucleotide auf eine Art und Weise aufgefüllt, die ähnlich jener ist, die von Sanger et al., siehe oben, für die DNA Sequenzierung beschrieben wurde. Das resultierende doppelsträngige Subfragment wurde dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen aufgeschlossen und in pUC-Vektoren geklont, um die DNA-Sequenz zu bestätigen, wie zuvor beschrieben. Die Subfragmente 413-1 bis 413-4 wurden in pUC18 geklont, unter Einsatz der BamHI- und HindIII-Restriktionsstellen, die allen gemeinsam sind. Das subfragment c-term gp120 wurde in pUC8 kloniert, unter Verwendung der EcoRI und Smal- Restriktionsstellen. Das Subfragment 415 wurde in das Plasmid kloniert, das das c-term gp120 an der BgIII-Restriktionsstelle enthielt, und durch Restriktionsmapping wurde ein Screening für die korrekte Ausrichtung durchgeführt. Die Plasmid-DNAs für alle Subfragmente wurden nach dem Cäsiumchlorid- Schwimmdichtegradientenverfahren präpariert, und die einzelnen DNA-Sequenzen wurden direkt aus der doppelsträngigen Matrize bestätigt (Hatton et al., Nucl. Acid Res. (1985) 13:7813).
- Subfragmente, die stromabwärts von BS2-10 lokalisiert sind, wurden schrittweise geklont, unter Verwendung einzigartiger interner Restriktionsstellen am 5'-Ende und einer gemeinsamen HindIII-Stelle am 3'-Ende. Beispielsweise wurde das Subfragment 413-1 in BS2-10 an den Sall- und HindIII- Restriktionsstellen geklont, um Klon BS2-10A zu erzeugen, in den 413-2 an den HpaI- und HindIII-Restriktionsstellen eingefügt wurde, um Klon BS2-10B zu erzeugen. Ähnlich wurden die Subfragmente 413-3 und 413-4 hinzugefügt, unter jeweiliger Verwendung der einzigartigen EcoRV- und SnaBI- Restriktionsstellen. Die beiden Subfragmente, die stromaufwärts vom Klon BS2-10 lokalisiert sind, wurden, nachdem sie zusammen in pUC8 geklont worden waren, an BS2-10 als BamHI-Fragment ligiert. Figur 5 zeigt das Klonierungsverfahren, das verwendet wurde, um das synthetische HIV-1-Hüllengen in pUC18 zusammenzusetzen. Der vollendete Klon, bezeichnet als FSG, wurde einem Restriktionsmapping unterworfen, um die korrekte Ausrichtung des BamHI-BamHI-Fragments zu bestätigen.
- Die Expressionsanalyse des FSG wurde in Vektorsystemen, die den starken Lambda-pL-Promotor verwenden und das temperaturempfindliche-cl-Repressor-Gen (Benard et al., Gene (1979) 5:59) durchgeführt. Die spezifischen Vektoren, die in diesen Analysen verwendet werden, sind Derivate von pBR322, und sie enthalten einen Lambda-pL-Promotor und eine synthetische Shine-Dalgarno-Sequenz, gefolgt von Restriktionsstellen, die zum Klonen zahlreicher Gene, die von Interesse sind, verwendet werden. Zusätzlich enthalten diese Vektoren den starken Drei- Raster-Translations-Terminator rrnBt1. Der Vektor pSDKR816 enthält eine NcoI-Restriktionsstelle, die ein ATG-Startcodon liefert, das optimal vom Start der Transkription abgesetzt ist. Figur 6 zeigt schematisch die Klonierung von FSG im pSDKR816, um Klon pSD301 zu erzeugen. Kurz ausgedrückt, wurde FSG mit HindIII und SmaI aufgeschlossen, die Enden wurden in "blunt ends" überführt, indem mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 aufgefüllt wurde, und das 1209-bp-Fragment wurde gereinigt und in pSDKR816 an der NcoI-Stelle ligiert, die mit dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt worden war. Nach der Transformation in E. coli RR1 Zellen, die das clts-Gen auf dem kompatiblen Vektor pRK248 enthielten, wurde ein Klon mit FSG in der korrekten Ausrichtung durch Restriktionsmapping isoliert und als pSD301 bezeichnet. Die spezifische Aminosäuresequenz, für die pSD301 codiert, ist in Figur 7 gezeigt, unter Angabe aller von Linkem abgeleiteten Sequenzen (+) und aller Aminosäuresubstitutionen innerhalb der HIV-1-Hüllensequenzen, die bislang noch nicht in irgendeiner veröffentlichten Sequenz identifiziert worden sind (*).
- Zusätzlich wurde FSG als Fusion an das HIV-1-gag-Protein (Aminosäurerest Nrn. 121-407, Numerierung nach Ratner et al., siehe oben) geklont, das unter der Steuerung von dem Lambda-pL- Promotor im Vektor pKRR955 hochgradig exprimiert wird. FSG wurde mit AvaI aufgeschlossen, die Enden wurden durch Auffüllen mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 in "blunt ends" überführt, und das 1199-bp-Fragment wurde gereinigt und in pKRR955 an der SmaI-Restriktionsstelle zur Ausbildung eines HIV- 1-gag/synthetisches Hüllenfusionsproteins zu bilden (Figur 6) ligiert. Nach der Transformation in E. coli pRK248.clts/RR1 Zellen, wurde ein Klon, der FSG in der korrekten Ausrichtung enthielt, durch Restriktionsmapping identifiziert und als pSD302 bezeichnet. Die spezifische Aminosäuresequenz dieses Fusionsproteins ist in Figur 7 gezeigt, unter Angabe aller Seqenzen, die von Linkem abgeleitet sind, den HIV-1-gag Sequenzen, und den HIV-1-Hüllensequenzen, wie zuvor beschrieben.
- Kulturen fünfzig ml von pSD301 und pSD302 in E. coli pRK248.clts/RR1 Zellen wurden in Superbroth II Medium bei 30º C bis zu einer OD600 von 0,5 aufgezogen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Kulturen auf 42º C überführt wurden, um den temperaturempfindlichen cl-Repressor zu inaktivieren und dadurch die Expression entfernt vom Lambda-pL-Promotor zu induzieren. Zwei Proben (jeweils 2,0ml) wurden in 1-stündigen Intervallen entfernt. Die Probenpräparation wurde wie folgt durchgeführt.
- Die Zellen wurden zum pellettiert, dann in 1× TG-Puffer oder T50E10-Puffer resuspendiert. Ein gleiches Volumen von 2× SDS/PAGE Beladungspuffer wurde zu den 1× TG suspendierten Zellen hinzugefügt, um das Vollysat zu erzeugen. Die in T50E10 resuspendierte Probe war wurde acht mal jeweils 30 Sekunden lang bei einer Leistungseinstellung von 10 Watt beschallt, unter Einsatz der Mikrospitze, die mit dem Vibra Cell Sonicator (Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT) geliefert wird. Die beschallte Probe wurde dann zentrifugiert, um die unlösliche Fraktion zu entfernen, die im ursprünglichen Ausgangsvolumen von T50E10 resuspendiert wurde. Ein gleiches Volumen von 2× SDS/PAGE- Beladungspuffer wurde sowohl zu den beschallten löslichen als auch den unlöslichen Fraktionen hinzugefügt, die zusammen mit dem Vollzellysat 5 Minuten lang gekocht wurden und zentrifugiert, um jegliches verbleibende unlösliche Material zu entfernen, und aliquete Anteile davon (15µl) wurden an doppelten 12,5% SDS/PAGE-Gelen aufgetrennt. Die Proteine von einem solchen Gel wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulose zum Immunoblotting mit AIDS-Patientenseren überführt, wie zuvor beschrieben. Das zweite Gel wurde in einer Lösung von 50% Methanol, 10% Essigsäure 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und dann mit 0,25%igern Coomassieblau-Farbstoff in einer Lösung von 50% Methanol, 10% Essigsäure 30 Minuten lang gefärbt. Die Entfärbung wurde ausgeführt unter Verwendung einer Lösung mit 10% Methanol, 7% Essigsäure, 3-4 Stunden lang, oder solange, bis ein klarer Hintergrund erreicht wurde.
- Figur 8 zeigt die Expression von pSD301 und pSD302 vor (T0) und vier Stunden nach (T4) Induktion, untersucht mittels Coomassieblau-Färbung (Figur 8A) und Immunoblotting (Figur 8B). Die Proben waren pKRR955 (T0 Vollzellysat [Bahn 1], T4 Vollzellysat [Bahn 2]); pSD301 (T0 Vollzellysat [Bahn 3], T4 Vollzellysat [Bahn 4], T4 beschallte lösliche Fraktion [Bahn 5], und T4 beschallte unlösliche Fraktion [Bahn 6]); und pSD302 (T0 Vollzellysat [Bahn 7], T4 Vollzellysat [Bahn 8], T4 beschallte lösliche Fraktion [Bahn 9], und T4 beschallte unlösliche Fraktion [Bahn 10]). Die Molekulargewichtsstandards ließ man in Bahn 11 laufen. Pfeile zeigen die Position der induzierten Proteine an, welche sowohl in den Vollzellysaten als auch in der beschallten unlöslichen Zellfraktion mittels Coomassieblau- Färbung klar sichtbar gemacht sind (Darstellung 8A). Bahn 2 zeigt an, daß pKRR955 das HIV-1-gag Protein in einer Menge von mehr als 25% des Gesamtzellproteins exprimierte, Bahn 4 zeigt an, daß pSD301 das synthetische HIV-1-Hüllenprotein in einer Menge von ca. 12% des Gesamtzellproteins exprimierte, und Bahn 8 zeigt an, daß pSD302 das HIV-1-gag/synthetisches Hüllenfusionsprotein in einer Menge von etwa 5% des Gesamtzellproteins exprimierte. Die erhaltenen Expressionspegel, die unter Einsatz von FSG erzielt wurden, waren signifikant höher als jene, die unter Einsatz der entsprechenden nativen viralen DNA-Sequenzen in gleichartigen pL-Vektorsystemen erhalten werden. Alle drei rekombinanten Proteine waren gegenüber den Seren von AIDS-Patienten hochreaktiv (Figur 8B). Diese Daten zeigen, daß das synthetische HIV-1-Hüllengen einschließlich der hydrophoben Region des Transmembranproteins effizient in E. coli exprimiert werden kann, und daß die exprimierten Proteinene hoch immunreaktiv sind.
- Die HIV-spezifischen Proteine, die in E. coli überexprimiert werden, wurden gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik gereinigt. Die in hohen Pegeln exprimierten Proteine waren immunogen und wurden von Antikörpern, die von HIV- infizierten Individuen produziert werden, erkannt (siehe Figur 8). Die aus E. coli abgeleiteten HIV-spezifischen Proteine können in verschiedenen Immunoassaykonfigurationen verwendet werden, wie in der CIP-Anmeldung US Serial No. 020 282, angemeldet am 27. Februar 1987 von Dawson et al. beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Die Stammanmeldung ist EP 86 116 854.0 (4. Dezember 1986). In einer bevorzugten Konfiguration wurden HIV- spezifische Proteine auf einen festen Träger aufgezogen und mit Testproben inkubiert. Die virusspezifischen Antikörper, die in der Testprobe enthalten waren, erkannten die HIV-Proteine auf dem festen Träger und wurden an sie gebunden. Die HIV- spezifischen Antikörper wurden unter Verwendung von Ziegen-antihuman-Immunglobulin, das an HRPO konjugiert war, quantitativ bestimmt.
- Biologische Proben, die leicht durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet werden können, umfassen folgendes: menschliche und tierische Körperflüssigkeiten, sowie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Stuhl, Lymphocyten oder Zellkulturpräparate und gereinigte und teilweise gereinigte Immunglobuline. Das Polypeptid, das hierin beschrieben ist, kann verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern geegnüber HIV-Antigenen zu ermitteln, mittels Assayverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind.
- Ein solcher Assay schließt folgendes ein:
- a) Überziehen eines festen Trägers mit dem hierin offenbarten Polypeptid;
- b) In-Kontakt-Bringen des überzogenen festen Trägers mit der biologischen Probe, um einen Antikörper-Polypeptidkomplex zu bilden;
- c) Entfernen von ungebundener biologischer Probe von dem festen Träger;
- d) In-Kontakt-Bringen des Komplexes auf dem festen Träger mit einem markierten Immunglobulin, das spezifisch ist für den Antikörper;
- e) Nachweis des Markers, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von HIV-1-Antikörpern in der biologischen Probe zu bestimmen.
- Ein zweites Assayverfahren schließt folgendes ein:
- a) Überziehen eines festen Trägers mit dem hierin offenbarten Polypeptid;
- b) In-Kontakt-Bringen des überzogenen festen Trägers mit der biologischen Probe und den homologen Polypeptiden, die an einen Marker konjugiert sind;
- c) Entfernen vön ungebundener biologischer Probe und ungebundenen markierten Polypeptiden; und
- d) Nachweis des Markers, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von HIV-1-Antikörpern in der biologischen Probe zu bestimmen.
- Feste Träger, die bei solchen Immunoassays verwendet werden können, schließen folgendes ein: Vertiefungen in Reaktionsplatten, Teströhrchen, Kügelchen, Streifen, Membranen, Filter, Mikropartikel oder andere feste Träger, die dem Fachmann gut bekannt sind. Enzymatische, radioisotopische, fluereszierende, chemilumineszente und kolloidale Partikelmarker können bei den zuvor genannten Assays verwendet werden. Weiterhin könne Hapten/markiertes Antihapten-Systeme sowie ein Biotin/markiertes Antibiotin-System in dem Assays gemäß der Erfindung verwendet werden. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind als Reagenzien nützlich, und HIV- Antikörper der IgG- wie auch der IgM-Klasse können als feste Träger oder als markiertes Reagenz verwendet werden.
- Es ist aus den vorhergehenden Beispielen offensichtlich, daß jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, spezifische Subfragmente der konstruierten synthetischen Gene zusammen klonen könnte, um neue synthetische Gene zu erzeugen, die die gleichen Charakteristika haben würden wie jene, die hierin aufgezeigt sind. Beispielsweise können das c-term-gp120- Subfragment, BS2-10 und das Subfragment 413-1 zusammen geklont werden, um synthetische Genprodukte zu erleugen, die nützlich sind als diagnostische und therapeutfsche Reagenzien für AIDS.
Claims (10)
1. Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wie
folgt dargestellt wird:
MGDPMMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGIAPTKAKRRVVQREKRADLAVGILGALFLGFLGAAGSTMGARSL
TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIKDPKAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKL
ICTTAVPWNASWSNKSLEDIWNNMTWMQWEREINNYTNLIYSLLEESQNQQEKNEQELLQLDKWVDASLW
NWSNITKWLWYIKLFIMIVGGLAGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTRLPNPRGPDRPEGIDEEGGER
DRDRSTRLVDISLALVWEDLRSLCLFSYHRLRDLLLIATRIVELLGRRGWEVLKYWWNLLQYVSQELKNS
AVSLVNATAIAVAEGTDRVIEVVQRAYRAIRHIHRRIRQGLERILLQVHASSLESSWQFGPG.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, das von E. coli hergestellt
wird.
3. Fusionspolypeptid, das ein Polypeptid nach Anspruch 1
umfaßt, bei dem das Polypeptid an ein prokaryontisches
oder eukaryontischen Protein fusioniert ist.
4. Fusionspolypeptid nach Anspruch 3, wobei das
prokaryontische oder eukaryontische Protein das E.
coli-Enzym CKS ist.
5. Synthetisches Gen, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die wie
folgt dargestellt wird:
ATGGGGGATCCCATGATGCGCGACAACTGGCGCTCTGAACTGTACAAATACAAAGTTGTTAAAATCGAAC
CGCTGGGCATCGCTCCGACCAAAGCTAAACGCCGCGTTGTTCAGCGCGAAAAACGCGCAGATCTAGCTGT
TGGTATCCTGGGTGCTCTGTTTCTGGGTTTTCTGGGTGCTGCTGGTTCTACTATGGGTGCTCGCTCTCTG
ACTCTGACTGTTCAGGCTCGCCAGCTGCTGTCTGGTATCGTTCAGCAGCAGAACAACCTGCTGCGCGCTA
TCAAGGATCCCAAAGCTCAGCAGCATCTGCTGCAACTGACTGTTTGGGGTATCAAACAACTGCAGGCTCG
CGTTCTGGCTGTTGAACGCTACCTGAAAGACCAGCAGCTGCTGGGTATCTGGGGTTGCTCTGGTAAACTG
ATTTGCACTACTGCCGTTCCGTGGAACGCTTCTTGGTCCAACAAATCTCTGGAAGACATCTGGAACAACA
TGACTTGGATGCAATGGGAACGCGAAATCAACAACTACACTAACCTGATCTACTCTCTGCTGGAAGAATC
TCAGAACCAGCAGGAAAAAAACGAACAGGAACTGCTGCAACTGGACAAATGGGTCGACGCTTCTCTGTGG
AACTGGTCTAACATAACTAAATGGCTGTGGTACATCAAACTGTTTATCATGATCGTTGGTGGTCTGGCCG
GCCTGCGCATGCTTTTTGCTGTTCTGTCTATCGTTAACCGCGTTCGCCAGGGTTACTCTCCGCTGTCTTT
TCAGACTCGCCTGCCGAACCCGCGCGGTCCGGACCGCCCGGAAGGTATCGATGAAGAAGGTGGTGAACGC
GACCGCGACCGCTCTACTCGCCTGGTAGATATCTCTCTGGCTCTGGTTTGGGAAGACCTGCGCTCTCTGT
GCCTGTTTTCTTACCATCGCCTGCGCGACCTGCTGCTGATCGCTACTCGCATCGTTGAACTGCTGGGTCG
CCGCGGTTGGGAAGTGCTGAAATACTGGTGGAACCTGCTGCAATACGTATCTCAGGAACTGAAAAACTCT
GCTGTTTCTCTGGTTAATGCTACTGCTATCGCTGTTGCTGAAGGTACTGACCGCGTTATCGAAGTTGTTC
AGCGCGCTGTACCGCGCTATCCGCCATATCCATCGCCGCATCCGCCAGGGTCTGGAACGCATCCTGCTGCA
GGTGCATGCCTCGAGTCTAGAAAGCTCATGGCAATTCGGGCCCGGGTAA
6. Synthetisches Gen nach Anspruch 5, das für ein
Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
7. Fusionspolypeptid, das ein Polypeptid nach Anspruch 1
umfaßt, bei dem das Polypeptid an ein HIV-gag-Protein
fusioniert ist.
8. Fusionspolypeptid nach Anspruch 7, worin das HIV-gag-
Protein ein HIV-1-gag-Protein ist, das eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die durch folgendes dargestellt
wird:
DTGHSSQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNT
VGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGE
IYKRWIILGLLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDC
KTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNTATIMMQRGNFRNQRKMVKCFNCGKEGH
TARNCRA
9. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-Antigene bei
einem Individuum, das folgende Schritte umfaßt:
a) Erhalt einer Probe einer Körperflüssigkeit des
Individuums;
b) Inkubation der Körperflüssigkeit mit dem Polypeptid
nach Anspruch 1;
c) Inkubation der Körperflüssigkeit mit einem markierten
Antikörper gegen Immunglobulin; und
d) Nachweis der Markierung und daraus Bestimmung der
Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen
HIV-Antigene.
10. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-Antigene bei
einem Individuum, das folgende Schritte umfaßt:
a) Erhalt einer Probe von Körperflüssigkeit des
Individuums;
b) Inkubation der Körperflüssigkeit mit dem Polypeptid
nach Anspruch 1;
c) Inkubation der Körperflüssigkeit mit einem markierten
Antigen; und
d) Nachweis der Markierung, wobei dadurch die
Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen
HIV-Antigene bestimmt wird.
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Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5939074A (en) * | 1986-12-30 | 1999-08-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Multideterminant peptide antigens |
FR2676071B1 (fr) * | 1991-05-02 | 1994-11-18 | Transgene Sa | Nouveau variant gp160 non-clivable, soluble, de forme hybride. |
EP0601108B1 (de) * | 1991-08-29 | 1999-10-06 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Peptid-antigene bestehend aus multi-determinanten, die die t-helfer lymphozyten-antwort gegen hiv in einem weiten bereich von betroffenen menschen stimulieren |
GB9208428D0 (en) * | 1992-04-16 | 1992-06-03 | Proteus Molecular Design | Synthetic polypeptides |
EP0572737B1 (de) * | 1992-06-04 | 2001-02-28 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Gag-Env Fusion-Antigen aus HIV |
DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
US6846905B2 (en) | 1997-08-15 | 2005-01-25 | Abbott Laboratories | Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV |
EP1141313A2 (de) | 1998-12-31 | 2001-10-10 | Chiron Corporation | Verbesserte exprimierung von hiv polypeptiden und herstellung von virusähnliche partikeln |
AU2487300A (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-31 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US7935805B1 (en) * | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
PT1141315E (pt) | 1998-12-31 | 2008-05-05 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Polipéptidos do envelope (env) de hiv modificados |
WO2001002607A1 (en) * | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine |
US20030096778A1 (en) * | 2002-06-13 | 2003-05-22 | Shiver John W | Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 nef and modified hiv-1 nef |
US20040063653A1 (en) * | 2000-12-21 | 2004-04-01 | Shiver John W. | Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol |
US20040101957A1 (en) * | 2001-09-14 | 2004-05-27 | Emini Emilio A. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol.nef and modifications |
US6733993B2 (en) * | 2000-09-15 | 2004-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications |
DE60233942D1 (de) * | 2001-06-22 | 2009-11-19 | Hoffmann La Roche | Verwendung von fkbp-chaperons als expressionswerkzeug |
US7101683B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
CA2458995C (en) * | 2001-08-31 | 2013-04-30 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US6852491B2 (en) * | 2001-09-04 | 2005-02-08 | Abbott Laboratories | Amplification and detection reagents for HIV-1 |
US7825233B2 (en) * | 2004-06-30 | 2010-11-02 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active Botulinum Toxin type E |
US20080057575A1 (en) * | 2004-08-04 | 2008-03-06 | Allergan, Inc. | Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A |
WO2007141650A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-12-13 | Instituto De Medicina Molecular | Compositions and methods for diagnosing hiv-2 infection |
US8112229B2 (en) * | 2007-05-31 | 2012-02-07 | Abbott Laboratories | Method for determining the order of execution of assays of a sample in a laboratory automation system |
US8188250B2 (en) | 2008-04-28 | 2012-05-29 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans |
CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
US9551714B2 (en) | 2010-06-25 | 2017-01-24 | Abbott Laboratories | Materials and methods for assay of anti-hepatitis C virus (HCV) antibodies |
PT2691530T (pt) | 2011-06-10 | 2018-05-10 | Univ Oregon Health & Science | Glicoproteínas e vectores recombinantes cmv |
CA2789539A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-12 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
EP2586461A1 (de) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Von einem eingehüllten Virus abgeleitete Virenpartikel |
EP2856163B1 (de) * | 2012-05-30 | 2016-07-06 | Bio-Rad Innovations | Verfahren zur diagnose und differenzierung von hiv-2-infektionen |
ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
EP2848937A1 (de) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Verfahren zur Identifizierung neuartiger HIV-1-Immunogene |
US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (de) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2028287A (en) | 1931-01-02 | 1936-01-21 | William F Leicester | Process of making glued up plywood |
IE47889B1 (en) * | 1977-11-08 | 1984-07-11 | Genentech Inc | Synthetic dna and process tehrefor |
CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
AU600658B2 (en) * | 1984-12-24 | 1990-08-23 | Genentech Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
JP2564268B2 (ja) * | 1985-08-28 | 1996-12-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 融合抗原ポリペプチド |
US5079342A (en) * | 1986-01-22 | 1992-01-07 | Institut Pasteur | Cloned DNA sequences related to the entire genomic RNA of human immunodeficiency virus II (HIV-2), polypeptides encoded by these DNA sequences and use of these DNA clones and polypeptides in diagnostic kits |
US4753873A (en) | 1986-02-03 | 1988-06-28 | Cambridge Bioscience Corporation | Peptides for the diagnosis of HTLV-III antibodies, their preparation and use |
US4925784A (en) | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
JPH02501107A (ja) * | 1986-11-01 | 1990-04-19 | ブリティッシュ バイオーテクノロジー リミテッド | 微粒子ハイブリッドhiv抗原 |
ES2104556T3 (es) * | 1987-01-16 | 1997-10-16 | Pasteur Institut | Peptidos que tienen propiedades inmunologicas de hiv-2. |
US4861707A (en) * | 1987-02-02 | 1989-08-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Human immunodeficiency virus antigen |
US5124255A (en) * | 1988-03-11 | 1992-06-23 | Abbott Laboratories | CKS method of protein synthesis |
KR900701836A (ko) * | 1988-10-03 | 1990-12-04 | 라메쉬 엘. 라탄 | 신규 hiv 단백질 및 aids의 진단, 예방 또는 치료에 유용한 펩티드 |
EP0400245B1 (de) * | 1989-05-31 | 1995-12-20 | Institut Pasteur | HIV-2-EHO-Retrovirus-Proteine und -Glycoproteine, Antikörper gegen sie, Verwendung für diagnostische Zwecke |
-
1989
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