DE3586983T2

DE3586983T2 - Verfahren und vorrichtung fuer immunotest.

Info

Publication number: DE3586983T2
Application number: DE8585902788T
Authority: DE
Inventors: Alan Levinson; Coleman Owen; Edwin Valkirs
Original assignee: Hybritech Inc
Current assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1984-05-11
Filing date: 1985-05-13
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2005-05-14
Also published as: DK124994A; FI910057A0; DK11186A; AU4401785A; US4632901A; US4727019A; FI91566B; NO860057L; FI91565C; ES556866A0; EP0180638A1; IN163952B; EP0180638A4; AU6805090A; NZ212049A; JPH0734016B2; DK11186D0; EP0180638B1; FI91565B; CA1257542A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Immunoassays mit Ligandenrezeptoren. Insbesondere betrifft die Erfindung Immunoassay-Verfahren, insbesondere solche, die monoklonale Antikörper einsetzen. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Durchführen dieser Bestimmungsverfahren.

Hintergrund

Nahezu Jahrzehnte lang haben Immunoassay-Verfahren empfindliche diagnostische Werkzeuge zur in vitro-Bestimmung bzw. -Erfassung einer Vielzahl von Antigenen zur Verfügung gestellt, die mit Krankheiten oder anderen physischen Zuständen mit klinischer Bedeutung verknüpft sind. Ursprünglich verwendeten solche heterogene Bestimmungsverfahren eine Zubereitung eines polyklonalen Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist. Bei diesen Bestimmungsverfahren läßt man eine Lösung eines markierten Antigens direkt mit dem zu bestimmenden Antigen in der Probe um den Festphasen-Antikörper in Konkurrenz treten oder setzt diese Lösung dem Antikörper sequentiell zu. Das Ausmaß, in dem das markierte Antigen an die feste Phase gebunden oder in der flüssigen Phase bestimmt wird, kann als Maß für die Anwesenheit und Menge von Antigen in der analysierten Probe verwendet werden.
Später wurden nicht-kompetitive immunometrische Bestimmungsverfahren verfügbar. Bei diesen Bestimmungsverfahren wurde auch eine Zubereitung polyklonaler Antikörper verwendet, die an eine feste Phase gebunden waren. Die das vermutete Antigen enthaltende Probe wurde mit der festen Phase in Kontakt gebracht, damit sich das Antigen an die Antikörper der festen Phase bindet. Typischerweise wurde die Probe nach einem Inkubationsschritt von der festen Phase abgetrennt, die dann gewaschen und mit einer Lösung weiterer polyklonaler Antikörper inkubiert wurde, die beispielsweise mit einem Radionuklid, einem Enzym oder einem fluoreszierenden Teil markiert worden waren.
Nach dieser zweiten Inkubation wurde ungebundener markierter Antikörper von der festen Phase abgetrennt und die Menge an markiertem Antikörper entweder in der flüssigen Phase oder gebunden an die feste Phase in einer Antikörper/Antigen/Antikörper-Anordnung als Maß für die Anwesenheit und/oder Konzentration des Antigens in der untersuchten Probe gemessen.
Kürzlich wurden Immunoassay-Verfahren für die Verwendung von monoklonalen Antikörpern modifiziert. Die US-PS 4 376 110 beispielsweise beschreibt immunometrische Bestimmungsverfahren mit zwei Epitopstellen, welche Paare monoklonaler Antikörper verwenden, wobei einer an eine Festphase gebunden ist und der andere zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist. Die Verwendung von Paaren monoklonaler Antikörper, die unterschiedliche Epitopstellen auf einem Antigen erkennen, hat es ermöglicht, immunometrische Bestimmungsverfahren gleichzeitig durchzuführen, bei denen das Inkubieren von Antigen und markiertem Antikörper nicht die Zwischenschritte der Verfahren des Standes der Technik erfordert.
Bei den vorstehenden Verfahren ist der Festphasen-Antikörper typischerweise an ein Kügelchen oder an kleine Teilchen gebunden oder auf eine Oberfläche aufbeschichtet. All diese Verfahren erfordern charakteristischerweise sowohl mit den Festphasenantikörpern als auch den markierten Antikörpern eine Inkubationszeit und sind deswegen zeitaufwendig, selbst wenn sie gleichzeitig durchgeführt werden. Tatsächlich ist es nicht außergewöhnlich, daß ein Bestimmungsverfahren bis zu seiner Beendigung einige Stunden benötigt. Die Notwendigkeit, zeitgesteuerte Inkubierungsschritte und mehrere Waschschritte mit abgemessenen Reagenzien durchzuführen, hat daneben diese Verfahren weitgehend auf große Kliniken und klinische Referenzlabors beschränkt, wo zum Durchführen der Bestimmungsverfahren gut geschultes Personal und anspruchsvolle Ausrüstung verfügbar ist. Deswegen besteht weiterhin ein Bedarf an einem einfachen und schnellen Verfahren zum Durchführen von Immunoassays, bei denen relativ einfache Geräte eingesetzt werden, um solche Bestimmungsverfahren zum Einsatz in der Arztpraxis und zum Verkauf über den Ladentisch an Laien zum Einsatz in häuslichen Gesundheitsüberwachungsprogrammen verfügbar zu machen.
Die US-PS 4 246 339 beschreibt eine Vorrichtung zum Bestimmen flüssiger Proben, wobei die Vorrichtung teleskopartige Ober- und Unterteile aufweist. Das Oberteil enthält Testvertiefungen, wobei die Basis jeder Vertiefung eine mikroporöse Membran auf der Gesamtoberfläche darstellt, auf der ein Co-Reaktant immobilisiert ist. Das Unterteil enthält ein Sorbensmittel. Ein Federmittel spannt die Teile in der offenen Lage vor, wo sie nicht miteinander in Kontakt stehen. Die Reaktion des Bestimmungsverfahrens findet statt, wenn sich die Vorrichtung in der offenen Lage befindet, d. h. die zwei Teile nicht miteinander in Kontakt stehen. Nach Ablauf einer genügenden Zeit zum Ablauf der Reaktion wird das obere Teil zeitweise herabgepreßt, so daß es mit dem zweiten Teil in Kontakt gerät und die Flüssigkeit in jeder Vertiefung in das Sorbensmittel im zweiten Teil eintreten läßt.
Die US-PS 4 002 532 beschreibt Enzym-Makromolekülkonjugate, die durch Konjugieren mit polyfunktionellen Reagenzien in Anwesenheit organischer Verbindungen erzeugt werden, die als Konditionierer wirken. Die Konjugate sind geeignet zum Bestimmen bzw. Erfassen und Quantifizieren von Substanzen wie beispielsweise IgE in biologischen Fluiden.
Die US-PS 3 843 324 beschreibt Fasern, die auf einen Rahmen aufgespannt oder in Form eines im wesentlichen festen Gitters gewoben sind, und an die Materialien gebunden sind, welche immunoreaktive Gruppen enthalten. Das Produkt kann zum selektiven Entfernen von Zellen aus Fluiden verwendet werden.
Die US-PS 4 298 685 beschreibt ein Bestimmungsverfahren, bei dem eine ein Antigen oder Hapten enthaltende Probe mit Antikörpern gemischt wird, die gerichtet sind gegen die Substanz, die mit Biotin und mit einer bekannten Menge der mit einem Enzym markierten Substanz gerichtet sind. Nach der kompetitiven Komplexierung des Antikörpers mit der markierten Substanz und der zu bestimmenden Substanz wird auf einem inerten Träger immobilisiertes Avidin zugegeben. Das Avidin bindet sich an das Biotin und verursacht ein Ausfallen des Komplexes. Trennen von fester und flüssiger Phase und Messen der Aktivität des Enzyms in einer der Phasen erlaubt das Bestimmen der Menge an Testsubstanz in der Probe.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum einfachen und schnellen Durchführen von Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zur Verfügung, beispielsweise Immunoassays und immunometrische Assays und Bestimmungsverfahren, die die Hybridisierung von Nukleinsäure-Oligomeren einsetzen, welches eine einfache Vorrichtung verwendet und welches keine langdauernden Inkubationsschritte erfordert. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt als erstes Teil ein poröses Teil wie beispielsweise eine Membrane oder ein Filter, an welches innerhalb eines Bereiches, der kleiner ist als der Bereich des ersten Teils, auf den die Probe aufgebracht werden kann, ein Rezeptor für den zu bestimmenden Zielanalyten (Ligand) gebunden oder daran fixiert ist oder an welches innerhalb eines Bereiches, der kleiner ist als der Bereich des ersten Teils, auf den die Probe aufgebracht werden kann, ein Antirezeptor gebunden oder daran fixiert ist. Im Fall eines Immunoassays und eines immunometrischen Assays, bei dem der Ligand ein Antigen ist, wird beispielsweise ein Antikörper, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper, an das poröse Teil als Rezeptor gebunden. Die Vorrichtung weist weiter als zweites Teil ein Absorptionsteil auf, welches durch laufende Kapillarwege quer zu seiner oberen und unteren Oberfläche aufweist. Soweit hier verwendet, umfaßt der Begriff "Kapillare" eine Kapillare oder einen anderen Kanal oder Weg, der es einer Flüssigkeit erlaubt, das Absorptionsteil zu durchlaufen. Das zweite Teil steht in Kapillarverbindung mit dem porösen ersten Teil und ist so ausgewählt, daß es eine kapillare Porengröße aufweist, die Flüssigkeitsfluß durch das erste Teil ohne Einsatz von äußeren Mitteln hervorruft, wenn der hydrostatische Druck der Probe und nachfolgender im Bestimmungsverfahren verwendeter Zusätze nicht ausreichen, Fluß durch das erste Teil hervorzurufen. Das zweite Teil kann auch den Träger für das erste Teil zur Verfügung stellen.
Das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte, daß man dem porösen Teil eine flüssige Probe zusetzt, wodurch beim Fließen der Flüssigkeit durch das Teil der gesamte an das poröse Teil gebundene Rezeptor löslichen oder in der Probe suspendierten Liganden mit einer Geschwindigkeit bindet, die wesentlich schneller ist als die Geschwindigkeit, die man ohne Fluß durch das Teil beobachtet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung folgt auf die Probenzugabe eine Zugabe einer Lösung eines anderen Rezeptors für den Liganden, der zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist. Man verwendet beispielsweise bei einem immunometrischen Assay für ein Antigen eine Lösung eines Antikörpers, bevorzugt eines monoklonalen Antikörpers, der sich an das Antigen an dem Epitop bindet, welches nicht mit einer Bindung des ersten Rezeptors interferiert. Die bevorzugte Markierung ist ein Enzym, obwohl auch andere Markierungen verwendet werden können, wie beispielsweise ein Radionuklid oder eine Fluoreszenzmarkierung. Der Antikörper bindet sich an das vorher aus der Probe extrahierte Antigen entweder durch das gebundene Antigen oder durch Einschluß von zellulärem Material. Die Zugabe von markiertem Antikörper kann unmittelbar folgen oder nach einer kurzen Inkubation, um die Empfindlichkeit dadurch zu erhöhen, daß durch einen Waschschritt zum Entfernen von ungebundenem markierten Antikörper eine größere Bindung von Antigen und markiertem Antikörper ermöglicht wird. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem porösen Teil wird dann als Anzeichen für die Anwesenheit des Zielantigens in der Probe verwendet. Im Fall einer Enzym- Markierung erfolgt dies durch Zusatz einer Lösung eines farbbildenden Substrats auf das poröse Teil, um das Substrat mit dem Enzym reagieren zu lassen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt einen Querschnitt einer Vorrichtung zum Durchführen eines erfindungsgemäßen Immunoassays.
Fig. 2 ist eine Draufsicht auf ein für die Erfindung verwendetes poröses Teil zum Entfernen von Antigen aus der zu analysierenden Probe.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Wie bereits erwähnt, umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung als erstes Teil eine poröse Membran oder ein poröses Filter an die bzw. an das ein Rezeptor für einen Liganden oder ein anti-Rezeptor gebunden ist. Im letzteren Fall wird die Membran oder das Filter so ausgewählt, daß es eine Porengröße hat, die diese Trennung gestattet. Es kann eine Vielzahl von Filterteilen verwendet werden unter Einschluß von Glasfaserfiltern und Filtern verschiedenartiger synthetischer oder natürlicher Materialien.
Wenn das poröse Teil daran gebundenen Rezeptor aufweist, wird der Rezeptor nach Maßgabe seiner Fähigkeit ausgewählt, sich unmittelbar selektiv an den Zielliganden zu binden. Wenn beispielsweise der Ligand ein Antigen ist, kann der Rezeptor ein Antikörper sein, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. Wenn der Zielligand ein Antikörper ist, kann der Rezeptor ein Antigen oder anti-Antikörper sein. Wenn der Ligand ein Enzym ist, kann der Rezeptor ein Rezeptor für das Enzym sein. Wenn der Ligand eine Nukleinsäure, beispielsweise RNA oder DNA ist, kann der Rezeptor ein komplementäres Oligomer von DNA oder RNA sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Teil eine Membrane oder ein Filter, an welche(s) eine Antikörperzubereitung kovalent gebunden ist. Die Antikörperzubereitung umfaßt bevorzugt einen monoklonalen Antikörper, obwohl auch polyklonale Antikörper aus Antiseren eingesetzt werden können. Arbeitstechniken für polyklonale und monoklonale Antikörperzubereitungen sind bekannt und bedürfen hier keines Zitats.
Das Material des porösen Teils wird aus einem Material ausgewählt, an das der Rezeptor oder - falls verwendet - der anti-Rezeptor nicht gebunden werden kann. Im Falle von Proteinrezeptoren oder Protein-anti-Rezeptoren, z. B. Antikörpern oder Antigenen, stellt ein bevorzugtes Material Nylon dar, welches Aminogruppenreste aufweist oder in welches solche Gruppen mit chemischen Mitteln eingeführt wurden, mit dem ein Protein mit dem bekannten Glutaraldehydverfahren daran gekoppelt werden kann. Antikörper können mit Aminosilanen an Glasfasern gekoppelt werden. Andere natürliche oder synthetische Materialien, die direkt oder über Zwischenstufen an einen Rezeptor gekoppelt werden können, sind ebenfalls einsetzbar.
Vorstehend wird eine chemische Bindung des Rezeptors oder anti-Rezeptors an das poröse Teil betont. In bestimmten Fällen kann der Rezeptor oder Antirezeptor jedoch auf das poröse Teil aufbeschichtet sein oder kann aus Teilchen bestehen, die innerhalb der Wechselwirkung des porösen Teils eingeschlossen sind. Soweit hier verwendet, soll der Begriff "gebunden" deshalb jedes beliebige Mittel zum Fixieren von Rezeptor oder anti-Rezeptor an das poröse Teil umfassen.
Das zweite Teil ist ein Absorptionsteil mit Kapillardurchgängen, die im wesentlichen quer zur oberen und unteren Oberfläche liegen. Das zweite Teil ist mit dem ersten auf eine Weise verbunden, die eine direkte Verbindung zwischen den Poren oder Lücken des ersten Teils und den Kapillaren des zweiten Teil gestattet. Wenn deshalb eine Flüssigkeit auf das erste Teil aufgebracht wird und dieses sättigt, wird die Flüssigkeit in das Absorptionsteil eingezogen. Als Ergebnis kann ein Fluß durch das erste Teil erzeugt werden, wenn eine flüssige Probe auf die obere Oberfläche des ersten Teils aufgebracht wird, und zwar selbst dann, wenn der hydrostatische Druck des Fluids so klein ist, daß es ohne Hilfe nicht durch das erste Teil fließen könnte, ohne daß Druck bzw. ein Vakuum zum Durchdrücken bzw. Durchziehen angewandt wird.
Die Auswahl des Materials für das zweite Teil ist nicht kritisch, und es können eine Vielzahl von faserartigen Filtermaterialien verwendet werden. Ein brauchbares Material sind Zelluloseacetatfasern, die wie in einem Zigarettenfilter orientiert sind. Dem Fachmann ist klar, daß andere Absorptionsteile anstelle von Zelluloseacetat verwendet werden können, die aus Polyester, Polyolefin oder anderen Materialien hergestellt sind.
Fig. 1 zeigt im Querschnitt ein Element, welches für die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens verwendet werden kann. Fig. 1 sieht einen zylindrischen Behälter 10 mit einer oberen Öffnung 12 vor, die durch die Seitenwand 14 definiert ist; er kann jedoch jede beliebige andere geeignete Gestalt aufweisen. Der Behälter kann aus Glas, Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material hergestellt sein. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, hat der Behälter 10 auch eine untere Öffnung 16, in die ein entfernbarer Pfropfen 18 eingeführt ist, um das Einfügen des porösen Teils 20 - eine kreisförmige Membrane oder Filterscheibe - und eines wahlweisen Teils 21 zu ermöglichen, deren Funktion nachfolgend beschrieben wird, und die auf dem zylindrischen Absorptionsteil 22 ruhen, welches ebenfalls durch die Öffnung 16 eingeführt wird.
Ein Teil des Behälters 10 ist - wie in Fig. 1 durch Bezugszeichen 24 gezeigt ist - eingeschnürt, um einen einstückigen Trichter für Direktproben auf dem Teil 20 zu ergeben und sicherzustellen, daß ein wirksames Waschen der Probe und andere Zusätze auf dem Teil 20 bewerkstelligt wird.
Die Größe von Teil 22 und deshalb das Volumen des Teils von Behälter 10 unterhalb der Einschnürung ist bevorzugt so gewählt, daß die gesamte, der Vorrichtung während des Bestimmungsverfahrens zuzugebende Flüssigkeit in dem Absorptionsteil 22 aufgenommen und darin gehalten werden kann. Im Behälter 10 ist in der Nähe des Bodens eine Einrichtung zum Luftzutritt vorgesehen, beispielsweise kleine Öffnungen (in Fig. 1 nicht gezeigt), damit verdrängte Luft entweichen kann. Wahlweise kann man den Boden von Behälter 10 weglassen und die Flüssigkeit durch die Teile 20 und 22 eintreten und aus dem Behälter durch den Boden austreten lassen. Weil der Gegenstand jedoch ein Wegwerfartikel sein soll und zum Vereinfachen der Probenbeseitigung auf einfache und hygienische Weise ist die Verwendung eines Aufbaus bevorzugt, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist.
Wie bereits erwähnt wurde, kann das Teil 20 verwendet werden, um entweder zelluläres Material aus einer Probe auszufiltrieren oder als Träger für gebundenen Rezeptor gegenüber dem zu bestimmenden Liganden. In jedem Fall kann die flüssige Probe auf das Teil 20 durch Einführen durch die Öffnung 12 aufgebracht werden. Nach dessen Eindringen in das Teil 20 und nachdem die Flüssigkeit vom Absorptionsteil 22 durch und in sich hineingezogen wird, wird dem Teil 20 eine Lösung eines markierten Rezeptors durch die Öffnung 12 zugegeben.
Der markierte Rezeptor bindet sich dann an Liganden, die an den Rezeptor auf dem Teil 20 gebunden sind. Bei einem immunometrischen Assay - wenn an das Teil 20 ein monoklonaler Antikörper gebunden ist und der markierte Antikörper ebenfalls ein monoklonaler Antikörper ist - werden die zwei Antikörper so ausgewählt, daß sie sich an nicht interferierende Antigenbindungsstellen binden, wie es in der US-PS 4 376 110 und in der US-A-4 486 530 beschrieben ist.
Der lösliche Rezeptor ist bevorzugt mit einem Enzym markiert, obwohl unter entsprechenden Umständen auch andere herkömmliche Markierungen für Bestimmungsverfahren eingesetzt werden können. Beispielsweise kann auch eine Fluoreszenzmarkierung wie z. B. Fluoreszein oder Phycoerythrin oder ein Radionuklid verwendet werden. Brauchbare Markierungen sind beispielsweise auch Mikrobereiche, die mit einem farbigen Farbstoff oder mit fluoreszierenden Teilchen beladen sind. Andere brauchbare Markierungen sind beispielsweise Liposome oder andere Bläschen, die mit einem farbigen Farbstoff oder mit fluoreszierenden Teilchen beladen sind.
Nachdem die Lösung des markierten Rezeptors durch das Teil 20 gelaufen ist, wird auf das Teil 20 eine Waschlösung aufgebracht, um ungebundenen markierten Rezeptor aus dem Teil 20 heraus- und in Teil 22 hineinzuspülen. Der geneigte Aufbau der Wände 24 ergibt einen einstückigen Trichter zum leichterem Aufgeben der Waschlösung auf die Wände zum Entfernen von anhaftenden Rückständen der Lösung des markierten Rezeptors.
Der Zugabe der Lösung des markierten Rezeptors und der Waschlösung zum Teil 20 kann eine kurze Inkubationszeit vorangehen, um ein umfassenderes Binden durch Rezeptor oder Ligand in Lösungen zu ermöglichen, die auf oder in den Zwischenräumen des Teils 20 eingeschlossen sind und dadurch die Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens zu erhöhen. Es wurde jedoch gefunden, daß solche Inkubationsschritte entweder unnötig sind oder nur sehr kurz sein können, d. h. im allgemeinen in der Größenordnung von 60 Sekunden oder weniger. Der Fluß von Lösungen, die Ligand oder markierten Rezeptor enthalten, durch das Teil 20 führt zu einer wesentlich schnelleren Bindungsgeschwindigkeit, als man es ohne Fluß beobachtet.
Wenn die Rezeptormarkierung ein Enzym ist, wird dem Teil 20 nach Waschen des entfernten ungebundenen Rezeptors aus dem Teil 20 eine Lösung des Enzymsubstrats zugesetzt. Wenn der Zielligand entweder an Rezeptor gebunden ist, der an das Teil 20 gebunden ist, oder an zelluläres Material auf dem Teil 20, hat der Ligand an sich einen Teil des markierten Rezeptors gebunden. Das Enzym bringt dann das Substrat zur Rekation und erzeugt bei richtiger Auswahl eine visuelle Farbänderung.
Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von Zelluloseacetat als Material für das Absorptionsteil 22 dieses an seiner oberen Oberfläche markierten Rezeptor in unspezifischer Weise binden kann. Dementsprechend kann an dieser Oberfläche genau unter dem Teil 20 eine gewisse visuelle Farbänderung auftreten. Um zu vermeiden, daß diese Farbänderung durch das Teil 20 gesehen werden kann, ist ein Trennteil (in Fig. 1 mit 21 bezeichnet) aus porösem Polyethylen oder anderem Material, welches den Rezeptor nicht in unspezifischer Weise bindet, bevorzugt zwischen den Teilen 20 und 22 angeordnet.
Fig. 2 zeigt eine Draufsicht auf das Teil 20. Die gestrichelte Linie 26 stellt den äußeren Umfang des Bereichs 28 dar, in dem der Ligand gebunden wird. Dieser Bereich hat einen kleineren Durchmesser als der Durchmesser der Einschnürung, die von den Wänden 24 an ihrem engsten Punkt gebildet wird. Wenn deshalb als Rezeptormarkierung ein Enzym verwendet wird, können sich die folgenden Ergebnisse einstellen: (1) das Entstehen von mehr Farbe im Bereich 28 als am Umfang von Teil 20 wird als positives Ergebnis gelesen; (2) wenn im Teil 20 keine Farbentwicklung beobachtet wird, wird ein negatives Ergebnis gelesen; (3) wenn nach dem Waschen etwas markierter Rezeptor im Teil 2 verbleibt, kann eine mäßige Farbänderung auftreten, die über die gesamte sichtbare Oberfläche einheitlich ist. Ein solches Ergebnis wird ebenfalls als negativ interpretiert.
Das vorstehende ist eine allgemeine Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es wurde gefunden, daß sie brauchbar sind bei der Durchführung von Immunoassays, bei denen von der Probenzugabe bis zum Ablesen eines positiven Ergebnisses weniger als 5 Minuten verstreichen. Bei einem speziellen Beispiel wird dabei ein monoklonaler Antikörper gegen Human- Choriogonadotropin (HCG) - ein im Urin schwangerer Frauen mit erhöhten Werten vorkommendes Antigen - an eine poröse Nylonmembran unter Verwendung des Glutaraldehydverfahrens gebunden und in einen Behälter wie beispielsweise 10 in Figur 1 gegeben und dort von einem Absorptionsteil aus Zelluloseacetat gehalten, jedoch davon mit einer Scheibe aus porösem Polyethylen abgetrennt.
Urinproben (4 ml mit einem Gehalt von 0 und 50 mIU/ml an HCG) wurden auf die beschriebene Vorrichtung aufgebracht und durch die Teile 20 und 21 in das Absorptionsteil 22 eingezogen. Drei (3) Tropfen einer Lösung eines zweiten monoklonalen Antikörpers gegenüber HCG, an den alkalische Phosphatase gebunden ist, wurden dann zugegeben. Nach einer kurzen Inkubation von etwa einer Minute, während der das Konjugat durch das Teil 20 gezogen wird, wurden 4 ml Wasser zum Entfernen von ungebundenem Antikörper aus dem Teil 20 zugegeben. Auf diese Zugabe folgten drei Tropfen einer Indoxylphosphat enthaltenden Lösung, ein Substrat für alkalische Phosphatase. Innerhalb von zwei Minuten entstand keine Farbe in der Vorrichtung, die zum Messen der Probe verwendet wurde, die kein HCG enthielt (0 mIU/ml). Bei der Probe mit 50 mIU/ml HCG entwickelte sich innerhalb von dreißig Sekunden eine ausgeprägte blaue Farbe im Zentrum der Scheibe, die innerhalb von zwei Minuten dunkelblau wurde. Am Umfang der Scheibe entwickelte sich keine Farbe. Die gesamte Bestimmung benötigte etwa fünf (5) Minuten. Es ist zu sehen, daß die Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens durch Variieren des Volumens oder der Inkubationszeiten angepaßt werden kann.
Obwohl die Erfindung unter Verwendung als Bestimmungsverfahren oder unter Verwendung von HCG als Beispiel beschrieben wurde, ist klar, daß ein ähnliches Bestimmungsverfahren für ein anderes Antigen aufgebaut werden kann. Die gesamte Liste von Zielantigenen ist zu lange, um hier aufgeführt zu werden, es können jedoch Antigene wie beispielsweise IgE, prostatische saure Phosphatase, prostatisches spezifisches Antigen, Alphafetoprotein, karzinoembryonales Antigen, leutenisierendes Hormon, Kreatinkinase MB oder andere Antigene in Serum, Plasma, Urin oder anderen flüssigen Medien bestimmt werden. Zusätzlich können flüssige Proben bestimmt werden, die Material enthalten, welches gemeinsam mit Antigenen vorkommt, wie z. B. Antigene, die gemeinsam vorkommen mit Bakterien, Parasiten, Pilzen oder Viren unter Einschluß von beispielsweise Streptokokken der Gruppe A und B, Neisseria gonorrhea, Gardnerella vaginalis, Trichomonas, vaginalis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Hepatitis B und Zytomegalovirus, indem man als Teil 20 ein Filter verwendet, an welches für das Antigen spezifischer Antikörper gebunden ist. Der Zusatz einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers, der beispielsweise mit einem Enzym markiert ist, führt zu einer Bindung des Antikörpers an das Antigen. Waschen und Zusatz von Substrat ergibt die mit der Anwesenheit des markierten Antikörpers auf den Zellen in Zusammenhang stehende Farbänderung, die optisch bzw. visuell oder mit Hilfe eines Meßgeräts erfaßt werden kann.
Wenn man als Markierung etwas anderes als ein Enzym verwendet, kann das Verfahren variiert werden. Bei Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung könnte die Fluoreszenz der Membran gemessen werden. Bei Verwendung einer Radionuklidmarkierung wie beispielsweise ¹²&sup5;I kann die Membran entfernt und ausgezählt werden.
Die vorstehenden Ausführungen befassen sich mit der Anwendung der Erfindung auf sequentielle immunometrische Bestimmungsverfahren mit monoklonalen Antikörpern d. h. auf einen Immmunoassay unter Verwendung eines ersten Rezeptors mit monoklonalem Antikörper auf dem porösen Teil und eines zweiten Rezeptors mit monoklonalem Antikörper, welcher markiert ist. Auf das poröse Teil wird die Probe gefolgt von markiertem Antikörper aufgegeben. Andere Varianten des Bestimmungsverfahrens sind möglich. Beispielsweise bei einem immunometrischen Bestimmungsverfahren können der markierte Antikörper und die Probe vor dem Aufgeben auf das poröse Teil vermischt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch in Bestimmungsverfahren für einen Antikörper verwendet werden, die ein Antigen als ersten Rezeptor auf der festen Phase verwenden und die als zweiten Rezeptor markiertes Antigen oder markierten anti-Antikörper verwenden. Letzteres ist besonders geeignet bei allergiespezifischen Bestimmungsverfahren, wo der erste Rezeptor ein an das poröse Teil gebundenes Allergen und der zweite Rezeptor ein Antikörper gegenüber IgE ist, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. In anderen Fällen kann in ähnlicher Weise die IgG-Antwort auf Allergene gemessen werden, d. h. unter Verwendung eines Antikörpers wie beispielsweise eines monoklonalen Antikörpers gegenüber IgG als zweiten Rezeptor. Andere auf diese Weise ausführbare Antikörpertests sind beispielsweise Tests für Antikörper gegenüber Herpes, Rubella, Hepatitis, Zytomegalovirus und HTL-III.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Vorrichtung zur Durchführung kompetitiver Bestimmungsverfahren verwendet, d. h. Bestimmungsverfahren, bei denen der Ligandenrezeptor an das poröse Teil gebunden ist und bei denen der Ligand in der Probe mit einer festgesetzten Menge von markiertem Liganden in Konkurrenz tritt, die der Probenlösung zugesetzt sind oder nach der Probenzugabe zugesetzt werden. Kompetitive Immunoassays werden herkömmlicherweise auf diese Art unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt, beispielsweise einer Zubereitung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, der als Rezeptor an die feste Phase gebunden ist. Vor der Probenzugabe auf das poröse Teil kann der Probe markiertes Antigen zugesetzt werden. Alternativ kann es nach dem Zusatz der Probe oder zusammen mit ihr zugegeben werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch zum Bestimmen eines Enzyms verwendet werden, indem der Rezeptor des Enzyms an das poröse Teil als Rezeptor des Bestimmungsverfahrens gebunden wird. Man kann einen markierten Antikörper gegenüber dem Enzym verwenden, um die Bildung eines Rezeptor/Enzym-Komplexes auf dem porösen Teil zu erfassen.
Das poröse Teil kann auch auf einem Oligomer einer Nukleinsäure als Sonden-Rezeptor für Nukleinsäure-Material in einer Probe aufgebaut sein. Die Sonde kann ein DNA-Oligomer sein, welches beispielsweise zu einer Sequenz in der interessierenden Nukleinsäure komplementär ist und kann dazu verwendet werden, je nach Fall entweder RNA oder DNA als Liganden zu binden. Das Erfassen des Liganden/Rezeptor-Komplexes kann erfolgen unter Verwendung eines zweiten Nukleinsäureoligomers, welches zu einem nicht interferierenden Bereich des interessierenden Nukleinsäureliganden komplementär ist, wobei das zweite Oligomer zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann an das poröse Teil anti-Rezeptor gebunden sein. Soweit hier verwendet, soll der Begriff "anti-Rezeptor" Agenzien bedeuten, die sich selektiv an den Rezeptor eines Liganden/Rezeptor-Paares binden. Wenn beispielsweise der Ligand ein Antigen und der Rezeptor ein Antikörper ist - beispielsweise ein Maus-IgG-Antikörper (bevorzugt ein monoklonaler Antikörper) -, kann der anti-Rezeptor ein Antikörper gegenüber Murin-IgG sein, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. In anderen Fällen kann der Rezeptor mit einem Anteil konjugiert sein, der sich selektiv dem anti-Rezeptor bindet. Beispielsweise kann der Teil ein Hapten und der anti-Rezeptor ein Antikörper gegenüber dem Hapten sein. Ein bevorzugtes Hapten dieser Art ist Fluoreszein. In anderen Fällen kann der anti-Rezeptor Avidin sein. In diesem Fall hat der Rezeptor Biotin an sich gebunden. In anderen Fällen kann der Rezeptor ein Nukleinsäureoligomer sein oder ein solches Oligomer an sich gebunden haben, und der anti-Rezeptor kann ein Nukleinsäuresegment sein, welches zu einem Teil des Rezeptoroligomers komplementär ist, des die Bindung des Rezeptors mit dem Liganden nicht beeinträchtigt. Dem Fachmann wird aus Vorstehenden deutlich, daß eine Vielzahl von anti- Rezeptor/Rezeptor-Kombinationen eingesetzt werden können.
Bei Verwendung eines anti-Rezeptors kann die Probe auf vielfältige Weise untersucht werden. Beispielsweise bei einem "sandwich assay" können der erste und der - markierte - zweite Rezeptor mit der Probe kombiniert werden, um vor dem Aufbringen auf das poröse Teil Liganden zu binden. Alternativ können der erste Rezeptor und die Probe vor dem Aufgeben auf das poröse Teil kombiniert werden oder zuerst der Rezeptor und dann die Probe zugegeben werden, gefolgt von der Zugabe des markierten Rezeptors. Bei solchen Sandwichassays wird der anti-Rezeptor so ausgewählt, daß er den ersten Rezeptor bindet und nicht den markierten Rezeptor.
Die Verwendung eines an das poröse Teil gebundenen anti-Rezeptors ermöglicht ein Vereinfachen von Entwicklung und Herstellung des in Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren brauchbaren porösen Teils. Wenn beispielsweise der Rezeptor an das poröse Teil gebunden ist, kann es erforderlich sein, das Bindungsverfahren zu modifizieren, um die Bindung eines jeden Rezeptors zu optimieren, der für ein Feld von Bestimmungsverfahren erforderlich ist. Bei vielen Bestimmungsverfahren ist jedoch ein einfacher, an das poröse Teil gebundener anti-Rezeptor einsetzbar. Deshalb ergibt sich eine außerordentliche Vereinfachung des Entwicklungsaufwandes und der Herstellungsverfahren, wenn ein solches "universelles" poröses Teil möglich ist.

Claims

1. Vorrichtung zur Verwendung in einem Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum Erfassen der Anwesenheit oder Konzentration eines Zielliganden in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung aufweist:

a) ein poröses erstes Teil (20), welches eine obere und eine untere Oberfläche aufweist und in der Vorrichtung so angeordnet ist, daß die Probe auf der oberen Oberfläche aufgebracht werden kann, und wobei mindestens ein erster, zum Binden des Zielliganden befähigter Rezeptor oder mindestens ein Antirezeptor, der zum Binden eines ersten, zum Binden des Zielliganden befähigten Rezeptors befähigt ist, direkt oder indirekt innerhalb eines Bereiches gebunden ist, der kleiner ist als der Bereich des Teils, auf den die Probe aufgebracht werden kann; und

b) ein einen Körper aus Absorptionsmaterial darstellendes zweites Teil (22), welches eine Oberfläche aufweist, über der die untere Oberfläche des ersten Teils angeordnet ist und welches durchlaufende Kapillaren in einer Richtung aufweist, die im wesentlichen quer zur Oberfläche verläuft, über der das erste Teil angeordnet ist, wobei die Kapillaren mit den Poren der unteren Oberfläche des ersten Teils in Verbindung stehen, um Flüssigkeit, die auf die obere Oberfläche des ersten Teils aufgegeben wurde und in das erste Teil eingedrungen ist, in die Kapillaren des zweiten Teils hineinzuziehen, wobei das erste und das zweite Teil in der Vorrichtung so angeordnet sind, daß vor und während der Zugabe einer Flüssigkeit zur Vorrichtung bei der Bestimmung, zwischen ihnen eine Verbindung aufgebaut bzw. aufrechterhalten wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste Teil eine Membrane oder ein Filter ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Enzymen und Nukleinsäure-Oligomeren.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Enzymrezeptoren und Nukleinsäure- Oligomeren.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der erste Rezeptor ein DNA-Oligomer, eine polyklonale Antikörperzubereitung oder ein monoklonaler Antikörper ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der erste Rezeptor ein Antigen und der Zielligand ein Antikörper gegenüber dem Rezeptor ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei das Antigen ein Allergen und der Antikörper ein Antikörper gegenüber dem Allergen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der Antikörper ein IgE oder IgG ist.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das poröse erste Teil aus einem Material besteht, welches ausgewählt ist aus Glas oder Nylon.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung weiter einen Behälter (10) für das erste und das zweite Teil aufweist, der eine Öffnung zum Ermöglichen der Zugabe der Bestimmungsreagenzien auf die obere Oberfläche des ersten Teils aufweist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Öffnung weiter einen Bereich mit nach innen geneigten Seiten aufweist, um einen Trichter zum Richten der zugegebenen Reagenzien auf die obere Oberfläche des ersten Teils zu definieren.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Boden des Behälters geschlossen ist und der Behälter entlüftet wird, um das Austreten von von den zugegebenen Reagenzien verdrängter Luft zu ermöglichen.

13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an das poröse erste Teil mindestens ein erster Rezeptor gebunden ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei an das erste Teil ein Antirezeptor gebunden ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei der erste Rezeptor ein Antikörper und der Antirezeptor ein Antikörper zum ersten Rezeptor ist, oder wobei der erste Rezeptor mit einem Hapten konjugiert und der Antirezeptor ein Antikörper gegenüber dem Hapten ist oder wobei der erste Rezeptor zu Biotin konjugiert und der Antirezeptor Avidin ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei der Rezeptor mit einem Hapten konjugiert ist und das Hapten Fluoreszein ist.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der Antirezeptor ein monoklonaler Antikörper ist.

18. Bestimmungsverfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder der Konzentration eines Zielliganden in einer flüssigen Probe, bei dem man

a) eine flüssige Probe, von der man vermutet, daß der Zielligand darin enthalten ist, auf die obere Oberfläche des ersten porösen Teils einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 aufbringt, wobei das erste Teil ein Teil ist, an welches ein erster Rezeptor für den Liganden gebunden ist;

b) auf die obere Oberfläche einen zweiten Rezeptor aufbringt, der zum Binden des Zielliganden befähigt ist, wobei der zweite Rezeptor zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist;

c) nicht gebundenen zweiten Rezeptor abtrennt; und

d) die Anwesenheit oder Konzentration eines Zielliganden durch Erfassen des zweiten Rezeptors bestimmt, der - falls vorhanden - an den Liganden gebunden ist, der an den ersten Rezeptor gebunden ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der erste, an die poröse Membran gebundene Rezeptor ausgewählt wird aus Antigenen, Antikörpern, Enzymrezeptoren und Nukleinsäure- Oligomeren.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der erste Rezeptor und der zweite Rezeptor die Liganden an nicht interferierenden Stellen binden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Zielligand ein Nukleinsäure-Oligomer ist und der erste und der zweite Rezeptor komplementäre Nukleinsäure-Oligomere sind oder der Zielligand ein Antigen ist und der erste und der zweite Rezeptor monoklonale Antikörper sind oder der Zielligand ein Antikörper ist und der erste und der zweite Rezeptor Antigene sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Rezeptoren DNA- Oligomere sind und der Zielligand ein DNA-Oligomer oder ein RNA-Oligomer ist oder der Zielligand ein Antikörper ist und der erste Rezeptor ein Antigen ist und der zweite Rezeptor ein Antikörper gegenüber dem Ziel-Antikörper ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Zielligand ein IgE oder ein IgG ist und der erste Rezeptor ein Antigen ist, welches ein Allergen darstellt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Zielligand ein IgE ist und der zweite Rezeptor ein monoklonales Anti- IgE ist oder wobei der Zielligand IgG ist und der zweite Rezeptor ein Anti-IgG ist.

25. Bestimmungsverfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder der Konzentration eines Zielliganden in einer flüssigen Probe, unter Einsatz einer Vorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei an das poröse Teil ein Antirezeptor zu einem ersten Rezeptor für den Zielliganden gebunden ist, wobei man

a) auf die obere Oberfläche des porösen ersten Teils den ersten, zum Binden des Zielliganden befähigten Rezeptor und die flüssige Probe aufbringt, von der man vermutet, daß der Zielligand darin enthalten ist;

b) auf die obere Oberfläche einen zweiten, markierten Rezeptor aufbringt;

c) den nicht gebundenen zweiten Rezeptor abtrennt; und

d) die Anwesenheit oder Konzentration des Zielliganden bestimmt, in dem man gebundenen, markierten zweiten Rezeptor erfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Zugabe der flüssigen Probe auf die Zugabe des ersten Rezeptors folgt.

27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei man den ersten Rezeptor und die flüssige Probe vor der Zugabe zum porösen Teil vermischt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25, 26 und 27, wobei man den zweiten Rezeptor dem porösen ersten Teil nach der Zugabe der flüssigen Probe zusetzt.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25, 26 und 27, wobei man den markierten zweiten Rezeptor der flüssigen Probe vor der Zugabe der flüssigen Probe auf den porösen ersten Teil zusetzt.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei der Antirezeptor ein Antikörper ist.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei man ungebundenen markierten zweiten Rezeptor durch Waschen abtrennt.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 16, 17, 18, 25, 26, 27, 28 und 29, wobei der Zielligand ein Antigen, Antikörper, Enzym oder ein Nukleinsäure-Oligomer ist.