DE3586304T2 - Verfahren zur herstellung von proteinen und transformierten zellen und dna-konstruktionen zur korrektur von mankos und wirtszellen sowie deren herstellung und verwendung. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von proteinen und transformierten zellen und dna-konstruktionen zur korrektur von mankos und wirtszellen sowie deren herstellung und verwendung.Info
- Publication number
- DE3586304T2 DE3586304T2 DE8585303702T DE3586304T DE3586304T2 DE 3586304 T2 DE3586304 T2 DE 3586304T2 DE 8585303702 T DE8585303702 T DE 8585303702T DE 3586304 T DE3586304 T DE 3586304T DE 3586304 T2 DE3586304 T2 DE 3586304T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- gene
- plasmid
- dna
- host cell
- host
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 145
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 227
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 71
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 68
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 29
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 18
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 101150026646 CDC4 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 10
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 claims description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 6
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 claims description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 101150039048 GCR1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 108010029692 Bisphosphoglycerate mutase Proteins 0.000 claims 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 claims 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 claims 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 102000011025 Phosphoglycerate Mutase Human genes 0.000 claims 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims 1
- 101900104102 Schizosaccharomyces pombe Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 102
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 49
- 101150032817 TPI1 gene Proteins 0.000 description 43
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 41
- 101001060231 Homo sapiens F-box/WD repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 description 41
- 102100028138 F-box/WD repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 description 40
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 31
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 29
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 25
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 25
- 101150014925 POT1 gene Proteins 0.000 description 19
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 15
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 10
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000714205 Woolly monkey sarcoma virus Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101710112083 Para-Rep C1 Proteins 0.000 description 5
- 102100022881 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710119887 Trans-acting factor B Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100102100 Drosophila melanogaster uri gene Proteins 0.000 description 4
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 4
- 101150044775 LYS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101710084218 Master replication protein Proteins 0.000 description 4
- 101000708578 Milk vetch dwarf virus (isolate N) Para-Rep C3 Proteins 0.000 description 4
- 101710112078 Para-Rep C2 Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022880 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710119961 Trans-acting factor C Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 108700021031 cdc Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 108700021652 sis Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 101000760646 Homo sapiens Phosphatidylserine lipase ABHD16A Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102100024634 Phosphatidylserine lipase ABHD16A Human genes 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 101000845167 Woolly monkey sarcoma virus PDGF-related-transforming protein sis Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100058229 Arabidopsis thaliana BEL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150085381 CDC19 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 235000013175 Crataegus laevigata Nutrition 0.000 description 1
- XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N D-fructose 1,6-bisphosphate Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(=O)COP(O)(O)=O XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102100030960 DNA replication licensing factor MCM2 Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101710198391 Hexokinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030338 Hexokinase-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710198385 Hexokinase-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029242 Hexokinase-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000583807 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM2 Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100234604 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ace-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093629 PYK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004135 animal tissue culture Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000009849 cataract 37 Diseases 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N fructose-1,6-phosphate Natural products OC1C(O)C(O)(COP(O)(O)=O)OC1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 1
- 229940012229 genone Drugs 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 1
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 230000013120 recombinational repair Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 101150003680 rep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
- C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
- Die Verwendung von Mikroorganismen für die Herstellung nützlicher Polypeptid-Produkte durch rekombinante DNA-Technologie ist dabei, sich als eine Industrie zu etablieren. Fremdes genetisches Material kann in eine Kultur von Mikroorganismen eingebracht werden, und die richtigen intrazellulären und extrazellulären Bedingungen vorausgesetzt, kann (können) das (die) gewünschte(n) Protein-Produkt(e) aus dem (den) fremden Gen(en) synthetisiert werden. Solches genetisches Material wird üblicherweise in Form von Plasmiden. die autonom replizierende extrachromosomale Elemente sind, in Mikroorganismen eingebracht. Um die Erhaltung von Plasmiden in einer Kultur transformierter Zellen sicherzustellen, ist es notwendig gewesen, diese Zellen unter speziellen Bedingungen zu züchten. Bei Nicht-Vorhandensein solcher Bedingungen werden Plasmide, die inhärent instabil sein können, nicht erhalten. und die Zellpopulation wird zum nichttransformierten Zustand zurückkehren.
- Erhöhte Plasmidstabilität und Kopienzahl sind für die Biotechnologie-Industrie als ein Mittel zum Halten der Produktion von plasmidkodierten Proteinen auf einem konstant hohen Niveau wichtig. Früher mitgeteilte Versuche, Plasmidstabilität zu erhöhen, scheinen für kommerzielle Anwendung nicht optimal zu sein. Es hat sich gezeigt, daß die Einführung von Hefe-Centromeren in ARS-tragende Plasmide, obgleich dies die Stabilität erhöht, die Plasmid-Kopienzahl merkbar senkt (Clarke und Carbon, Nature 287: 504-509, 1980 und Stinchcomb, et al., J. Molec. Biol. 158; 157-179, 1982). Lineare centromere Hefeplasmide zeigen in ähnlicher Weise eine inverse Beziehung zwischen Stabilität und Kopienzahl (Murray und Szostak, Nature 305: 189-193, 1983).
- Plasmide enthalten typischerweise Gensequenzen, bekannt als selektionierbare Marker, die Antibiotika-Resistenz kodieren oder Nährstoffanforderungen der Wirtszelle komplementieren. Um auf das Vorhandensein solcher Plasmide zu selektionieren, müssen transformierte Zellen somit in speziellen Medien gezüchtet werden, die eine selektive Droge enthalten oder die an spezifischen Nährstoffen abgereichert sind. Diese Medienanforderungen können sowohl teuer sein als auch optimalen Zellwachstumsgeschwindigkeiten während des Fermentationsprozesses im Großmaßstab entgegenstehen. Über viele solcher Plasmide ist in der Literatur berichtet worden. Diejenigen, die Antibiotika-Resistenz-Gene umfassen, schließen pBR322 (Bolivar, et al., Gene 2: 95-113, 1977) und seine Derivate, wie etwa die pUC-Vektoren (Vieira und Messing, Gene 19: 259- 268, 1982), die ein Gen für Ampicillin-Resistenz tragen; und pBR325 (Prentki, et al., Gene 14: 289, 1981), das Resistenz- Gene für Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol trägt, ein. Plasmide, die Nährstoffanforderungen des Wirtes komplementieren, schließen die Hefevektoren YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121-133, 1979), das das LEU2-Gen trägt; und YRp7' (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39, 1979), das das TRP1-Gen trägt, ein.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Bereitstellung von DNA-Konstruktionen, die, als selektionierbare Marker, Gen- Sequenzen enthalten, deren Produkte für die Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum der Wirtszelle auf Komplexmedien wesentlich sind.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Bereitstellung von transformanten Mikroorganismenstämmen, die Plasmide enthalten, die durch Wachstum auf Komplexmedien selektionierbar sind.
- Außerdem ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Mikroorganismenstämmen, denen wesentliche Funktionen fehlen und die als Wirte für DNA-Konstruktionen dienen können, die Gen-Sequenzen tragen, die diese fehlenden wesentlichen Funktionen komplementieren.
- Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung fremder Proteine in transformierten Mikroorganismen, wobei die Proteine die Produkte von Genen sind, die auf DNA-Konstruktionen liegen, die, als selektionierbare Marker, Gen-Sequenzen enthalten, die ein Manko in einem wesentlichen Gen im Wirtsmikroorganismus komplementieren.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden DNA-Konstruktionen und geeignete Wirtszellen zur Verfügung gestellt, so daß die Konstruktionen bei hoher Kopienzahl ohne die Notwendigkeit spezieller selektiver Medien erhalten werden. Wachstum unter solchen Bedingungen kann zu schnellerer Zellteilung, größerer Zelldichte und verringerten Herstellungskosten führen.
- Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Proteinprodukten in einer Wirtszelle zur Verfügung, die ein Manko in einer für normales Zellwachstum in Komplexmedien notwendigen Funktion aufweist, welches den Schritt der Transformation der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül umfaßt, das ein Gen, welches das Manko komplementiert, und eine Sequenz, die für das (die) Proteinprodukt(e) kodiert, umfaßt. Das vorliegende Verfahren stellt auch DNA- Konstruktionen, insbesondere Plasmide, und transformante Stämme, die diese Konstruktionen enthalten, zur Verfügung.
- Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "DNA-Konstruktion" jedes DNA-Molekül, das vom Menschen in einer Weise modifiziert worden ist, daß die Nukleotidsequenzen im Molekül nicht identisch mit einer Sequenz sind, die natürlicherweise produziert wird. Der Ausdruck "DNA-Konstruktion" schließt auch Klone von DNA-Molekülen ein, die so modifiziert worden sind. Der Ausdruck "Expressionsvektor" ist als eine DNA- Konstruktion definiert, die eine autonome Replikationsstelle, eine Transkriptionsinitiationsstelle und wenigstens ein Strukturgen, das für ein Protein kodiert, das im Wirtsorganismus exprimiert werden soll, einschließt. Der Expressionsvektor wird üblicherweise auch geeignete Kontrollregionen enthalten, wie etwa einen Promotor und Terminator, die die Expression des Proteins im Wirtsorganismus kontrollieren. Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung werden auch einen Selektionsmarker enthalten, der ein essentielles Gen, wie es hier beschrieben ist, umfaßt.
- Der Ausdruck "Plasmid" wird seine allgemein akzeptierte Bedeutung haben, d.h. autonom replizierende DNA mit üblicherweise geschlossener Schleife.
- In den beiliegenden Zeichnungen:
- Figur 1 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pB4.
- Figur 2 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pB5.
- Figur 3 veranschaulicht die Konstruktion von Plasnid pB15L.
- Figur 4 zeigt einen Southern-Transfer von DNA aus S. cerevisiae-Stamm A2.7.c, co-transfomiert mit den Plasmiden pB5 und pB15L. Der Transfer wurde mit einem 2,5 kb BamHI- HindIII-Fragment aus der 5' -Flankenregion von CDC4 gesondet, um auf Bruch des genomischen CDC4-Locus zu testen. Spur a enthält DNA aus Zellen, die allein mit pB5 transformiert sind; Spur b nicht-transformierte Zellen; Spuren c-h Co- Transformanden. Pfeile zeigen die an die Sonde hybridisierenden genomischen Fragmente.
- Figur 5 zeigt die Sequenzen von S. pombe-POT1- und S. cerevisiae-TPI1-Genen zusammen mit den entsprechenden abgeleiteten Proteinsequenzen. Die gesamte S. pombe-TPI-Proteinsequenz ist angegeben. Die Sequenz des S. cerevisiae-Proteins ist nur dort angegeben, wo sie sich von der S. pombe-Sequenz unterscheidet. Das Methionin an Position 1 in der S. cerevisiae-Proteinsequenz ist im reifen Protein nicht vorhanden.
- Figur 6 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pCPOT.
- Figur 7 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pFATPOT.
- Figur 8 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pUCTPI- LEU2.
- Figur 9 zeigt einen Teil der Polylinker-Sequenz von Plasmid pIC19R.
- Figur 10 veranschaulicht Plasmid pMPOT2.
- Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, daß essentielle Gene als selektionierbare Marker auf DNA-Konstruktionen, wie etwa Plasmiden, verwendet werden können. Ein "essentielles Gen" ist definiert als jedes Gen, das für eine für die Zell-Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum auf Komplexmedien notwendige Funktion kodiert. Komplexmedien sind diejenigen Medien, in denen die Nährstoffe aus Produkten abgeleitet sind, deren Zusammensetzung nicht wohldefiniert ist, wie etwa rohe Zellextrakte, Fleischextrakte, Fruchtsaft, Serum, Proteinhydrolysate, etc.. Um daher auf einen gewünschten Transformanden gemäß der vorliegenden Erfindung zu selektionieren, wird das Selektions-Nährmedium lediglich ein konventionelles Komplex-Nährmedium sein, nicht ein Spezialmedium, das ein relativ teures Antibiotikum, einen Metallantagonisten oder ein anderes, für die nicht-transformierte Wirtszelle letales Mittel enthält oder dem ein oder mehrere spezifische Nährstoffe fehlen, die der nichttransformierte Wirt benötigt. Essentielle Gene schließen Gene ein, die für Zellteilung, Membranbiosynthese, Zellwandbiosynthese, Organellenbiosynthese, Proteinsynthese, Kohlenstoffquellennutzung, RNA-Transkription und DNA-Replikation erforderlich sind, sind aber nicht darauf beschränkt.
- Um ein essentielles Gen als einen selektionierbaren Marker auf einer DNA-Konstruktion, wie etwa einem Plasmid, zu verwenden, ist es notwendig, einen geeigneten mutanten Wirtszellstamm bereitzustellen. Unter Verwendung der einstufigen Methode von Rothstein zum Aufbrechen von Genen (Meth. in Enzymology 101: 202-210, 1983) oder des hier beschriebenen Co-Transformationsverfahrens können geeignete Wirtsstämme konstruiert werden, die Deletionen in einem geeigneten essentiellen Gen in Genom tragen. Solche Deletionsmutanten wachsen, wenn die Mutation durch eine Funktion komplementiert wird, die von plasmid- getragenem genetischen Material kodiert ist. Es ist bevorzugt, daß die Deletionen in dem (den) essentiellen Gen(en) des Genoms des Wirtes substantielle Segmente der Kodierungsregion und/oder der Flankenregionen umfassen. Wenn die Mutation oder die Mutationen im essentiellen Gen auf eine Weise erreicht werden, daß nur Punktmutationen erzielt werden, besteht eine Wahrscheinlichkeit, dar die mutante Wirtszelle durch einen Rekombinations- Reparaturmechanismus zum Wildtyp zurückkehren wird, wodurch die durch Verwendung des plasmidgetragenen Gens erreichbare Selektivität verringert oder beseitigt wird.
- Essentielle Gene existieren oft in multiplen Kopien (wie etwa Histon- oder ribosomale RNA-Gene) und/oder in multiplen, verwandten Formen, genannt Genfamilien (wie etwa verschiedene Hexokinase-Gene oder verschiedene DNA-Polymerase-Gene). In solchen Fällen können diese redundanten Funktionen sequentiell mutiert werden, um eine Wirtszelle herzustellen, der es mehrfach an einer gegebenen wesentlichen Funktion fehlt. Durch Verwendung eines High-Copy-Number-Plasmids, um die Aktivität des Gens zu erhöhen, kann jedoch ein einzelnes essentielles Gen auf einem Plasmid multiple Wirtszell-Mankos komplementieren. Ein High-Copy-Number-Plasmid ist wünschenswert, weil ein Anstieg in der Kopienzahl eines klonierten fremden Gens zu einem Ansteig in der Produktion des Proteinproduktes, das von besagtem Gen kodiert wird, führen kann.
- Die Selektion auf Transformanden, die eine hohe Kopienzahl von Plasmiden mit essentiellen Genen enthalten, kann durch Reduzieren der Expressionsniveaus jeden plasmidgetragenen essentiellen Gens und/oder durch Reduzieren der Aktivitäten der Genprodukte, die von den plasmidgetragenen selektionierbaren Markern kodiert werden, erreicht werden. Ein Ansatz besteht darin, die essentiellen Gene so zu mutieren, daß die Transkriptions- und/oder Translationsraten der Gene reduziert werden oder daß die Genprodukte so verändert werden, daß sie niedrigere spezifische Aktivitäten besitzen. Eine andere Methode zum Absenken der Expressionniveaus von essentiellen Genen, die als selektionierbare Marker verwendet werden, besteht darin, ein Gen aus einem anderen Organismus zu verwenden, um Defekte in der Wirtszelle zu komplementieren. Solche fremden Gene können natürlicherweise einen Defekt für die Expression in einer Wirtszelle aufweisen, weil die Signale für Transkription und/oder Translation in verschiedenen Spezies suboptimal sein können oder das Genprodukt kann verringerte Aktivität besitzen, weil es sich in einem fremden Zellmilieu befindet.
- Es existiert ein weiter Bereich von Funktionen, die für die Zell-Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum auf Komplexmedien notwendig sind. Ein Defekt oder eine Deletion in einem essentiellen Gen kann zu Letalität, einer Abnahme in der Zellteilungsrate, Stillstand von Zellteilung, Abbruch von DNA-, RNA- oder Proteinsynthese, Abbruch von Membransynthese, Abbruch von Zellwandsynthese, Abbruch von Organellensynthese, Defekten im Zuckermetabolismus, etc. führen. Beispiele von essentiellen Genen schliefen die CDC (Zellteilungszyklus)- Gene der Hefe Saccharomyces cerevisiae (für einen Überblick s. Pringle und Hartwell, "The Saccharomyces cerevisiae Cell Cycle", in Strathern, et al., Hrg., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Life Cycle and Inheritance, 97-142, Cold Spring Harbor, 1981), die Gene, die für Funktionen des Glycolyseweges von S. cerevisiae und E. coli kodieren, und die SEC-(Novick und Schekman, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76: 1856-1862, 1979 und Novick, et al., Cell 21: 205-215, 1980) und INO- (Culbertson und Henry, Genetics 80: 23-40, 1975) - Gene von S. cerevisiae ein.
- Eine bevorzugte Klasse von Wirtszellen mit einem Manko an einem essentiellen Gen enthält Defekte in den CDC-Genen, bekannt als cdc-Mutationen, was zu stufenspezifischen Hemmungen des Zellteilungszyklus führt. Die meisten cdc-Mutationen bewirken die vollständige Blockierung von Ereignissen, die für den Zellzyklus wesentlich sind, indem sie entweder die Synthese oder die Funktion der besonderen CDC-Genprodukte beeinflussen. Solche Mutationen können durch ihre Wirkungen auf Ereignisse identifiziert werden, die biochemisch oder morphologisch überwacht werden können. Die meisten bekannten cdc-Mutationen sind konditionell letale (d.h., temperaturempfindliche) Mutationen, was zum Stillstand der normalen Entwicklung von unter restriktiven Bedingungen gezüchteten mutanten Zellen führt. Der aus einer cdc-Mutation resultierende primäre Defekt muß jedoch nicht ein Defekt in einer stufenspezifischen Funktion per se sein. Zum Beispiel können kontinuierlich synthetisierte Genprodukte stufenspezifische Funktionen besitzen; ein Defekt im Hefe-Glycolyse-Gen PYK1 (für das Enzympyruvat-Kinase) ist allelisch zur Zellteilungszyklus-Mutation cdc19 (Kawasaki, Ph.D. Thesis, University of Washington, 1979). Diese Mutation führt zum Zellzyklus-Stillstand in der G1-Phase von Zellen, die im typischen Hefe-Komplexmedium YEPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Baktopepton und 2 % Dextrose) inkubiert werden. Ob also die cdc-Mutation zu einem Defekt in einer stufenspezifischen Funktion führt oder ob sie eine Hemmung oder eine unbrauchbarmachende Mutation eines Genprodukts mit einer stufenspezifischen Funktion bewirkte, kann die Wirkung des Defekts kann überwacht werden.
- Pringle und Hartwell (ebd.) beschreiben die Funktion von ungefähr 51 CDC-Genen. Zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung können solche Gene aus Genbibliotheken durch Komplementation in einem Stamm, der die gewünschte Mutation trägt, isoliert werden. Genbibliotheken können mit allgemein bekannten Verfahren konstruiert werden (z.B. Nasmyth und Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2119- 2123, 1980; und Nasmyth und Tatchell, Cell 19: 753-764, 1980). Stämme, die die gewünschte cdc-Mutation tragen, können, wie hier beschrieben, hergestellt werden oder können von der Öffentlichkeit zugänglichen Hinterlegungsstellen erhalten werden, wie etwa der American Type Culture Collection und dem Berkeley Yeast Stock Center.
- Eine zweite bevorzugte Klasse von essentiellen Genen sind diejenigen, die Produkte kodieren, die in den Glykolyse-Weg einbezogen sind, einschließlich Genen, die für Stoffwechselenzyme und für Steuerfunktionen kodieren. Beispiele von Glykolyse-Weg-Genen in S. cerevisiae, die identifiziert worden sind, sind das Glykolyse-Steuerungs-Gen GCR1 und die Gene, die für die Enzyme Triose-Phosphat-Isomerase, Hexokinase 1, Hexokinase 2, Phosphoglucose-Isomerase, Phosphoglycerat-Isomerase, Phosphorfructo-Kinase-Endolase, Fructose 1, 6-Bisphosphat-Dehydrogenase und Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase kodieren. Wie oben angegeben, ist das Pyruvat- Kinase-Gen von Kawasaki identifiziert und beschrieben worden. Ein Plasmid, das ein Hefe-Phosphoglycerat-Kinase-Gen und begleitende Steuerungssignale enthält, ist von Hitzeman, et al. (J. Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980) beschrieben worden. Isolierung und Sequenzierung des Hefe-Triose-Phosphat-Isomerase-Gens TPI1 ist von Alber und Kawasaki (J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982) und von Kawasaki und Fraenkel (Biochem. Biophys. Res. Comm. 108: 1107-1112, 1982) beschrieben worden.
- Ein besonders bevorzugtes Glykolyse-Gen ist TPI1, das für die Hefe-Triose-Phosphat-Isomerase kodiert, ein Enzym, das die gegenseitige Umwandlung von Glyceraldehyd-3-phosphat und Dihydroxyaceton-3-phosphat katalysiert und daher für Glykolyse und Gluconeogenese wesentlich ist. In S. cerevisiae kodiert der einzelne genetische Locus, TPI1, für diese Funktion. Zellen, die Mutationen in TPI1 tragen, wachsen auf Glukose überhaupt nicht und auf anderen Kohlenstoffquellen schlecht.
- Das S. cerevisiae-TPI1-Gen wurde durch Komplementation der tpi1-Mutation isoliert (Alber und Kawasaki, ebd., und Kawasaki und Fraenkel, ebd.). Das Triose-Phosphat-Isomerase- Gen aus der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (POT1) ist durch Komplementation derselben S. cerevisiae-Mutation isoliert und, wie in Fig. 5 dargestellt, sequenziert worden. Sequenzierung des S. pombe-Gens, als POT1 bezeichnet, hat bewiesen, dar das S. pombe-TPI-Protein zum TPI-Protein von S. cerevisiae homolog ist.
- Während im Normalfall das essentielle Gen, das in der DNA- Konstruktion (Plasmid) eingesetzt wird, ein Wildtyp-Gen aus der Wirtsspezies sein wird, wird es in einigen Fällen bevorzugt sein, ein essentielles Gen zu verwenden, das zur Wirtszelle fremd ist, weil das fremde Gen natürlicherweise fehlerhaft sein kann und dadurch auf hohe Plasmid-Kopienzahl selektionierbar. Als ein Beispiel eines solchen fremden essentiellen Gens, das verwendet wird, zeigt eines der Beispiele hierin, dar das s. pombe-POT1-Gen effektiv als ein selektionierbarer Marker in einem S. cerevisiae-Wirt verwendet werden kann.
- Die DNA- Konstruktionen gemäß der vorliegenden Erfindung, die essentielle Gene als selektionierbare Marker enthalten, werden in mutante Wirtszellen transformiert werden, die in der Funktion des essentiellen Gens fehlerhaft sind. Richtig mutierte Wirtszellen müssen entweder hergestellt werden oder können ohne weiteres von einer öffentlichen Hinterlegungsstelle erhältlich sein. Mutation der Wildtyp-Zelle, um einen richtigen Mutanten zu erhalten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel können Wildtyp-Zellen mit herkömmlichen mutationsauslösenden Mitteln, wie etwa Ethanmethylsulfonat, behandelt und mit einen Plasmid transformiert werden, das ein essentielles Gen enthält, um die Kolonien zu identifizieren, in denen Komplementation auftritt. Alternativ dazu kann das Genom aufgebrochen werden, um eine spezifische Mutation zu schaffen (Rothstein, ebd.).
- Die Stabilität des Plasmids, das das essentielle Gen enthält, in der Wirtszelle kann von dem Nicht-Vorhandensein von Sequenzen homologer essentieller Gene in der Wirtszelle abhängen. Die genetischen Defekte im Wirt stellen sicher, daß das Plasmid erhalten, da Wachstum der Wirtszelle nicht auftreten wird oder durch das Fehlen der essentiellen Genfunktion stark eingeschränkt sein wird. Zusätzlich kann die Integrität des Plasmids selbst vom Nicht-Vorhandensein von Homologie zwischen dem plasmidgetragenen essentiellen Gen und dem entsprechenden Locus im Wirtsgenom abhängen sein, weil Rekombination zwischen entsprechenden Plasmid und genomischen Loci die Zelle sowohl von der Mutation als auch vom Plasmid heilen kann. Es ist somit bevorzugt, daß die Mutation im Wirtszellgenom, das das genomische essentielle Gen inaktiviert, von substantieller Natur ist, d.h., daß Deletionen von den DNA-Sequenzen der Kodierungssektion und/oder der Flankenregionen des chromosomalen Gens hergestellt werden. Wenn dies erst einmal erreicht ist, ist es weniger wahrscheinlich, daß Heilung der genomischen Mutation durch Rekombination auftritt.
- Die Plasmide der vorliegenden Erfindung sind unerwartet stabil, wenn sie in den geeigneten mutanten Wirtszellen gehalten werden. Eine bevorzugte Wirtszelle ist Hefe; andere eukaryontische Zellen können jedoch verwendet werden, ebenso wie prokaryontische Zellen. Im Fall von Hefezellen scheint die Stabilität der Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung sogar diejenige von Hefeplasmiden, die Centromere enthalten, zu übersteigen. Zirkuläre Centromer-Plasmide sind unter den stabilsten Plasmiden, von denen für Hefe früher berichtet worden ist, leiden aber an einer extren niedrigen Kopienzahl (Clarke und Carbon, ebd. und Stinchcomb et al., 1982, ebd.). Lineare Centromer-Hefeplasmide sind entweder instabil oder liegen mit niedriger Kopienzahl vor, abhängig von der Plasmidlänge (Murray und Szostak, ebd.). Es ist daher ein unerwarteter Vorteil, daß verbesserte Stabilität von Plasmiden, die ein essentielles Gen tragen, erreicht wird.
- Die POT1- und CDC4-Gene sind zwei Beispiele für die Nützlichkeit von essentiellen Genen als selektionierbare Marker auf Expressionsvektoren. Diese zwei Gene gehören zu einer breiten Klasse von Genen, die für Zellwucherung auf Komplexmedien erforderlich sind. Die Verwendung anderer essentieller Gene kann Plasmidselektion in Pflanzen- oder Tier-Gewebekulturen ermöglichen, die komplexe Wachstumsbedingungen aufweisen, und kann im Extremfall die Erhaltung von Plasmiden in Zellen ermöglichen, die Nahrung aus Blut, Serum oder Saft von lebenden Tieren oder Pflanzen erhalten.
- Daten, die aus Experimenten erhalten wurden, in denen die hierin beschriebene Plasmide verwendet wurden, zeigen, daß die Produktion von humanem α&sub1;-Antitrypsin (AT) durch die Verwendung des S. pombe-POT1-Gens als selektionierbarem Marker verdoppelt wird, verglichen mit der AT-Produktion, die mit ähnlichen Plasmiden erhalten wird, die einen traditionellen auxotrophen selektionierbaren Marker, LEU2, tragen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dar POT1 enthaltende Plasmide funktionell größer in der Kopienzahl sind als die Nicht-POT1-Plasmide, von denen sie abgeleitet sind.
- Daten, die für die Expression des Affen-Sarcomavirus-v-sis- Gens erhalten wurden, zeigen einen etwa fünffachen bis achtfachen Anstieg in den Expressionsniveaus bei Verwendung von POT1 enthaltenden Plasmiden, verglichen mit Ergebnissen, die mit von YEp13 abgeleiteten Vektoren erhalten wurden.
- Die Techniken, die verwendet wurden, um die DNA- Konstruktionen, d.h. insbesondere die Plasmide, gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, umfassen herkömmliche Methoden. Das essentielle Gen, das in der DNA-Konstruktion verwendet werden soll, kann durch Verwendung einer markierten DNA-Sonde aus einer Bibliothek isoliert werden, wenn die Struktur des Gens bekannt ist, oder durch Ligieren von Segmenten der DNA-Bibliothek an herkömmliche Vektoren, Transformieren der Vektoren in eine mutante Zelle mit einem Manko im besonderen essentiellen Gen und Suchen nach Kolonien, die komplementiert sind, identifiziert werden. Wenn erst einmal ein geeignetes DNA-Fragment, das das essentielle Gen enthält, identifiziert ist, wird es an einen Vektor ligiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für das Strukturprotein kodiert, das exprimiert werden wird. Das essentielle Gen kann zusammen mit seinem eigenen Promotor und anderen Kontrollen, die für die Expression im Wirtsorganismus notwendig sind, verwendet werden. Alternativ dazu kann ein heterologer Promotor verwendet werden, um die Expression des essentiellen Gens zu steigern oder zu verringern. Methoden für die Ligation von DNA-Fragmenten sind reichlich beschrieben und ihre Durchführung liegt sehr wohl im Bereich der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet. Die DNA-Kodierungssequenz des zu exprimierenden Proteins kann im wesentlichen diejenige von irgendeinem Protein sein, insbesondere von Proteinen mit kommerzieller Bedeutung, wie etwa Interferonen, Insulin, Proinsulin, α&sub1;-Antitrypsin und Gewebe-Plasminogen- Aktivator.
- Nach Herstellung der DNA-Konstruktion wird sie unter Transformationsbedingungen in den Wirtsorganismus transformiert. Techniken zum Transformieren von Prokaryonten und Eukaryonten (einschließlich Gewebekulturzellen) sind in der Literatur bekannt.
- Wie oben beschrieben, muß der Wirtsorganismus für die Selektion des essentiellen Gens auf einem Plasmid ein Manko in der essentiellen Funktion aufweisen. Mutante Wirtsstämme sind von herkömmlichen Hinterlegungsstellen erhältlich oder können mit herkömmlichen Mitteln aus Wildtypen durch Mutagenese und Screenen auf den Mutanten, der die richtige Mutation trägt, hergestellt werden.
- Der transformierte Wirt kann dann durch Wachstum auf konventionellem Komplexmedium selektioniert werden. Im Fall von Hefe kann ein konventionelles Medium, wie etwa YEPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton und 2 % Dextrose) verwendet werden. Die selektionierbaren Marker, die essentielle Gene gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, können als Marker verwendet werden, wo immer sie in irgendeiner DNA-Konstruktion geeignet sind, und es wird daher anerkannt werden, daß Konstruktionen, die ein essentielles Gen enthaltende Selektionsmarker gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, viele Anwendungszwecke haben. Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung solcher Anwendungszwecke angeboten, nicht zur Beschränkung.
- Wenn nicht anders angegeben, wurden Standardmethoden aus der Molekularbiologie verwendet. Enzyme wurden von Bethesda Research Laboratories, New England BioLabs und Boehringer Mannheim Biochemicals erhalten und verwendet, wie vom Hersteller angegeben oder wie von Maniatis et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). E. coli-Kulturen wurden mit der Calciumchlorid-Methode transformiert, ebenfalls bei Maniatis et al. (ebd.) offenbart. Hefekulturen wurden mit der Methode von Beggs (Nature 275: 104-108, 1978) transformiert, mit hierin beschriebenen Modifikationen.
- Eine Hefegenon-Bibliothek wurde durch partielle Verdauung von Hefe-DNA mit Sau3A, Größeselektion auf Saccharose-Gradienten und Insertion der selektionierten Fragmente in den Hefevektor YRp7, der mit BamHI verdaut worden war, konstruiert (Nasmyth und Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 2119-2123, 1980). Ein rekombinantes Plasmid, das das CDC4-Gen enthält, wurde durch Transformation von Hefestämmen GEB5 (MATa cdc4-4 leu2 trp1 lys1 ura1) und GEB7 (MATa cdc4-3 leu2 trp1 lys1) mit der Bibliothek isoliert. Diese Stämme wurden abgeleitet von den Stämmen A364A cdc4-3 und A364A cdc4-4 (Hartwell, et al., Genetics 74: 267-286, 1973) durch Kreuzen mit einem Stamm, von dem bekannt ist, daß er mit großer Häufigkeit transformiert (k79 [MATα leu2 trp1] Nasmyth, et al., Nature 289: 244- 250, 1981; Tatchell, et al., Cell 27:25-35, 1981), gefolgt von Rückkreuzung zu hochtransformierenden Stämmen (K79 und K80 [MATα leu2 trp1 lys1]), um cdc4-3- und cdc4-4-Mutationen im gewünschten genetischen Hintergrund (leu2 trp1) zu erhalten. Selektion von Transformanden auf Tryptophan-Prototrophie und die Fähigkeit, bei der restriktiven Temperatur (37º) zu wachsen, identifizierte ein solches Plasmid (als pJY35 bezeichnet), von dem sich zeigte, daß es sich in das Genom integrierte und zum CDC4-Locus kartierte. Spontane Plasmid- Integranden wurden auf der Grundlage ihres selektiven Wachstumsvorteils identifiziert. Dieser Wachstumsvorteil beruht auf dem Vorhandensein, auf dem ursprünglichen Plasmid, eines mit CDC4 verknüpften Gens, das für Zellwachstum schädlich ist, wenn es in hoher Kopienzahl vorliegt (d.h. wenn das Plasmid nicht in das Wirtsgenom integriert ist). Es wurde gezeigt, daß der TRP1-Plasmidmarker in den Integranden genetisch an SUP11 gebunden ist, der auf Chromosom VI an CDC4 gebunden ist (Mortimer und Schild, "Genetic Map of Saccharomyces cerevisiae" in Strathern, et al., Hrg., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae Life Cycle and Inheritance, 641-651, Cold Spring Harbor, 1981). Die cdc4-3- Komplementierungsregion wurde als ein 6,4 kb BamHI-Fragment aus pJY35 gereinigt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem Vektor YRp7 verknüpft (Struhl, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1979), der mit BamHI geschnitten worden war. Diese Konstruktion ist bekannt als pJY51 und ist in Fig. 1 dargestellt.
- Bezugnehmend auf Fig. 1, wurde die CDC4-Kodierungsregion von den flankierenden genomischen DNA-Sequenzen abgetrennt in der folgenden Weise gereinigt. Plasmid pJY51 wurde mit HindIII geschnitten und das 3,6 kb Fragment, das die CDC4-Region umfaßt, wurde im bakteriellen Plasmid pBR322 subkloniert. Diese Konstruktion wurde vollständig mit BamHI verdaut, partiell mit HincII verdaut und das ca. 2,3 kb CDC4 enthaltende Fragment wurde gereinigt. Das HincII-Fragmentende wurde durch Zugabe von Linker-Sequenzen (Sequenz: 5'CCGGATCCGG3') (erhalten von Collaborative Research) und anschließende Verdauung mit BamHI, um überschüssige Linker zu entfernen, zu einem BamHI-Ende umgewandelt. Das resultierende Fragment, das etwa 1,9 kb des CDC4-Gens umfaßt, wurde in die BamHI-Stelle von yRP7 inseriert, um Plasmid pJY70 herzustellen. Es wurde gezeigt dar dieses Plasmid die cdc4-3-Mutation, wie oben beschrieben, komplementiert. Obgleich in dem 1,9 kb Fragment kleine Teile sowohl der 5'- als auch der 3'-Kodierungsregionen des CDC4-Gens fehlen, komplementiert es überraschenderweise den temperaturempfindlichen Defekte. Vermutlich wird Transkription und Translation der CDC4-Sequenz von Sequenzen kontrolliert, die in den pBR322-Regionen des Plasmids angesiedelt sind, was die Produktion eines funktionellen Genproduktes ermöglicht.
- Plasmid pJY70 wurde mit EcoRI geschnitten, um die Hefe-TRP1- und ARS1-Sequenzen zu entfernen, und wurde re-ligiert, was ein hybrides Plasmid ergab, das pBR322- und CDC4-Sequenzen umfaßte. Dieses Plasmid ist bekannt als pJY71 und ist in Fig. 1 dargestellt.
- Die 1,9 kb Hefe-Sequenz wurde als ein BamHI-HindIII-Fragment aus pJY71 gereinigt. Dieses Fragment wurde mit pBR322 verknüpft, das durch Verdauung mit BamHI und HindIII linearisiert worden war, um das Plasmid pB4 herzustellen, und ist in Figur 1 dargestellt.
- Die CDC4-Region wurde zur Insertion in einen High-Copy- Number-Hefevektor aus pB4 re-isoliert. Solch ein Vektor wird einen Replikationsursprung des Hefe-2µ-Plasmids enthalten und eine oder mehrere Restriktionsenzym-Schnittstellen, die als Klonierungsstellen für fremde Gene von Interesse dienen werden. Vorzugsweise werden solche Stellen im Plasmid nur einmal auftreten. Ein bevorzugter Vektor ist MW5, der den Hefe-2µ-Plasmid-Replikationsursprung und einmal auftretende EcoRI- und BamHI-Klonierungsstellen umfaßt. Bezugnehmend auf Fig.2, wurde Plasmid MW5 von Plasmid YRp7' (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39-43, 1979) durch partielle Verdauung mit EcoRI, um im Durchschnitt eine der zwei EcoRI-Stellen pro Molekül zu spalten, abgeleitet. Die resultierenden ungepaarten Enden der linearen Moleküle wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und die resultierenden glatten Enden wurden unter Verwendung von T4- DNA-Ligase wieder miteinander verknüpft. Das resultierende Plasmid, das die EcoRI-Stelle benachbart zur ARS1-Sequenz zurückbehielt, wurde dann selektiert. Die ARS1-Sequenz wurde durch Verdauung mit PstI und EcoRI entfernt und durch das PstI-EcoRI-Fragment von Plasmid YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121-133, 1979), das den Replikationsursprung von Hefe-2µ- DNA umfaßt, ersetzt. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als MW5, ist in Fig. 2 dargestellt.
- Um das endgültige CDC4 enthaltende stabile Plasmid zu konstruieren, wurde MW5 mit EcoRI und BamHI geschnitten. Das CDC4-Fragment wurde durch Verdauen des Plasmids mit BamHI und EcoRI aus Plasmid pB4 gereinigt. Die zwei Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verknüpft und die so hergestellten chimären Moleküle wurden in den E. coli-Stamm RRI (Nasmyth und Reed, ebd.) mit Selektion auf ampicilinresistente tetracyclinempfindliche Kolonien transformiert. Plasmid pB5 (dargestellt in Fig. 2), isoliert aus einer solchen Kolonie, umfaßte den Hefe-2µ-Replikationsursprung, pBR322- Plasmidsequenzen, den selektionierbaren Marker TRP1, 1,9 kb der Hefe-CDC4-Kodierungssequenz und eine einzige EcoRI- Klonierungsstelle.
- Die Stabilität, in einem transformierten Wirt, des CDC4 enthaltenden Plasmids gemäß der vorliegenden Erfindung hängt von dem Fehlen eines funktionellen CDC4-Gens im Wirt ab. Es ist außerdem wünschenswert, daß zwischen dem Wirtsgenom und dem CDC4 enthaltenden stabilen Plasmid keine Homologie besteht, um Rekombination zwischen Plasmid und chromosomalen DNAs zu verhindern. Um einen Hefestamm zu erhalten, der einen in geeigneter Weise deletierten CDC4-Locus aufweist, kann ein Hefewirt, der das Wildtyp-CDC4-Gen enthält, mit einem linearisierten Plasmidfragment transformiert werden, das ein "aufgebrochenes" CDC4-Gen aufweist (Rothstein, ebd.). Das linearisierte Plasmidfragment ist ein bevorzugtes Transformierungsmittel, weil die freien Enden des Fragmentes Rekombination in der CDC4-Region steigern können. Solch ein Plasmidfragment wird intakte CDC4-Flankenregionen an seinen Enden aufweisen, um Rekombination mit den intakten genomischen CDC4-Locus zu erleichtern. Das zwischen die CDC4- Flankenregionen des Plasmidfragmentes inserierte genetische Material wird für ein phänotypisches Merkmal kodieren, das im transformierten Wirt selektioniert werden kann (ein selektionierbarer Marker, wie etwa TRP1 oder LEU2). Dem aufbrechenden Plasmid wird vorzugsweise auch ein Hefe-Replikationsursprung fehlen, um auf die Integration der aufgebrochenen CDC4- selektionierbaren Markersequenz in das Wirtsgenom zu selektionieren. Im Anschluß an die Transformation mit dem linearisierten Plasmid führt genetische Rekombination zur Substitution der genomischen Sequenz des Wirts durch die aufgebrochene Sequenz. Zellen, in denen das CDC4-Gen nunmehr deletiert worden ist, werden dann entsprechend des beim Aufbrechen verwendeten Markers selektionierbar sein.
- Ein Verfahren für einstufiges Aufbrechen eines Wirtsgenoms ist bei Rothstein (ebd.) beschrieben. Wie oben beschrieben, wird das Aufbrechen mit der zugesetzten Verbesserung der Co- Transformation eines Wirtsstammes in einem intakten stabilen Plasmid und einem linearisierten Plasmid durchgeführt, so daß zusätzlich zur Erzielung des Aufbrechens des Wirtsgenoms auch Transformation des Wirts mit dem stabilen Plasmid bewirkt wird.
- Ein bevorzugtes Plasmid zum Aufbrechen des Wirts-CDC4-Locus ist pB15L, dargestellt in Fig. 3. Es umfaßt das Hefe-LEU2- Gen, inseriert zwischen die Flankenregionen von CDC4 und den Vektor pUC13 (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982 und Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983). Wenn an den Verknüpfungsstellen von Hefe- und Vektorsequenzen linearisiert und in einen geeigneten Hefe-Wirtsstamm transformiert, produziert das Plasmid eine Deletion von CDC4 im Wirtsgenom, was zur Substitution der CDC4-Region durch die LEU2-Sequenz führt. In einem auf Leucin auxotrophen Wirtsstamm können aufgebrochene Transformanden dann auf der Basis von Leucin-Prototrophie selektioniert werden.
- Um Plasmid pB15L zu konstruieren, wurde ein 6,4 kb Fragment, das das CDC4-Gen und seine 5'- und 3'-Flankenregion umfaßt, aus einem BamHI-Verdauungsgemisch von pJY51 gereinigt. Dieses Fragment wurde in mit BamHI verdauten pUC13 inseriert, um das Plasmid pB14 herzustellen. Der größte Teil der CDC4-Kodierungsregion wurde durch Verdauen von pB14 mit ClaI und Reinigen des größeren Fragmentes, das die pUC13- und CDC4- Flankensequenzen umfaßt, entfernt. Die Fragmentenden wurden durch Zugabe von XhoI (BglII)-"smart"-Linkern (Worthington Diagnostic) gereinigt, und das 2,8 kb BglII-LEU2-Fragment von YEp13 (Broach, et al., Gene 8:121-133, 1979) wurde mit den resultierenden kohäsiven Termini verknüpft. So hergestellte DNA wurde verwendet, um den E. coli-Stamm RRI zu transformieren. Transformanden wurden auf der Basis von Leucin-Prototrophie selektioniert, da die Hefe-LEU2-Sequenz den leuB-Defekt im E. coli-Wirt komplementiert. Plasmid pB15L wurde aus einer solchen transformierten Kolonie gereinigt.
- Plasmid pB15L umfaßt nur etwa 50 Basenpaare des 5'-Endes der CDC4-Kodierungssequenz zusätzlich zu den 5'- und 3'-Flankensequenzen. Ein Vergleich der Karten der Plasmide pB5 und pB15L zeigt ein Fehlen von Homologie zwischen deren entsprechenden CDC4-Sequenzen, da die Verknüpfungspunkte der CDC4-LEU2-Genfusion von pB15L außerhalb der Region des in pB5 vorliegenden CDC4-Fragmentes angesiedelt sind. Dieses Fehlen von Homologie verhindert Rekombination zwischen pB5 und dem auf gebrochenen CDC4-Locus in der Wirtszelle.
- Um gleichzeitig das genomische CDC4-Gen zu deletieren und Plasmid pB5 einzuführen, wurden Hefezellen mit mit BamHI geschnittenem pB15L und intaktem Plasmid pB5 co-transformiert. Der Wirtsstamm, der bei der Transformation verwendet werden soll, sollte auf Tryptophan und Leucin auxotroph sein, um gleichzeitig auf Plasmid pB5 und den genomischen CDC4-Bruch zu selektionieren. Stamm A2.7.c (MATα cdc4-3 trpl leu2-2, 112 lys1 his3-11, 15) can1, erhalten aus einer Kreuzung von Stamm A2 (MATα leu2-2, 112 his3-11, 15 can1; s. Szostak, Meth. in Enzymology 101: 245-252, 1983) mit Stamm GEB7 (s. Beispiel 1A) wurde verwendet.
- In einem typischen Co-Transformations-Experiment wurden 10 ml einer Kultur von S. cerevisiae A2.7.c in logarithmischem Phasenwachstum mit etwa 6 µg mit BamHI verdautem pB15L, 1 µg pB5 und 10 µg Kalbsthymus-DNA als Trägersubstanz transformiert. Die Transformationsbedingungen waren, wie bei Beggs (ebd.) beschrieben. Die Zellen wurden auf ein Medium aufgebracht, dem Leucin und Tryptophan fehlte. Sie wurden über Nacht bei 22º gezüchtet und auf 37º verschoben. Etwa 30 Kolonien wurden erhalten. Die Kontrolltransformation mit pB5 allein und Selektion auf Tryptophan-Prototrophie erbrachte etwa 1000 Transformanden.
- Sechs co-transformierte Kolonien wurden analysiert, um den Bruch des CDC4-Locus zu verifizieren und die Stabilität des pB5-Plasmids zu testen. Genomische DNA wurde aus den Cotransformanden mit der Methode von Abraham, et al. (Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 47: 989-998, 1983) isoliert und wurden mit EcoRI und BamHI verdaut, auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und auf Nitrozellulose überführt (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517), 1975). Der Transfer wurde mit dem 2,5 kb BamHI-HindIII-Fragment aus der 5'-Flankenregion von CDC4, das in pB15L, aber nicht in pB5 vorliegt, gesondet. Figur 4 zeigt, daß die Sonde an ein 6,4 kb Fragment von DNA aus nicht-transformierten Zellen hybridisierte (Spur b); es gibt keine EcoRI-Stelle innerhalb dieses 6,4 kb BamHI-Fragmentes. Da die LEU2-Sequenz eine EcoRI-Stelle enthält, wird der Bruch des CDC4-Locus zu einer Verringerung in der Größe des Hybridisierungsbandes führen (angedeutet durch die Pfeile in Figur 4). Dies ist der Fall für die Transformanden, die in den Spuren c, d, f, g und h dargestellt sind. Spur e zeigt ein etwa anderes Muster und behält das Band in Genomgröße bei, was darauf hinweist, daß Deletion des genomischen CDC4 nicht auftrat. (Die kleineren Bänder, die in den Spuren c bis h zu sehen sind, beruhen auf Kontamination der gelgereinigten Sonde, wie durch die Muster der Kontrollen in den Spuren a und b gezeigt.)
- Die sechs Co-Transformanden wurden durch Züchten auf Komplexmedium (YEPD) auf Plasmidstabilität getestet. Zellen wurden bei 25º auf YEPD plattiert und bei 37º auf YEPD, tryptophanloses Medium und leucinloses Medium replikaplattiert. Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse weisen daraufhin, daß alle Co-Transformanden mit Ausnahme von #3 auf Komplexmedien für die Plasmidmarker 100% stabil waren. (Isolat Nr. 3 ist derselbe Co-Transformand, der in Spur e von Figur 4 dargestellt ist).
- Weitere Stabilitätstests wurden auf der zwei Co-Transformanden mit den Nummern 1 und 2 durchgeführt. Der Test wurde auf 663 bzw. 681 Kolonien durchgeführt. Nach Wachstum über 30 Generationen auf YEPD bei 30º waren alle Kolonien für Tryptophan und Leucin prototroph.
- Co-Transformand #1 wurde bei 22º auf seine Wachstumsgeschwindigkeit getestet, und es wurde festgestellt, daß er mit derselben Geschwindigkeit wie eine nicht-transformierte A2.7.c- Kontrolle wuchs.
- Co-Transformand #1 ist als BELL1 bezeichnet worden. Er ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 20698 hinterlegt worden.
- Das Saccharomyces cerevisiae-TPI1-Gen kodiert für das Triose- Phosphat-Isomerase-Protein und ist durch Komplementieren des tpi1-Mankos erhalten worden (Kawasaki und Fraenkel, ebd.; Alber und Kawasaki, ebd.). Überraschenderweise ist das homologe Gen aus S. pombe durch Komplementieren derselben S. cerevisiae-tpi1-Mutation isoliert worden. Das S. pombe-TPI- Gen, bezeichnet als POT1 (für Pombe-Triose-Phosphat-Isomerase), ist aus einer von Russel und Hall (J. Biol. Chem. 258: 143-149, 1983) beschriebenen Bibliothek kloniert worden, die genomische S. pombe-DNA enthält, die partiell mit Sau3A verdaut und in den Vektor YEp13 inseriert worden ist. Eine vorläufige DNA-Sequenz (mit der Methode von Maxam und Gilbert, Meth. in Enzymology 65: 497-559, 1980) hat bewiesen, daß das POT1-Gen für das TPI-Protein kodiert, und besagtes Protein ist mit TPI-Proteinen aus anderen Organismen homolog (s. Alber und Kawasaki, ebd.). Diese POT1-DNA-Sequenz ist in Figur 5 angegeben, zusammen mit der S. cerevisiae-TPI1-DNA- Sequenz und den entsprechenden Proteinsequenzen.
- Das S. pombe-POT1-Gen ist gegenüber dem S. cerevisiae-TPI1- Gen in diesem Beispiel als ein selektionierbarer Marker in S. cerevisiae bevorzugt. Fremde Gene, wie etwa POT1 in S. cerevisiae, könnten in einer fremden Wirtszelle nicht gut funktionieren und daher eine höhere Kopienzahl erfordern, um einen Wirtszelldefekt zu konplementieren. Das selektionierbare POT1-Gen auf einem Hefeplasmid ermöglicht auch die Verwendung des endogenen TPI1-Promotors und TPI1-Terminators (Kontrollregionen, die keine Homologie mit POT1 zeigen) zur Expression von kommerziell wichtigen Genen auf demselben Vektor. Weil POT1 und die Flankenregionen von TPI1 keine Homologie zeigen, sind intramolekulare Rekombination und anschließende Plasmidinstabilität reduziert. Schließlich ist es nicht wahrscheinlich, daß das POT1-Gen mit der chromosomalen DNA von S. cerevisiae rekombiniert, weil es auf dem DNA-Niveau nur wenig Homologie mit der TPI1-Sequenz teilt und ein Großteil des TPI1-Gens in den Wirtsstämmen deletiert worden ist. POT1 enthaltende Plasmide können somit bei hohen Kopienzahlen gehalten werden, die für die gesteigerte Expression fremder Gene von kommerziellem Interesse in Hefe wünschenswert sind.
- Ein Plasmid, das das POT1-Gen umfaßt, wurde aus der S. pombe- Bibliothek von Russel und Hall (ebd.) durch Komplementation der tpi1-Mutation im S. cerevisiae-Stamm N587-2D (Kawasaki und Fraenkel, ebd.) identifiziert.
- Eine Restriktionskarte dieses Plasmids, pPOT, ist in Figur 6 dargestellt. Weil pPOT den Vektor YEp13 enthält, ist es inhärent instabil, da ihm die für die Erhaltung von 2-Mikron- Plasmiden in Hefe notwendigen Replikationsfunktionen fehlen. Das POT1-Gen kann daher in kompetentere Vektoren überführt werden, wie etwa C1/1 und verwandte Vektoren, die die vollständigen 2-Mikro-Plasmidsequenzen enthalten. Plasmid C1/1 wurde von pJDB248 (Beggs, Nature 275: 104-109, 1978) und pBR322, wie in Beispiel 3 hierin beschrieben, abgeleitet. Es enthält die gesamte Hefe-2-Mikron-Plasmid-DNA, ein selektionierbares LEU2-Gen und pBR322-Sequenzen.
- Das POT1-Gen wurde aus pPOT als ein BamHI-XbaI-Restriktionsfragment mit nahezu 3400 Basenpaaren isoliert und wurde in die entsprechenden Polylinkerstellen von pUC13 inseriert. Das resultierende Plasmid ist pUCPOT, von dem eine partielle Restriktionskarte in Figur 6 dargestellt ist.
- Das pUCPOT-Plasmid wurde mit SalI geschnitten und re-ligiert, um etwa 1800 Basenpaare von S. pombe- und S. cerevisiae-DNA zu deletieren. Dieses resultierende pUCPOT-Sal-Plasmid ist in Figur 6 dargestellt.
- Das POT1-Gen wurde in der folgenden Art und Weise in C1/1 eingebracht. Da sowohl C1/1 als auch pUCPOT-Sal eine BglI- Stelle im Ampicilinresistenz-Gen und eine einzige BamHI- Stelle an irgendeiner anderen Stelle besitzen, kann ein Teil der pBR322-Region von C1/1 durch das POT1-Fragment von pUCPOT-Sal ersetzt werden. C1/1 wurde mit BglI und BamHI geschnitten, um ein großes Fragment von nahezu 7700 Basenpaaren freizusetzen, daß einen Teil des ampr-Gens, die gesamte 2- Mikron-DNA und das LEU2-Gen enthielt. In ähnlicher Weise wurde pUCPOT-sal mit BglI und BamHI geschnitten, um ein Fragment von nahezu 3400 Basenpaaren freizusetzen, das den anderen Teil des ampr-Gens und das POT1-Gen enthielt. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, um pCPOT zu bilden, das ein "wiederhergestelltes" selektionierbares ampr-Gen, das POT1- Gen, das LEU2-Gen, die gesamte 2-Mikron-DNA und die bakterielle Replikationsursprungsregion aus pUC13 enthält (die bakterielle Ursprungsregion aus pUC13 ermöglicht eine höhere Kopienzahl von Plasmiden in E. coli, als dies die Ursprungsregion von pBR322 tut).
- E. coli-Stamm HB-101, transformiert mit pCPOT, ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 39685 hinterlegt worden.
- Das POT1-Gen kann mit einer ähnlichen Konstruktion auch in von C1/1 abgeleitete Vektoren inseriert werden. Zum Beispiel enthält das Plasmid pFAT5 (Fig. 7) eine Expressionseinheit für die Produktion von humanem α&sub1;-Antitrypsin (AT), inseriert in C1/1. Diese Expressionseinheit, hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben, besteht aus dem TPI1-Promotor, der AT- cDNA-Sequenz und dem TPI1-Transkriptionsterminator. Eine Restriktionskarte von pFAT5 ist in Figur 7 angegeben.
- pFAT5 wurde mit BglI und BamHI geschnitten, um ein Fragment (2200 Basenpaare) freizusetzen, das das AT-Gen und den TPI1- Terminator enthielt. Auch freigesetzt wird ein BglI-BamHI- Fragment, das mit dem oben beschriebenen C1/1-BglI-BamHI- Fragment identisch ist, mit der Ausnahme, daß das Fragment auf pFAT5 zusätzliche 900 Basenpaare enthält, die den TPI- Promotor umfassen. Dieses letztere pFAT5-Stück und das 3400 bp BglI-BamHI-Fragment von pUCPOT-Sal (oben beschrieben) werden ligiert, um das Plasmid pFPOT zu bilden, das die in Figur 7 gezeigte Restriktionskarte besitzt.
- Der Vektor pFPOT wurde an der einzigen BamHI-Stelle geschnitten, um die Insertion des 2200 Basenpaare langen AT- Gens und des TPI1-Terminatorfragments aus pFAT5 zu ermöglichen. Das Klonieren des 2200 Basenpaare langen Fragments in der richtigen Orientierung in pFPOT ermöglicht die Expression von humanem AT in diesem Hefevektor. Das richtig ligierte Produkt wird als pFATPOT bezeichnet, dessen Restriktionskarte in Figur 7 angegeben ist.
- Das Saccharomyces cerevisiae-TPI1-Gen ist kloniert und sequenziert worden (Kawasaki und Fraenkel, ebd., und Alber und Kawasaki ebd.). Das Plasmid pTPIC10, das das Strukturgen für das TPI-Protein umfaßt, ist bei Alber und Kawasaki (ebd.) beschrieben worden. Eine BglII-Stelle existiert an der DNA- Position 295 in der Kodierungsregion von TPI1 und eine andere BglII-Stelle ist etwa 1200 Basenpaare entfernt in der 5'- Flankenregion angesiedelt. Diese BglII-Stellen sind geeignete Klonierungsstellen zum Deletieren eines Teils des TPI1-Gens und zum Inserieren eines anderen Gens, wie etwa des Hefe- LEU2-Gens. Solch eine Konstruktion kann verwendet werden, um einen Bruch des genomischen TPI1-Locus in einem transformierten Wirt zu bewirken.
- Bei etwa -1800 in der 5'-Flankenregion von TPI1 befindet sich eine PstI-Stelle. In pTPIC10 ist daher das TPI1-Gen von einer PstI-Stelle auf der 5'-Seite und von einer SalI-Stelle (im tetr-Gen) auf der 3'-Seite flankiert. Dieses PstI-SalI- Fragment, das TPI1 enthält, wurde in pUC13 an den PstI- und SalI-Stellen inseriert, um pUCTPI zu produzieren. Eine Restriktionskarte des PstI-SalI-Inserts (in pUC13) ist in Figur 8 angegeben.
- Das Plasmid pUCTPI wurde dann mit BglII geschnitten und die zwei DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese getrennt. Das größere Fragment wurde gereinigt und phosphatasiert, um Selbst-Ligierung zu verhindern. In die BglII-Stellen dieser DNA wurde das Hefe-LEU2-Gen ligiert, das aus dem Plasmid YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121-133, 1979) als ein BglII- Fragment entnommen wurde. Das resultierende Plasmid war pUCPTI-LEU2, das eine partielle Deletion von TPI1 und eine Insertion von LEU2 trägt. pUCPTI-LEU2 ist in Figur 8 dargestellt.
- Das Plasmid pUCTPI-LEU2 wurde mit PstI und BamHI geschnitten, um die DNA zu linearisieren. Die Hefesequenzen wurden dann durch Elektrophorese und Gelreinigung aus den pUC13-Sequenzen isoliert. Der Hefe-DNA-Teil, der in Figur 8 dargestellt ist, wurde verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm E2-7B (ATCC Nr. 20689). dem LEU2 fehlt. zu transformieren, um das chromosomale TPI1-Gen aufzubrechen (Rothstein, ebd.). Leu+- Transformanden wurden auf einem synthetischen (modifizierten Wickerham's) Medium (Mortimer und Hawthorne, in Rose und Harrison, Hrg., The Yeasts, Bd. 1, 385-460, Academic Press, 1969), das 3 % Glycerin und 1 % Lactat (neutralisiert auf pH 7), 1M Sorbit und kein Leucin enthielt, selektioniert. Die Transformanden wurden über ihre Unfähigkeit, auf YEP-Dextrose zu wachsen, auf ein TPI-Manko gescreent. Ein tpi&supmin;-Transformand wurde unter den ersten 99 gescreenten Transformanden gefunden. Dieser Stamm wurde als E2-7BΔtpi#29 (im weiteren Δtpi#29) bezeichnet. Δtpi#29 wuchs auf YEP-3% Glycerin-1% Lactat, aber nicht auf YEP-Dextrose. Enzymtests (Clifton, et al., Genetics 88: 1-11, 1980) wurden auf rohen Zellextrakten durchgeführt und bestätigten, daß Δtpi#29 nachweisbare Niveaus von Triose-Phosphat-Isomerase-Aktivität fehlte.
- tpi#29 kann mit anderen Hefestämmen gekreuzt werden, um Diploide zu bilden, die für die tpi&supmin;-Deletion heterozygot sind. Solche Diploide können sporuliert werden, so daß andere Stämme mit einem Manko für Triose-Phosphat-Isomerase erzeugt werden können. Zum Beispiel ist Δtpi#29 mit E8-10A (MATα leu2) (einem Sporen-Segreganden der Kreuzung E2-7B[ATCC 20689]xGK100[ATCC 20669]) gekreuzt worden, um das Diploid E11 zu bilden. Dieser Diploid ist sporuliert worden, um den haploiden Abkömmling, E11-3C, zu erzeugen, der den folgenden Genotyp besitzt: MATα pep4-3 tpi1. E11-3C ist mit Δtpi#29 rückgekreuzt worden, um ein Diploid, E18, zu bilden, das Homozygot für die tpi1-Deletion ist. E18 kann gegenüber Δtpi#29 als Wirtsstamm für ein Plasmid bevorzugt sein, weil er keine Aminosäuren erfordert, größere Zellen besitzt und schneller wächst. Diese tpi&supmin;-Stämme werden auf das genetische Material deletiert, das für die Glykolyse-Funktion kodiert, und man erwartet daher, daß sie nicht-zurückschlagende (d.h. stabile) Mutanten sind.
- Die Plasmide pFPOT und pFATPOT wurden in Δtpi#29 und verwandte Stämme mit tpi&supmin;-Deletion transformiert. Die Hefe-Mutanten ließ man aerob über Nacht bis zu später logarithmischer Phase in YEP-2% Galactose bei 30º wachsen. Die Transformationsbedingungen waren, wie bei Beggs (ebd.) beschrieben, mit der Ausnahme, daß man die Zellen sich bei 30º für 1-2 Stunden in 1M Sorbit, das YEP-3% Glycerin-1% Lactat oder YEP-2% Galactose enthielt, anstelle von YEP-Dextrose, regenerieren ließ, bevor die Zellen in Top-Agar plattiert wurden. Der Top-Agar und die Platten enthielten synthetisches, modifiziertes Wickerham's-Medium mit 1% Sorbit und 2% Dextrose. Nach 3 Tagen bei 30º waren Transformanden sichtbar und wurden zum Replattieren auf YEPD aus dem Agar entnommen. Danach wurden die Transformanden auf YEPD oder anderen dextrosehaltigen Komplexmedien gehalten.
- Stamm E18, transformiert mit pFATPOT, wurde als ZYM-3 bezeichnet. Er wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 20699 hinterlegt.
- Um Plasmidstabilität zu untersuchen, wurden Kolonien aus einer Einzelzelle in Röhrchen eingeimpft, die YEPD enthielten, und man ließ sie bis zu einer Gesamtpopulation von 10&sup9; Zellen (etwa 30 Teilungen) wachsen. Die Hefezellen wurden beschallt, um Klumpen aufzubrechen, auf angemessene Anzahl verdünnt und auf YEP-2% Galactose oder YEP-2% Glycerin-1% Lactat plattiert, was das Wachstum von tpi&supmin;-Zellen ermöglicht (mit oder ohne die Plasmide, die das POT1-Gen tragen). Die Kolonien, die auf YEP-Galactose entstehen, wurden dann auf YEPD replikaplattiert, um auf den Verlust des Plasmids zu screenen (d.h. tpi&supmin;-Zellen, die das POT1 enthaltende Plasmid verloren haben, werden nicht auf Dextrose wachsen). Die Ergebnisse, zusammengefaßt in Tabelle 2, weisen daraufhin, daß die pFPOT- und pFATPOT-Plasmide in Hefestämmen mit tpi&supmin;-Deletion stabil sind. Sie sind überraschenderweise weit stabiler als Hefeplasmide, die Centromere enthalten. Centromertragende Plasmide (die niedrig in der Kopienzahl sind) zählen zu den stabilsten Plasmiden, über die für Hefe berichtet worden ist, und gehen im allgemeinen mit einer Häufigkeit von um 1% Zellen pro Teilung auf Komplexmedien verloren (s. Murray und Szostak, ebd., für einen Überblick zur centromer-Plasmidstabilität). Wie Tabelle 2 zeigt, gehen die hier beschriebenen POT1-Plasmide mit einer Häufigkeit von weniger als 1 % nach 30 Teilungen auf Komplexmedien in Stämmen mit tpi&supmin;-Deletion verloren.
- Um die Nützlichkeit der POT1-Plasmide zur Erhöhung der Expression fremder Proteine in einer transformierten Hefe zu untersuchen, wurden die Plasmide pFATPOT und pFAT5 verwendet, um die S. cerevisiae-Stämme Δtpi#29 bzw. E2-7B zu transformieren. Transformierte Zellen wurden in leucinlosen Medien, die Dextrose enthielten, selektioniert. Kulturen wurden bei 30º auf einen O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 3-4 gezüchtet. Zellextrakte wurden hergestellt und, wie in Beispiel 5 beschrieben, auf AT untersucht.
- Von pFATPOT/Δtpi#29 produziertes AT stellte 4-6% des gesamten löslichen Proteins dar. Von pFAT5/E2-7B produziertes AT stellte 2-3% des gesamten löslichen Proteins dar.
- Obgleich Plasmid-Kopienzahlen schwer exakt zu messen sind und einen Populationsdurchschnitt darstellen, stellen empirische Beobachtungen von Quantitäten des Genprodukts einen Hinweis auf relative Plasmidniveaus zur Verfügung, vorausgesetzt, daß die Expressionseinheit (Promotor, Gen von Interesse, Terminator) dieselbe bleibt. pFATPOT scheint daher funktionell größer in der Anzahl zu sein als pFAT5, aus dem es abgeleitet wurde. Weil die zwei transformierten Stämme genetisch nahezu identisch sind (Δtpi#29 wurde durch plasmidgesteuerte Mutagenese von E2-7B abgeleitet) und unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, stellt dieses Ergebnis einen Hinweis auf den Wert des hier beschriebenen stabilen Plasmid-Expressionssystems gegenüber früher beschriebenen Vektoren dar.
- Ein zweiter stabiler Expressionsvektor, der die REP1-, REP2-, REP3- und ori-Sequenzen aus Hefe-2-Mikron-DNA und das POT1- Gen umfaßt, wurde konstruiert. Das POT1-Gen wurde aus pFATPOT durch Verdauung des Produkts mit SalI und BamHI erhalten. Dieses 1600 bp Fragment wurde dann an pIC19R ligiert (das die in Figur 9 dargestellte Polylinker-Sequenz umfaßt, inseriert in die HindIII-Stelle von pUC19 [Norrander et al., Gene 26: 101-106, 1983]), das zunächst durch Verdauung mit SalI und BamHI linearisiert worden war. Die BamHI-, PstI- und SalI- Stellen im resultierenden Plasmid wurden in zwei Schritten zerstört, um Plasmid pICPOT* herzustellen. Die PstI- und SalI-Stellen wurden durch Schneiden mit PstI und SalI entfernt; die Enden wurden durch Verdauen des PstI-3'-Überhangs mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Einfüllen des SalI-5'-Überhanges mit Klenow-Fragment geglättet. Die glatten Enden wurden dann ligiert. Die BamHI-Stelle wurde dann durch Schneiden des Plasmids mit BamHI, Einfüllen der Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Re-Ligieren der glatten Enden entfernt.
- Die 2u-Sequenzen wurden aus den Plasmiden YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121 133, 1979) und C1/1 erhalten. Die REP3- und ori-Sequenzen wurden durch Verdauung mit Pst I und Xba I und Gelreinigung aus YEp13 entfernt. REP2 wurde durch Verdauung mit Xba I und Sph I und Gelreinigung aus C1/1 erhalten. Die zwei Fragmente wurden dann mit pUC18 (Norrander et al., ebd.) verknüpft, das mit Pst I und Sph I linearisiert worden war, um Plasmid pUCREP2,3 herzustellen. REP1 wurde durch Verdauung mit Eco RI und Xba I und Gelreinigung des 1704 bp Fragments aus C1/1 erhalten. Das EcoRI-XbaI-Fragment wurde in pUC13 kloniert, das mit Eco RI und Xba I linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pUC13 + REP1 bezeichnet. Das pUC13 + REP1-Plasmid wurde mit HindII geschnitten und in Gegenwart von EcoRI-Linkern (erhalten von Bethesda Research Laboratories) ligiert. Das REP1-Gen wurde dann als ein Eco RI-Fragment von etwa 1720 bp entfernt. Dieses EcoRI-Fragment wurde in pIC7 kloniert (das die in Figur 9 dargestellte Polylinker-Sequenz umfaßt, inseriert in die HindIII-Stelle von pUC8), das mit Eco RI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pICREP1#9 bezeichnet.
- Um den endgültigen Expressionsvektor pMPOT2 zu konstruieren, wurde pICPOT* durch partielle HindIII-Verdauung und vollständige SstI-Verdauung linearisiert. Plasmid pUCREP2,3 wurde mit Hind III und Sst I geschnitten, und das Fragment, das REP2-, REP3- und ori-Sequenzen umfaßt, wurde gelgereinigt und mit linearisiertem pICPOT* verknüpft. Das resultierende Plasmid, das REP2-, REP3-, ori-, POT1- und ampr-Sequenzen umfaßt wurde als pMPOT1 bezeichnet. REP1 wurde dann als ein BglII-NarI-Fragment aus pICREP1#9 entfernt und mit pMPOT1 ligiert, das mit Bgl II und Nar I gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligation wurde als pMPOT2 bezeichnet (Figur 10). Der S. cerevisiae-Stamm Δtpi#29, transformiert mit pMPOT2, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 20744 hinterlegt worden.
- Das v-sis-Gen von Affen-Sarcomavirus (SSV) kodiert ein als p28sis bezeichnetes Protein, das als das transformierende Protein des Virus impliziert worden ist. Es hat sich gezeigt, daß das p28sis-Protein antigenisch und strukturell ähnlich zu von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF) ist. Das v-sis-Gen ist kloniert und seine DNA-Sequenz bestimmt worden (Devare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3179, 1982; Devare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 731, 1983). Teile dieses Gens wurden in Hefe unter Verwendung von POT1-Plasmiden exprimiert.
- Das SSV-Retrovirus-Genom wurde aus nicht-produktiv infizierten normalen SSV-11-Ratten-Nierenzellen kloniert, die SSV integriert in das Genom aufwiesen (Devare et al., 1982 ebd.). Die SSV-DNA wurde als 5,8 kb EcoRI-Fragment isoliert und anschließend in pBR322 inseriert, um Plasmid pSSV-11 herzustellen. Ein 1,2 kb v-sis-Fragment wurde dann aus einer Pst I-Verdauungsmischung von pSSV-11 gereinigt und in die PstI- Stelle von pUC13 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als pVSIS/Pst bezeichnet.
- Die v-sis-Sequenzen wurden dann mit einem Teil aus dem Hefe- Reife-Pheromon-Alpha-Faktor (MFα1)-Gen (Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982) verknüpft, um eine sekretorische Expressionseinheit herzustellen. Plasmid pSSV-11 wurde mit Bam HI und Pvu II verdaut und die Verdauungsprodukte wurden einer Elektrophorese durch ein 1,1 % Agarosegel unterworfen, extrahiert und ethanolgefällt. Die DNA wurde resuspendiert, mit Hph I verdaut, und das 396 bp HphI-PvuII-Fragment wurde auf einem 1,25 % Agarosegel gereinigt. Die HphI-Spaltungsstelle wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) geglättet. Die DNA wurde dann mit Bgl II verdaut und das 296 bp HphI-BglII-Fragment (5'-v-sis-Fragment) wurde gelgereinigt. Die 3'-v-sis-Sequenz wurde aus Plasmid pVSIS/Pst als ein 756 bp BglII-XbaI-Fragment isoliert. Plasmid p192, das ein 1700 bp EcoRI-Fragment enthält, welches das MFα1-Gen, inseriert in die EcoRI-Stelle von pUC13, umfaßt, wurde mit HindIII verdaut. DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und alle vier Desoxyribonukleotide wurden dann zur Reaktionsmischung zugegeben. Die DNA wurde dann mit Phenol/CHCl&sub3;/Ether extrahiert, konzentriert und mit Eco RI verdaut. Das 1,2 kb EcoRI-HindIII-Fragment (geglättet), das die Promotor- und die sekretorischen Signalsequenzen des MFα1-Gens umfaßt, wurde dann durch Elektrophorese auf einem 0,9 % Agarosegel isoliert. Äquimolare Mengen der 5'-v-sis-, 3'-v-sis- und MFα1-Fragmente plus mit Eco RI + Xba I verdautem pUC12 (Vieira und Messing, ebd., und Messing, ebd.) wurden dann zusammen ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pVSα bezeichnet.
- Ein zweites MFα1/v-sis-Hybridgen wurde konstruiert, indem die ersten 66 Codon der v-sis-Sequenz deletiert wurden, so daß Codons 67 von v-sis unmittelbar auf die Codons für das Lys- Arg-Verarbeitungssignal von Pro-Alpha-Faktor folgen würde. Um präzise die Codons 1-66 von v-sis zu entfernen, wurde eine oligonukleotidgesteuerte Mutagenese im wesentlichen gemäß der Zwei-Starter-Methode von Zoller und Smith durchgeführt (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Eine Matrize wurde durch Verdauen von pVSα mit Xba I, Reinigen des 2,2 kb MFα1- v-sis-Fragmentes, Ligieren desselben mit mit Xba I verdautem M13mp11 (replikative Form) und Isolieren der Positivstrang- DNA aus transfiziertem E. coli JM1O1 hergestellt. Dieser Klon als m11VSα bezeichnet.
- Ein halbes pmol m11VSα wurde mit 1 pmol kinasiertem Oligonukleotid ZC130 (3', AGA AAC CTA TTT TCC TCG GAC CCA5') und 1,5 pmol universellem Sequenzierungsstarter (BRL) unter Anwendung beschriebener Bedingungen (Zoller und Smith, ebd.) hybridisiert, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungsmischung zunächst für 10 Minuten auf 65ºC erhitzt, für 10 Minuten auf 37ºC heruntergefahren und dann schnell auf Eis abgeschreckt wurde. Die hybridisierte Mischung wurde dann mit Klenow-Polymerase, wie bei Zoller und Smith (ebd.) beschrieben, behandelt, um zirkuläre Duplex-DNA herzustellen. Teile der Verlängerungsmischung wurden verwendet, um E. coli K12 JM101 zu transformieren. Die resultierende Phagen-Plaques wurden durch Transfer auf Nitrozellulosefilter und anschließende Hybridisierung mit ³²P-phosphoryliertem ZC130 bei 65ºC auf richtige Deletion gescreent. Richtig gegenüberliegende Sequenzen bildeten mit der radioaktiven Sonde bei der verwendeten scharfen Hybridisierungstemperatur stabile Duplizes. Etwa 1 % der gescreenten Transformanden gaben bei Audioradiographie positive Signale. Zehn Klone wurden plaquegereinigt und DNA in replikativer Form wurde für Restriktionsenzym-Analyse hergestellt. Fünf Isolate zeigten das erwartete 1450 bp HindIII-BglII-Fragment. DNA-Sequenzanalyse von zwei Isolaten bestätigte, daß die richtige Fusionsverknüpfung hergestellt worden war, wodurch der richtige Translations-Leserahmen beibehalten wurde. Eine dieser Phagen wurde als m11VS2α bezeichnet.
- Zur Expression in Hefe wurden die VSα- und VS2α-Expressionseinheiten (die die MFα1- und v-sis-Sequenzen umfassen) in der folgenden Art und Weise benachbart zur Hefe-TPI1-Terminator angeordnet. Das TPI1-Terminatorfragment wurde aus Plasmid pFG1 (Alber und Kawasaki, ebd.) erhalten. Es umfaßt die Region vom vorletzten Aminosäurecodon des TPI1-Gens bis zur EcoRI-Stelle etwa 700 Basenpaare flußabwärts. Diese einzige EcoRI-Stelle von pFG1 wurde durch eine BamHI-Stelle ersetzt, indem das Plasmid zunächst mit Eco RI geschnitten wurde, die Enden dann mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geglättet wurden, synthetische BAm HI-Linker (CGGATCCA) zugesetzt wurden und re-ligiert wurde, um Plasmid p136 herzustellen. Der TPI1-Terminator wurde dann als ein XbaI-BamHI-Fragment aus p136 herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in YEp13 ligiert, das mit XbaI und Bam HI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid ist als p213 bekannt. Die HindIII- Stelle wurde dann aus der TPI1-Terminatorregion von p213 entfernt, indem das Plasmid mit Hind III verdaut wurde, die resultierenden Termini mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geglättet wurden und das lineare Molekül unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert wurde. Das resultierende Plasmid ist p270.
- Plasmid p270 wurde mit Xba I verdaut und mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um Re-Ligation der kohäsiven Vektorenden zu verhindern. v-sis-Expressionseinheiten VSα und VS2α wurden durch XbaI-Verdauung und Agarosegel-Reinigung von pVSα bzw. m11VS2α (replikative Form) hergestellt. Jedes der isolierten Fragmente wurde mit einer etwa äquimolaren Menge des phosphatasierten p270-Vektors in Gegenwart von 40 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase ligiert und die Ligierungsmischungen in E. coli RR1 transformiert. Plasmid-DNA wurde aus ampicillin-resistenten Kolonien hergestellt und Restriktionsenzym-Analyse durchgeführt, um Klone zu identifizieren, die den TPI-Terminator benachbart zu 3'-v-sis-Sequenzen besaßen. Das Vorhandensein von 3,3 kb oder 3,1 kb BglII-Fragmenten nach Gelelektrophorese deutet auf die richtige Orientierung von YEpVSα bzw. YEpVS2α hin.
- Die VSα- und VS2α-Sequenzen wurden dann in die stabilen Vektoren pCPOT und pMPOT2 inseriert und der MFα1-Promotor wurde durch den Hefe-TPI1-Promotor ersetzt. Der TPI1-Promotor wurde aus Plasmid pM220 erhalten. E. coli RR1, transformiert mit pM220, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 39853 hinterlegt worden.
- Plasmid pM220 wurde mit Bgl II und Bam HI verdaut, einer Elektrophorese durch ein 0,9 % Agarosegel unterworfen und das 2,2 kb TPI1-Promotor, MFα1-Gen-Fragment extrahiert. Das gereinigte Fragment wurde mit Pst I verdaut und das resultierende 1 kb BglII-PstI-Fragment wie oben auf Agarosegel gereinigt. Plasmid YEpVS2α wurde mit Pst I und Bam HI verdaut und das 1,8 kb MFα1/v-sis/TPI1-Terminator-Fusionsfragment gelisoliert. Plasmid pCPOT wurde mit Bam HI verdaut, mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert, dann mit Elektrophorese durch Agarose gereinigt, aus dem Gel extrahiert und EtOH-gefällt.
- Etwa äquimolare Mengen der drei isolierten Fragmente wurden über Nacht bei 12ºC ligiert und die Ligationsmischung verwendet, um E. coli-K-12-Stamm DH1 (Hanahan, D. und Meseleson, M., J. Mol. Biol. 166: 577, 1983) auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus Transformanden gewonnen und Restriktions-Verdauungsanalyse verwendet, um das Vorhandensein des gewünschten 1500 bp BamHI-SalI-Fragmentes und 800 bp SphI-Fragmentes zu verifizieren. Dieses Plasmid wurde mit p117-2 bezeichnt.
- Plasmid YEpVS2α wurde mit Pst I und Bam HI verdaut und das 1,8 kb Fragment, das die partiellen MFα1-, v-sis-, und TPI1- Terminatorsequenzen umfaßt, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Plasmid pIC19R wurde mit Pst I und Bam HI verdaut, und das Vektorfragment wurde gelgereinigt und mit dem 1,8 kb Fragment aus YEpVS2α verknüpft, um Plasmid pVS2αT herzustellen.
- Plasmid pM220 wurde mit Bgl II und Pst I verdaut, und das ca. 1 kb Fragment, das den TPI1-Promotor und den 5'-Teil der MFα1-Sequenz umfaßt, wurde isoliert und in mit Bgl II + Pst I verdautem pIC19R kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit Cla I und Pst I verdaut, und das TPI1-Promotor-MFα1-Fragment wurde gelgereinigt. Plasmid pVS2αT wurde dann mit Cla I und Pst I geschnitten und mit dem TPI1-Promotor-MFα1-Fragment verknüpft. Die richtige Konstruktion wurde durch das Vorhandensein eines 2,6 kb ClaI-BamHT-Fragmentes identifiziert und als pTVS2αT bezeichnet.
- Etwa 10 ug Plasmid pVSα wurden mit Bst EII bis zur Vervollständigung in einem Volumen von 20 ul verdaut. 5 Einheiten Pst I wurden zugegeben, die Mischung wurde 30 Minuten inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von EDTA abgebrochen. Die gelöschte Reaktionsmischung wurde sofort einer Elektrophorese durch 1 % Agarosegel unterworfen, und das ca. 800 bp partielle PstI-BstEII-Band (das den größten Teil der MFα1- Präpro-Sequenz und den 5'-Teil von v-sis umfaßt) wurde herausgeschnitten, aus dem Gel extrahiert und EtOH-gefällt.
- Plasmid pTVS2αT wurde bis zur Vervollständigung mit Pst I und Bst EII verdaut und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das resultierende ca. 4,8 kb Fragment und das 800 bp PstI-BstEII-Fragment aus pVSα wurden in Gegenwart von T&sub4;- DNA-Ligase für 6 Stunden bei Raumtemperatur ligiert, und die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Ein Plasmid wurde identifiziert, das ein ca. 1450 bp BglII-Fragment enthielt, was auf das Vorhandensein des Inserts hinwies. Es wurde als pTVSα bezeichnet.
- Plasmid pTVSα wurde bis zur Vervollständigung mit Cla I und Bam HI verdaut und das ca. 2,9 kb Fragment, das die VSα-Sequenzen enthält, wurde mit Elektrophorese durch Agarose, Extraktion aus dem Gel und EtOH-Fällung isoliert. Das ca. 2,9 kb ClaI-BamHI-VSα-Fragment wurde mit mit Cla I und Bam HI verdautem pMPOT2 ligiert. Der resultierende Vektor wurde als pVSαm bezeichnet.
- Plasmid pTVS2αT wurde bis zur Vervollständigung mit Cla I und Bam HI in BamHI-Puffer verdaut. Der Puffer wurde auf hohen Salzgehalt eingestellt (Maniatis et al., ebd.) und die DNA wurde bis zur Vervollständigung mit Pvu I verdaut, das die Vektorsequenzen zweimal schneidet und Auflösung des ca. 2,7 kb ClaI-BamHI-Fragmentes, das die VS2α-Sequenzen enthält, auf einem Agarosegel ermöglicht. Dieses Fragment wurde einer Elektrophorese durch 0,9 % Agarose unterworfen, extrahiert und EtOH-gefällt. Das Fragment wurde dann mit ClaI-Bam H1 verdautem pMOT2 in Gegenwart von T&sub4;-DNA-Ligase für 20 Stunden bei 13ºC ligiert. Die ligierte DNA wurde verwendet, um E. coli HB101 auf Ampicilinresistenz zu transformieren, und Plasmid-DNA wurde aus den resultierenden Kolonien gewonnen. Ein Plasmid, das das 2,7 kb Cla I-Bam HI-VS2α-Fragment enthielt, wurde identitiziert und als pVS2αm bezeichnet.
- Expressionsvektoren, die v-sis-Sequenzen enthalten, wurden in geeignete Hefe-Wirtstämme transformiert und die Kulturmedien auf das Vorhandensein von PDGF-ähnlichem Material durch enzymverknüpften immunsorbierenden Test (ELISA) untersucht. Von YEP13-abgeleitete Plasmide wurden in S. cerevisiae E8-11c (MATα leu2 pep4) transformiert. Plasmide p117-2, pVSαm und pVS2αm wurden in Stämme mit tpi&supmin;-Deletion transformiert. Transformanden wurden in geeigneten Medien bei 30ºC bis zu stationärer Phase in einem Drehrüttler bei 220 UPM gezüchtet. Kulturen wurden geerntet, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Medien, wie in Beispiel 6 beschrieben, untersucht. Resultate sind in Tabelle 3 angegeben. Expressionsniveaus von v-sis-Sequenzen auf POT1-Plasmiden sind 5-8mal größer als auf herkömmlichen Hefevektoren. TABELLE 1: STABILITÄT VON CDC4-PLASMIDEN Isolat Nummer Gesamte Koloniena CDC4+b Trp+c Leu+d aZellen wurden auf Komplexmedium (YEPD) bei 25º plattiert und über 30 Generationen wachsen gelassen. bZellen wurden auf YEPD bei 37º replikaplattiert und über 30 Generationen wachsen gelassen. Zellen, denen ein intaktes CDC4-Gen fehlt, wuchsen bei dieser (restriktiven) Temperatur nicht. cZellen wurden auf Medium replikaplattiert, dem Tryptophan fehlte, und nach 30 Generationen ausgezählt. dzellen wurden auf Medium replikaplattiert, dem Leucin fehlten und nach 30 Generationen ausgezählt. TABELLE 2: STABILITÄT VON POT1-PLASMIDEN GEGENÜBER pTPIC10 Experiment Plasmid/Stamm Gesamte Koloniena TPI+b % Verlustc gepoolte Daten aDie Plasmid/Stamm-Kombinationen wurden auf YEPD-Platten gezüchtet, bis leicht sichtbare Kolonien von etwa 10&sup4; bis 10&sup5; Zellen zu sehen waren. Diese Kolonien wurden verwendet, um 6 ml YEPD-Flüssigmedium zu beimpfen. Die Kulturen wurden aerob über Nacht auf eine Zelldichte von 1-3 x 10&sup8; Zellen/ml gezüchtet und auf YEP-2% Glycerin-1% Lactat oder YEP-2% Galactose plattiert. Jedes dieser Medien würde tpi&supmin;-Stämme wachsen lassen, obgleich die resultierenden tpi&supmin;-Kolonien langsamer entstanden als tpi+-Kolonien. Nur 100-300 Zellen wurden auf jede Platte verteilt, so daß jede Kolonie (ob tpi&supmin; oder tpi&spplus;) auszählbar wäre. bDie Kolonien wurden auf synthetische Medien replikaplattiert, die Dextrose mit einer 2 %-Endkonzentration enthielten. Zellen, die das Triose-Phosphat-Isomerase-Gen auf den Plasmiden verloren hatten, waren nicht in der Lage zu wachsen. cDer "% Verlust" stellt die Häufigkeit von Zellen dar, die das Plasmid nach nahezu 30 Teilungen in YEPD verloren hatte.
- die POT1-Plasmide über diese vielen Teilungen hinweg extrem stabil sind und mit einer kombinierten Häufigkeit deutlich unter 1 % in 30 Zellverdoppelungen verloren gehen. TABELLE 3: EXPRESSION VON v-sis UNTER VERWENDUNG VON POT1 UND VON YEPD13 ABGELEITETEN VEKTOREN Plasmid/Stamm
- C1/1 wurde aus Plasmid pJDB248 (Beggs, J., Nature 275. 194- 109 (1978)) konstruiert. Die pMB9-Sequenzen wurden durch partielle Verdauung mit Eco RI aus pJDB248 entfernt und durch pBR322-DNA ersetzt, die mit Eco RI geschnitten wurde. Die Restriktionskarte von C1/1 ist in Fig. 6 angegeben. Das C1/1- Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA aus Hefe (S. cerevisiae), mit einer pBR322-Insertion an einer EcoRI- Stelle. Es enthält auch das LEU2-Gen.
- Das Gen, das für die vorherrschende Form von humanem α&sub1; -Antitrypsin (AT) kodiert, wurde aus einer humanen Leber-cDNA- Bibliothek mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung der Pavian-Sequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6826-6830, 1980; und Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 103: 751-758, 1981) als einer DNA-Hybridisierungssonde isoliert. Die Bibliothek wurde durch Inserieren humaner Leber-cDNA in die PstI-Stelle des Plasmids PBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95-113, 1977) konstruiert. Das AT-Gen wurde aus der Bibliothek als ein 1500 Basenpaare (bp) langes PstI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die PstI-Stelle von pUC13 inseriert, um das Plasmid pUCα1 herzustellen. In pUCα1 ist die AT-Sequenz auf dem 3'-Ende durch XbaI- und EcoRI- Stellen im Polylinker flankiert.
- Der TPI-Terminator wurde aus Plasmid pFG1 (Alber und Kawasaki, ebd.) als ein XbaI-EcoRI-Fragment von etwa 700 bp gereinigt und in pUCα1 inseriert, das mit XbaI und EcoRI gespalten worden war. Diese Konstruktion wurde dann mit EcoRI geschnitten und die Oligonukleotidlinker (Sequenz: AATTCATGGAG GTACCTCCTAG9) wurden zugegeben, in multiplen verknüpften Kopien, um eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des TPI-Terminators zur Verfügung zu stellen. Das resultierende Plasmid ist als BAT5 bekannt.
- Das TPI-Promotorfragment wurde aus Plasmid pTPIC10 (Alber und Kawasaki, ebd.) erhalten. Dieses Plasmid wurde an der einzigen KpnI-Stelle geschnitten, die TPI-Kodierungsregion wurde mit Bal31-Exonuklease entfernt und ein EcoRI-Linker (Sequenz: GGAATTCC) wurde am 3'-Ende des Promotors zugefügt. Verdauung mit BglII- und EcoRI lieferte ein TPI-Promotorfragment mit kohäsiven BglII und EcoRI-Enden. Dieses Fragment wurde dann mit Plasmid YRp7' (Stinchcomb, et al. Nature 282: 39-43, 1979) verknüpft, das mit BglII und EcoRI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, TE32, wurde mit EcoRI und BamHI gespalten, um einen Teil des Tetracyclinresistenzgens zu entfernen. Das linearisierte Plasmid wurde dann durch die Zugabe des oben beschrieben EcoRI-BamHI-Linkers rezirkularisiert, um Plasmid TEA32 zu produzieren. TEA32 wurde dann mit BglII und BamHI gespalten und der TPI-Promotor als ein Fragment von etwa 900 bp gereinigt.
- Um Plasmid pFAT5 zu konstruieren, wurde Plasmid C1/1 mit BamHI linearisiert und mit dem 900 bp TPI-Promotorfragment aus TEA32 verknüpft. Die resultierende Konstruktion, bekannt als Plasmid F, hat eine einzige BamHI-Stelle, die am 3'-Ende des TPI-Promotors angesiedelt ist. Dieses Plasmid wurde BamHI geschnitten und ein 2200 bp BamHI-Fragment, das die AT kodierende Sequenz und den TPI-Terminator umfaßt, wurde aus BAT5 gereinigt und in die BamHI-Stelle inseriert. Das resultierende Plasmid, bekannt als pFAT5, ist in Figur 7 dargestellt.
- Als Kontrolle wurden 10 Mikroliter (1 Mikrogramm) einer Lösung von 100 Mikrogramm/ml Trypsin, 100 Mikrogramm (100 Mikroliter) Rinderserum-Albumin und 100 ul 0,05 molarer TRIS- Puffer, pH 8,0, enthaltend 1 mM Benzoylargininoyl-p-nitroanilid, vermischt, und der Anstieg in der Extinktion bei 405 nm wurde in einem Spektrophotometer über die Zeit gemessen. Der Extinktionswert dieser Lösung wurde als Standard für 100 % Trypsinaktivität verwendet. Alle untersuchten Proben enthielten gleiche Konzentrationen an Substrat und Rinderserum- Albumin.
- Die Expression von PDGF-ähnlichen Molekülen durch die Hefe- Transformanden wurde mit ELISA untersucht und durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert, die mit gereinigtem humanen PDGF entwickelt worden war (Raines und Ross, J. Biol. Chem. 257: 5154). Eine typische Standardkurve wurde wie folgt hergestellt. Gereinigtes humanes PDGF, 2,5 ng/ml in PBS, wurde über Nacht mit Immulon II (Dynatech Laboratories, Inc.) auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (100 ul/Vertiefung) bei 4ºC inkubiert. Diese Beschichtung wurde entfernt und 100 ul/Vertiefung 0,1 % Kaninchen-Albumin in PBS wurden zugegeben und die Platten für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Proben von gereinigtem PDGF (0,1-40 ng/ml) wurden separat mit Ziegen-anti-PDGF-IgG (5 ug/ml) in PBS, das 0,05 % Tween 20 und 1 mg/ml Kaninchen-Albumin (RSA) enthielt, inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden 5mal mit 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20 gewaschen, entleert und 100 ul von jeder Testlösung wurden zu den Mikrotitervertiefungen zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen und peroxidasekonjugiertes Schweine-anti-Ziegen-IgG (Tago, Inc.), verdünnt 1:1000 in PBS, das 0,05 % Tween 20 und 1 mg/ml RSA enthielt, wurde für 2 Stunden bei 37ºC zugegeben. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen und frisch hergestelltes 0,04 % o-Phenylendiamin, das 0,012 % Wasserstoffperoxid enthielt, (100 ul/Vertiefung), wurde für 50 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und die Reaktion nach 50 Minuten durch Zugabe von 4N H&sub2;SO&sub4; (50 ul/Vertiefung) abgebrochen. Extinktion bei 492 nm wurde unter Verwendung eines Dynatech- Plattenscanners bestimmt. Jeder Testpunkt wurde dreifach gemessen.
- Hefekultur-Medienproben wurden in PBS verdünnt, wie beschrieben untersucht und mit der PDGF-Standardkurve verglichen. Tabelle 3 ist eine Zusammenfassung von Testergebnissen für eine repräsentative Reihe von Experimenten.
Claims (20)
1. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in einer
Wirtszelle, die ein Manko in einem Gen aufweist, dessen
Expression für normales Zellwachstum auf Komplexmedien
wesentlich ist, welches die Schritte umfaßt:
(a) Transformieren besagter Wirtszelle mit einem DNA-
Molekül, das ein Gen, das, wenn exprimiert, besagtes
Manko komplementiert, und eine Sequenz, die für
besagtes Proteinprodukt kodiert, umfaßt; und
(b) Kultivieren des Transformanden aus Schritt (a) in
einem Nährmedium, das Antibiotika oder Schwermetalle
nicht zu enthalten braucht und nicht um spezifische
Nährstoffe abgereichert zu sein braucht, wodurch
besagtes Gen als ein selektierbarer Marker für
besagten Transformanden funktioniert und wodurch besagte
Sequenz, die besagtes Proteinprodukt kodiert,
exprimiert wird.
2. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in einer
Wirtszelle, die ein Manko in einem Gen aufweist, dessen
Expression für normales Zellwachstum auf Komplexmedien
wesentlich ist, welches die Schritte umfaßt:
(a) Transformieren besagter Wirtszelle mit einem DNA-
Molekül, das ein Gen, das, wenn exprimiert, besagtes
Manko komplementiert, und eine Sequenz, die für
besagtes Proteinprodukt kodiert, umfaßt; und
(b) Kultivieren der Zellen aus Schritt (a) in einem
Nährmedium, das Antibiotika oder Schwermetalle nicht
zu enthalten braücht und nicht um spezifische
Nährstoffe abgereichert zu sein braucht, wodurch
besagtes Gen als ein selektierbarer Marker für
transformante Zellen funktioniert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Proteinprodukt α&sub1;-Antitrypsin ist.
4. Verfahren zur Herstellung transformierter Zellen, welches
die Schritte umfaßt:
(a) Unterwerfen von Wirtszellen, die ein Manko in
einem Gen aufweisen, dessen Expression für normales
Zellwachstum auf Komplexmedien wesentlich ist, unter
transformierende Bedingungen in Gegenwart einer DNA-
Konstruktion, die ein Gen umfaßt, das, wenn
exprimiert, besagtes Manko komplementiert; und
(b) Unterwerfen der Zellen aus Schritt (a) unter ein
Wachstum in einem Medium, das Antibiotika oder
Schwermetalle nicht zu enthalten braucht und nicht um
spezifische Nährstoffe abgereichert zu sein braucht,
wodurch transformierte Zellen lebensfähig bleiben und
sich vermehren, während nicht-transformierte Zellen
sich wegen besagten Mankos nicht vermehren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Gen ein Gen ist, das für
Wirtszellteilung, Zellwandbiosynthese, Membranbiosynthese,
Organellenbiosynthese, Proteinsynthese,
Kohlenstoffquellennutzung, RNA-Transkription oder DNA-Replikation erforderlich
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes Gen ein Gen des Hefezellteilungszyklus oder ein Gen
des Glykolyse-Weges ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
besagte Wirtszelle eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle ist
und besagtes Gen ein Saccharomyces cerevisiae-Gen ist,
ausgewählt aus Genen, die die Enzyme Pyruvat-Kinase,
Triose-Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase, Phosphoglycerat-
Mutase, Phosphoglycerat-Kinase, Phospho-Fructokinase,
Hexokinase oder Glucokinase kodieren, und dem Regulator-Gen,
GCR1.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
besagtes Gen ein Hefe-CDC4-Gen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Gen ein Schizosaccharomyces pombe-
Triose-Phosphat-Isomerase-Gen ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Gen aus einer Zellspezies ist, die
von besagter Wirtszelle verschieden ist.
11. DNA-Konstruktion, die ein Gen umfaßt, das, wenn
exprimiert, ein Manko in einer Wirtszelle komplementiert, wobei
besagtes Manko in einem Gen vorliegt, das für
Wirtszellteilung, Zellwandbiosynthese, Membranbiosynthese,
Organellenbiosynthese, Proteinsynthese, Kohlenstoffquellennutzung,
RNA-Transkription oder DNA-Replikation erforderlich ist.
12. DNA-Konstruktion nach Anspruch 11, weiter gekennzeichnet
durch eine DNA-Sequenz, die für ein Proteinprodukt kodiert,
das in besagter Wirtszelle exprimiert wird.
13. DNA-Konstruktion nach Anspruch 12, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Proteinprodukt α&sub1;-Antitrypsin ist.
14. DNA-Konstruktion nach einem der Ansprüche 11 bis 13,
weiter definiert durch das spezifische Merkmal einer der
Ansprüche 6 bis 9.
15. DNA-Konstruktion nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß sie das Plasmid pFPOT oder ein Plasmid, das aus den
ATCC Hinterlegungsnummern 20698, 20699, 20744 oder 39685
erhältlich ist, umfaßt.
16. Transformanter Stamm, der eine DNA-Konstruktion nach
einem der Ansprüche 11 bis 15 enthält.
17. Transformanter Stamm, der die DNA-Konstruktion pB5, die
DNA-Konstruktion pFATPOT oder die DNA-Konstruktion pMPOT2
enthält und die wesentlichen Merkmale der
Hinterlegungsnummern ATTC 20698, ATCC 20699 bzw. ATCC 20744 aufweist.
18. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Konstruktion nach
Anspruch 11, welches das Einführen eines Gens, das ein Manko
im Wirt komplementiert, in einen Vektor umfaßt, der in der
Lage ist, besagten Wirt zu transformieren, so daß besagtes
Gen nach einer solchen Transformation in besagtem Wirt
phänotypisch exprimierbar ist.
19. Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die zu normalen
Wachstum auf Komplexmedien in der Lage ist, aus einer
Wirtszelle, der eine solche Fähigkeit fehlt, welches das
Transformieren besagter Wirtszelle mit einem DNA-Molekül, das ein
Gen umfaßt, das, wenn exprimiert, ein Manko in besagter
Wirtszelle in einem Gen, dessen Expression für normales
Zellwachstuin auf Komplexmedien wesentlich ist, komplementiert,
umfaßt.
20. Verwendung einer DNA-Konstruktion in einem Verfahren nach
Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die DNA-Konstruktion ein
Gen umfaßt, das, wenn exprimiert, ein Manko in einer
Wirtszelle komplimentiert, wobei besagtes Manko in einem Gen
vorliegt, dessen Expression für normales Zellwachstum auf
Komplexmedien wesentlich ist.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61473484A | 1984-05-25 | 1984-05-25 | |
US614734 | 1984-05-25 | ||
US73411985A | 1985-05-15 | 1985-05-15 | |
US734119 | 1985-05-15 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3586304D1 DE3586304D1 (de) | 1992-08-13 |
DE3586304T2 true DE3586304T2 (de) | 1992-12-10 |
DE3586304T3 DE3586304T3 (de) | 2005-02-17 |
Family
ID=27087316
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3586304T Expired - Lifetime DE3586304T3 (de) | 1984-05-25 | 1985-05-24 | Verfahren zur Herstellung von Proteinen und transformierten Zellen und DNA-Konstruktionen zur Korrektur von Mankos und Wirtszellen sowie deren Herstellung und Verwendung. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5527668A (de) |
EP (1) | EP0171142B2 (de) |
JP (2) | JP2543497B2 (de) |
AT (1) | ATE78055T1 (de) |
AU (1) | AU600885B2 (de) |
CA (1) | CA1285505C (de) |
DE (1) | DE3586304T3 (de) |
DK (1) | DK175105B1 (de) |
Families Citing this family (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
US5723292A (en) * | 1984-05-25 | 1998-03-03 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs |
EP0487116B1 (de) * | 1984-10-12 | 1999-12-29 | ZymoGenetics, Inc. | Von Blutplättchen abstammende biologisch aktive Analoga eines Wachstumsfaktors in eukaryotischen Zellen |
US4801542A (en) * | 1984-10-12 | 1989-01-31 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
EP0251579A3 (de) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Markiersystem ohne Antibiotika |
EP0259632B1 (de) * | 1986-08-13 | 1995-12-13 | Zymogenetics, Inc. | Expression von biologisch-aktiven PDGF-Analogen in eukaryotischen Zellen |
US5474982A (en) * | 1986-08-13 | 1995-12-12 | Zymogenetics, Inc. | PDGF analogs and methods of use |
JP2795850B2 (ja) * | 1987-03-23 | 1998-09-10 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 酵母発現ベクター |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
WO1989006694A1 (en) * | 1988-01-15 | 1989-07-27 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules |
WO1991000920A2 (en) * | 1989-07-07 | 1991-01-24 | Unilever N.V. | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
US6004776A (en) * | 1989-07-07 | 1999-12-21 | Unilever Patent Holdings, B.V. | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
US5759833A (en) * | 1994-05-27 | 1998-06-02 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Human isoleucyl-tRNA synthetase proteins, nucleic acids and tester strains comprising same |
GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
US6576478B1 (en) * | 1998-07-14 | 2003-06-10 | Zyomyx, Inc. | Microdevices for high-throughput screening of biomolecules |
US6897073B2 (en) * | 1998-07-14 | 2005-05-24 | Zyomyx, Inc. | Non-specific binding resistant protein arrays and methods for making the same |
US20020119579A1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-08-29 | Peter Wagner | Arrays devices and methods of use thereof |
US6406921B1 (en) | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
WO2001049870A1 (en) | 1999-12-29 | 2001-07-12 | Novo Nordisk A/S | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast |
US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
JP3966819B2 (ja) | 2001-05-24 | 2007-08-29 | キム,スーギョン | 毛嚢に存在する新規の第2ケラチノサイト成長因子類似体 |
US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
ATE514717T1 (de) | 2002-07-18 | 2011-07-15 | Merus B V | Rekombinante produktion von antikörpermischungen |
WO2004106375A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
WO2005047508A1 (en) | 2003-11-14 | 2005-05-26 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
EP1692168B1 (de) | 2003-12-03 | 2011-07-20 | Novo Nordisk A/S | Einzelketteninsulin |
JP2006067883A (ja) * | 2004-09-01 | 2006-03-16 | Kao Corp | 組換えバチルス属細菌 |
IL165484A0 (en) * | 2004-11-30 | 2006-01-15 | Applied Research Systems | Production of proteins |
EP1831375B1 (de) | 2004-12-23 | 2014-07-16 | Novozymes Biopharma DK A/S | Genexpressionsmethode |
WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
WO2007096431A1 (en) | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
WO2008012629A2 (en) | 2006-07-24 | 2008-01-31 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Exendin fusion proteins |
WO2008037735A1 (en) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making maturated insulin polypeptides |
MX2009006398A (es) | 2006-12-12 | 2009-06-23 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Genotecas de proteinas de fusion de transferrina. |
WO2009021955A1 (en) | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Rapid acting insulin analogues |
ES2548304T3 (es) | 2007-08-15 | 2015-10-15 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina que contienen una fracción acilo y alquilenglicol |
ES2526924T3 (es) | 2007-08-15 | 2015-01-16 | Novo Nordisk A/S | Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol |
CN102639559B (zh) | 2009-11-25 | 2015-04-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 用于制备多肽的方法 |
CN102791730A (zh) | 2010-01-22 | 2012-11-21 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 低度o-糖基化的fgf21的制备方法 |
PT2838917T (pt) | 2012-04-20 | 2019-09-12 | Merus Nv | Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas |
EP3004156A1 (de) | 2013-06-07 | 2016-04-13 | Novo Nordisk A/S | Verfahren zur herstellung von reifen insulinpolypeptiden |
KR102277898B1 (ko) * | 2014-07-03 | 2021-07-15 | 삼성전자주식회사 | 산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
JPS6048322B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-26 | 松下電工株式会社 | セメント系無機材料の押出成形方法 |
US4506013A (en) * | 1980-10-03 | 1985-03-19 | Eli Lilly And Company | Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells |
EP0076037B1 (de) * | 1981-09-02 | 1988-12-07 | Biogen, Inc. | Verstärkte Expression von DNS-Sequenzen |
CA1198069A (en) * | 1982-06-08 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Temperature sensitive multicopy plasmids |
GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
GB8407498D0 (en) * | 1984-03-22 | 1984-05-02 | Biogen Nv | High copy number expression vectors |
US4931373A (en) * | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
-
1985
- 1985-05-23 AU AU42794/85A patent/AU600885B2/en not_active Ceased
- 1985-05-24 JP JP60111975A patent/JP2543497B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 EP EP85303702A patent/EP0171142B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 DE DE3586304T patent/DE3586304T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 CA CA000482272A patent/CA1285505C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-24 DK DK198502350A patent/DK175105B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-24 AT AT85303702T patent/ATE78055T1/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-10-12 US US08/134,480 patent/US5527668A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-31 JP JP6118650A patent/JP2704115B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-06 US US08/473,012 patent/US5700643A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK175105B1 (da) | 2004-06-01 |
US5700643A (en) | 1997-12-23 |
JPS6156092A (ja) | 1986-03-20 |
JPH0767685A (ja) | 1995-03-14 |
AU4279485A (en) | 1985-11-28 |
AU600885B2 (en) | 1990-08-30 |
US5527668A (en) | 1996-06-18 |
ATE78055T1 (de) | 1992-07-15 |
JP2704115B2 (ja) | 1998-01-26 |
JP2543497B2 (ja) | 1996-10-16 |
DK235085A (da) | 1985-11-26 |
EP0171142A1 (de) | 1986-02-12 |
EP0171142B2 (de) | 2004-09-01 |
DE3586304D1 (de) | 1992-08-13 |
EP0171142B1 (de) | 1992-07-08 |
DE3586304T3 (de) | 2005-02-17 |
CA1285505C (en) | 1991-07-02 |
DK235085D0 (da) | 1985-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3586304T2 (de) | Verfahren zur herstellung von proteinen und transformierten zellen und dna-konstruktionen zur korrektur von mankos und wirtszellen sowie deren herstellung und verwendung. | |
US4931373A (en) | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin | |
DE3382821T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Proteasehemmenden Aktivität von Säugetier-alpha-1-Antitrypsin | |
DE68927344T2 (de) | Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces | |
DE68929115T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serumalbumin in Hefe | |
DE68928545T2 (de) | Herstellung von glukoseoxidase in rekombinanten systemen | |
DE3588199T2 (de) | Lymphokin-Herstellung und -Reinigung | |
DE3588234T2 (de) | Hefevektor | |
DE3854256T2 (de) | Expressionsvektor für hefe. | |
US5013652A (en) | Composite yeast vectors | |
US4935350A (en) | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability | |
DE69025457T2 (de) | Mutantschimmelstammnachweis | |
EP0324712B1 (de) | Hirudin-Derivat | |
DE68913846T2 (de) | Expressionssystem. | |
DE69027970T2 (de) | Hefe-Promoter | |
DE69011183T2 (de) | Hefestämme für die Herstellung von heterologen reifen Proteinen, besonders von Hirudin. | |
DE69226028T2 (de) | Mutanter AOX2 Promotor, Mikroorganismen es enthaltend, Verfahren zur Herstellung und Produktion von heterologem Protein, das solche Mikroorganismen benutz | |
DE69034051T2 (de) | Stabil transformierte Hefezellen und ihre Verwendung zur Herstellung von Albumin | |
US5871957A (en) | Stable DNA constructs | |
DE3689918T2 (de) | Verfahren zur Verwendung von BAR1 für die Fremdproteinsekretion. | |
DE3685985T2 (de) | Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion. | |
US5723292A (en) | Stable DNA constructs | |
DE69329540T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren | |
DE3906540A1 (de) | Expressionsvektoren zur synthese von proteinen in der spalthefe schizosaccharomyces pombe | |
AU594650B2 (en) | Stable DNA constructs for expression of alpha-1-antitrypsin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8363 | Opposition against the patent | ||
8366 | Restricted maintained after opposition proceedings |