DE69025457T2

DE69025457T2 - Mutantschimmelstammnachweis

Info

Publication number: DE69025457T2
Application number: DE69025457T
Authority: DE
Inventors: Graham Paul Belfield; Andrew Robert Goodey; Darrell Sleep
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1989-12-05
Filing date: 1990-12-04
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2010-12-05
Also published as: GB2239315A; EP0431880B1; JP2710470B2; ATE134447T1; GR3019231T3; GB8927480D0; GB2239315B; DK0431880T3; EP0431880A1; GB9026282D0; DE69025457D1; ES2086383T3; JPH04339259A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung von Pilzstämmen, beispielsweise von Saccharomyces cerevisiae, die heterologe Proteine in wesentlich höheren Mengen exprimieren als der Eltemstamm.
Die Herstellung von Hefestämmen mit besseren Eigenschaften, wie beispielsweise besseren Wachstumseigenschaften oder höheren Expressionsniveaus an heterologen Polypeptiden, ist bekannt. Bisher bekannte Verfahren bedienten sich enzymatischer Tests oder Antikörper, die auf Elektrophoresegele appliziert wurden. Die EP-A-201 208 offenbart beispielsweise ein Sichtungsverfahren zum Nachweis von übermäßig sezernierenden Mutanten von S. cerevisiae unter Verwendung einer Milchgerinnungsuntersuchung, bei der Prochymosin durch die vermutliche, übermäßig sezernierende Mutante exprimiert und sezerniert wird. Die vorliegende Erfindung liefert ein verbessertes Verfahren zur Identifizierung von geeigneten Mutanten, die ein hohes Expressionsniveau (und vorzugsweise ein hohes Sekretionsniveau) an heterologen Polypeptiden aufweisen.
Gegenstand eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Produktionsniveaus eines heterologen Polypeptids in Kolonien von Pilzzellen mit der Fähigkeit zur Expression des heterologen Polypeptids, wobei das Verfahren ein Applizieren der Pilzzellen auf ein ein Mittel, das selektiv an das heterologe Polypeptid bindet, enthaltendes festes Medium, ein Gewährleisten einer Expression des Polypeptids durch die Zellen auf dem festen Medium, ein Gewährleisten einer Wechselwirkung des heterologen Polypeptids mit dem genannten Bindungsmittel in dem Medium und ein Sichtbarmachen der gebildeten Komplexe umfaßt.
Unter dem Ausdruck "festes" Medium verstehen wir ein Medium, das ausreichend fest ist, um die Hefestämme zu immobilisieren und dadurch zu gewährleisten, daß ihre Produkte sichtbar gemacht werden und einer gegebenen Kolonie eines Stamms zugeschrieben werden. Würde ein flüssiges Medium verwendet werden, wäre eine solche Zuordnung nicht möglich. Ein Gel wie Agar, das mit den geeigneten Nährstoffen ergänzt ist, ist üblicherweise günstig.
Die Zellen können auf das Medium im Rahmen eines beliebigen üblichen Verfahrens, wie durch Sprühen oder Applizieren mit einem Draht, das üblicherweise als "Ausplattieren" bezeichnet wird, appliziert werden.
Die Selektion neuer Pilzstämme umfaßt die Herstellung des heterologen Proteins, beispielsweise von Humanalbumin (HA). Es hat sich gezeigt, daß das Verfahren es ermöglicht, eine große Zahl von einzelnen Pilzkolonien auf ihre Fähigkeit zur Herstellung von erhöhten Niveaus an heterologen Proteinen zu sichten.
Wenn das Polypeptid durch die Hefe sezerniert wird, kann man das Produktionsniveau ohne Lyse der Zellen nachweisen. Ein hohes Produktionsniveau kann auf ein hohes Expressionsniveau, das intrazellulär mit einer normalen Fähigkeit zur Sekretion des Polypeptids verbunden ist, oder ein normales Expressionsniveau, das mit einer erhöhten Fähigkeit zur Sekretion des Polypeptids verbunden ist, oder auf bezüglich beider Belange erhthte Fähigkeiten hindeuten. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, müssen die Zellen (entweder durch die Einwirkung eines äußeren Mittels oder als natürliche Folge des Wachstums der Hefe) einer Lyse unterzogen werden. Ein hohes Produktionsniveau in dieser Situation weist auf ein hohes Expressionsniveau hin. Wir haben festgestellt - obwohl wir nicht voraussagen können, daß dies immer zutrifft -, daß ein guter Expressor des Polypeptids häufig, wenn geeignete Sekretionsleadersignale vorhanden sind, auch ein guter Sekretor ist und umgekehrt. Sicherlich ist die erhöhte Fähigkeit der Hefe zur Expression und/oder Sekretion des Polypeptids offenbar nicht vom Polypeptid selbst abhängig.
Der hier verwendete Ausdruck "Humanalbumin" (HA) soll ein Material bezeichnen, das von Humanserumalbumin (HSA) nicht unterscheidbar ist oder das eine Variation oder ein Fragment hiervon, beispielsweise eine Form, der lediglich eine oder einige Aminosäurereste fehlen oder die das Produkt konservativer Substitutionen darstellt, oder ein in der EP-A-322 094 beschriebenes HSA-Analoges ist. Im allgemeinen besitzen die Varianten oder Fragmente von HA, bezogen auf das Gewicht, mindestens 50, vorzugsweise mindestens 80, 90 oder 95% der Ligandenbindungsaktivität von HA, beispielsweise der Bilirubinbindungsaktivität, und mindestens 50, vorzugsweise mindestens 80, 90 oder 95% der oncotischen Aktivität von HA.
Das genetische Material eines Pilzstamms mit dem Vermögen zur Expression und Sekretion von HA kann im Rahmen eines beliebigen Verfahrens aus einer Reihe von Standardverfahren modifiziert werden. Zu diesen gehört die Belichtung mit elektromagnetischer Strahlung, vorzugsweise im Ultraviolett (UV)-Bereich, oder die Behandlung mit chemischen Mutagenen, beispielsweise 1,2,7,8-Diepoxyoctan, Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und 4-Nitrochinolin-N-oxid (NQO), die die im Wirt enthaltenen DNA-Sequenzen modifizieren. Einige dieser Mutationen sind entweder letale Mutationen oder vernichten die Expression und/oder Sekretion von HA. Einige Mutationen besitzen das Vermögen, die Expression und Sekretion von HA zu erhöhen. Diese vorteilhaften Mutationen beherbergende Klone können nachgewiesen und isoliert werden, wenn die Zellen auf einem festen Nährmedium, das einen Humanalbumin (HA)-Antikörper enthält, in einer derartigen Weise verteilt werden, daß einzelne Zellen voneinander getrennt werden. Bei einer Züchtung bei 30ºC während 72 bis 96 h können isolierte Kolonien auf dem Nährmedium beobachtet werden. Idealerweise entsteht jede Kolonie aus einer einzelnen Zelle. Kolonien mit dem Vermögen zur Expression und Sekretion von HA werden durch einen opaken Halo, der um die Kolonie herum erscheint, nachgewiesen. Dieser bildet sich infolge einer Wechselwirkung zwischen der sezernierten HA und dem anti-HA-Antikörper. Die Größe des Halos schwankt in Abhängigkeit von der Menge des durch die Kolonie sezernierten HAS.
Die HA-Kodierregion ist vorzugsweise in einem eine Promotorsequenz, eine DNA-Sequenz mit Kodierung für HA, die sich unter der Transkriptionssteuerung des Promotors befindet, und eine DNA-Sequenz, die eukaryontische Transkriptionsterminationssignale enthält, umfassenden Hybridplasmid enthalten. Das Hybridplasmid enthält vorzugsweise ferner weitere DNA- Sequenzen, die andere Funktionen erfüllen, beispielsweise die Vermehrung der mit den Plasmiden transformierten Zellen. Die "Disintegrations"-Vektoren aus der EP-A-286 424 sind Beispiele für verwendbare Hybridplasmide.
Zur Erleichterung der Selektion der Transformanten infolge der phenotypischen Expression des Markers kann ein selektiver Genmarker verwendet werden. Geeignete Marker für Pilze sind insbesondere diejenigen, die eine Antibiotikumresistenz exprimieren, oder - wie im Falle von auxotrophen Hefemutanten - Gene, die Wirtläsionen vervollständigen. Entsprechende Gene tragen beispielsweise zur Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Cycloheximid bei oder sorgen für eine Prototrophie bei einer auxotrophen Hefemutante, beispielsweise die URA1-, URA3-, LEU2-, HIS4-, HIS3-, TRP5- und TRP1-Gene.
Antikörper können in bekannter Weise, beispielsweise wie bei Chard "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques" (Elsevier 1982) beschrieben, hergestellt und markiert werden. Die Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein.
Insbesondere wenn das heterologe Polypeptid nicht HA ist, kann das Polypeptid durch andere Mittel als durch Antikörper sichtbar gemacht werden. Beispielsweise kann das Polypeptid eine hohe Affinität zu einem Co-Faktor oder einer prosthetischen Gruppe, beispielsweise Biotin, Haem Fe³&spplus;, NAD oder FAD, oder zu einem bestimmten natürlichen Liganden, wie einem Zelloberflächenrezeptor, der in bekannter Weise markiert oder radioaktiv etikettiert sein kann, aufweisen.
Geeignete Promotoren für die Sekretion von HA sind beispielsweise diejenigen, die mit dem Phosphoglyceratkinase (PGK1)-Gen, den GAL1- und GAL10-Genen, dem CYC1-Gen, dem Gen saurer Phosphatase (PHO5), deni ADH1-, dem ADH2- und MFα-1- Pheromon-Gen verknüpft sind, sowie die aus der GB-A-2 196 635 und der EP-A-424 117 bekannten Promotoren. Der bevorzugte Promotor ist der des PRB1-Gens.
Das Strukturgen PRB1 für die Vakuolen-Endoprotease B von Saccharomyces cerevisiae wurde von Moehle und Mitarbeitern (Genetics 115, 255-263, 1987) auf zwei prb1-Komplementärplasmiden mit der Bezeichnung MK4 und FP8 isoliert. Wenn die Hefe Saccharomyces cerevisiae auf Glucose in einer Schüttelkolbenkultur gezüchtet wird, wird sehr wenig Protease-B-Aktivität nachgewiesen, bis die Zellen die Glucose katabolisiert haben und das während des Wachstums akkumulierte Ethanol verwenden (T. Saheki und H. Holzer, Biochem. Biophys. Acta 384, 203-214, 1975; Jones und Mitarbeiter, UCLA Symp. Mol. Cell Biol. New Ser. 33, 505-518, 1986). Dies ist vermutlich eine Konsequenz eines Transkriptionssteuermechanismus, der eine mRNA-Akkumulation unterdrückt, bis die Glucose erschöpft ist und die Kultur auf das Diauxieplateau gelangt (Moehle und Mitarbeiter, Genetics 115, 255-263, 1987).
Untersuchungen bei Mutanten mit Protease B (prb1&supmin;)-Defizienz deuten auf Protease B im Proteinabbau hin, der auftritt, wenn negativen Zellen Stickstoff und Kohlenstoff als Nahrung fehlt (D. Wolf und C. Ehmann, Eur. J. Biochem. 98, 375-384, 1979; G. Zubenko und E. Jones, Genetics 97, 45-64, 1981).
Die DNA-Sequenz des PRB1-Gens besitzt Berichten zufolge 150 Basenpaare des PRB1-Promotors (Moehle und Mitarbeiter, Mol. Cell. Biol. 7, 4390-4399, 1987). Eine umfangreichere DNA-Se quenz des PRB1-Promotors ist auch als Eintrag in der Genbank-Datenbank, Zugangsnummer M18097, Ort YSCPRB1, erhältlich.
Der gesamte PRB1-Promotor oder ein kleinerer Teil hiervon kann, wie ohne weiteres festgestellt werden kann, verwendet werden. Beispielsweise ist die etwa 1kbp große Sequenz, die sich stromauf vom Startkodon zur Snabl-Stelle erstreckt, wirksam.
Ein geeigneter Promotor kann sich auf einem Klonierungsvektor oder einem Expressionsvektor nahe einer Restriktionsstelle in einer derartigen Weise befinden, daß eine heterologe Kodiersequenz stromab des Promotors und im richtigen Leserahmen, bezogen auf ein Translationsstartkodon, angeordnet ist. Das Startkodon kann auf dem Vektor, beispielsweise unmittelbar 3' zum Promotor, angeordnet sein oder es kann als ein 5'-Ende der heterologen Kodiersequenz insertiert werden. Zwischen dem Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung und dem Startkodon kann sich gewünschtenfalls ein Linker befinden. Vorzugsweise weist das DNA-Konstrukt an beiden Enden synthetische Oligonudeotidlinker auf, die eine Insertion und Klonierung des Konstrukts in einem Klonierungsvektor gewährleisten. Der Promotor, die DNA-Kodiersequenz und die Pilztranskriptionsterminationssignale sind operativ miteinander verbunden, d.h. sie befinden sich in einer derartigen Weise nebeneinander, daß ihre normalen Funktionen aufrechterhalten werden. Die Verbindung ist somit so ausgestaltet, daß die Expressionssteuersequenz eine geeignete Expression der Kodiersequenz bewirkt und die Transkriptionsterminationssignale eine geeignete Beendigung der Transkription und Polyadenylierung bewirken. Die Verbindung dieser Sequenzen erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von synthetischen Oligonudeotidlinkern, die die Erkennungssequenz einer Endonuclease tragen können.
Es können Hybridvektoren mit einem oder mehreren DNA-Inser ten verwendet werden, die jeweils einen geeigneten Promotor, ein DNA-Segment aus einer DNA-Sequenz mit Kodierung für ein gewünschtes Polypeptid, wobei sich das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung des Promotors befindet, und eine DNA-Sequenz, die eukaryontische Transkriptionsterminationssignale enthält, umfassen.
Es können ferner Hybridplasmide verwendet werden, die neben der Expressionssteuersequenz, dem obigen DNA-Segment und der die Transkriptionsterminationssignale enthaltenden Sequenz weitere DNA-Sequenzen enthalten, die für die Funktion des Promotors, d.h. für die Expression des gewünschten Polypeptids, nicht wesentlich oder weniger wichtig sind, die jedoch wichtige Funktionen erfüllen, beispielsweise bei der Vermehrung der mit den Hybridplasmiden transformierten Zellen. Die weiteren DNA-Sequenzen können aus prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen stammen und können chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Sequenzen umfassen. Beispielsweise können die weiteren DNA-Sequenzen aus Plasmid-DNA, beispielsweise bakterieller oder eukaryontischer Plasmid- DNA, Virus-DNA und/oder chromosomaler DNA, wie bakterieller chromosomaler DNA, chromosomaler DNA von Hefen oder chromosomaler DNA von höheren Eukaryonten, herstammen oder bestehen. Bevorzugte Hybridplasmide enthalten weitere DNA-Sequenzen aus bakteriellen Plasmiden, insbesondere dem Eschenchia-coli-Plasmid P8R322 oder verwandten Plasmiden, Bakteriophagen, Hefe-2µ-Plasmiden und/oder chromosomaler Hefe-DNA.
In den bevorzugten Hybridplasmiden tragen die weiteren DNA- Sequenzen einen Hefereplikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Einen Hefereplikationsursprung, beispielsweise ein autonom replizierendes Segment (ars), enthaltende Hybridplasmide bleiben extrachromosomal in den Hefezellen nach Transformation erhalten und werden autonom bei der Mitose repliziert. Sequenzen, die homolog zur Hefe-2µ-DNA sind, enthaltende Hybridplasmide können ebenso verwendet werden. Diese Hybridplasmide können durch Rekombination in bereits in der Zelle vorhandene 2µ-Plasmide integriert werden oder sich autonom replizieren. Die Integrationsvektoren gemäß EP-A-251 744 oder die "Disintegrations"-Vektoren gemäß EP-A-286 424 können verwendet werden.
In vorteilhafter Weise umfassen die in den Hybridplasmiden vorhandenen weiteren DNA-Sequenzen auch einen Replikationsursprung und einen selektiven Genmarker für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli. Es gibt geeignete Merkmale, die mit der Anwesenheit eines E.-coli-Replikationsursprungs und eines E.-coli-Markers in einem Hefehybridplasmid verbunden sind. Erstens können durch Wachstum und Vermehrung in E. coli große Mengen an Hybridplasmid-DNA erhalten werden. Zweitens erfolgt die Konstruktion von Hybridplasmiden bequemerweise in E. coli unter Verwendung des gesamten Repertoires der auf E. coli basierenden Kloniertechniken. E.-coli-Plasmide, wie pBR322 und dgl., enthalten sowohl einen E.-coli-Replikationsursprung als auch E.-coli-Genmarker, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika, beispielsweise Tetracyclin und Ampicillin, verleihen. Sie werden in vorteilhafter Weise als Teil der Hefehybridvektoren verwendet.
Die Hybridvektoren können einen oder mehrere DNA-Inserte enthalten, die jeweils unter anderem die Expressionssteuersequenz und die DNA-Sequenz mit Kodierung für das gewünschte Protein umfassen. Wenn die Hybridvektoren mehrere bzw. Mehrfach-DNA-Inserte, beispielsweise 2 bis 4 DNA-Inserte, enthalten, können diese in einer Anordnung in Reihe oder an unterschiedlichen Stellen des Hybridvektors vorhanden sein. Bevorzugte Hybridvektoren enthalten ein DNA-Insert oder DNA- Inserte in Reiheanordnung. Die DNA-Inserte befinden sich in besonders bevorzugter Weise in einer Kopf-zun-Schwanz-Anordnung.
Die Hybridplasmide werden nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt. Das Verfahren zur Herstellung der Hybridvektoren umfaßt ein Einführen einer oder mehrerer DNA-Konstrukte, die einen Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung, ein DNA-Segment aus einer DNA-Sequenz mit Kodierung für ein gewünschtes Polypeptid, wobei sich das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung der Expressionssteuersequenz befindet, und eine Pilztranskriptionsterminationssignale enthaltende DNA-Sequenz enthalten, als solches oder ein Einführen der Komponenten der genannten DNA-Konstrukte nacheinander in der vorgegebenen Reihenfolge in eine Vektor-DNA.
Die Konstruktion der Hybridplasmide erfolgt unter Verwendung herkömmlicher Ligationstechniken. Die Komponenten der Plasmide werden durch übliche Restriktionsstellen und/oder mit Hilfe von synthetischen Linkermolekülen und/oder durch stumpfendige Ligation verknüpft.
Zu den in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet verwendbaren Pilzzellen gehören die Gattungen Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula, Schizo saccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis und dgl. Bevorzugte Gattungen sind solche aus der Gruppe Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula, da die Möglichkeit zur Manipulation der DNA dieser Hefen gegenwärtig in höherem Maße entwickelt ist als bei den anderen oben erwähnten Gattungen. Beispiele für Saccharomyces sind Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces italicus und Saccharomyces rouxii. Beispiele für Kluyveromyces sind Kluyveromyces fragilis und Kluyveromyces lactis. Beispiele für Hansenula sind Hansenula polymorpha, Hansenula anomala und Hansenula capsulata. Yarrowialipolytica ist ein Beispiel für eine geeignete Yarrowia- Spezies. Aspergillus niger ist ein Beispiel für einen faserförmigen Pilz.
Es wurde gezeigt, daß Pilzzellen der Gattungen Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula durch enzymatische Verdauung der Zellwände unter Bildung von Sphäroplasten transformiert werden können. Die Sphäroplasten werden anschließend mit der transformierenden DNA vermischt und in Gegenwart von Calciumionen und Polyethylenglykol inkubiert. Anschließend werden die transformierten Sphäroplasten in Regenerationsmedium regeneriert.
Verfahren zur Transformation von S. cerevisiae sind allgemein in der EP-A-251 744, der EP-A-258 067 und WO-A-90/01063 beschrieben.
Die Transformation von Hefe mit den Hybridvektoren kann nach deni von Hinnen und Mitarbeitern (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)) beschriebenen Verfahren erfolgen. Dieses Verfahren kann in drei Stufen unterteilt werden:
(1) Entfernen der Hefezellwände oder von Teilen hiervon unter Verwendung verschiedener Zubereitungen von Glucosidasen, wie Schneckendarnisäften, wie Glusulase oder Helicase , oder aus Mikroorganismen erhaltenen Enzymmischungen, wie Zymolyase , in osmotisch stabilisierten Lösungen, wie 1 Mol Sorbit;
(2) Behandeln der "nackten" Hefezellen (Sphäroplasten) mit dem DNA-Vektor in Gegenwart von PEG (Polyethylenglykol) und Ca²&spplus;-Ionen;
(3) Regenerieren der Zellwände und Auswählen der transformierten Zellen in einer festen Schicht aus Agar. Diese Regeneration erfolgt üblicherweise durch Einbetten der Sphäroplasten in Agar. Beispielsweise wird geschmolzener Agar (etwa 50 ºC) mit den Sphäroplasten vermischt. Beim Abkühlen der Lösung auf Hefewachstumstemperatur (etwa 30ºC) wird eine feste Schicht erhalten. Diese Agarschicht soll eine rasche Diffusion und einen Verlust merklicher Makromoleküle aus den Sphäroplasten verhindern. Dadurch wird die Regeneration der Zellwände erleichtert. Die Zellwandregeneration kann jedoch auch durch Plattieren der Sphäroplasten auf die Oberfläche vorgeformter Agarschichten (wenn auch in geringerer Effizienz) erreicht werden.
Vorzugsweise wird der Regenerationsagar in einer Weise hergestellt, so daß die Regeneration und Auswahl der transformierten Zellen gleichzeitig gewährleistet sind. Da Hefegene mit Kodierung für Enzyme von Aminosäurebiosynthesewegen im allgemeinen als selektive Marker (vgl. oben) verwendet werden, erfolgt die Regeneration vorzugsweise in einem Hefeminimalmediumagar. Wenn sehr hohe Effizienzen bezüglich der Regeneration erforderlich sind, ist das folgende zweistufige Vorgehen von Vorteil: (1) Regenerieren der Zellwände in einem reichen Komplexmedium und (2) Auswahl der transformierten Zellen durch Replikaplattieren der Zellschicht auf selektive Agarplatten.
Wenn der DNA-Vektor ein zum Transformieren eukaryontischer Wirtzellen verwendeter linearer DNA-Vektor ist, erfolgt die Transformation vorzugsweise in Gegenwart eines zweiten, einen selektiven Marker für Hefe enthaltenden Vektors. Diese Co-Transformation gewährleistet eine Anreicherung derjenigen Wirtzellen, die DNA aufgenommen haben, die nicht direkt diesbezüglich hierfür ausgewählt werden kann. Da kompetente Zellen jeden beliebigen DNA-Typ aufnehmen, wird auch ein hoher Prozentsatz von mit einem selektiven Vektor transformierten Zellen jede beliebige weitere DNA, beispielsweise den obigen linearen DNA-Vektor, aufnehmen. Die transformierten Wirtzellen können bezüglich der Produktion des gewünschten Polypeptids durch Mutation und Auswahl unter Verwendung von auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren verbessert werden. Die Mutation kann beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder geeignete chemische Reagenzien erfolgen. Stämme, denen Protease A und B fehlt, sind besonders bevorzugt. Derartige Stämme sind allgemein erhältlich.
Das Transkriptionsterminationssignal kann die das 3'-Ende flankierende Sequenz eines eukaryontischen Gens, das geeignete Signale zur Transkriptionsbeendigung und Polyadenylierung enthält, sein. Geeignete, das 3'-Ende flankierende Sequenzen können beispielsweise solche des natürlich mit der Expressionssteuersequenz verbundenen Gens sein. Andererseits kann es sich bei ihnen auch um unterschiedliche handeln. Vorzugsweise ist das Terminationssignal dasjenige des Saccharomyces-cerevisiae-ADH1-Gens.
Gegenstand eines zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Pilzstamms mit der Fähigkeit zur Expression und Sekretion eines heterologen Polypeptids, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (1) Einwirkenlassen eines Mutagens auf Pilzzellen, um Mutanten zu erzeugen, (2) Bestimmen der relativen Sekretionsmengen eines heterologen Peptids im Rahmen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und (3) Isolieren eines Stamms, der die gewünschte Menge des heterologen Polypeptids exprimiert, wobei die Expressionsmenge größer ist als die der Pilzzellen.
Gegenstand eines dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Fermentieren des verbesserten Pilzstamms und zur Gewinnung eines dadurch exprimierten Peptids. Das Peptid (dieser Ausdruck umfaßt Oligopeptide und Polypeptide) kann das in der Stammselektionsstufe exprimierte Polypeptid sein oder sich von diesem unterscheiden. Wenn es sich von diesem unterscheidet, muß selbstverständlich dann ein geeignetes Expressionsmittel (ein geeigneter Promotor und ein geeigneter Kodierbereich usw.) vorhanden sein, so wie es allgemein bekannt ist. Üblicherweise wird das Expressionsmittel für das ursprüngliche Polypeptid vor, während oder nach dem Einbau des neuen Expressionsmittels entfernt.
Das heterologe Peptid kann Fibronectin oder ein Teil hiervon, beispielsweise die in der EP-A-207 751 beschriebenen Collagen oder Fibrin bindenden Teile, Urokinase, Pro-Urokinase, der 1-368 Teil von CD4 (D. Smith und Mitarbeiter, Science 328, 1704-1707, 1987), platelet derived growth factor (Collins und Mitarbeiter, Nature 316, 748-750, 1985), transformierender Wachstumsfaktor β (Derynck und Mitarbeiter, Nature 316, 701-705, 1985), der 1-272 Teil des von Willebrandschen Faktors (Bontham und Mitarbeiter, Nucl. Acids Res. 145, 7125-7127), das Cathepsin-D-Fragment von Fibronectin (585-1578), α&sub1;-Antitrypsin, Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren, Faktor VIII, α-Globin, β-Globin, Myoglobin, Nervenwachstumsfaktor LAC1 (an Lipoprotein geknüpfter Koagulationshemmer), Lactoferrin oder platelet-derived Endothelzellenwachstumsfaktor (PDECGF) oder eine konservative Variante einer der oben genannten Stoffe sein. Das Polypeptid kann ferner ein Fusionspeptid von HSA oder einem N-terminalen Teil hiervon und einem beliebigen weiteren Polypeptid, wie einem der oben genannten, sein.
Das Peptid wird vorzugsweise anfänglich als Fusionsprodukt mit einer Sekretionsleadersequenz exprimiert. Dies kann beispielsweise der natürliche HA-Leader, der Leader von Saccharomyces cerevisiae MFα-1, der Kluyveromyces-lactis-Killer toxinleader, ein Fusionsprodukt zwischen dem natürlichen HA- Leader und der MFα-1-Leadersequenz oder ein Fusionsprodukt zwischen dem Kluyveromyces-lactis-Killerleader und der MFα- 1-Leadersequenz sein. Somit kann zumindestens in Hefe der Leader einer der folgenden Leadersequenzen sein:
oder
oder konservativ modifizierte Variationen einer dieser Sequenzen gemäß der Beschreibung in der WO-A-90/01063.
Die Fermentation des transformierten Pilzes und die Abtrennung des gewünschten Peptidprodukts erfolgen auf bekannte Weise, beispielsweise gemäß der Beschreibung in "Yeast Biotechnology", Herausgeber D.R. Berry, I. Russel und G.G. Stewart, Allen & Unwin.
Die erfindungsgemäßen Mutantennachweisverfahren und neuen Promotoren können bei S. cerevisiae, anderen Hefespezies, wie Schizosaccharomyces pombe oder Kluyveromyces lactis, oder anderen Pilzen, wie Aspergillus spp., verwendet werden.
Bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im folgenden anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
die Fig. 1 bis 7 die jeweiligen Plasmidkarten von pAYE333, pAYE334, pAYE328, pAYE335, pAYE309, pSAC35 und pAYE316;
Fig. 8 einen Northern Blot, der die Akkumulation von HA- mRNA, wie sie in einer Schüttelkolbenkultur für die beiden Stämme DB1 pAYE316 und DS65 pAYE316 beobachtet wird, wobei die RNA aus Zellen A) in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase und B) in der späten logarithmischen Wachstumsphase extrahiert wird;
Fig. 9 die Konstruktion der Plasmide pDBP1 und pDBP2;
die Fig. 10 bis 14 die jeweiligen Plasmidkarten von pDBPS, pDBP6, pDBP7, pDBAL und pDBA2.
Die rekombinanten Standard-DNA-Verfahren sind bei Maniatis und Mitarbeiter (1982) "Molecular Cloning: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, New York) und in der zweiten Ausgabe hiervon (Sambrook und Mitarbeiter, 1989) beschrieben.

Beispiel 1: Herstellung eines HA-Sekretionsplasmids

Das den Protease-B-Promotor enthaltende 1,440-kbp-HindIII- EcoRI-DNA-Fragment (SEQ1) wurde in den Polylinker des M13- Bakteriophagen mp18 kloniert (Yanish-Perron und Mitarbeiter (1985) Gene 33, 103-119), wobei das Plasmid pAYE333 erhalten wurde (Fig. 1). Das Plasmid pAYE333 wurde durch teilweises Verdauen mit SnaB1 linearisiert, worauf der doppelsträngige Oligonudeotidlinker 1 durch Ligation in die SnaB1-Stelle in dem PRB1-Promotor insertiert wurde. Linker 1
Dadurch wird eine NotI-Restriktionsstelle am 5'-Ende des Protease-B-Promotors erzeugt. Dieses Promotorelement wurde durch stellengerichtete Mutagenese (Oligonucleotidgerichtetes in-vitro-Mutagenesesystem Version 2, Amersham) nach der Anleitung des Herstellers weiter modifiziert. Die Mutagenese mit dem 31-mer-Oligonucleotid
führt nahe des ATG-Translationsinitiationskodons eine HindIII-Restriktionsstelle ein: nicht modifiziert modifiziert
Das Plasmid pAAH5 (Goodey und Mitarbeiter, 1987: In Yeast Biotechnology, 401-429, herausgegeben von D.R. Berry, I. Russell und G.G. Stewart, veröffentlicht von Allen und Unwin) wurde durch teilweises Verdauen mit BamHI lineansiert. Die 5' vorstehenden Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs stumpfendig gemacht und mit dem doppelsträngigen Oligonudeotidlinker 1 ligiert. Ein rekombinantes Plasmid pAYE334 (Fig. 2) wurde ausgewählt, bei dem eine NotI-Restriktionsstelle die BamHI-Stelle am 3'-Ende des ADH1-Terminators ersetzt hatte.
Das Plasmid pAT153 (Twigg & Sherratt, Nature 283, 216-218, 1980) wurde mit EcoRI/BamHI verdaut und das größere 3,36- kbp-DNA-Fragment gereinigt. Die 5'-vorstehenden Ende wurden mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs stumpfendig gemacht und mit dem doppelsträngigen Oligonudeotidlinker 1 unter Erzeugung des Plasmids pAYE328 (Fig. 3) rezirkularisiert.
Die modifizierte 0,8-kbp-NotI-HindIII-Protease-B-Promotorsequenz wurde stromauf des 0,45-kbp-HindIII-Noti-ADHI-Transkriptionsterminators auf dem auf pAT153 basierenden Plasmid pAYE328 unter Erzeugung von pAYE335 (Fig. 4) angeordnet.
Das Plasmid pAYE309 (Fig. 5) wurde durch eine Dreiwegligation zwischen HindIII-linearisiertem pAYE335 (Fig. 4), dem doppelsträngigen Oligonudeotidlinker 2 Linker 2
(der SEQS darstellende 5'-3'-Strang) und einem 1,9-kbp-HA- cDNA-Fragment, das aus XhoI-linearisiertem mp19.7 (EP-A-201 239) freigesetzt worden war, konstruiert, mit S1-Nuclease stumpfendig gemacht und anschließend mit HindIII verdaut. Das markierte ATG zeigt den Start eines offenen Leserahmens für die Fusionsleadersekretionssequenz an.
Das im Plasmid pAYE309 erzeugte 3,2-kbp-NotI-Restriktionsfragment wurde anschließend in einen eine einzige NotI-Restriktionsstelle enthaltenden geeigneten Hefereplikationsvektor (beispielsweise pSAC35, Fig. 6) unter Bildung eines Plasmids pAYE316 (Fig. 7) übertragen.
Das Plasmid pSAC35 ist ein Derivat von pSAC3, das von Chinery und Hinchliffe in Curr. Genet. 16, 21-25 (1989) und der EP-A-286 424 beschrieben ist. Der selektierbare LEU2- Marker ist ein 1,95-kbp-SalI-HpaI-Fragment aus YEp13 (J.R. Broach und Mitarbeiter, Cell 16, 827-839, 1979), das in die SnaBI-Stelle von pSAC3 insertiert ist. Das LEU2-Gen besitzt eine einzige Tth111-I-Stelle. Nach einer Verdauung mit diesem Enzym wurden die 5'-vorstehenden Enden durch Behandeln mit T4-DNA-Polymerase 1 aufgefüllt. Die Insertion der NotI- Erkennungsstelle unter Bildung von pSAC35 erfolgte durch Ligation der stumpfendigen, linearisierten DNA mit dem doppelsträngigen Oligonudeotidlinker 1.
Das Plasmid pAYE316 wurde nach dem von Hinnen und Mitarbeiter in P.N.A.S. 75, 1929 (1978) beschriebenen Verfahren in den Saccharomyces-cerevisiae-Stamm DB1 (MATa, leu2, [cir&sup0;]) eingeführt. Die Transformanten wurden auf einem Minimalmedium, dem Leucin fehlte (Hefestickstoffgrundlage, Difco), ausgewählt. Wenn die Transformanten 72 h bei 30ºC und 200 1/min in entweder 10 ml Komplexmedium (YEP, 1% (g/v) Hefeextrakt, 2% (g/v) Bactopepton und 2% (g/v) Saccharose) oder definiertem (0,15% (g/v) Hefestickstoffgrundlage ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,5% (g/v) Ammoniumsulfat, 0,1 Mol Citronensäure/Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O eines pH-Werts von 6,5, 2% (g/v) Saccharose) flüssigem Medium enthaltenden 50 ml Kolben gezüchtet wurden, konnte das HA in dem zellfreien Kulturüberstand durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und/oder durch Raketenimmunogelelektrophorese (rocket immunogelelectrophoresis) nachgewiesen werden.

Beispiel 2: Herstellung von übermäßig sezernierenden Stämmen unter Verwendung von HSA

Nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren wurden Mutantenstämme von DB1 cir&sup0; (pAYE316) hergestellt. Kurz gesagt wurde in definierten Medien bis zu einer optischen Dichte OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5-1,0 (mittlere logarithmische Wachstumsphase) DB1 cir&sup0; (pAYE316) gezüchtet. 20 ml der Kultur wurden zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen anschließend in 20 ml definiertem Medium, dem Saccharose fehlte, resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend mit einem aus einer Reihe von verfügbaren chemischen Mutagenen so behandelt, daß eine Überlebensrate von 10-30% erreicht wurde. Die mutierten Zellen wurden anschließend auf YEP, 2% (g/v) Saccharose, 1% (g/v) Agarose aufweisender Platten, die 2,5% (v/v) Kaninchen-anti-HA-Antikörper (Cambio. Cambridge, GB) enthielten, verteilt und mindestens 72 h bei 30ºC inkubiert. Die Zahl der einzelnen, auf jede Platte applizierten Zellen wurde so eingestellt, daß sich pro cm² 1 bis 2 Kolonien entwickelten. Mit der Zunahme der Größe der Kolonien entwickelten sich um die Kolonien herum opake Fällungshalos. Die erhhte Mengen HA in das Medium sezernierenden Mutantenstämme von DB1 cir&sup0; (pAYE316) wurden direkt durch eine Zunahme der Größe des Fällungshalos nachgewiesen. Die die größten Halos liefernden Kolonien wurden identifiziert, auf definiertes Medium aufweisenden Agarpiatten subkultiviert und bezüglich ihrer Fähigkeit zur Sekretion von HA in Komplexmedium und definiertes flüssiges Medium gemäß der obigen Beschreibung untersucht.
Wenn ein übermäßig produzierender Stamm identifiziert wurde, wurde die Stelle der Mutation (chromosomal gegen episomal) durch Heilen (curing) des Plasmidstamms und Zurücktransformieren des [ciro&sup0;]-Mutantenstamms zu einer Leucinprototrophie mit dem Plasmid pAYE316 festgelegt. Wenn die Mutation im Genom lokalisiert ist, behält der retransformierte Stamm die Fähigkeit zur Sekretion von HA in erhöhter Menge bei.
Der Fällungshalo, der sich entwickelt, ist im allgemeinen blaß und verschwommen. Vorzugsweise ist folglich das verwendete Medium klar. Aus diesem Grund ist Agarose gegenüber Agar bevorzugt. Die Konzentration des festen Mediums (wenn es nicht klar ist) und die Dichte der darauf abgeschiedenen Zellen können so gewählt werden, daß das klarste Ergebnis erreicht wird.
Wenn das heterologe Polypeptid nicht sezerniert wird, kann es nichtsdestotrotz entweder durch freiwillige Herbeiführung einer Lyse der Zellen auf mechanischem, chemischem oder en zymatischem Weg oder durch Zulassen einer Autolyse nachgewiesen werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform, die sich besonders eignet, wenn lediglich geringe Expressionsmengen erreicht werden, werden die Zellen auf Agarose oder ein anderes geeignetes Medium plattiert und anschließend auf eine hydrophile Kunststoffolie, wie "Gelbond" (Handelsbezeichnung, Pharmacia, Schweden), heruntergetrocknet. Die Antikörper HA- Komplexe werden anschließend beispielsweise durch Anfärben mit Coomassie-Blau (Handelsbezeichnung), um blaue Halos zu erzeugen, sichtbar gemacht werden.
Ein übermäßig sezernierender Stamm kann abermals mutiert werden. Nachfolgende Mutationsrunden erhöhen die Produktivität des Stamms merklich. Auf diese Weise wurde eine Reihe von mutierten Stämmen entwickelt (Tabelle 1). All diese Mutationen sind chromosomalen Ursprungs. Es wurde ursprünglich beobachtet, daß DS37 cir&sup0; (pAYE316) ein übermäßig sezernierender Mutantenstamm von DB1 cir&sup0; (pAYE316) ist. Nachfolgende Ergebnisse zeigten jedoch, daß dieser Stamm HA nicht in merklich höheren Mengen sezernierte als DB1 cir&sup0; (pAYE316), wenn Messungen in komplexem flüssigem Medium gemäß der obigen Beschreibung durchgeführt wurden. Tabelle 1 STAMM MUTAGEN SEZERNIERTE HSA-MENGE (bezogen auf DB1)
Die genauen Genorte der Läsionen sind nicht bekannt. Die phenotypischen Effekte von zwei der Mutationen wurden jedoch teilweise charakterisiert. Die Gleichgewichtsmengen von HA- mRNA im Elternstamm DB1 cir&sup0; 0 (pAYE316) spiegeln die Mengen an Protease-B-mRNA, die während des Wachstums in einer Schüttelkolbenkultur beobachtet wird, wider (Moehle, Genetics, 115, 255-263, 1987). Die Mutation, die zu einer erhöhten Produktivität des Stamms DS65 cir&sup0; (pAYE316) führt, gewährleistet offensichtlich eine konstitutive Expression von HA-mRNA vom Protease-B-Promotor aus während der logarithmischen Wachstumsphase (Fig. 8).
Eine zweite Mutation zerstört offensichtlich die Synthese aktiver Protease A. Der Stamm, in dem diese Mutation zuerst identifiziert wurde, DS212pep&supmin; cir&sup0; (pAYE316), sezerniert HA in gegenüber dem Elternstamm DS212 cir&sup0; (pAYE316) ununterscheidbaren Mengen.

Beispiel 3: Intrazelluläre Expression von pAI-2

Als Quelle der Plasminogenaktivatorinhibitor-Typ 2(PAI-2)- cDNA wurde eine aus mRNA, die aus mit 4-Phorbol-12-myristat-13-acetat stimulierten Zellen der menschlichen monocytenartigen histiocytischen Lymphomzellinie U937 (erhalten von Clontech Laboratories Inc.) isoliert worden war, konstruierte lambda-gt11-CDNA-Bibliothek verwendet. Die Bibliothek wurde unter Verwendung von radioaktiv markierten Oligonucleotidsonden, die den DNA-Sequenzen mit Kodierung für den N-Terminus (Oligo 1) bzw. den C-Terminus (Aminosäuren 400- 410) des PAI-2-Proteins entsprechen, gescreent. Oligo 1 Oligo 2
Aus den vermutlichen positiven Klonen wurde ein Klon (lambda gt11-186) ausgewählt, der scheinbar den gesamten PAI-2-Kodierbereich enthält. Dies wurde durch Sequenzanalyse des DNA-Inserts in diesem Klon (SEQ8) nach einem Transfer in M13mp19 unter Bildung von pDBP1 (Fig. 9) bestätigt. In der Sequenz SEQ8 bezeichnet das ATG in der Position 42 den Start der Kodiersequenz und das TAA in der Position 1287 das Stoppkodon.
Zu Erleichterung der Insertion in Expressionsvektoren wurden am 5'-Ende und 3'-Ende des PAI-2-Gens Restriktionsenzymer kennungsstellen erzeugt. Eine BGlII-Stelle wurde unter Verwendung des Oligonucleotidprimers
am 5'-Ende des Gens erzeugt, um eine im folgenden dargestellte Mutation in der dritten Position des zweiten Kodons zu schaffen:
geändert zu:
(SEQ11 ist der Start der dargestellten Proteinsequenz). Eine AflII-Stelle wurde unter Verwendung des Oligonucleotidprimers
am 3'-Ende des Gens erzeugt, um die im folgenden dargestellten Mutationen in der dritten Position des letzten Kodons (Prolin) und in der ersten Base nach dem Stoppkodon zu schaffen:
verändert zu:
(SEQ15 ist das durch den dargestellten C-terminalen Bereich kodierte Peptid). Diese beiden Oligonudeotide wurden zum einzelstrangigen pDBP1 verknüpft (annealed) und anschließend in einem nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführten in-vitro-Mutagenesevorgehen (Amersham plc) verwendet. Ein von diesem Vorgehen hergeleiteter Klon mit den richtigen Änderungen wurde als pDBP2 (Fig. 9) bezeichnet.
Das große 6,38-kbp-HindIII-BamHI-Fragment aus dem Hefe E.- coli-Shuttlevektor pJDB207 (J.D. Beggs, Molecular Genetics in Yeast, 1981, Alfred Benzon Symposium 16, 383-395) wurde mit dem Klenow-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Anschließend erfolgte eine Ligation mit dem doppelsträngigen Oligonudeotidlinker 1 (Beispiel 1) unter Erzeugung des Plasmids pDBPS (Fig. 10). Die 1,25-kbp-NotI-Protease-B-Promotor/ADH1-Terminatorkassette aus dem Plasmid pAYE335 (Fig. 4) wurde in die einzige NotI-Stelle des Plasmids pDBP5 unter Erzeugung von pDBP6 (Fig. 11) eingeführt.
Um die Insertion einer Human-PAI-2-CDNA in das Expressions plasmid pDBP6 zu gewährleisten, wurden zwei doppelsträngige Oligonudeotidlinker verwendet. Linker 3 Linker 4
Die Linker 3 und 4 wurden mit der 1,34-kbp-BglII-AflII-PAI- 2-cDNA aus pDBP2 (Fig. 9) in durch HindIII linearisiertes pDBP6 unter Erzeugung des Plasmids pDBP7 (Fig. 10) ligiert.
Eine stabile Erhaltung von pDBP7 durch die S.-cerevisiae- Stämme DB1 cir&sup0; und DS569 cir&sup0; kann nicht erreicht werden, bis auf dem nativen 2-µ-Plasmid (A.B. Futcher, Yeast 4, 27- 40, 1988) vorhandene, trans-wirkende Funktionen eingeführt sind. Dies erfolgt durch Cotransformieren von DB1 cir&sup0; und DS569 cir&sup0; mit pSAC3 (S.A. Chinery und E. Hinchuffe, Current Genetics 16, 21-25, 1989 und EP-A-286 424) und pJDB207 und Auswählen bezüglich Transformanten auf Minimalmedium, dem Leucin fehlt. Ein Heilen (curing) von DB1 cir&sup0; (pSAC3/pJDB207) und DS569 cir&sup0; (pSAC3/pJDB207) des pJDB207- Plasmids führt in wirksamer Weise zu cir&spplus;-Derivaten der ursprünglichen Stämme.
DB1 cir&sup0; (pSAC3) und DS569 cir&sup0; (pSAC3) wurden mit dem Plasmid pDBP7 zu einer Leucinprototrophie zurücktransformiert und Transformanten auf Minimalmedium, dem Leucin fehlt, ausgewählt. DS569 cir&sup0; (pSAC3), DS569 cir&sup0; (pSAC3/pDBP7), DB1 cir&sup0; (pSAC3) und DB1 cir&sup0; (pSAC3/pDBP7) wurden 72 h in einer Schüttelkolbenkultur bei 200 1/min und 30ºC in 10 ml Komplexmedium (1% (g/v) Hefeextrakt, 2% (g/v) Bactopepton und 2% (g/v) Saccharose) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und einer Lyse unterzogen, worauf die löslichen Proteinextrakte durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert wurden. Eine Extraproteinbande von 46 kD wird lediglich in den löslichen Proteinextrakten der Kulturen, die das PAI-2 exprimierende Plasmid pDBP7 enthalten, beobachtet. Diese Extraproteinbande weist das vorausgesagte Molekulargewicht für das die vollständige Länge aufweisende Human-PAI-2 auf. Ferner wurde durch Westernblot-Analyse gezeigt, daß diese Extraproteinbande mit anti-PAI-2-Antikörpern reagiert. Dadurch wurde die Identität dieser Bande als PAI-2 verifiziert. Der Stamm DS569 cir&sup0; (pSAC3/pDBP7), der ursprünglicherweise auf der Basis ausgewählt worden war, daß er erhöhte Mengen Humanalbumin in den Kulturüberstand sezerniert, akkumuliert Human-PAI-2 in Mengen, die mindestens 10mal höher sind als beim ancestralen Stamm DB1 cir&sup0; (pSAC3/pDBP7).

Beispiel 4: Intrazelluläre Expression von α&sub1;AT

Eine Human-α&sub1;-antitrypsin-cDNA, die bezüglich der Sequenz mit der in der Genbank-Datenbank, Zugangsnummer K01396, Stelle HUMA1ATM beschriebenen identisch ist, wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) nach den Anleitungen des Herstellers amplifiziert.
Die Sequenz ist hier als SEQ19 dargestellt.
Die DNA-Sequenzen der beiden primären PCR-Oligonucleotide waren die folgenden: 5' Oligonudeotide 3' Oligonudeotide
Bei der Amplifikation wurden sowohl der 5'- als auch der 3'- Terminus der α&sub1;-Antitrypsinsequenz wie folgt modifiziert: 5' Terminus ursprünglich modifiziert
Die jeweiligen hierdurch kodierten Aminosäurebereiche finden sich als SEQ23 und SEQ2S. 3' Terminus ursprünglich modifiziert
(Der oben angegebene C-terminale Bereich findet sich als SEQ27). Diese Modifikationen entfernen die 23 Aminosäuren umfassende Signalsequenz und führen eine HindIII-Restriktionsstelle am 3'-Ende der cDNA ein.
Die modifizierte 1,18-kbp-cDNA wurde gereinigt, mit eingeführtem HindIII und BamHI verdaut und in die HindIII-BamHI- Stellen von M13mp19 (Yanish-Perron und Mitarbeiter, Gene 33, 103-119, 1985) unter Erzeugung von pDBA1 (Fig. 13) kloniert. Die Unversehrtheit von Human-α&sub1;-antitrypsin wurde durch Didesoxynucleotidsequenzierung bestätigt.
Um die Insertion der Human-α&sub1;-antitrypsin-cDNA in das Hefeexpressionsplasmid pDBP6 (Fig. 11) zu gewährleisten, wurde ein doppelsträngiger Oligonudeotidlinker verwendet. Linker 5
Der Linker 5 wurde mit der 1,18-kbp-BamHI-HindIII-Human-α&sub1;- antitrypsin-cDNA in das durch HindIII linearisierte pDBP6 unter Erzeugung des Plasmids pDBA2 (Fig. 14) ligiert.
DB1 cir&sup0; (pSAC3) und DS569 cir&sup0; (pSAC3) wurden mit dem Plasmid pDBA2 zu einer Leucinprototrophie zurücktransformiert und Transformanten auf Minimalmedium, dem Leucin fehlte, selektiert. DB1 cir&sup0; (pSAC3/pDBA2) und DS569 cir&sup0; (pSAC3/pDBA2) wurden 72 h in einer Schüttelkolbenkultur bei 200 1/min und 30ºC in 10 ml Komplexmedium (1% (g/v) Hefeextrakt; 2% (g/v) Bactopepton und 2% (g/v) Saccharose) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und einer Lyse unterzogen, worauf die löslichen Proteinextrakte durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert wurden.
In den löslichen Proteinextrakten von DS569 cir&sup0; (pSAC3/- pDBA2) wurde eine intensive Bande von α&sub1;-Antitrypsin beobachtet. Diese Extrabande weist das vorausgesagte Molekulargewicht von α&sub1;-Antitrypsin auf. a&sub1;-Antitrypsin wird auch in den löslichen Proteinextrakten von DB1 cir&sup0; (pSAC3/pDBA2) nachgewiesen. DS569 cir&sup0; (pSAC3/pDBA2) akkumuliert α&sub1;- Antitrypsin in Mengen, die mindestens 10mal über denen des ancestralen Stamms DB1 cir&sup0; (pSAC3/pDBA2) liegen.

Angaben zu SEQ ID NO:1:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 1440 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls Genom-DNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Antisense: Nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Saccharomyces cerevisiae
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:1:

Angaben zu SEQ ID NO:8:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 1412 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Doppeistrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls CDNA zu mRNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Antisense: Nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Homo sapiens
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: EXON
(B) Lage: 1..1412
(C) Sonstige Angaben:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:8:

Angaben zu SEQ ID NO:19:

(i) Sequenzkennzeichen
(A) Länge: 1352 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNA zu mRNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Antisense: Nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Homo sapiens
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:19:

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der relativen Produktionsmen gen eines heterologen Polypeptids in Kolonien von Pilzzellen mit der Fähigkeit zur Expression des heterologen Polypeptids, wobei das Verfahren ein Aufbringen der Pilzzellen auf ein ein Mittel, das selektiv an das heterologe Polypeptid bindet, enthaltendes, festes Medium, ein Gewährleisten einer Expression des Polypeptids durch die Zellen auf deni festen Medium, ein Gewährleisten eines Wechseiwirkens des heterologen Polypeptids mit dem bindenden Mittel in dem Medium und ein Sichtbarmachen der gebildeten Komplexe umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mittel ein Antikörper zu deni Polypeptid ist und die Stufe des Sichtbarmachens aus einem Beobachten von Habeffekten der ausgefallenen Antikörper/Polypeptid-Komplexe besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medium Agarose umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pilzzellen Saccharomyces cerevisiae sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das heterologe Polypeptid Humanalbumin, Human-PAI-2 oder Human-α&sub1;-antitrypsin ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid durch Pilzzellen sezerniert wird.

7. Verfahren zur Gewinnung eines Pilzstamms mit der Fähigkeit zur Produktion eines ersten heterologen Polypeptids, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (1) Einwirkenlassen eines Mutagens auf Pilzzellen, um Mutanten zu erzeugen, (2) Bestimmen der relativen Produktionsmengen eines zweiten heterologen Peptids im Rahmen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und (3) Isolieren eines Stamms, der die gewünschte Menge des ersten heterologen Polypeptids produziert, wobei die Produktionsmenge die der Pilzzellen übersteigt und wobei das erste und zweite Polypeptid gleich oder verschieden sein können.

8. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids durch Fermentieren eines gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 erhaltenen Pilzstamms und Reinigen des ersten Polypeptids.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Pilzstamm mit Mitteln zur Expression des ersten Polypeptids zuerst transformiert wird, wobei sich das erste Polypeptid vom zweiten Polypeptid nach Anspruch 7 unterscheidet.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das erste heterologe Polypeptid aus Pilzzellen sezerniert wird.